CN118703694B - 一种与抗大豆白粉病相关的snp标记、扩增引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于大豆分子生物学技术领域，具体涉及与一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记、扩增引物及其应用。所述PMD‑Glyma.16G210800标记位于SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的第150bp处，该处碱基发生了GCTC至G的突变；所述PMD‑Glyma.16G212300标记位于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第150bp处，该处碱基发生了T至G的突变。本发明所提供的PMD‑Glyma.16G210800的扩增引物和PMD‑Glyma.16G212300的扩增引物可以对抗感材料进行良好分型，检测SNP多态性表达的差异，可以用于大豆白粉病性状的分子标记辅助育种。

Description

一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记、扩增引物及其应用

技术领域

我本发明属于大豆分子生物学技术领域，具体涉及与一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记、扩增引物及其应用。

背景技术

大豆是我国食用油和饲料原料的主要来源。大豆白粉病是由专性活体营养型真菌白粉菌侵染引起的世界性大豆病害，其能侵害大豆叶片等不同器官，严重影响大豆的产量。该菌引起的大豆白粉病是大豆上主要的真菌病害之一。大豆白粉病会危害成株叶片，造成黄化、萎蔫，导致光合速率下降，在有利的环境条件下，能导致感病品种减产10%—40%。近年来，在我国华南、东北和西南大豆种植区，大豆白粉病发病趋势愈发严重。其中，大豆白粉病的英文名称为soybean powdery mildew。白粉菌的拉丁文名称为Erysiphe diffusa。

传统杀菌剂不仅给生态环境造成极大污染，还容易引起病菌抗药性的产生，降低药效，增加杀菌剂的开发成本。应用抗病品种是控制大豆白粉病流行、减少危害的最经济、安全、有效的途径。因此，开展抗大豆白粉病基因的精细定位和标记开发研究，对通过分子育种方法改良大豆对白粉病的抗性，选育出适合东北地区的抗病品种具有重要意义。

目前利用关联分析技术挖掘出一批抗大豆胞囊线虫病、大豆猝死综合征、大豆茎溃疡病、大豆花叶病毒病、大豆疫霉根腐病、大豆褐茎腐病和大豆锈病等相关的标记或抗病基因。近年利用关联分析法开发目标性状功能标记，已成为分子生物学研究的热点之一。分子标记辅助选择可显著提高大豆对白粉病的抗性遗传改良进程。

目前通过连锁分析和全基因组关联分析将大豆对白粉病的抗性基因的定位于大豆基因组的16号上末端，但定位位置存在一些差异。这些研究为抗病育种中分子标记辅助选择提供了可利用的分子标记，为抗病基因的图位克隆奠定了基础。但尚未开发与抗大豆白粉病性状相关的SNP分子标记，这给利用分子标记辅助选择育种培育优质的抗大豆白粉病品种带来了困难。

发明内容

为解决现有技术中尚未开发与抗大豆白粉病性状相关的SNP分子标记，这给利用分子标记辅助选择育种培育优质的抗大豆白粉病品种带来了困难的问题，本发明提供了一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记、扩增引物及其应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记。所述SNP标记包括PMD-Glyma.16G210800标记位点和PMD-Glyma.16G212300标记位点。这2个标记是基于Glyma.16G210800和Glyma.16G212300基因上存在的indel/SNP变异开发的HRM标记。

其中，所述PMD-Glyma.16G210800标记位点位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第150bp处，该处碱基发生了GCTC至G的indel突变；

所述PMD-Glyma.16G212300标记位点位于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第150bp处，该处碱基发生了T至G的SNP突变。

SEQ ID NO 1的核苷酸序列如下所示：

TTGGACTCCAAAGTTTAGACCTGGATGATTGTGAAAATTTTTTGTTACCAAGTAACATTATTGCCATGATGCCTAAACTGTCTTCATTGAAGGCTATAAGTTGCAAGGGGTTGCAATGGGTAAAATCAGAAGAGGGTGAAGAAAACGTG[GCTC/G]AATAGCATGTTCAAATGTTGATTACATCATTGTCGATTATTGCAACCTGTATGATGATTTTTTTCCAACAGGTTTCATGCAGCTTCATCATGTGAAAACTTTAAGCCTAAGGGAGAATAATTTCACATTCCTTCCTGAATGCATCA，展示了突变位点上下游各150bp的序列，其中[GCTC/G]中GCTC为突变位点，G为突变后的位点。

