CN118703514A - GhVdR2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了GhVdR2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用，属于生物技术应用领域。本发明提供了GhVdR2在异源四倍体陆地棉品种TM‑1基因组中全长ORF核苷酸序列和氨基酸序列。干扰表达GhVdR2植株通过调控IAA和SA的串扰提高植株抗病性。对生长发育、产量和纤维品质相关性状表型调查结果显示，与对照相比，干扰GhVdR2表达的棉花植株其根长和根表面积增加，株高增加，子指增大，但衣分和衣指降低。纤维品质性状中纤维长度、整齐度和纤维强度均增加，马克隆值降低。本发明利用生物技术明确了GhVdR2调控棉花抗病性的作用，提出通过抑制GhVdR2表达调控棉花抗病性的育种利用价值。

Description

GhVdR2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及一种GhVdR2基因及其在提高棉花抗病性中的应用。该基因ORF全长为576bp，编码了191个氨基酸。基于黄萎病菌诱导后棉花根部转录组测序结果，得到这一受黄萎病菌诱导后显著下调表达的基因。在棉花中该基因功能未有相关文献报道。本发明在棉花中抑制GhVdR2基因表达，使得植株对黄萎病的抗性显著提高。转录组测序分析表明，GhVdR2转录水平的抑制影响了植物激素信号转导通路相关基因的表达，其中生长素响应相关基因大多数下调表达，水杨酸通路关键基因和病程相关蛋白大多数上调表达。进一步研究表明，相比于对照，GhVdR2干扰的棉花中IAA含量显著降低，SA含量显著增加。表明干扰GhVdR2表达导致IAA和SA的串扰进而影响植株抗病性。对生长发育、产量和纤维品质相关性状表型调查结果显示，与对照相比，干扰GhVdR2表达的棉花植株其根长和根表面积增加，株高增加，子指增大，衣分和衣指降低，纤维长度、整齐度和强度均增加。本发明利用生物技术明确了GhVdR2调控棉花抗病性的作用，提出通过抑制GhVdR2表达调控棉花抗病性的育种利用价值。

背景技术

植物激素(Phytohormone)是指植物体内产生的能调节自身生理过程的微量有机化合物，参与调控植物生长发育和对逆境的应答。在受到逆境胁迫时，植物激素信号转导能在感知刺激信号后调控下游防御网络，启动多种防御反应，包括：细胞壁增厚、抗菌素积累、ROS爆发、MAPK信号级联通路激活和PR基因的表达等(Dhar et al.,2020；Billah et al.,2021)。水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(Eth)、生长素(AUX)、细胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)、油菜素甾醇(BR)和独脚金内酯(SL)是已经被报道过参与植物逆境应答的激素(Shaban et al.,2018；Dhar et al.,2020)。其中ABA是在植物应对非生物胁迫中发挥重要作用的激素之一(Lata and Prasad,2011)，此外SA、JA和ET在植物应对生物胁迫中也发挥作用，但关于这三种激素更多的报道是围绕它们帮助植物响应生物胁迫展开的，在生物胁迫下它们均受病原菌诱导(Bari and Jones,2009)。其他几种激素则主要通过与ABA、SA、JA和ET串扰参与植物逆境中的信号转导，多种激素共同组成复杂的信号网络，以响应环境变化(Bari and Jones,2009；Navarro et al.,2008；Nishiyama et al.,2013)。

SA是防御相关的主要激素之一，在激活下游抗病基因表达和建立SAR中起重要作用(Shaban et al.,2018)。SA既在植物抵御营养生长或半营养生长病原菌胁迫中发挥重要作用，又能帮助植物抵御坏死型病原菌的胁迫(Dhar et al.,2020)。现已有多项研究证明SA在棉花抗黄萎病菌中尤为重要。

SA合成过程的关键酶是苯丙氨酸解氨酶(PAL)和异分支酸合成酶(ICS)，TCP转录因子GhTCP4-like与SAR的关键调节因子GhNPR1互作促进GhICS1表达，使得SA积累，增强棉花对黄萎病菌的抗性(Jia et al.,2022)。吲哚是诱导SA合成的关键，能够增强SA信号通路相关基因的表达，敲除色氨酸合成酶GbTSA1和GbTSB1后吲哚积累，激活SA生物合成和防御信号通路，提高棉花对黄萎病菌的抗性(Miao et al.,2019)。棉花叶片中miR530-GhSAP6模块通过SAR远程对黄萎病菌做出反应，放大SA信号增强棉花抗性(Hu et al.,2023)。SA信号通路的激活还受复杂次生代谢物影响，精氨酸生物合成限速的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶GhSAMDC和清除ROS中发挥重要作用的谷胱甘肽S-转移酶GaGSTF9等都通过调控SA来调控棉花抗病(Mo et al.,2016；Gong et al.,2018；Zhang et al.,2020)。

