CN118703371B

CN118703371B - 一种高效处理高盐医药化工废水的复合菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN118703371B
Application number: CN202410843780.XA
Authority: CN
Inventors: 王白杨; 王双硕; 王筱兰; 杨林; 叶桦清
Original assignee: Jiangxi Wobangxing Environmental Protection Technology Co ltd
Current assignee: Jiangxi Wobangxing Environmental Protection Technology Co ltd
Priority date: 2024-06-27
Filing date: 2024-06-27
Publication date: 2025-05-09
Anticipated expiration: 2044-06-27
Also published as: CN120249118A; CN118703371A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有较强降低COD浓度能力的耐盐耐高温菌株PWBX2401和另一种具有较强除氮能力的耐盐耐高温菌株BWBX2402及包含两种菌株的复合菌剂、复合菌剂的制备方法和应用。其中，菌株PWBX2401的保藏编号为：GDMCC No:64263，菌株BWBX2402的保藏编号为：GDMCC No:64264。本发明研究表明，菌株PWBX2401和菌株BWBX2402的菌液按体积比1:2混合制得的复合菌剂可以更加高效处理高盐医药化工废水，在处理高盐废水的过程中，这两种菌能够产生协同作用，高效去除高盐废水中的COD、TN、NH₃‑N。

Description

一种高效处理高盐医药化工废水的复合菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及两株高效处理高盐医药化工废水的耐盐耐高温菌株及其复合菌剂、制备方法和应用。

背景技术

随着现代医药化工产业的快速发展，医药化工废水的排放量持续上升。医药化工产品的生产过程中，会产生大量废水，其成分复杂，含有大量有毒物质。如未经适当处理而直接排入自然水体，将对环境造成严重的负面影响。因此，必须对医药化工废水进行严格的处理，确保其达到规定的排放标准。生物处理法在各行业中得到了广泛应用。然而，对于一般的生物处理工艺而言，高盐、高温环境都会抑制许多微生物的代谢功能，从而降低对污染物的去除效率。此外，在处理高盐废水的过程中，单一菌种往往面临一定的局限性，无法高效地处理所有污染物。因此，为了提高废水的处理效率，复合菌剂的研究具有很大的意义。

发明内容

针对现有技术中微生物法处理高盐度有机废水的不足，本发明提供了两株耐盐耐高温菌，采用了多菌复配的方法，制备得到耐盐耐高温的高效处理高盐医药化工废水的复合菌剂。通过将具有不同降解特性的菌种混合，可以充分利用各菌种的优势，弥补彼此的不足，从而达到更好的处理效果。利用本发明的菌株及复合菌剂能显著提高高盐有机废水的降解效率。

本发明的第一个目的是提供一株具有较强降低COD浓度能力的耐盐耐高温菌株PWBX2401，一株具有较强除氮能力的耐盐耐高温菌株BWBX2402。其中，菌株PWBX2401的保藏编号为：GDMCC No:64263，已于2024年1月10日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，分类名称为Stutzerimonas balearica。菌株BWBX2402的保藏编号为：GDMCC No:64264，已于2024年1月10日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，分类名称为Bacillus paralicheniformis。

本发明提供的菌株PWBX2401的菌落形态为：37℃在LB平板培养基上培养24h，菌落颜色为淡黄色，菌落呈圆形，直径约1mm，中间隆起，边缘平滑整齐，表面光滑有光泽，经过16S rDNA基因序列检测鉴定，序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供的菌株BWBX2402的菌落形态为：45℃在LB平板培养基上培养24h，菌落颜色为白色，直径约3mm，中间脐突状，边缘不规则，表面干燥不粘稠、无光泽，经过16S rDNA基因序列检测鉴定，序列如SEQ ID No.2所示。

上述菌株筛选培养使用的培养基为：

LB固体培养基：超纯水1L、蛋白胨10g·L^-1、酵母粉5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1、琼脂粉20g·L^-1。

