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CN118679180A - 包含d结构域的多肽及其用途 - Google Patents

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CN118679180A
CN118679180A CN202280088084.1A CN202280088084A CN118679180A CN 118679180 A CN118679180 A CN 118679180A CN 202280088084 A CN202280088084 A CN 202280088084A CN 118679180 A CN118679180 A CN 118679180A
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cell
car
ddpp
seq
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CN202280088084.1A
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D·拉弗勒
J·S·斯威斯
J·爱德华斯
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Arcellx Inc
Original Assignee
Arcellx Inc
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Abstract

本文提供了特异性结合感兴趣的靶标的包含D结构域的多肽，以及编码包含D结构域的多肽的核酸、含有核酸的载体和含有核酸和载体的宿主细胞。本文还提供了制造和使用包含D结构域的多肽、核酸、载体和宿主细胞用于例如但不限于诊断和治疗应用的方法。本文还提供了基于多功能嵌合抗原受体(CAR)的组合物和衔接子及其在将免疫应答引导至靶细胞的方法中的用途。在一些实施方案中，该方法包括与衔接子组合使用表达CAR的细胞。衔接子赋予在体外和体内调节、改变和/或引导表达CAR的细胞介导的免疫应答的能力。

Description

包含D结构域的多肽及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年11月15日提交的美国申请号63/279,489的权益，该申请通过引用整体并入本文。
以电子方式提交的序列表的引用
与本申请一起提交的以电子方式提交的序列表(名称：6666_0301_Sequence_Listing.xml；大小：163,868字节；创建日期：2022年11月6日)的内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明的领域一般涉及包含D结构域的多肽，包括包含D结构域的多功能嵌合抗原受体和衔接子，以及它们在治疗方法中的用途，例如，通过将免疫应答引导至靶细胞。
背景技术
遗传修饰的T细胞的过继转移是一种快速发展的癌症创新治疗方法。嵌合抗原受体(CAR)工程化T细胞是可再生药物，具有提供持续功能性免疫的能力。已证明CD19 CAR T在一系列血液癌症中具有临床疗效，并且已报道其他遗传修饰的CAR T在实体瘤中的令人鼓舞的早期临床数据。然而，在CAR技术能够更充分地发挥其巨大潜力之前，必须应对重大挑战。
发明内容
在一个方面，本文提供了包含D结构域(DD)靶结合结构域(DDpp)的蛋白质，其中DD特异性结合感兴趣的靶标。在一些实施方案中，感兴趣的靶标是人CD123(SEQ ID NO：1)或其片段。在一些实施方案中，DDpp是单价或多价的。在一些实施方案中，DDpp是单特异性或多特异性的。在进一步的实施方案中，DDpp是单特异性和多价的。在其他实施方案中，DDpp是多特异性和多价的。还提供了包含一个或多个DD的融合蛋白，以及制造和使用融合蛋白的方法。还提供了编码DDpp的核酸以及含有核酸的载体和宿主细胞。此类用途的非限制性实例包括但不限于靶标分析以及诊断和治疗应用。在一些实施方案中，DDpp包含CD123结合DD，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含DD，所述DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含DD，所述DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一个方面，本公开内容提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含靶结合结构域，所述靶结合结构域包含所公开的DD。在一些实施方案中，DD结合CD123并包含选自SEQ IDNO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，DD结合AFP p26(SEQ ID NO：37)并包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR还包含具有与DD靶结合结构域相同或不同的靶标的第二靶结合结构域。在一些实施方案中，CAR在免疫细胞中表达。在一些实施方案中，CAR在免疫效应细胞中表达。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是自体T细胞(CAR-T细胞)或自体自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体T细胞(CAR-T细胞)或同种异体自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，CAR在源自人胚胎干细胞(CAR-hESC)或诱导多能干细胞(CAR-iPSC细胞)的免疫细胞中表达。
还提供了编码所公开的DDpp(例如，DDpp融合蛋白、CAR或衔接子)的核酸。另外还提供了含有编码DDpp(例如，DDpp融合蛋白、CAR或衔接子)的核酸的载体(例如，质粒、病毒载体和非病毒载体)以及含有核酸和载体的宿主细胞。在一些实施方案中，载体包含调节核酸分子编码的多肽的表达的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，载体包含可诱导的启动子序列。在另外的实施方案中，载体包括用于表达编码蛋白质的核酸的一个或多个额外的标准组分(例如，启动子、包装组分等)。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体。