生长素是植物生长发育必不可少的激素之一，它调控多个生长发育过程，包括：向性、根和茎形态结构、花和果实发育等(Gomes and Scortecci,2021)，随着对植物与病原菌互作机制了解的深入，研究发现生长素信号转导和代谢的每一个过程都与植物免疫密切相关，生长素在植物应答胁迫时也发挥重要作用。吲哚-3-乙酸(IAA)是植物中生长素的普遍存在形式，被广泛研究(Gomes and Scortecci,2021)。生长素在多数报道中被认为负调植物抗病，主要有以下三方面的原因：(1)生长素会破坏植物天然屏障细胞壁，帮助病原菌入侵。生长素诱导参与细胞壁延伸的内切-β-1,4-葡聚糖酶(EGases)和木葡聚糖内转糖苷酶(XETs)表达，使细胞壁松动(Fry et al.,1992；Cataláet al.,1997)；生长素还诱导参与细胞壁延伸的扩张蛋白表达，而过表达扩张蛋白会使敏感型野生水稻对胁迫更敏感(Ding etal.,2008；Fu et al.,2011)；(2)生长素可能调控气孔开放，为病原菌入侵提供机会(Schroeder et al.,2001；Melotto et al.,2006)；(3)IAA信号通路通过与SA信号通路拮抗，参与抗病。SA介导的植物免疫通常伴随生长素信号通路的表达(Wang et al.,2007)。紫丁香III型效应基因AvrRpt2通过抑制PR基因的表达来增加拟南芥的易感性，SA免疫转导会激活该基因的表达(Chen et al.,2004)，同时IAA含量显著增加(Chen et al.,2007)。微阵列数据表明，一些防御反应基因在正调IAA含量的相关基因过表达拟南芥中下调表达(Zhaoet al.,2002；Redman et al.,2004)。除此之外，也有研究发现IAA并不总是负调植物抗病性，过表达OsGH3.1的水稻对真菌病原体稻瘟病菌的抗性增强，推测可能与防御应答基因的激活有关(Domingo et al.,2009)。

生长素响应因子阻遏蛋白(Aux/IAA)是一种短寿命核蛋白，作为主要抑制因子在生长素信号转导途径中发挥作用，研究证明生长素介导的转录调控完全依赖Aux/IAA的功能(Lavy and Estelle,2016)。Aux/IAAs通过参与生长素信号转导调控植物生长发育和胁迫应激等过程。

作为生长素信号的早期响应因子，Aux/IAAs与生长素受体(TIR1/AFB)和生长素反应因子(ARF)共同组成生长素信号转导经典通路已被广泛研究。在没有生长素的情况下，Aux/IAAs通过负调控ARFs的转录活性抑制生长素反应基因转录；在高水平生长素下，Aux/IAAs与TIR1/AFBs结合后被泛素化，ARFs释放并调节生长素反应相关基因表达(Leyser,2018)。不同的TIR1/AFB-Aux/IAA蛋白组合具有不同的生长素结合亲和力，且生长素水平在不同组织和发育阶段不同，这导致生长素感应效应不同(Trenner et al.,2017)。因此，精确把控生长素信号转导通路，准确调控植物生长素水平，有利于更好地调控植物生长发育和植物免疫反应。

目前只在植物中鉴定到了Aux/IAAs：拟南芥、水稻、小麦、玉米、高粱、马铃薯基因组分别有29个、31个、84个、40个、26个、26个AUX/IAAs基因(Overvoorde et al.,2005；Jainet al.,2006；Qian et al.,2015；Jiang et al.,2021；Wang et al.,2010；Gao et al.,2016)。二倍体棉(雷蒙德氏棉)中找到44个Aux/IAA家族基因，在四倍体棉(陆地棉TM-1)中找到84个Aux/IAAs基因(Su et al.,2018)。其余植物中也鉴定出大量的Aux/IAAs(Fan etal.,2024；Mathura et al.,2023；Wang et al.,2023)。

Aux/IAA家族成员基因在植物的生长发育中发挥多种生物学功能，包括：向地性、侧根形成、叶片扩张、器官发育、顶端优势等。拟南芥中敲除AtIAA3后侧根形成受到严重影响(Luo et al.,2018)。马铃薯StIAA2基因下调表达使植株株高增加、叶柄向下(Deng etal.,2012)。过表达OsIAA4基因的水稻植株则出现矮化、分蘖角度增加等现象(Klooster etal.,2006)。