SEQ ID NO.2的核苷酸序列如下所示：

TTCCGGCATCAGGACAATGCTACTTGGCACCTTAAAAATTGCATGAGGACTTAAAAAGCTCAGGTCTAATCCTTGAAGGCCCAGCAAGATTTTGAAATGAAAATGACAATTCTGTTATGGAAGAGTTTGACAAACAAAGTTGTCTTATGT[T/G]TTCCATCTTTCCTAATATTTTTGGAAAACTCTCAAGACTGTAACAAAATGAAAGATTAAGTTTTTCAAGAGAAGTCAACTTGATAGGTGGAAAACTTCTGAGCCTTTTGCATCTAAAAGCATTCAATATTTTAAGCTTATCCAGAAA，ACC展示了突变位点上下游各150bp的序列，其中[T/G]中T为突变位点，G为突变后的位点。

本发明还提供了一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记的扩增引物。所述SNP标记的扩增引物的扩增引物包括所述PMD-Glyma.16G210800标记位点的扩增引物和/或所述所述PMD-Glyma.16G212300标记位点的扩增引物。具体地，所述PMD-Glyma.16G210800标记位点的扩增引物包括PMD-Glyma.16G210800F和PMD-Glyma.16G210800R。

所述PMD-Glyma.16G210800F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-AGTTTAGACCTGGATGATTGTGA-3’。

所述PMD-Glyma.16G210800R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-CATACAGGTTGCAATAATCGAC-3’。

优选地，所述PMD-Glyma.16G212300标记位点的扩增引物包括PMD-Glyma.16G212300F和PMD-Glyma.16G212300R。

所述PMD-Glyma.16G212300F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：5’-GTTAAACATTTGCACCCGTCA-3’

所述PMD-Glyma.16G212300R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：5’-AGTTACCCTATAGTTGTATTTCGTC-3’。

本发明还提供了一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记在鉴定大豆抗白粉病性状中的应用。

优选地，检测大豆第16号染色体上的所述PMD-Glyma.16G210800标记位点，发生GCTC至G突变的为白粉病抗性高的大豆。

优选地，检测大豆第16号染色体上的所述PMD-Glyma.16G212300标记位点，发生T至G突变的为白粉病抗性高的大豆。

本发明还提供了一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记在大豆育种中的应用。

优选地，所述大豆育种为培育抗白粉病的大豆品种。

优选地，所述PMD-Glyma.16G210800标记位点发生GCTC至G突变的和/或所述PMD-Glyma.16G212300标记位点发生T至G突变的为抗白粉病大豆。

优选地，检测大豆基因组中所述PMD-Glyma.16G212300标记位点和/或所述PMD-Glyma.16G212300标记位点的基因型，选择基因型均为GG的大豆作为亲本进行育种，收获抗白粉病大豆后代。其中，所述GG是所述SNP为G的纯合型。

优选地，检测大豆基因组中SNP的多态性或基因型的物质用于大豆育种；

优选地，所述检测大豆基因组中SNP的多态性或基因型的物质含有为扩增包括所述PMD-Glyma.16G210800和PMD-Glyma.16G212300 SNP标记位点在内的大豆基因组DNA片段的PCR引物。

优选地，所述PCR引物包括所述PMD-Glyma.16G210800标记和所述PMD-Glyma.16G212300标记的扩增引物。

其中，所述PMD-Glyma.16G210800的扩增引物为：

PMD-Glyma.16G210800F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；PMD-Glyma.16G210800R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述PMD-Glyma.16G212300的扩增引物为：

PMD-Glyma.16G212300F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；PMD-Glyma.16G212300R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记、扩增序列及其应用。本发明利用全基因组关联分析获得抗大豆白粉病基因，根据位点序列信息开发鉴定大豆白粉病的SNP特异性标记，开展大豆白粉病性状SNP分子标记：PMD-Glyma.16G210800标记和PMD-Glyma.16G212300标记的开发。利用这2个分子标记，可以对大豆抗病选择育种予以辅助，从而培育出品质优良的抗大豆白粉病品种。

本发明提供的PMD-Glyma.16G210800的扩增引物和PMD-Glyma.16G212300的扩增引物可以对抗感材料进行良好分型，检测SNP多态性表达的差异，可以用于大豆白粉病性状的分子标记辅助育种，为实现大豆白粉病性状的早期鉴定、筛选和育种提供分子辅助技术支持，对于加快大豆优质品种的选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。

附图说明

图1为本发明中331份大豆的疾病严重度指数的频率分布图。

图2为本发明中331份大豆的群体结构分析图；其中，图2中的A为LnP（k）和Delta K均值变化曲线图；图2中的B为供试群体的遗传结构图；图2中的C为供试群体的主成分分析的二维散点图；图2中的D为供试群体的系统发育树图。