在一个方面，本公开内容还提供了包含编码本文公开的靶结合DDpp的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞(例如，细胞系的细胞)被工程化以表达含有本文公开的DD(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：8-33的DD)的蛋白质。在一些实施方案中，宿主细胞的DDpp(例如，DDpp融合蛋白或衔接子)的表达允许产生和分离DDpp。在一些实施方案中，表达导致DDpp(例如，CAR)在宿主细胞的表面表达和/或整合到宿主细胞的膜上。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌、酵母、真菌或植物细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在进一步的实施方案中，哺乳动物细胞是免疫细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是人免疫细胞。在一些实施方案中，人免疫细胞是T细胞。在其他实施方案中，人免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，人免疫细胞在其细胞表面上展示DDpp(例如，CAR)。
在一个方面，本公开内容还提供了表达包含本文公开的DD的蛋白质的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞表达包含本文公开的DD的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR包含靶结合结构域和跨膜结构域，该靶结合结构域包含含有选自SEQ ID NO：8-33的氨基酸序列的DD。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR还包含细胞内结构域(包含信号传导结构域)。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，CAR免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，CAR免疫效应细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是免疫效应细胞，其还包含第二CAR多肽，该第二CAR多肽具有DD或其他结合结构域(例如，scFv)，其特异性结合与宿主免疫细胞表达的第一CAR相同或不同的靶标(例如，癌细胞表达的相同靶标的不同表位或第二感兴趣的靶标)。
还提供了包含含有本文公开的DD的蛋白质、本文公开的编码蛋白质的核酸、本文公开的含有核酸的载体、编码蛋白质的病毒和本文公开的含有核酸和/或载体的宿主细胞的药物组合物。还提供了含有一种或多种所公开的靶结合DDpp(例如，DDpp融合蛋白，例如DD-Fc和DD-CAR，或衔接子)、核酸分子、载体和宿主细胞的试剂盒(例如，治疗试剂盒、诊断试剂盒、研究用试剂盒等)。
本文提供的DDpp具有的活性包括但不限于在体外或体内特异性结合感兴趣的靶标(例如，CD123)的能力以及用作用于将蛋白质(例如，DDpp融合蛋白)和一个或多个附加部分(例如，固体支持物)和/或其他修饰的反应位点连接或缔合的能力。本文提供的DDpp还可以具有在制造、配制和生物、诊断和治疗应用中有用的其他所需特性和/或功能。
还提供了在诊断和治疗应用中使用DDpp的方法。在一个实施方案中，本公开内容提供了一种治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的DDpp(例如，DDpp融合蛋白、CAR和/或衔接子)，所述DDpp特异性结合感兴趣的治疗靶标(例如，CD123)。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症、B细胞恶性肿瘤、免疫系统疾病或病症或感染。还提供了治疗疾病或病症的方法，所述方法包括与公开的DDpp共同施用额外的治疗剂。在一些实施方案中，疾病或病症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是急性髓系白血病。
在一些实施方案中，本公开内容提供：
[1.]包含特异性结合CD123并包含氨基酸序列SEQ ID NO：8-32或33的D结构域靶结合结构域的蛋白质。
[2.][1]的蛋白质，其中D结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：8、13、14或31-33。
[3.][1]的蛋白质，其中D结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：14。
[4.][1]至[3]中任一项的蛋白质，其中D结构域与异源多肽融合。
[5.][4]的蛋白质，其中异源多肽包括全长抗体或抗体片段。
[6.][4]的蛋白质，其中D结构域与全长抗体重链的氨基末端融合；与全长抗体轻链的氨基末端融合；与全长抗体重链的羧基末端融合；或与全长抗体轻链的羧基末端融合。
[7.][4]的蛋白质，其中异源多肽是Fc结构域。
[8.][4]的蛋白质，其中异源多肽包括选自以下的成员：
(a)跨膜结构域；
(b)膜缔合结构域；
(c)人血清白蛋白或其片段；
(d)AFP或其片段；
(e)AFP p26或其片段；和
(f)受体的细胞外结构域或其片段。
[9.][4]的蛋白质，其中异源多肽包含选自以下的受体的细胞外结构域或细胞外结构域的片段：BCMA、CD123、CS1和CD19。
[10.][2]至[9]中任一项的蛋白质，还包含肽接头。
[11.][1]至[10]中任一项的蛋白质，其被标记。
[12.][11]的蛋白质，其中标记选自酶标记、荧光标记、发光标记、生物发光标记和生物素部分。
[13.][1]至[12]中任一项的蛋白质，其与治疗剂或细胞毒性剂缀合。
[14.]嵌合抗原受体(CAR)，其包含靶结合结构域，所述靶结合结构域包含[1]至[3]中任一项的蛋白质。
[15.][14]的CAR，其包含靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
[16.][14]或[15]的CAR，其中跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28跨膜结构域。
[17.][14]至[16]中任一项的CAR，其中细胞内信号传导结构域选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合。
[18.][14]至[17]中任一项的CAR，其中细胞内信号传导结构域包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其任意组合。
[19.][14]至[18]中任一项的CAR，其还包含肽接头。
[20.][14]的CAR，其包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。