在参与生物和非生物胁迫方面，Aux/IAAs基因也发挥重要作用：高盐条件下，水稻OsIAA9和OsIAA20基因表达量显著升高(Jain and Khurana,2009)；水稻OsIAA6基因受干旱胁迫诱导，OsIAA6过表达株系抗旱能力显著增强(Jung et al.,2015)；拟南芥在被烟草花叶病毒(TMV)侵染时，体内Aux/IAAs基因IAA26、IAA27、IAA18被TMV复制酶靶向，使维管组织内病毒运动增强，病毒在韧皮部积累(Padmanabhan et al.,2005；Meenu et al.,2006；Tamara et al.,2016)；丁香假单胞菌利用III型效应基因AvrRpt2刺激Aux/IAAs(AXR2，AXR3)蛋白周转，促进宿主体内生长素产生，促进疾病发展(Cui et al.,2013)；木薯中Aux/IAAs基因过表达增强木薯对木薯枯萎病的抗病性(Fan et al.,2020)。另有报道指明Aux/IAAs通过促进IAA与ABA、SA串扰参与植物免疫反应调节。将小麦Aux/IAA蛋白TaIAA15-1A过表达到二穗短柄草中，激活ABA信号通路并提高植株耐旱性(Su et al.,2023)；SA通过抑制生长素相关受体基因(包括TIR1)表达，增加Aux/IAA蛋白质稳定性，从而抑制生长素应答(Wang et al.,2007；李艳艳等，2022)。近期研究发现，拟南芥中的Aux/IAAs蛋白IAA15可以在体外和体内被MPK3和MPK6磷酸化(Kim et al.,2022)。

在棉花中，Aux/IAAs基因GhAux1、GhAux2、GhAux3、GhAux6和GhAux7被报道参与棉花营养生长，GhAux4和GhAux5参与棉纤维的起始，GhAux8和GhIAA16在棉花纤维发育阶段优势表达，GhAux8参与早期纤维的伸长与次生壁合成有关(Han et al.,2012；王曦烨等，2016)。Aux/IAAs在植物生长发育和植物应激中均发挥重要作用，进一步研究Aux/IAAs机理将有可能找到植物生长和免疫间的平衡点。

本实验室通过分析黄萎病菌诱导后棉花根部转录组测序结果，发现生长素响应因子阻遏蛋白基因GhVdR2，受黄萎病菌诱导后表达水平显著下调；而在棉花中瞬时沉默该基因后，植株的抗病性显著增强。进一步以异源四倍体陆地棉材料W0为受体创制了稳定的GhVdR2下调表达抗性材料，该基因干扰表达促进棉花的纤维产量和品质提升。GhVdR2含有典型的AUX_IAA结构域，属于Aux/IAA家族Ⅲ族。其位于棉花第13号部分同源染色体，A/D亚组各一个拷贝，分别为GH_A13G1981和GH_D13G1941，同源性高。通过接菌黄萎病抗性鉴定，结果表明，GhVdR2干扰棉花具有显著提高的黄萎病抗性。

棉花黄萎病危害巨大，治理困难，而占全球种植面积90％以上的陆地棉抗源匮乏。鉴于此，GhVdR2的发现及抗病分子机理研究，可以拓宽对棉花黄萎病抗性的认识。通过调控目标基因的表达，实现精确调控棉花生长和抗病之间的平衡，培育抗性显著提高的新种质并在生产上应用，为棉花抗黄萎病育种提供理论和材料基础。

发明内容

本发明的目的是提供GhVdR2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用。通过RNAi技术证明了干扰表达GhVdR2可以显著提高棉花植株对黄萎病的抗性。以此基因为靶基因，培育生长发育正常，棉纤维产量、品质无不利影响的沉默、干扰或抑制所述棉花GhVdR2基因表达的生物材料，实现其在提高棉花抗病性或培育黄萎病抗病性提高的棉花新种质中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种提高棉花抗黄萎病的方法。

本发明的又一目的在于提供一种棉花GhVdR2基因，并提供该基因在陆地棉品种TM-1中的全长cDNAORF核苷酸序列及编码的氨基酸序列。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明请求保护如SEQ ID NO.1所示的编码生长素响应因子阻遏蛋白(AUX/IAA)的GhVdR2基因或与GhVdR2基因相关的生物材料在如下(a1)-(a2)中的至少一种应用：

(a1)提高棉花黄萎病抗病性；

(a2)培育黄萎病抗病性提高的棉花新种质；

进一步，所述的与GhVdR2基因相关的生物材料为如下(b1)或(b2)或(b3)所述的生物材料：

(b1)所述GhVdR2基因编码的蛋白GhVdR2；

(b2)含有所述GhVdR2基因的生物材料；

(b3)用于沉默、干扰或抑制所述GhVdR2基因的生物材料。

更进一步，(b1)中所述GhVdR2基因编码的蛋白GhVdR2具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

更进一步，(b2)中所述的含有所述GhVdR2基因的生物材料为如下(c1)～(c6)中的至少一种：

(c1)含有所述GhVdR2基因的表达盒；

(c2)含有所述GhVdR2基因的重组载体、或含有(c1)所述表达盒的重组载体；

(c3)含有所述GhVdR2基因的重组微生物、或含有(c1)所述表达盒的重组微生物、或含有(c2)所述重组载体的重组微生物；

(c4)含有所述GhVdR2基因的转基因植物细胞系、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

(c5)含有所述GhVdR2基因的转基因植物组织、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物组织、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物组织；

(c6)含有所述GhVdR2基因的转基因植物器官、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物器官、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物器官。