图3为本发明中331份大豆的LD衰减图。

图4为本发明中331份大豆对白粉病的抗性的MLM关联分析结果的曼哈顿图。

图5为本发明中PMD-Glyma.16G210800标记基因分型结果图。

图6为本发明中PMD-Glyma.16G212300标记基因分型结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施示例中的331份大豆种质资源源自国家基因库并由吉林省农业科学院大豆研究所保育提供。331份大豆种质资源来源地涵盖我国高纬度大豆主产区的大部分，包括黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古等。

实施例1：与抗大豆白粉病相关的SNP标记的获得

大豆白粉病温室抗性鉴定及标准

在吉林省农业科学院的安普温室开展大豆白粉病鉴定试验。采用盆栽种植，实验遵循完全区组随机设计，设3次重复，每个重复种植1盆，播种10粒，待出苗后，定苗到5株。在病原圃中将采集的新鲜大豆白粉病病叶叶片放入空塑料盒内，采用无菌的毛笔刷取病叶片上附着的孢子，并用无菌水冲洗病叶，充分摇晃、震荡后，经纱布过滤，获得孢子悬浮液。利用血球计数板进行显微镜计数，并分别配制成1×10⁵孢子/mL浓度的孢子悬浮液。采用人工喷雾接种法，在大豆植株幼苗在第一片三出复叶完全展开时，利用喷雾器将制备的不同的孢子悬浮液均匀喷洒在植株叶面上，并确保每一株的顶部叶片完全湿润。接种后，需要严格控制温室环境，温度控制在23℃，相对湿度75%。在接种4周后，进行大豆白粉病的表型调查。根据分级标准和疾病严重度指数对331份大豆种质资源进行白粉病的抗性鉴定及评估，结果见图1。图1的结果发现331份大豆种质资源的DSI变幅为0~100，平均值为36.92。其中，疾病严重度指数的英文名称为disease severity index，DSI。

大豆抗白粉病基因的全基因组关联分析

2.1 基因组DNA获取：

利用CTAB法提取上述331份大豆材料的嫩叶中提取基因组DNA，用Thermonanodrop 2000检测DNA浓度达100ng/μL，并用1%琼脂糖电泳检测DNA的纯度及完整性，并置于-80℃条件下进行保存备用。其中，CTAB法为采用十六烷基三甲基溴化铵提取DNA的方法。

2.2 基因分型和质控：

使用Illumina SoySNP50k对331份大豆种质资源进行测序和基因分型，其中Illumina SoySNP50k基因芯片由52041个SNPs组成。通过beagle软件对供试材料的基因型进行填补，并使用PLINK1.90软件对填补后SNP数据进行质控过滤，参数设置为：maf是0.05，geno是0.2，共获得30，602个高质量的SNP标记用于关联分析。

2.3 供试群体遗传结构分析：

基于质控过滤后的SNP矩阵通过主成分分析、亲缘关系分析、系统发育分析和种群遗传结构分析推断331份大豆种质资源群体分层关系。具体步骤如下：

①主成分和亲缘关系分析：利用Tassel V5.2.60软件对供试群体进行主成分分析和亲缘关系矩阵评估，其中亲属关系矩阵的类型为CENTERED_IBS。

②系统发育分析：使用MEGA-X中的最大复合似然模型构建邻接法系统发育树，其中Bootstrap值为1000个重复，缺口/缺失数据处理选择部分删除，站点覆盖率截止为80%。

③遗传结构分析：

第一步，利用PLINK V1.09对连锁SNP筛选删除，其中窗口大小为50kb，SNP步长为10，SNP相关阈值为0.2，保留未连锁的SNP，共获得1643个未连锁的SNP用于供试群体的遗传结构分析。

第二步，使用STRUCTURE 2.3.4对331份大豆种质资源群体进行遗传结构分析。

第三步，通过Structure Harvester分析K值所对应的LnP（D）和ΔK值的变化曲线进而确定该群体最佳分群。其遗传结构结果如图2中的A所示：随着K值不断增加，LnP（K）呈上升趋势，在K=2时，出现拐点，且ΔK值最大。且利用全基因组上30，602个高质量的SNP标记对供试群体进行系统发育分析，结果如图2中的C所示和如图2中的B所示的主成分分析的群体分成结果与STRUCTURE遗传结构分析结果基本吻合。

因此，可确定最优K值为2，表明331份大豆种质资源组成的自然群体中存在1个亚群结构，可将Q2矩阵作为协变量加入GWAS模型中用于控制供试群体遗传结构，以减少假阳性检测率，提高关联分析准确度。