[21.][14]的CAR，其包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。
[22.][1]至[13]中任一项的蛋白质或[14]至[21]中任一项的CAR，其还包含具有与D结构域靶结合结构域相同或不同的靶标的第二靶结合结构域。
[23.]衔接子，其包含(a)特异性结合CD123并包含SEQ ID NO：8-32或33的氨基酸序列的D结构域靶结合结构域，和(b)抗原决定簇(AD)。
[24.][23]的衔接子，其中D结构域包含SEQ ID NO：8、13、14或31-33的氨基酸序列。
[25.][23]的衔接子，其中D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
[26.][23]至[25]中任一项的衔接子，其中AD包含AFP p26或其片段。
[27.][26]的衔接子，其中AFP p26包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。
[28.][26]的衔接子，其中AFP p26包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
[29.][26]的衔接子，其中AFP p26包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
[30.][23]至[25]中任一项的衔接子，其中AD包含BCMA(SEQ ID NO：34)或其片段。
[31.][23]至[30]中任一项的衔接子，其还包含肽接头。
[32.][23]至[31]中任一项的衔接子，其中衔接子包含特异性结合CD123的单个D结构域。
[33.][32]的衔接子，其包含SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列。
[34.][32]的衔接子，其包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。
[35.][23]至[31]中任一项的衔接子，其中所述衔接子包含两个特异性结合CD123的D结构域。
[36.][35]的衔接子，其包含SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列。
[37.][35]的衔接子，其包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列。
[38.]编码[1]至[10]或[22]中任一项的蛋白质或[23]至[37]中任一项的衔接子的分离的多核苷酸。
[39.]包含[38]的多核苷酸的载体。
[40.][39]的载体，其中多核苷酸与调节由该多核苷酸编码的蛋白质的表达的核苷酸序列可操作地连接。
[41.]包含[38]的多核苷酸或[39]或[40]的载体的宿主细胞。
[42.]产生[1或10或22]中任一项的蛋白质或[23]至[37]中任一项的衔接子的方法，其包括在合适的条件下培养[41]的宿主细胞以产生蛋白质或衔接子。
[43.]编码[14]至[22]中任一项的CAR的分离的多核苷酸。
[44.]包含[43]的多核苷酸的载体。
[45.][44]的载体，其中多核苷酸与调节由该多核苷酸编码的蛋白质的表达的核苷酸序列可操作地连接。
[46.][45]的载体，其为慢病毒载体。
[47.]包含[43]的多核苷酸或[44]至[46]中任一项的载体的宿主细胞。
[48.]经工程化以表达[14]至[22]中任一项的CAR的细胞。
[49.][47]或[48]的细胞，其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
[50.]包含[1]至[13]或[22]中任一项的蛋白质和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[51.]包含[44]的载体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[52.][51]的药物组合物，其中所述载体是慢病毒载体。
[53.]包含表达[14]至[22]中任一项的CAR的细胞和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[54.][53]的药物组合物，其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
[55.]包含[23]至[37]中任一项的衔接子的试剂盒。
[56.]包含[44]的载体的试剂盒。
[57.]包含表达[14]至[22]中任一项的CAR的细胞的试剂盒。
[58.][57]的试剂盒，其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
[59.]一种递送针对一种或多种靶细胞的免疫应答的方法，其包括将包含靶细胞的组合物与表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞接触，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[60.]一种杀死靶细胞的方法，其包括将包含靶细胞的组合物与表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞接触，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[61.][59]或[60]的方法，其中靶细胞表达CD123。
[62.][59]至[61]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含选自SEQ IDNO：8-32和338-33、99和100的氨基酸序列。
[63.][59]至[61]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含选自SEQ IDNO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。
[64.][59]至[61]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
[65.][59]至[64]中任一项的方法，其中跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28跨膜结构域。
[66.][59]至[65]中任一项的方法，其中细胞内信号传导结构域选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合。
[67.][59]至[66]中任一项的方法，其中细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其任意组合。