更进一步，(b3)中所述用于沉默、干扰或抑制所述GhVdR2基因的生物材料为如下(d1)～(d4)中的至少一种：

(d1)所述GhVdR2基因的干扰片段或沉默片段；

(d2)用于扩增(d1)所述GhVdR2基因干扰片段或沉默片段的引物；

(d3)所述GhVdR2基因的干扰表达载体或沉默载体；

(d4)含有如(d3)所述干扰表达载体或沉默载体的重组微生物。

进一步，上述的应用中，通过抑制棉花GhVdR2基因的表达量或降低棉花GhVdR2基因编码的蛋白GhVdR2的水平(活性或含量)提高棉花黄萎病抗病性。更进一步，所述的抑制棉花GhVdR2基因的表达量的方法是：构建该基因的干扰表达载体，通过农杆菌介导法将构建的干扰表达载体转化棉花，获得GhVdR2基因表达显著降低的棉花材料。

研究表明，干扰表达GhVdR2能显著提高植株抗病性，干扰GhVdR2株系与对照相比根长和根表面积增加，株高增加，子指增大，衣分和衣指降低，纤维长度、整齐度和强度增大。

第二方面，本发明请求保护一种方法，该方法用于提高棉花黄萎病抗病性，通过抑制所述棉花GhVdR2基因的表达量或降低由棉花GhVdR2基因编码的蛋白GhVdR2的水平(活性或含量)提高棉花黄萎病抗病性。

第三方面，本发明请求保护一种棉花GhVdR2基因，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

第四方面，本发明请求保护由所述的GhVdR2基因编码的蛋白GhVdR2，该蛋白GhVdR2具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

第五方面，本发明请求保护与所述棉花GhVdR2基因相关的生物材料，该生物材料为含有所述GhVdR2基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌；或用于沉默、干扰或抑制所述棉花GhVdR2基因的生物材料，具体为含有所述棉花GhVdR2基因的干扰或沉默特异性片段的重组载体、表达盒和重组菌。

本发明克隆一种编码棉花生长素信号转导途径中阻遏蛋白的GhVdR2基因，该基因的ORF序列如SEQ ID NO.1所示。该基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。研究发现，抑制所述GhVdR2基因的表达能显著提高棉花对黄萎病的抗性。将目标基因的干扰或沉默表达载体导入现有的推广品种中，对推广品种进行棉花抗病性改良。本发明的具体实施方式中，以所述的棉花GhVdR2基因为靶基因，通过基因干扰方法，抑制GhVdR2基因表达，培育棉花抗病性显著改良的新种质并在生产上应用。

本发明的优点表现在：

首次对棉花中的GhVdR2基因进行系统的序列结构、表达模式及功能分析，明确GhVdR2在棉花生长发育及抗病性中的重要作用。

AUX/IAA是生长素信号转导途径中的阻遏蛋白，通过调控生长素信号转导影响植物生长发育和抗病过程，其在棉花抗病中未见报道。我们通过系统的分子生物学实验证实了棉花中GhVdR2表达水平的下降对植株产量和纤维品质有促进作用。干扰表达GhVdR2植株通过控植株IAA含量，拮抗调控植株SA含量并影响植株抗病性。研究结果揭示了棉花中GhVdR2调控植物生长发育及黄萎病抗性的分子机制，也为进一步探究植物如何精准平衡生长-免疫的研究方向提供了新思路与参考。

附图说明

图1：GhVdR2结构分析和表达特征分析

a：GhVdR2基因结构分析。b：GhVdR2蛋白结构域。c：GhVdR2在TM-1中不同组织和器官中的表达特征分析：棉花TM-1根、茎、叶、花瓣、雄蕊，-3，0，3DPA胚珠，5，10，20，25和25dpa纤维取样用于转录组分析，颜色深浅表示表达量高低。d：GhVdR2在黄萎病菌诱导下的表达特征，误差线表示三个生物学重复平均值±标准误。星号代表其他时期基因的表达水平与0h相比有显著性差异(*表示P<0.05，**表示P<0.01，t检验)。

图2：GhVdR2定位于细胞核

Nuclear是细胞核标记，GhVdR2蛋白与细胞核标记蛋白共定位。标尺＝50μM。

图3：GhVdR2转基因纯系材料鉴定

a：pART27-pKANNIBAL-GhVdR2和pCAMBIA2301-GhVdR2转基因材料部分PCR鉴定结果。b：GhVdR2转基因纯系材料基因表达量。误差线表示三个生物学重复平均值±标准误。星号代表其他材料中基因的表达水平与W0相比有显著性差异(**表示P<0.01，t检验)。

图4：干扰表达GhVdR2显著提高棉花抗病性

a：接菌后20天和25天GhVdR2转基因植株和W0植株发病表型。b：接菌后15天、20天和25天GhVdR2转基因植株和W0植株病叶发病率统计。c：茎部真菌积累观察。d：转基因植株茎部真菌恢复分析。e：转基因植株根部真菌生物量。误差线表示三个生物学重复平均值±标准误。星号代表每个时期其他材料与W0相比有显著性差异(**表示P<0.01，t检验)。