2.4 供试群体的LD分析：

基于30602个高质量的SNPs数据矩阵，利用PLINK1.90软件计算供试群体所有SNP的R²，使用R脚本绘制了平均LD衰减图及每条染色体上成对距离在500kb内的SNPs的R²值。LD衰减率是利用R²均值降至其最大值的一半时确定的物理区间。当R²等于0.422时，正好为R²最大值的一半，此时对应物理距离为109kb，故该供试群体的LD半衰减距离为109kb，如图3所示。

2.5 GWAS分析：

基于关联群体的30602个SNP标记、遗传结构数据、亲缘关系Kinship矩阵以及供试材料对白粉病的疾病严重指数进行全基因组关联分析。采用R包GAPIT中的MLM模型进行GWAS分析。从图4中的GWAS结果的曼哈顿图来看，在16号染色体末端出现一个整齐的矗状信号峰，这表明位于Chr16的某些SNP与大豆白粉病的抗性存在显著且强有力的关联信号。在Bonferroni阈值为N=1/30，602（-log10P=4.49）的条件下，检测到与白粉病抗性显著相关的7个SNP标记，如表1所示。

表1 与大豆白粉病抗性显著关联的SNP标记信息

2.6 候选基因预测及qRT-PCR验证：

利用显著SNPs标记所在候选物理区域挖掘与白粉病抗性相关的候选基因，根据LD衰减距离或LD连锁区域块确定候选物理区域。使用blast工具对候选基因在KOG、GO、KEGG、拟南芥数据库和Pfam数据库等功能数据库进行比对，并根据数据库中的注释信息对候选基因进行注释及qRT-PCR验证，发现具有TIR-NBS-LRR结构域的基因家族Glyma.16G210800、Glyma.16G212300和Glyma.16G213900在抗感材料中存在差异性表达。

2.7 候选基因核酸序列的结构变异检测及注释：

具体步骤如下：利用CTAB法提取了高感大豆白粉病ZDD06944和高抗大豆白粉病ZDD00359基因组DNA，并提交给北京百迈客生物科技有限公司进行质量检测及个体重测序。并根据抗感材料的Clean Reads在大豆参考基因组Williams82：Glycine max v2.1的比对结果，使用Picard过滤冗余reads：MarkDuplicates，以保证质检的准确性。接着，使用GATKv3.2-2工具包的局部单体型组装算法对抗感材料的SNP/InDel的进行变异检测及过滤，并利用SnpEff v3.6c软件对抗感材料间变异的SNP/InDel进行注释。在ZDD06944和ZDD00395中均存在差异性表达的Glyma.16G210800、Glyma.16G212300和Glyma.16G213900这3个R-like进行核酸结构变异检测与注释，仅在Glyma.16G210800和Glyma.16G212300上存在密码子的功能突变。

其中，局部单体型组装算法的英文名称为HaplotypeCaller。

实施例2：与大豆白粉病抗性基因显著关联SNP标记的应用

根据抗感材料在候选基因Glyma.16G210800和Glyma.16G212300的核酸序列变异，选取SNP位点前后300bp左右，设计开发SNP标记引物，成功开发出PMD-Glyma.16G210800标记和PMD-Glyma.16G212300标记，所述 PMD-Glyma.16G210800标记位于大豆基因组16号染色体第36985346bp位，所述标记变异碱基类型为GCTC/G；所述PMD-Glyma.16G212300标记位于大豆基因组16号染色体第37064285bp位，所述标记变异碱基类型为T/G。

其中，SNP标记：high resolution melting，HRM。

所述 PMD-Glyma.16G210800标记位于大豆基因组Chr16第36985346bp位，所述标记变异碱基类型为GCTC/G。所述PMD-Glyma.16G210800标记位点上下游侧翼序列150bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.1序所示：

TTGGACTCCAAAGTTTAGACCTGGATGATTGTGAAAATTTTTTGTTACCAAGTAACATTATTGCCATGATGCCTAAACTGTCTTCATTGAAGGCTATAAGTTGCAAGGGGTTGCAATGGGTAAAATCAGAAGAGGGTGAAGAAAACGTGGCTCAATAGCATGTTCAAATGTTGATTACATCATTGTCGATTATTGCAACCTGTATGATGATTTTTTTCCAACAGGTTTCATGCAGCTTCATCATGTGAAAACTTTAAGCCTAAGGGAGAATAATTTCACATTCCTTCCTGAATGCATCA。

所述PMD-Glyma.16G212300标记位于大豆基因组Chr16第37064285bp位，所述标记变异碱基类型为T/G。所述PMD-Glyma.16G212300标记位点上下游侧翼序列150bp的苷酸序列如SEQ ID NO.2序所示：