[68.][59]至[61]中任一项的方法，其中包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。
[69.][59]至[61]中任一项的方法，其中包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。
[70.][59]至[61]中任一项的方法，其中表达CAR的细胞是免疫细胞。
[71.][70]的方法，其中表达CAR的细胞是免疫效应细胞。
[72.][70]的方法，其中表达CAR的细胞是T细胞。
[73.][70]的方法，其中表达CAR的细胞是自然杀伤(NK)细胞。
[74.][58]至[73]中任一项的方法，其中靶细胞是癌细胞。
[75.][74]的方法，其中靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞、骨髓增生异常细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞，优选急性髓系白血病(AML)细胞。
[76.][58]至[73]中任一项的方法，其中接触发生在人患者中。
[77.]一种递送针对靶细胞的免疫应答的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFPp26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。
[78.]一种递送针对靶细胞的免疫应答的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[79.]一种递送针对靶细胞的免疫应答的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)结合除CD123之外的抗原决定簇(AD)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD。
[80.]一种递送针对靶细胞的免疫应答的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)所述衔接子包含(i)结合靶AD的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)结合AFP p26抗原决定簇(AD)的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[81.]一种递送针对靶细胞的免疫应答的方法，其包括：将包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)所述CAR包含(i)结合AFP p26抗原决定簇(AD)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包括衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。
[82.]一种递送针对靶细胞的免疫应答的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)所述CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[83.]一种递送针对靶细胞的免疫应答的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)所述CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD。
[84.]一种递送针对靶细胞的免疫应答的方法，其包括：将包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[85.]一种杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。
[86.]一种杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[87.]一种杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD。
[88.]一种杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[89.]一种杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。
[90.]一种杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[91.]一种杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)所述CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD。
[92.]一种杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)所述CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[93.][77]至[79]、[81]至[83]、[85]至[87]或[89]至[91]中任一项的方法，其中靶细胞表达CD123。
[94.][80]、[84]、[88]或[92]中任一项的方法，其中靶细胞表达靶AD。
[95.][77]至[94]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含选自SEQ IDNO：8-32和338-33、99和100的氨基酸序列。
[96.][77]至[94]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含选自SEQ IDNO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。
[97.][77]至[94]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
[98.][77]至[97]中任一项的方法，其中跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28跨膜结构域。
[99.][77]至[98]中任一项的方法，其中细胞内信号传导结构域选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合。
[100.][77]至[99]中任一项的方法，其中细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其任意组合。
