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CN118703475A - 热稳定的葡萄糖淀粉酶TaGA58040及其编码基因和应用 - Google Patents

热稳定的葡萄糖淀粉酶TaGA58040及其编码基因和应用 Download PDF

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CN118703475A
CN118703475A CN202410694010.3A CN202410694010A CN118703475A CN 118703475 A CN118703475 A CN 118703475A CN 202410694010 A CN202410694010 A CN 202410694010A CN 118703475 A CN118703475 A CN 118703475A
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CN
China
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glucoamylase
taga58040
seq
gene
recombinant
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罗会颖
黄火清
姚斌
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Zhongnong Kerui Biotechnology Research Co ltd
Original Assignee
Zhongnong Kerui Biotechnology Research Co ltd
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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及热稳定的葡萄糖淀粉酶TaGA58040及其编码基因和应用。本发明的葡萄糖淀粉酶TaGA580400的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。属于糖苷水解酶第15家族，其最适pH为5.0，在pH 3.0‑6.0范围内，该酶能够维持其95％以上的酶活力；其最适温度为60℃，在60℃下处理60min，酶活仍能保持90％以上，具有较好的温度稳定性。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良、适合工业应用的葡萄糖淀粉酶。

Description

热稳定的葡萄糖淀粉酶TaGA58040及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及热稳定的葡萄糖淀粉酶TaGA58040及其编码基因和应用。
背景技术
葡萄糖淀粉酶是我国产量最大应用最广的酶种，在轻工、食品、医药、饲料、发酵等行业中均具有重要的应用价值，但目前工业用的葡萄糖淀粉酶存在最适反应温度较低以及热稳定性较差的问题，导致在生产应用过程中需要降低反应温度以适应葡萄糖淀粉酶的催化性能。具体地，在淀粉制糖生产工艺过程中，先利用高温α-淀粉酶在95～105℃和pH 5.5～6.5条件下将淀粉液化成糊精、麦芽糖和较小的寡糖；然后冷却降温至60～65℃、调整pH至4.0～4.5，再添加葡萄糖淀粉酶将淀粉液化产物进一步分解生成葡萄糖。
目前，工业化应用的葡萄糖淀粉酶主要来源于黑曲霉、米根霉和米曲霉等，这些酶的最适温度一般为55～60℃，最适pH为3.5～5.0；因而，从淀粉液化过程切换到糖化过程，则需要增加额外的冷却设备将温度从95℃降至60℃，来确保葡萄糖淀粉酶活性最大化，这导致了淀粉制糖工业的能耗大，成本高，因此，挖掘新型葡萄糖淀粉酶对于淀粉制糖工业的发展具有较大的应用前景和实用性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的葡萄糖淀粉酶的最适温度较低的问题，提出并完成本发明。
本发明的目的在于提供一种葡萄糖淀粉酶TaGA58040。
本发明的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶基因Taga58040。
本发明的再一目的在于提供包含葡萄糖淀粉酶基因Taga58040的重组表达载体。
本发明的再一目的在于提供包含葡萄糖淀粉酶基因Taga58040的重组菌株。
本发明的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶TaGA58040的制备方法。
根据本发明具体实施方式的葡萄糖淀粉酶TaGA58040，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
SEQ ID NO:1