本发明的第二个目的是提供耐盐耐高温菌株PWBX2401和菌株BWBX2402在高盐废水处理中的应用，包括菌株PWBX2401在去除高盐医药化工废水中的有机物的应用，包括菌株BWBX2402在高盐医药化工废水的除氮处理中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种复合菌剂，所述的复合菌剂包含由耐盐耐高温菌株PWBX2401和菌株BWBX2402组成的活性成分。其中，所述的复合菌剂中，菌株PWBX2401和菌株BWBX2402的菌液按体积比为1:1～1:3混合。优选地，复合菌剂中，菌株PWBX2401和菌株BWBX2402的菌液体积比为1:2。

上述复合菌剂的制备方法具体为：

将菌株PWBX2401和菌株BWBX2402分别接入LB液体培养基中，37℃，200r/min摇床震荡培养24h，得到种子菌液；再将两种菌株的种子菌液按体积比3％的接种量分别倒入两个发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，将培养至OD₆₀₀＝1的两种菌液按照1:2的体积比混合配置成复合菌剂，密封冷藏，得到复合菌剂。

上述菌株培养使用的培养基为：

LB液体培养基：超纯水1L、蛋白胨10g·L^-1、酵母粉5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1。

本发明的第四个目的是提供上述包含由菌株PWBX2401和菌株BWBX2402组成的活性成分的复合菌剂在处理高盐废水中的应用，能够有效降低高盐医药化工废水中有机物(COD)的浓度、总氮(TN)、氨氮(NH₃-N)。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的菌株在高盐环境下生存能力强，生长速度快，适应期短，稳定期长，能更好适应污水中的高盐环境。

(2)本发明提供的菌株PWBX2401在高温下可以有效降低高盐医药化工废水中COD的浓度，菌株BWBX2402则具有较强除氮能力。

(3)本发明提供的菌株PWBX2401和BWBX2402的菌液按体积比1:1～1:3混合制得的复合菌剂可以更加高效处理高盐医药化工废水，在处理高盐废水的过程中，实现更高效的去除污染物的效果。制备的复合菌剂不仅集合了单个菌株的功能，而且两种菌能够产生协同作用，高效去除高盐废水中的COD、TN、NH₃-N。

附图说明

图1为本发明的菌株PWBX2401的菌落形态图。

图2为本发明的菌株BWBX2402的菌落形态图。

图3为本发明的菌株PWBX2401的系统发育进化树。

图4为本发明的菌株BWBX2402的系统发育进化树。

图5为本发明实施例的筛选过程中不同菌在处理高盐医药化工废水的COD、TN、NH₃-N处理效果统计图。

图6为菌株PWBX2401和BWBX2402及其混合比例在高盐医药化工废水中COD、TN、NH₃-N处理效果统计图。

图7为在处理高盐医药化工废水时，添加复合菌剂后COD、TN、NH₃-N处理效果统计图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。

实施例1：菌株PWBX2401和菌株BWBX2402的分离、筛选和复合菌剂的复配

1、富集培养：

从江西沃邦兴科技环保有限公司医药化工污水处理系统好氧池取活性污泥样品，采用梯度稀释法将该样品稀释至10^-3，分别吸取10^-1、10^-2、10^-3稀释液各100μL至LB液体培养基，每个梯度涂布均匀后倒置于28℃、37℃、45℃条件下培养，约36h长出单菌落。

2、分离纯化：

每个温度下，在涂布板上挑选不同形态特征的单菌落接至LB液体培养基培养24h，重复划线三次以上，在显微镜下观察到形态单一的菌体则说明菌株已经分离纯化。

3、筛选：

将不同温度下纯化后的菌株以相同接种量(接种量3％)接种至实际高盐医药化工废水中，按规定周期(48h)培养后检测废水的COD、TN、NH₃-N，结果如图5所示。选取一株在高温下COD降解效率最高的菌株和一株在高温下除氮效果最好的菌株，分别命名为PWBX2401和BWBX2402，并转入LB斜面4℃冰箱保藏备用。