图5：GhVdR2转录组分析

a：GhVdR2干扰株系RNAi1402和W0在水处理和病处理下差异基因数目统计。b：GhVdR2干扰株系RNAi1402和W0病处理下差异基因KEGG富集分析。c：水杨酸、PR蛋白和生长素相关基因表达量分析。d：SA相关基因和编码PR蛋白基因的表达量。星号表示基因在GhVdR2转基因植株中的相对表达量和对照相比有显著性差异(*表示P<0.05，**表示P<0.01，t检验)。

图6：干扰表达GhVdR2植株IAA含量降低而SA含量升高

a：GhVdR2转基因植株和W0植株叶片IAA。b：GhVdR2转基因植株和W0植株叶片SA含量。星号表示GhVdR2转基因植株中的IAA和SA含量和对照相比有显著性差异(*表示P<0.05，**表示P<0.01，t检验)。

图7：GhVdR2转基因材料表型性状调查

a：GhVdR2转基因植株和W0植株根表型。b：GhVdR2转基因植株和W0植株总根长。c：GhVdR2转基因植株和W0植株总根面积。d：GhVdR2转基因植株和W0植株株高。星号表示GhVdR2转基因植株株高和对照相比有显著性差异(*表示P<0.05，**表示P<0.01，t检验)。YIN是转基因阴性对照株。

具体实施方式

实施例1

(一)GhVdR2的结构特征和表达特征分析

GhVdR2位于棉花第13号部分同源染色体，A/D亚组各一个拷贝，同源性高。该基因ORF全长为576bp，编码了191个氨基酸，含两个内含子，属于Aux/IAA家族Ⅲ族。通过结构域验证，含有典型的AUX_IAA结构域。基于本实验室已有的陆地棉TM-1组织器官转录组数据和植物根部受黄萎病诱导后转录组数据，使用MEV4.9(http://en.bio-soft.net/chip/MeV.html)分别分析GhVdR2的黄萎病诱导表达特征及棉花组织器官表达特征，GhVdR2在棉花各组织器官内基础表达量都比较高，特别是在花瓣和雄蕊这个生殖器官中表达量更高，且受黄萎病诱导(图1)。

(二)GhVdR2的亚细胞定位

去除目的基因GhVdR2 ORF的终止密码子后，在CE Design V1.03软件中设计重组引物，以陆地棉遗传标准系TM-1的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增反应结束后加入10×Loading buffer 2μL，进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶回收，具体步骤参见胶回收试剂盒说明书。将pBINGFP4载体质粒进行酶切，之后与目标片段置于PCR仪中37℃反应30min进行重组反应。30min后立即取出放于冰上，将重组产物转化大肠杆菌感受态，涂平板后放置于37℃培养箱倒置培养12h。从平板上挑取单克隆，放入含有700μL对应抗生素的液体LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养5-6h。以菌液为模板，载体上的通用引物进行PCR扩增，跑胶后，将阳性菌液进行测序，测序序列正确的菌液提取质粒，并转入LBA3101农杆菌中。将混合好的菌液从烟草叶片的背面进行注射，烟草暗培养12-16h后正常培养2-3天，用激光共聚焦显微镜(Zeiss,LSM780,德国)对目标蛋白的定位进行观察，空pBin-GFP做对照。结果显示：GhVdR2定位在细胞核上(图2)(引物序列见表1)。

表1实验所用引物

(三)干扰表达GhVdR2显著提高棉花抗病性

我们构建了包含GhVdR2特异的397bp片段的正向序列和反向序列插入的干扰载体pART27-pKANNIBAL-GhVdR2，并转入农杆菌侵染棉花，经过多年鉴定和自交繁种，最终获得RNAi1401和RNAi1402两个纯合的GhVdR2干扰表达株系(图3a)。为了检测GhVdR2在体内的表达水平，对这两个株系的叶片进行取样提取RNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR实验。结果显示GhVdR2在两个株系中的表达量相比对照植株W0显著降低(图3b)(引物序列见表2)。

表2实验所用引物

靶标片段(397bp)序列：

CGGCAACTCTTCGGAGCAACAACAAAAGAGCCTTGCCTGAAGAATCTATGTCTAGTAATG

CCACAGCTTCCAAAAACTGTGACCAAGAAACTGCTCCACTCCCCAAGGCACAAGTGATA

GGGTGGCCACCGATCAGATCTTACAGAAAAAACAACTTGCAACCTAAGAAAAGTGAGGG

TGAAATTAGTGGGATATATGTGAAAGTGAGCATGGATGGGGCTCCTTATCTTAGAAAGATA

GATTTGAAGGTGTTTAAAGGGTACCAAGAATTGCTTAAGGCCTTGGAAGACATGTTCAAG

TTCAAAGCTGGTGAATATTCAGAGAGGGAAGGATATAATGGATCAGAATTTGTGCCCACTTATGAAGATAAAGATGGTGATTGGATGTTGGTCGGAGA(SEQ ID NO.3)