MVKSFLTLSLRTLGLVQAAIAAPSAPVLPRASGSLDQWLATETPYALQGVLDNIGADGAKAAGAKSGVVIASPSKSNPDYFYTWTRDAALTIKCLVDAFIAGNTDLESEIRNYISSQAYLQTVSNPSGGLSTGGLGEPKFNVDLTQFTGAWGRPQRDGPALRATAMIAYAKWLIANGQSDLADSIVWPIVQNDLSYVTQYWNSTGFDLWEEVQGSSFFTTAVQHRALVEGNALAQQLGHSCSNCVSQAPQVLCFLQSYWTGSYILANFGGGRTGKDTNTILGSIHTFDPEAGCDDATFQPCSARALANHKAVTDSFRSIYSINSGIAQGQAVAVGRYAEDVYQGGNPWYLCTLAAAEQLYDALYQWDRAGQLTITDVSLPFFRDVYPSAAVGTYASSSSTYQDIVAAVKAYADGYMSVAQKYTPSSGALAEQFSRNDGTPLSAADLTWSYAALLTAAARRSAVVPASWDAPSADSVPAVCSATSATGPYSTATNTVWPGEATTTATATATSTPCTAAPTAVAVTFNERVTTVWGENVFLVGSISALGSWDTNSAVALSADRYTSSDPLWYVTVSLPAGTSFEYKYIKKETDGSVVWESDPNRSYTVPKACGVTTATVNDSWR*
其中，该酶全长622个氨基酸，N端30个氨基酸为信号肽序列“MVKSFLTLSLRTLGLVQAAIAAPSAPVLPR”。因此，成熟的葡萄糖淀粉酶TaGA58040的理论分子量为62.85kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
如SEQ ID NO：2
ASGSLDQWLATETPYALQGVLDNIGADGAKAAGAKSGVVIASPSKSNPDYFYTWTRDAALTIKCLVDAFIAGNTDLESEIRNYISSQAYLQTVSNPSGGLSTGGLGEPKFNVDLTQFTGAWGRPQRDGPALRATAMIAYAKWLIANGQSDLADSIVWPIVQNDLSYVTQYWNSTGFDLWEEVQGSSFFTTAVQHRALVEGNALAQQLGHSCSNCVSQAPQVLCFLQSYWTGSYILANFGGGRTGKDTNTILGSIHTFDPEAGCDDATFQPCSARALANHKAVTDSFRSIYSINSGIAQGQAVAVGRYAEDVYQGGNPWYLCTLAAAEQLYDALYQWDRAGQLTITDVSLPFFRDVYPSAAVGTYASSSSTYQDIVAAVKAYADGYMSVAQKYTPSSGALAEQFSRNDGTPLSAADLTWSYAALLTAAARRSAVVPASWDAPSADSVPAVCSATSATGPYSTATNTVWPGEATTTATATATSTPCTAAPTAVAVTFNERVTTVWGENVFLVGSISALGSWDTNSAVALSADRYTSSDPLWYVTVSLPAGTSFEYKYIKKETDGSVVWESDPNRSYTVPKACGVTTATVNDSWR*
本发明还提供了编码上述葡萄糖淀粉酶Taga58040的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO:3
ATGGTGAAAAGTTTCCTGACTCTCTCCCTTCGCACACTTGGCCTCGTCCAAGCAGCAATCGCTGCTCCCTCTGCCCCGGTTCTCCCGCGGGCGAGTGGCTCTCTGGATCAATGGCTCGCAACGGAGACCCCTTACGCTCTCCAGGGTGTCCTGGACAACATCGGAGCTGATGGGGCCAAGGCAGCGGGCGCAAAATCCGGCGTTGTCATTGCGAGTCCGAGCAAAAGCAATCCTGACTGTGAGTTCAGTCAATAAAGAAAGATTGCATACATGCCGCGTTTTCTCTTTTGAGTGAATTAATTAGAACTTTGCACTGACCGATATAACATCCAGACTTCTACACCTGGACCCGGGACGCCGCTCTCACCATCAAATGCCTGGTCGACGCCTTCATCGCCGGCAACACCGATCTGGAATCGGAGATCCGAAACTACATCAGCTCGCAAGCCTACCTGCAGACGGTGTCAAATCCTTCCGGTGGTCTCTCCACTGGGGGTCTCGGAGAGCCAAAGTTCAATGTCGACTTGACGCAGTTCACGGGCGCCTGGGGCCGTCCTCAACGGGACGGGCCGGCGTTGAGGGCCACGGCGATGATTGCCTATGCGAAGTGGCTTATTGTAAGTGTGATTTCCAGCTGTTATCAACTTTGTGTAGCTAACGGTGGACCTTATTTCAGGCGAATGGACAATCAGACCTAGCGGACTCGATCGTGTGGCCAATTGTCCAAAACGATCTGTCATATGTGACGCAGTACTGGAACTCGACCGGATTTGGTATATACAGTCACATATCTCTCATATAAATGAAATCATATCTAACGGGATCCACACAGACCTCTGGGAAGAAGTCCAAGGCTCCTCTTTCTTCACCACCGCCGTGCAGCACCGCGCCCTCGTGGAGGGCAACGCCCTCGCCCAGCAACTCGGCCACAGCTGCTCCAACTGCGTCTCCCAAGCGCCGCAGGTCCTCTGCTTCCTGCAGTCCTACTGGACGGGCTCGTACATCCTGGCCAACTTCGGCGGCGGCCGCACGGGCAAGGACACCAACACCATCCTGGGCAGCATCCACACGTTCGACCCCGAGGCCGGGTGCGACGACGCGACCTTCCAGCCCTGCTCGGCGCGGGCCCTGGCGAACCACAAGGCCGTGACGGACTCGTTCCGGTCCATCTACAGCATCAACTCGGGCATCGCGCAGGGACAGGCGGTCGCCGTGGGCCGGTACGCCGAGGACGTCTATCAGGGCGGGAATCCGTGGTACCTGTGCACGTTGGCCGCCGCGGAGCAGCTCTACGATGCGCTGTACCAGTGGGATCGGGCGGGCCAGCTCACCATCACGGACGTGAGCTTGCCTTTCTTCCGGGATGTCTATCCCTCTGCGGCCGTTGGGACGTATGCCTCCTCCTCCTCGACTTATCAAGACATCGTTGCGGCGGTAAAGGCGTACGCGGACGGATATATGAGCGTGGCGGTAAGTTCCCTAGCTATATATATATACCTACTCACCCCTTTATCAGCCTGCACTTGATCAATCGGACGGTATATGCTGATTGTAGACATCACCAGCAAAAATACACACCCTCCTCCGGCGCCCTCGCGGAGCAATTCTCCCGCAACGACGGCACCCCCCTCTCCGCCGCGGACCTGACCTGGTCCTACGCAGCTCTCTTGACCGCCGCCGCGCGTCGAAGCGCCGTCGTCCCCGCATCCTGGGATGCGCCGTCCGCCGACAGCGTGCCCGCCGTCTGCTCCGCGACCTCCGCCACGGGGCCCTACAGCACGGCCACGAACACCGTCTGGCCGGGCGAAGCGACCACAACCGCAACCGCGACGGCGACAAGTACACCATGCACGGCAGCGCCCACCGCCGTGGCAGTCACGTTCAACGAGCGCGTCACCACCGTCTGGGGCGAGAACGTCTTCCTCGTCGGCTCGATCTCCGCGCTCGGGTCGTGGGATACCAACTCTGCCGTCGCACTGAGCGCGGACCGGTACACGAGCAGCGATCCGCTGTGGTATGTGACGGTGTCGCTGCCGGCGGGGACGAGCTTCGAGTACAAGTATATCAAGAAGGAGACCGACGGAAGCGTGGTGTGGGAGAGTGATCCGAATCGGTCGTATACGGTGCCGAAGGCCTGTGGGGTGACGACGGCGACGGTGAACGATAGCTGGAGATGA。
本发明的葡萄糖淀粉酶基因Taga58040结构基因全长2177bp，含有4个内含子，+239～333bp、+618～676bp、+774～832、+1471～1565为其内含子序列，cDNA长1869bp，其cDNA序列如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:4
ATGGTGAAAAGTTTCCTGACTCTCTCCCTTCGCACACTTGGCCTCGTCCAAGCAGCAATCGCTGCTCCCTCTGCCCCGGTTCTCCCGCGGGCGAGTGGCTCTCTGGATCAATGGCTCGCAACGGAGACCCCTTACGCTCTCCAGGGTGTCCTGGACAACATCGGAGCTGATGGGGCCAAGGCAGCGGGCGCAAAATCCGGCGTTGTCATTGCGAGTCCGAGCAAAAGCAATCCTGACTACTTCTACACCTGGACCCGGGACGCCGCTCTCACCATCAAATGCCTGGTCGACGCCTTCATCGCCGGCAACACCGATCTGGAATCGGAGATCCGAAACTACATCAGCTCGCAAGCCTACCTGCAGACGGTGTCAAATCCTTCCGGTGGTCTCTCCACTGGGGGTCTCGGAGAGCCAAAGTTCAATGTCGACTTGACGCAGTTCACGGGCGCCTGGGGCCGTCCTCAACGGGACGGGCCGGCGTTGAGGGCCACGGCGATGATTGCCTATGCGAAGTGGCTTATTGCGAATGGACAATCAGACCTAGCGGACTCGATCGTGTGGCCAATTGTCCAAAACGATCTGTCATATGTGACGCAGTACTGGAACTCGACCGGATTTGACCTCTGGGAAGAAGTCCAAGGCTCCTCTTTCTTCACCACCGCCGTGCAGCACCGCGCCCTCGTGGAGGGCAACGCCCTCGCCCAGCAACTCGGCCACAGCTGCTCCAACTGCGTCTCCCAAGCGCCGCAGGTCCTCTGCTTCCTGCAGTCCTACTGGACGGGCTCGTACATCCTGGCCAACTTCGGCGGCGGCCGCACGGGCAAGGACACCAACACCATCCTGGGCAGCATCCACACGTTCGACCCCGAGGCCGGGTGCGACGACGCGACCTTCCAGCCCTGCTCGGCGCGGGCCCTGGCGAACCACAAGGCCGTGACGGACTCGTTCCGGTCCATCTACAGCATCAACTCGGGCATCGCGCAGGGACAGGCGGTCGCCGTGGGCCGGTACGCCGAGGACGTCTATCAGGGCGGGAATCCGTGGTACCTGTGCACGTTGGCCGCCGCGGAGCAGCTCTACGATGCGCTGTACCAGTGGGATCGGGCGGGCCAGCTCACCATCACGGACGTGAGCTTGCCTTTCTTCCGGGATGTCTATCCCTCTGCGGCCGTTGGGACGTATGCCTCCTCCTCCTCGACTTATCAAGACATCGTTGCGGCGGTAAAGGCGTACGCGGACGGATATATGAGCGTGGCGCAAAAATACACACCCTCCTCCGGCGCCCTCGCGGAGCAATTCTCCCGCAACGACGGCACCCCCCTCTCCGCCGCGGACCTGACCTGGTCCTACGCAGCTCTCTTGACCGCCGCCGCGCGTCGAAGCGCCGTCGTCCCCGCATCCTGGGATGCGCCGTCCGCCGACAGCGTGCCCGCCGTCTGCTCCGCGACCTCCGCCACGGGGCCCTACAGCACGGCCACGAACACCGTCTGGCCGGGCGAAGCGACCACAACCGCAACCGCGACGGCGACAAGTACACCATGCACGGCAGCGCCCACCGCCGTGGCAGTCACGTTCAACGAGCGCGTCACCACCGTCTGGGGCGAGAACGTCTTCCTCGTCGGCTCGATCTCCGCGCTCGGGTCGTGGGATACCAACTCTGCCGTCGCACTGAGCGCGGACCGGTACACGAGCAGCGATCCGCTGTGGTATGTGACGGTGTCGCTGCCGGCGGGGACGAGCTTCGAGTACAAGTATATCAAGAAGGAGACCGACGGAAGCGTGGTGTGGGAGAGTGATCCGAATCGGTCGTATACGGTGCCGAAGGCCTGTGGGGTGACGACGGCGACGGTGAACGATAGCTGGAGATGA。
其中，信号肽的碱基序列为：“ATGGTGAAAAGTTTCCTGACTCTCTCCCTTCGCACACTTGGCCTCGTCCAAGCAGCAATCGCTGCTCCCTCTGCCCCGGTTCTCCCGCGG”。因此，成熟基因的编码序列如SEQID NO:5所示.
SEQ ID NO:5
GCGAGTGGCTCTCTGGATCAATGGCTCGCAACGGAGACCCCTTACGCTCTCCAGGGTGTCCTGGACAACATCGGAGCTGATGGGGCCAAGGCAGCGGGCGCAAAATCCGGCGTTGTCATTGCGAGTCCGAGCAAAAGCAATCCTGACTACTTCTACACCTGGACCCGGGACGCCGCTCTCACCATCAAATGCCTGGTCGACGCCTTCATCGCCGGCAACACCGATCTGGAATCGGAGATCCGAAACTACATCAGCTCGCAAGCCTACCTGCAGACGGTGTCAAATCCTTCCGGTGGTCTCTCCACTGGGGGTCTCGGAGAGCCAAAGTTCAATGTCGACTTGACGCAGTTCACGGGCGCCTGGGGCCGTCCTCAACGGGACGGGCCGGCGTTGAGGGCCACGGCGATGATTGCCTATGCGAAGTGGCTTATTGCGAATGGACAATCAGACCTAGCGGACTCGATCGTGTGGCCAATTGTCCAAAACGATCTGTCATATGTGACGCAGTACTGGAACTCGACCGGATTTGACCTCTGGGAAGAAGTCCAAGGCTCCTCTTTCTTCACCACCGCCGTGCAGCACCGCGCCCTCGTGGAGGGCAACGCCCTCGCCCAGCAACTCGGCCACAGCTGCTCCAACTGCGTCTCCCAAGCGCCGCAGGTCCTCTGCTTCCTGCAGTCCTACTGGACGGGCTCGTACATCCTGGCCAACTTCGGCGGCGGCCGCACGGGCAAGGACACCAACACCATCCTGGGCAGCATCCACACGTTCGACCCCGAGGCCGGGTGCGACGACGCGACCTTCCAGCCCTGCTCGGCGCGGGCCCTGGCGAACCACAAGGCCGTGACGGACTCGTTCCGGTCCATCTACAGCATCAACTCGGGCATCGCGCAGGGACAGGCGGTCGCCGTGGGCCGGTACGCCGAGGACGTCTATCAGGGCGGGAATCCGTGGTACCTGTGCACGTTGGCCGCCGCGGAGCAGCTCTACGATGCGCTGTACCAGTGGGATCGGGCGGGCCAGCTCACCATCACGGACGTGAGCTTGCCTTTCTTCCGGGATGTCTATCCCTCTGCGGCCGTTGGGACGTATGCCTCCTCCTCCTCGACTTATCAAGACATCGTTGCGGCGGTAAAGGCGTACGCGGACGGATATATGAGCGTGGCGCAAAAATACACACCCTCCTCCGGCGCCCTCGCGGAGCAATTCTCCCGCAACGACGGCACCCCCCTCTCCGCCGCGGACCTGACCTGGTCCTACGCAGCTCTCTTGACCGCCGCCGCGCGTCGAAGCGCCGTCGTCCCCGCATCCTGGGATGCGCCGTCCGCCGACAGCGTGCCCGCCGTCTGCTCCGCGACCTCCGCCACGGGGCCCTACAGCACGGCCACGAACACCGTCTGGCCGGGCGAAGCGACCACAACCGCAACCGCGACGGCGACAAGTACACCATGCACGGCAGCGCCCACCGCCGTGGCAGTCACGTTCAACGAGCGCGTCACCACCGTCTGGGGCGAGAACGTCTTCCTCGTCGGCTCGATCTCCGCGCTCGGGTCGTGGGATACCAACTCTGCCGTCGCACTGAGCGCGGACCGGTACACGAGCAGCGATCCGCTGTGGTATGTGACGGTGTCGCTGCCGGCGGGGACGAGCTTCGAGTACAAGTATATCAAGAAGGAGACCGACGGAAGCGTGGTGTGGGAGAGTGATCCGAATCGGTCGTATACGGTGCCGAAGGCCTGTGGGGTGACGACGGCGACGGTGAACGATAGCTGGAGATGA。
本发明还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶基因Taga58040的重组载体，优选为SESA-Taga58040。将本发明的葡萄糖淀粉酶基因Taga58040插入到表达载体启动子下游之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将葡萄糖淀粉酶基因插入到质粒SESA，使该核苷酸序列位于启动子An_201cp下游并受其调控，得到重组丝状真菌表达质粒SESA-Taga58040。
本发明还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶基因的重组菌株，优选为重组菌株Δalp1/TaGA58040。
根据本发明的制备葡萄糖淀粉酶TaGA58040的方法，包括以下步骤：
用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
培养重组菌株，组成型表达重组葡萄糖淀粉酶TaGA58040；
回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶。
其中，优选所述宿主细胞为嗜热毁丝霉细胞或异宗毁丝霉细胞，优选将重组丝状真菌表达质粒转化嗜热毁丝霉细胞Δalp1，得到重组菌株Δalp1/TaGA58040。本发明提供了上述葡萄糖淀粉酶TaGA58040的应用，运用基因工程手段来产业化生产葡萄糖淀粉酶，可作应用于饲料、食品、医药等行业。
本发明的葡萄糖淀粉酶TaGA58040属于糖苷水解酶第15家族，与现有已公开的葡萄糖淀粉酶序列最高一致性为79％，其最适pH为5.0，在pH 3.0-6.0范围内，该酶能够维持其95％以上的酶活力；其最适温度为60℃，在60℃下处理60min，酶活仍能保持90％以上，相对于现有序列一致性较高的葡萄糖淀粉酶，具有较好的温度稳定性。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良、适合工业应用的葡萄糖淀粉酶。
附图说明
图1显示分离纯化后葡萄糖淀粉酶TaGA58040的SDS-PAGE结果；
图2显示葡萄糖淀粉酶TaGA58040的最适pH；
图3显示葡萄糖淀粉酶TaGA58040的pH稳定性情况；
图4显示葡萄糖淀粉酶TaGA58040的最适温度；
图5显示葡萄糖淀粉酶TaGA58040的温度稳定性情况。