TTCCGGCATCAGGACAATGCTACTTGGCACCTTAAAAATTGCATGAGGACTTAAAAAGCTCAGGTCTAATCCTTGAAGGCCCAGCAAGATTTTGAAATGAAAATGACAATTCTGTTATGGAAGAGTTTGACAAACAAAGTTGTCTTATGTTTTCCATCTTTCCTAATATTTTTGGAAAACTCTCAAGACTGTAACAAAATGAAAGATTAAGTTTTTCAAGAGAAGTCAACTTGATAGGTGGAAAACTTCTGAGCCTTTTGCATCTAAAAGCATTCAATATTTTAAGCTTATCCAGAAAACC。

PMD-Glyma.16G210800标记的扩增引物为：

PMD-Glyma.16G210800F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-AGTTTAGACCTGGATGATTGTGA-3’。

PMD-Glyma.16G210800R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-CATACAGGTTGCAATAATCGAC-3’。

PMD-Glyma.16G212300标记的扩增引物为：

PMD-Glyma.16G212300F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：5’-GTTAAACATTTGCACCCGTCA-3’。

PMD-Glyma.16G212300R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：5’-AGTTACCCTATAGTTGTATTTCGTC-3’。

利用上述SNP标记辅助判断大豆白粉病抗性的具体步骤如下：

1、利用CTAB方法从新鲜的大豆嫩叶中提取基因组DNA，具体操作如下：

（1）剪取大豆嫩叶约250mg，放入液氮充分研磨至粉碎完全，分装至1.5mL离心管中。

（2）向离心管中加入700µL提前65℃预热并混匀体积百分比2%CTAB提取液，缓慢摇匀，并65℃水浴30min。

（3）使用12000r/min速度离心5min，并在离心后向上清中加入等体积的氯仿/异戊醇=24：1的溶液，颠倒混匀，在4℃下12000r/min离心10min。

（4）吸取上清并加入2/3体积的异丙醇，充分混匀，在-20℃条件下静置30min。接着，使用12000r/min速度离心10min，弃上清保留离心底物，向离心管加入适量的体积百分比75%乙醇进行洗涤，并离心去上清，重复2次。最后，将离心管倒扣在灭菌后吸水纸上进行干燥。

（5）使用50µL无菌的TE溶解DNA，置于-80℃条件下进行保存备用，并使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其DNA质量，并利用Thermo Scientific NanoDrop2000C对DNA的浓度进行检测。

2、基因型检测

具体方法如下：采用0.2µM上下游引物混合物、5µL Ex Taq Mix、2µL cDNA稀释液，0.15μL Eva Green，并用超纯水调节终体积至10µL。并在CFX48ECO™实时聚合酶链式反应系统上进行qRT-PCR。

具体操作如下：50℃，2min，95℃预变性3min，95℃变性10s，退火温度为55℃复性20s，72℃下延伸30s，进行45个循环，95℃变性15 s，退火温度为55℃复性15s，95℃变性15s。

其中，CFX48ECO™实时聚合酶链式反应系统：Illumina，USA。

将白粉病高抗材料ZDDD00395和高感材料ZDDD06944作为对照，利用PMD-Glyma.16G210800和PMD-Glyma.16G212300引物分析供试群体的基因型，并复合表型，结果如图5和图6所示。

其中，白粉病高抗材料ZDDD00395：HR，序号69。

白粉病高感材料ZDDD06944：HS，序号214。

图5的结果发现：PMD-Glyma.16G210800标记对抗性材料的检测准确率高达85.92%；图6的结果发现：PMD-Glyma.16G212300标记对抗性材料的检测准确率为51%，这表明这2个SNP标记用于辅助选择是切实有效的。

由上述实验结果可知，通过全基因组关联分析获得的抗大豆白粉病基因Glyma.16G210800和Glyma.16G212300，并在这2个抗性基因上开发多态性SNP标记用于分子辅助育种选择是切实有效的。

本发明提供的PMD-Glyma.16G210800的扩增引物和PMD-Glyma.16G212300的扩增引物可以对抗感材料进行良好分型，检测SNP多态性表达的差异，可以用于大豆白粉病性状的分子标记辅助育种，为实现大豆白粉病性状的早期鉴定、筛选和育种提供分子辅助技术支持，对于加快大豆优质品种的选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改，这些变更和修改均落入本发明范围的所有变更和修改。

Claims (3)

1.一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其中第150bp处存在GCTC至G的突变。

2.检测权利要求1所述的一种与抗大豆白粉病相关的SNP标记的引物在鉴定大豆抗白粉病性状中的应用，其特征在于，检测所述SNP标记发生GCTC至G的突变为白粉病抗性高的大豆。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。