为探究GhVdR2在棉花抗黄萎病菌中的作用，对获得的转基因材料进行抗病性鉴定。棉花幼苗培养于同一温室，使用营养土培养，温室光温条件设置：光照培养28℃、16h，黑暗培养25℃、8h，湿度70％。黄萎病菌V991孢子悬浮液通常保存在-80℃冰箱，使用时先在土豆培养基(PDA)上活化并置于25℃培养7天，再在超净台中将菌落切入液体察氏培养基中25℃、180rpm震荡培养7天(CPK培养基：1000mL ddH₂O中加2g NaNO₃、0.5g KCl、0.5gMgSO₄·7H₂O、1.31g K2HPO₄·3H₂O、0.1g FeSO₄·7H₂O和30g Sucrose，调pH至7.2，高压蒸汽锅灭菌121℃，20min)，通过孢子计数法确定菌液浓度，最终将菌液精确稀释至1×10⁷孢子/毫升用于接种棉花(Gao et al.,2013)。当棉花植株生长至“两叶一心”期时采用伤根法接种黄萎病菌，每株接30mL菌液(Wang et al.,2011)，病叶率调查时以接种黄萎病菌当日为0d，接菌第11d、15d、20d和25d进行发病情况统计，计算病叶发病率并拍照记录。具体调查方法为：统计材料每株病叶数和叶片总数，按照发病率＝发病叶片数/总叶片数计算每株发病率，据此拍照记录植株表型。结果显示在接菌后第20天，对照W0植株发病率为87％；GhVdR2干扰株系RNAi1401和RNAi1402植株叶片仅部分黄化脱落，发病率分别为54％和56％。在接菌后第25天，对照W0植株叶片几乎全部枯萎脱落，发病率为95％；GhVdR2干扰株系RNAi1401和RNAi1402植株叶片发病率分别为69％和75％。在接菌后第20天和第25天，GhVdR2干扰株系RNAi1401和RNAi1402植株病叶率均显著低于对照W0植株。说明GhVdR2干扰后显著提高了陆地棉抗病性(图4a,b)

进一步在病原菌处理后第15天，GhVdR2干扰株系RNAi1401和RNAi1402植株和对照W0植株进行劈秆实验、真菌恢复分析和真菌生物量测定，观察和检测棉花植株茎部和根部微菌核积累情况。实验操作具体如下：(1)维管组织真菌积累观察：棉花接菌后观察棉花发病情况，在棉花发病率差异较大的时期(一般为接菌后15d)取棉花幼苗子叶节以上茎段，在距子叶节1cm位置对新鲜茎段进行斜切，尽量保证切口平滑，对切口用超景深体视镜(Olympus MVX10，日本东京)观察拍照，维管柱中黑色素沉积多少代表黄萎病菌侵入植株量多少，这一结果可佐证抗病性鉴定结果；(2)真菌复苏实验：棉花接菌后根据棉花发病情况，在植株发病率差异较大的时期(一般为接菌后15d)取棉花幼苗子叶节以上茎段，将其横切后得到长度约为1.5cm的新鲜茎段，茎段用70％酒精消毒2次，用灭菌水清洗5次，置于加入34mg/L氯霉素的PDA培养基培养5d，观察茎段两端黄萎病菌复苏情况，若菌落较多较大说明该植株中定殖的黄萎病菌较多，这一结果可佐证抗病性鉴定结果；(3)真菌含量测定：棉花接菌后根据棉花发病情况，在植株发病率差异较大的时期(一般为接菌后15d)取棉花幼苗根，提取样品DNA，以此DNA为模板通过qRT-PCR检测根部病原菌含量，黄萎病菌测定片段为核糖体DNA的内部转录间隔区(ITS)，内标基因为棉花基因GbHis3。结果显示干扰表达GhVdR2植株茎部积累的微菌核和黑色素较少，对照W0植株茎部积累了大量微菌核和黑色素(图4c)；干扰表达GhVdR2的植株茎段两端在PDA培养基上仅生长出少量黄萎病菌菌落，对照W0植株茎段两端均生长出大量菌落(图4d)；干扰表达GhVdR2植株根部真菌含量与对照相比显著减少(图4e)。以上结果再次证明，干扰表达GhVdR2能显著提高植株抗病性。

(四)干扰表达GhVdR2植株IAA含量降低而SA含量升高

为了进一步揭示GhVdR2调节棉花抗病性的分子机制，分别取病原菌处理3天和同时期水处理下GhVdR2干扰株系RNAi1701植株和对照W0植株根部以及同时期未经病处理的RNAi1701和W0植株叶片，提取RNA进行转录组测序。测序时3个单株的混样为一个样品，设置五个生物学重复；提取样品RNA后，RNA浓度及质量用“one drop spectrophotometer OD-1000+”分光光度计检测，RNA完整性用琼脂糖凝胶电泳检测，最终挑选质量较好的RNA送至诺禾致远公司进行转录组测序。测序结果返回后使用NGS QC工具对数据进行预处理，删去低质量和污染序列；使用带有默认参数的Hisat2将处理后的序列回帖到陆地棉W0基因组，得到不同处理的TPM值和reads数(Hu et al.,2019)；使用网站https://www.omicshare.com/对所有的测序数据进行差异基因挖掘，以表达倍数≥1倍且FDR(falsediscovery rate)多重校验值q-value≤0.05两个参数来判定差异表达基因；病挑选差异表达基因进行qRT-PCR验证，以log₂Fold change(qRT-PCR)为横坐标，log₂Fold change(RNA-seq)为纵坐标，作线性回归方程。根据线性回归方程R²值判断转录组数据是否真实可靠。得到以下转录组数据，分别为RNAi1402-W(H₂O)、RNAi1402-V(V991)、W0-W(H₂O)、W0-V(V991)。结果显示GhVdR2干扰植株在水处理和病处理后差异基因极少(图5a)。说明病处理几乎没有引起RNAi1402植株体内转录水平发生改变，病处理下GhVdR2干扰植株和对照植株的差异基因大部分由干扰表达GhVdR2引起。