具体实施方式
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
本发明中基因过表达载体构建采用高保真DNA聚合酶2xPhantaMax Master Mix，Trans1-T1克隆感受态细胞、pEASY-Blunt Cloning Kit和pEASY-Uni Seamless CloningandAssembly Kit试剂盒。嗜热毁丝霉ATCC 42464购自美国菌种保藏中心。
STC溶液：50mM氯化钙，1M山梨醇，10mM Tris-HCl pH 7.5；
PEG溶液：25％PEG 6000，50mM氯化钙，10mM Tris-HCl pH 7.5；
上层培养基：2％蔗糖，20mL/L 50×Vogel’s盐溶液，1M山梨醇，0.75％琼脂糖；
下层培养基：2％蔗糖，20mL/L 50×Vogel’s盐溶液，1M山梨醇，1.5％琼脂；
菌丝体裂解液：0.05M氢氧化钠,1mM乙二胺四乙酸,1％曲拉通X-100；
发酵培养基：40g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，0.15g/L磷酸二氢钾，0.15g/L磷酸氢二钾，0.10g/L七水合硫酸镁，0.10g/L氯化钙，0.1mg/L生物素，1mL/L50×Vogel’s盐溶液。
实施例1葡萄糖淀粉酶编码基因Taga58040的克隆
以嗜热蓝状菌Talaromyces sp.GY1的cDNA为模板，设计引物SESA-Taga58040-F(SEQ ID NO:6)和SESA-Taga58040-R(SEQ ID NO:7)进行PCR扩增，PCR反应参数为：98℃5min；95℃30sec,50℃30sec,72℃2min,30个循环；72℃10min。得到约1800bp的基因片段Taga58040，将该片段回收后测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
SEQ ID NO:6
5′-TCGCCACGGGCGCCGTGGCTGCGAGTGGCTCTCTGGATCAATG-3′；
SEQ ID NO:7
5′-ATAAGAAATTCGGATCCTCATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCTCCAGCTATCGTTCACCGTC-3′。
实施例2葡萄糖淀粉酶TaGA58040工程菌株的构建
2.1表达载体的构建
设计引物Vec-F(SEQ ID NO:8)和Vec-R(SEQ ID NO:9)，以质粒pEASY-Blunt-SESA为模板，采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增产物Vec经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收。然后，利用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit试剂盒对扩增产物Taga58040和Vec进行无缝拼接，拼接产物转化至大肠杆菌克隆感受态细胞Trans1-T1，挑取阳性克隆进行测序验证，得到嗜热毁丝霉重组表达质粒SESA-Taga58040。
SEQ ID NO:8
5′-TGAGGATCCGAATTTCTTATGATTTATG-3′；
SEQ ID NO:9
5′-AGCCACGGCGCCCGTGGCGAAGAC-3′。
2.2表达载体的转化
将嗜热毁丝霉孢子悬液涂布在铺有玻璃纸的马铃薯葡萄糖琼脂平板，37℃培养15小时后收集菌丝体。然后，使用0.5％溶壁酶消化菌丝体细胞壁，30℃消化2小时后双层擦镜纸过滤离心收集原生质体。用预冷STC溶液洗涤并重悬原生质体，将原生质体浓度调整为5x107个/mL，即得到原生质体悬液。取200μL原生质体悬液加入10μL过表达载体SESA-Taga58040和50μL PEG溶液，轻轻混匀，冰浴20分钟。然后，再加入2mL PEG溶液，室温放置5分钟。加入4mL STC溶液，与含100μg/mL遗传霉素的上层培养基混匀后，倾倒于含100μg/mL遗传霉素的下层培养基上，37℃培养3天后长出嗜热毁丝霉转化子。
2.3筛选高表达转化子
从平板上将具有遗传霉素抗性的转化子转接至PDA平板上，45℃恒温培养箱中培养3天后，采用菌丝体裂解液提取基因组，进行PCR验证，部分转化子扩增出大小约2.0kb的目的条带，野生型菌株无相应条带，表明已成功获得含有Taga58040基因表达盒的重组嗜热毁丝霉表达菌株。随机选取重组嗜热毁丝霉表达菌株，按106个/mL孢子悬液浓度接种发酵培养基，并对发酵液上清蛋白进行SDS-PAGE分析，相比于野生型菌株，重组TaGA58040嗜热毁丝霉表达菌株检测到目的条带，进而从中筛选出葡萄糖淀粉酶高表达的转化子。
实施例3葡萄糖淀粉酶TaGA58040性质分析
3.1重组葡萄糖淀粉酶TaGA58040的制备