4、菌剂的复配：

将复筛得到的菌株PWBX2401和菌株BWBX2402分别用LB液体培养基在37℃，200r/min下培养24h，得到种子液。将菌株PWBX2401和菌株BWBX2402的种子液分别用无菌水稀释到OD₆₀₀＝1，按接种量1:0、0:1、1:1、1:2、1:3、2:1、3:1的比例分别混合后，按体积比为3％的接种量接种至高盐医药化工废水中，在摇床中45℃，200r/min条件下培养48h后取样测定COD、TN、NH₃-N检验处理效果，结果如图6所示。结果显示，菌株PWBX2401单独处理高盐医药化工废水时，COD、TN、NH₃-N去除率分别为90.85％、51.97％、69.55％，菌株BWBX2402单独处理高盐医药化工废水时，COD、TN、NH₃-N去除率分别为71.38％、80.77％、86.30％。菌株PWBX2401和菌株BWBX2402的混合比例为1:1时，COD、TN、NH₃-N去除率分别为90.08％、65.24％、72.20％；混合比例为1:2时，COD、TN、NH₃-N去除率分别为89.13％、80.56％、85.47％；混合比例为1:3时，76.51％、81.47％、86.84％；混合比例为2:1时，COD、TN、NH₃-N去除率分别为89.51％、48.97％、64.20％；混合比例为3:1时，COD、TN、NH₃-N去除率分别为89.63％、36.02％、44.18％。混合比例为1:2时，能够同时高效处理高盐医药化工废水中的COD、TN、NH₃-N，且去除效果最好。最终确定最优选为复合菌剂由两种菌液按1:2体积比混合配置而成。

实施例2：菌株PWBX2401和菌株BWBX2402的鉴定

1、菌落形态：

菌株PWBX2401的菌落形态为：37℃在LB平板培养基上培养24h，菌落颜色为淡黄色，菌落呈圆形，直径约1mm，中间隆起，边缘平滑整齐，表面光滑有光泽，如图1所示。

菌株BWBX2402的菌落形态为：45℃在LB平板培养基上培养24h，菌落颜色为白色，直径约3mm，中间脐突状，边缘不规则，表面干燥不粘稠、无光泽，如图2所示。

2、分子生物学鉴定：

(1)用接种环分别从菌株PWBX2401和菌株BWBX2402的斜面上挑适量菌体接种到LB液体培养基中，37℃、200r/min培养24h，取2～3mL发酵液，10000转离心1min收集菌体。

(2)用Solarbio公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，具体步骤参照试剂盒内说明书。

(3)将提到的总DNA分别进行PCR扩增，选用细菌通用引物27F和1492R进行扩增。PCR反应体系50μL：Premix rTaq 25μL；27F 1μL；1492R 1μL；模板1μL；ddH₂O₂ 2μL。热循参数95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，72℃延伸5min。以1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物结果，后将产物送至上海生工进行测序。

(4)扩增获得的序列经测序，菌株PWBX2401的16S rDNA序列长度为1435bp，序列如SEQ ID No.1所示，菌株BWBX2402的16S rDNA序列长度为1332bp，序列如SEQ IDNo.2所示。将测序获得的基因序列提交到NCBI，利用Blast进行同源性比较。利用MEGA 6.0软件进行多序列比对分析，并用Neighbor-Joining法构建系统发育树。结果显示菌株PWBX2401与Stutzerimonas balearica(NR_025972.1)同源性达99％以上，菌株BWBX2402与Bacillusparalicheniformis(NR_137421.1)同源性达100％，综合菌株PWBX2401和菌株BWBX2402的形态学特征、生理生化特征及同源性和系统发育分析，将菌株PWBX2401鉴定为Stutzerimonas balearica，其系统发育进化树如图3所示，菌株BWBX2402鉴定为Bacillusparalicheniformis，其系统发育进化树如图4所示。

菌株PWBX2401于2024年1月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所微生物菌种保藏中心，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No:64263。

菌株BWBX2402于2024年1月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所微生物菌种保藏中心，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No:64264。

菌株PWBX2401的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)为：

GAGTGGCGGCAGCTACCATGCAGTCGAGCGGCAGCGGGTCCTTCGGGATGCCGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACTCGGGGAAACTCGAGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTACCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTGGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGATAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATCCAAAACTGTCTGACTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTAAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTACCACGACGATCAA

菌株BWBX2402的16S rDNA序列(SEQ ID NO.2)为：

CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATTATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAG

实施例3：复合菌剂的制备

将菌株PWBX2401和菌株BWBX2402分别接入LB液体培养基中，37℃，200r/min摇床震荡培养24h，得到种子菌液。再将两种菌株的种子菌液按体积比3％的接种量分别倒入两个发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，将培养至OD₆₀₀＝1的两种菌液按照1:2的体积比混合配置成复合菌剂，密封冷藏，得到复合菌剂。所述发酵培养基按照以下比例配置：超纯水1L、蛋白胨10g·L^-1、酵母粉5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1，pH控制在6.5-7.5，将各成分混合均匀，121℃高温灭菌20min。

实施例4：复合菌剂性能检测

江西华邦药业有限公司以抗生素系列原料药、医药中间体为主导产品，目前主要产品包括美罗培南MAP，美罗培南侧链，美罗培南粗品，舒巴坦酸，他唑巴坦酸，他唑巴坦酸等，生产过程中产生大量的生产废水。废水中含有大量有机污染物及有毒有害物质，该医药化工废水初始COD值等一些参数见表1。

表1华邦废水的初始参数

名称	pH	盐度(mg/L)	COD(mg/L)	TN(mg/L)	NH₃-N(mg/L)
						华邦废水	6.5	18060	18000	780	260

将复合菌剂按接种量3％接种至含20ml高盐废水的50ml锥形瓶中，本实施例中选取的是稀释10^-3的华邦高盐医药化工废水，在摇床中45℃、200r/min条件下培养48h后取样测定COD、TN、NH₃-N检验处理效果，结果如图7所示。

由图7可知，菌株PWBX2401单独处理高盐医药化工废水时，COD、TN、NH₃-N去除率分别为91.37％、55.14％、68.21％，菌株BWBX2402单独处理高盐医药化工废水中时，COD、TN、NH₃-N去除率分别为68.83％、83.28％、88.42％。复合菌剂在处理盐度为6020mg/L的华邦高盐医药化工废水，混合比例为1:2时，COD、TN、NH₃-N去除率分别为89.25％、80.52％、84.17％，混合比例为1:3时，COD、TN、NH₃-N去除率分别为79.27％、81.47％、85.37％。结果表明，单一菌株PWBX2401和菌株BWBX2402处理废水中的某些污染物质会存在偏好性(COD或氮)，而复合菌剂可以更高效的兼顾高盐废水中COD、TN、NH₃-N的处理。本发明提供的菌株相较于真菌能在高盐环境下生存，生长速度快，适应期短，稳定期长，能更好适应污水中的高盐环境。该复合菌剂能耐受高盐环境，在处理高浓度有机污染物及有毒有害物质时，该复合菌剂的COD、TN、NH₃-N去除效果都比较理想，可用于高浓度医药化工废水处理。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一种具有除氮能力的耐盐耐高温菌株BWBX2402，其特征在于，菌株BWBX2402的分类名称为Bacillus paralicheniformis，保藏编号为：GDMCC No: 64264。

2. 一种复合菌剂，其特征在于，包含耐盐耐高温菌株PWBX2401和菌株BWBX2402作为活性成分；菌株PWBX2401的分类名称为Stutzerimonas balearica，菌株PWBX2401的保藏编号为：GDMCC No: 64263；菌株BWBX2402的分类名称为Bacillus paralicheniformis，菌株BWBX2402的保藏编号为：GDMCC No: 64264。

3.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于，所述的复合菌剂中，菌株PWBX2401的菌液和菌株BWBX2402的菌液的体积比为1:1~1:3。

4.根据权利要求3所述的复合菌剂，其特征在于，所述的复合菌剂中，菌株PWBX2401的菌液和菌株BWBX2402的菌液的体积比为1:2。

5.一种制备权利要求4所述的复合菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将菌株PWBX2401和菌株BWBX2402分别接入LB液体培养基中，37℃，200 r/min摇床震荡培养24 h，得到种子菌液；再将两种菌株的种子菌液按体积比3%的接种量分别倒入两个发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，将培养至OD₆₀₀=1的两种菌液按照1:2的体积比混合配置成复合菌剂，密封冷藏，得到复合菌剂。

6.根据权利要求1所述的菌株BWBX2402在处理废水中的COD、总氮、NH₃-N中的应用。

7.根据权利要求2~4中任意一项所述的复合菌剂在处理废水中的COD、总氮、NH₃-N中的应用。