为探究GhVdR2参与调控的通路，对病处理下GhVdR2干扰植株和对照植株的差异基因进行KEGG富集分析。富集结果显示植物与病原菌互作、植物激素信号转导、MAPK信号通路等与抗病相关的通路被显著富集，说明干扰表达GhVdR2诱导抗病相关基因表达(图5b)。

对富集到的抗病相关通路中的基因进行功能注释，结果显示通路中生长素响应相关基因大部分下调表达，水杨酸相关基因和编码PR蛋白关键基因均上调表达，说明GhVdR2在调控植物体内IAA和SA的过程中发挥一定的作用(图5c)。

为验证转录组分析结果，以W0-W与RNAi1402-W的棉花根部组织的cDNA为模板，进行qRT-PCR实验。结果显示水杨酸相关基因GhPDS4、GhICS1和GhICS2以及编码PR蛋白的关键基因GhPR1、GhPR3、GhPR4、GhPR5、GhPR6、GhPR9和GhPR10在GhVdR2干扰植株的表达量均显著高于在W0植株中的表达量。以上结果表明GhVdR2参与调控生长素和水杨酸信号转导通路(图5d)(引物序列见表3)。

表3转录组验证引物

对照W0和GhVdR2干扰株系RNAi1401和RNAi1402的棉花叶片测定IAA含量、SA含量，生长素含量测定方法如下：

(1)称取约0.2g的叶片研磨而成的粉末于10mL离心管中；

(2)向离心管中加入1mL的提取液(体积比为异丙醇:H₂O:HCl＝2:1:0.002)，4℃震荡提取30min；

(3)在离心管中加入2mL二氯甲烷，4℃震荡提取30min；

(4)4℃，13000r/min，离心5min；

(5)取下清液2mL到棕色玻璃管中，氮气吹干后用200μL 50％(v/v)甲醇溶解；

(6)过0.22μm滤膜(直径13mm)后装2mL进样小棕瓶，用液质联用仪(LC-MS)测定。

水杨酸含量测定方法如下：

(1)取接菌后3d的棉花根部研磨成粉末，称取0.1g左右的样品，并在其中加入750μL-20℃预冷的抽提缓冲液(甲醇：双纯水：冰乙酸，体积比80:19:1)，手动摇匀；

(2)避光在4℃震荡仪上剧烈振荡12h左右使样品充分萃取，4℃ 12000rpm离心15min，将上清转移至一新离心管；

(3)向原离心管中加入250μL抽提缓冲液，避光在4℃震荡2h，再次吸取上清于上清离心管中，将两次得到的总上清液用氮吹仪吹干；

(4)用300μL 10％(v/v)的甲醇溶解干粉，避光在4℃震荡2h左右；

(5)将液体经直径13mm，孔径0.22μm滤膜(Nylon 66，欧美国家进口)过滤至棕色小瓶子，保存于4℃备用。

测定仪器为HPLC-MS/MS(1200LL.C-MS system,Varian)，标样浓度为：1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL和100ng/mL。

测定结果显示GhVdR2干扰株系RNAi1401、RNAi1402的IAA含量与对照相比显著减少，SA含量与对照相比显著升高(图6)。说明干扰表达GhVdR2能降低植株中IAA的含量，提高植株中SA含量。综上，GhVdR2通过调控生长素和水杨酸信号转导通路基因表达，正调控植株IAA含量，负调控植株SA含量，参与植株抗病反应。

(五)GhVdR2转基因材料表型性状调查

对“两叶一心”期棉花植株根系进行取样，取6株长势相同棉花的完整根系进行仪器扫描，测定棉花总根长(Total Root Length,TRL)和根表面积(Root Surface Area,RS)。扫描仪型号：中晶i800plus，所用图像分析系统为万深LA-S型(根系分析独立版)。扫描采集的信息进行分析，结果显示GhVdR2干扰株系RNAi1401和RNAi1402的棉花总根长显著长于对照W0，根表面积显著大于W0。同一生长时期下，GhVdR2干扰植株根系生长更加旺盛(图7a,b,c)。