将葡萄糖淀粉酶高表达的转化子按106个/mL孢子悬液浓度接种发酵培养基，收集第3天摇瓶表达的重组葡萄糖淀粉酶TaGA58040上清液，先通过10kDa膜包进行浓缩，同时用缓冲液(20mMpH 7.4Na2HPO4-NaH2PO4，500mM NaCl)置换其中的培养基，然后用镍亲和层析柱进行纯化，收集电泳纯的洗脱组分并透析至蛋白储存液中。图1显示分离纯化后葡萄糖淀粉酶TaGA58040的SDS-PAGE结果。
3.2重组葡萄糖淀粉酶TaGA58040性质分析
采用DNS法对本发明的葡萄糖淀粉酶TaGA58040进行活性分析。具体方法如下：在pH 5.0，60℃条件下，200μL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，100μL可溶性淀粉，反应30min，加入300μL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。葡萄糖淀粉酶活性单位定义：在60℃pH 5.0条件下，每分钟内催化水解底物释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。
(1)葡萄糖淀粉酶TaGA58040的最适pH及pH稳定性
所用缓冲液为pH 3.0～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液，将经纯化的葡萄糖淀粉酶TaGA58040在上述不同的pH下的缓冲液中进行酶促反应，以测定其最适pH。
如图2所示，在温度为30℃下，葡萄糖淀粉酶TaGA58040的最适pH为5.0，在pH 3.0-6.0范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力。
将葡萄糖淀粉酶TaGA58040酶液混在不同pH值的缓冲液，于30℃下处理60min，再测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。
如图3所示，葡萄糖淀粉酶TaGA58040在pH 3.0-6.0之间能够维持95％以上的酶活力，说明该酶具有优良的pH稳定性。
(2)葡萄糖淀粉酶TaGA58040的最适温度及温度稳定性
在pH 5.0条件下，于不同温度(30-80℃)测定纯化的葡萄糖淀粉酶TaGA58040酶活性。
如图4所示，葡萄糖淀粉酶TaGA58040的最适反应温度为60℃，在70℃时依然具有60％的酶活力。
在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定，以测定葡萄糖淀粉酶TaGA58040的热稳定性。
如图5所示，葡萄糖淀粉酶TaGA58040在60℃下处理60min，酶活仍能保持90％以上，具有较好的温度稳定性。
(3)葡萄糖淀粉酶TaGA58040的比活力
以0.5％淀粉为底物，在pH 5.0的0.1mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液体系中，60℃下测定酶活性，反应时间30分钟，测定葡萄糖淀粉酶TaGA58040的比活力。经测定，葡萄糖淀粉酶TaGA58040的比活力为811U/mg。
以上实施例仅用于理解本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

Claims (9)

1.葡萄糖淀粉酶TaGA58040，其特征在于，所述葡萄糖淀粉酶TaGA58040的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.葡萄糖淀粉酶基因，其特征在于，所述葡萄糖淀粉酶基因编码权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶TaGA58040。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖淀粉酶基因，其特征在于，葡萄糖淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
4.包括权利要求2所述葡萄糖淀粉酶基因的重组表达载体。
5.包括权利要求2所述葡萄糖淀粉酶基因的重组菌株。
6.权利要求1所述葡萄糖淀粉酶TaGA58040的应用。
7.权利要求1所述葡萄糖淀粉酶TaGA58040用于水解淀粉的应用。
8.一种制备热稳定的葡萄糖淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
用权利要求4所述重组表达载体转化宿主，获得重组菌株；
培养所述重组菌株，组成型表达重组葡萄糖淀粉酶；
回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶。
9.根据权利要求8所述的制备热稳定的葡萄糖淀粉酶的方法，其特征在于，所述宿主为嗜热毁丝霉细胞。
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