田间测量生长至80d时对植株株高进行测量，每个克隆测量20株，取平均值作为该克隆株高，结果显示干扰表达GhVdR2的转基因植株与对照W0相比显著提高(图7d)。

对GhVdR2转基因株系和对照W0产量相关性状表型进行调查，其中：棉花成熟后随机取100粒棉籽称重，即为棉花子指(seed index，单位：克)；每个克隆取25个完整的大小相当的成熟铃称重并取平均值，即为单铃重(single boll weight，单位：克)；每个克隆收25个完整的大小相当的成熟铃，称重测量其皮棉重和籽棉重(单位：克)，按照皮棉÷籽棉×100％计算即为衣分(lint percentage，以百分数表示)；衣指(lint index，单位：克)按公式衣指＝(籽指×衣分)/(1-衣分)计算。产量性状调查结果如下表(表4)。结果显示干扰表达GhVdR2植株子指与对照相比显著升高，衣分和衣指与对照相比显著下降，单铃重与对照相比无显著差异。

在棉铃成熟吐絮后，对GhVdR2转基因株系和对照W0产量相关性状表型进行调查，每个克隆取25个完整的大小相当的成熟铃中的纤维进行成熟纤维品质检测，样品至少设置三个生物学重复；测定指标为纤维长度、纤维强度、整齐度、马克隆值以及伸长率；纤维质量参数由农业农村部纤维质量检验检测中心(中国农业科学院棉花研究所，河南省安阳市)检测；数据测定使用大容量纤维测试系统(Premier HFT 9000，Premier Evolvics Pvt Ltd，Coimbatore，India)。成熟纤维品质调查结果如下表(表5)。结果显示干扰表达GhVdR2植株成熟纤维长度显著长于对照W0，纤维整齐度显著高于对照W0，纤维强度显著强于对照W0，马克隆值显著低于对照W0，纤维伸长率与对照相比无明显差异。

表4转基因株系与对照W0产量相关性状表型比较

表5转基因植株与对照W0植株成熟纤维品质比较

星号代表转基因材料与W0相比有显著性差异(*表示P<0.05，**表示P<0.01，t检验)

综上，干扰GhVdR2株系与对照相比根长和根表面积增加，生长发育旺盛，产量相关性状中衣分和衣指降低，子指显著增大；纤维品质性状中纤维长度、纤维整齐度和纤维强度增大，马克隆值降低，具有较好的生产利用潜力。

Claims (10)

1.如SEQ ID NO.1所示的GhVdR2基因或与GhVdR2基因相关的生物材料在如下(a1)～(a2)中的至少一种应用：

(a1)提高棉花黄萎病抗病性；

(a2)培育黄萎病抗病性提高的棉花新种质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的与GhVdR2基因相关的生物材料为如下(b1)或(b2)或(b3)所述的生物材料：

(b1)所述GhVdR2基因编码的蛋白GhVdR2；

(b2)含有所述GhVdR2基因的生物材料；

(b3)用于沉默、干扰或抑制所述GhVdR2基因的生物材料。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，(b1)中所述GhVdR2基因编码的蛋白GhVdR2具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，(b2)中所述的含有所述GhVdR2基因的生物材料为如下(c1)～(c6)中的至少一种：

(c1)含有所述GhVdR2基因的表达盒；

(c2)含有所述GhVdR2基因的重组载体、或含有(c1)所述表达盒的重组载体；

(c3)含有所述GhVdR2基因的重组微生物、或含有(c1)所述表达盒的重组微生物、或含有(c2)所述重组载体的重组微生物；

(c4)含有所述GhVdR2基因的转基因植物细胞系、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

(c5)含有所述GhVdR2基因的转基因植物组织、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物组织、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物组织；

(c6)含有所述GhVdR2基因的转基因植物器官、或含有(c1)所述表达盒的转基因植物器官、或含有(c2)所述重组载体的转基因植物器官。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，(b3)中所述用于沉默、干扰或抑制所述GhVdR2基因的生物材料为如下(d1)～(d4)中的至少一种：

(d1)所述GhVdR2基因的干扰片段或沉默片段；

(d2)用于扩增(d1)所述GhVdR2基因干扰片段或沉默片段的引物；

(d3)所述GhVdR2基因的干扰表达载体或沉默载体；

(d4)含有如(d3)所述干扰表达载体或沉默载体的重组微生物。

6.根据权利要求1～5中任意一种所述的应用，其特征在于，通过抑制棉花GhVdR2基因的表达量或降低棉花GhVdR2基因编码的蛋白GhVdR2的水平提高棉花黄萎病抗病性。

7.一种方法，其特征在于，该方法用于提高棉花黄萎病抗病性，通过抑制权利要求1中所述棉花GhVdR2基因的表达量或降低由棉花GhVdR2基因编码的蛋白GhVdR2的水平提高棉花黄萎病抗病性。

8.一种棉花GhVdR2基因，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

9.由权利要求8所述的GhVdR2基因编码的蛋白GhVdR2，该蛋白GhVdR2具有如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。

10.与权利要求1所述棉花GhVdR2基因相关的生物材料，其特征在于，该生物材料为含有权利要求8所述GhVdR2基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌；或用于沉默、干扰或抑制所述棉花GhVdR2基因的生物材料。