[101.][77]至[94]中任一项的方法，其中包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。
[102.][77]至[94]中任一项的方法，其中包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。
[103.][77]至[102]中任一项的方法，其中AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。
[104.][77]至[103]中任一项的方法，其中AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
[105.][77]至[103]中任一项的方法，其中AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
[106.][77]至[105]中任一项的方法，其中与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFPp26 AD结合的scFv。
[107.][77]至[105]中任一项的方法，其中与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFPp26 AD结合的D结构域。
[108.][107]的方法，其中与AFP p26 AD结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。
[109.][107]的方法，其中与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。
[110.][107]的方法，其中与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
[111.][107]的方法，其中包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ IDNO：68的氨基酸序列。
[112.][107]的方法，其中包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ IDNO：69的氨基酸序列。
[113.][77]至[112]中任一项的方法，其中CAR包含与除CD123之外的AD结合的ADBD，该ADBD与肿瘤抗原结合。
[114.][113]的方法，其中肿瘤抗原选自以下组：BCMA、CD19、CD22、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。
[115.][113]的方法，其中肿瘤抗原是BCMA。
[116.][113]的方法，其中肿瘤抗原是CD19。
[117.][113]的方法，其中肿瘤抗原选自以下组：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。
[118.][77]至[117]中任一项的方法，其中包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列。
[119.][77]至[117]中任一项的方法，其中包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。
[120.][77]至[117]中任一项的方法，其中包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列。
[121.][77]至[117]中任一项的方法，其中包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列。
[122.][77]至[121]中任一项的方法，其中靶AD选自：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。
[123.][77]至[121]中任一项的方法，其中靶AD选自：CD19、CD22、CD123、BCMA、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。
[124.][77]至[121]中任一项的方法，其中靶AD为BCMA。
[125.][77]至[121]中任一项的方法，其中靶AD为CD19。
[126.][77]至[125]中任一项的方法，其中表达CAR的细胞是免疫细胞。
[127.][126]的方法，其中表达CAR的细胞是免疫效应细胞。
[128.][126]的方法，其中表达CAR的细胞是T细胞。
[129.][126]的方法，其中表达CAR的细胞是自然杀伤(NK)细胞。
[130.][77]至[129]中任一项的方法，其中靶细胞是癌细胞。
[131.][130]的方法，其中靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞、骨髓增生异常细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。
[132.][130]的方法，其中靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞。
[133.][77]至[132]中任一项的方法，其中接触发生在人患者中。
[134.][133]的方法，其包括以任意顺序向人患者施用表达CAR的细胞和衔接子。
[135.][133]的方法，其包括向人患者施用衔接子，其中人患者已被施用表达CAR的细胞。
[136.][133]的方法，其包括向人患者施用衔接子，其中人患者包括表达CAR的细胞。
[137.]一种递送针对患者中的靶细胞的免疫应答的方法，其包括：向患者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[138.]一种杀死有需要的患者中的靶细胞的方法，其包括：向患者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[139.][137]或[138]的方法，其中靶细胞表达CD123。
[140.][137]至[139]中任一项的方法，其中靶细胞是癌细胞。
[141.][140]的方法，其中靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞、骨髓增生异常细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞，优选急性髓系白血病(AML)细胞。
[142.]一种耗竭有需要的患者中的淋巴细胞的方法，其包括：向患者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[143.][142]的方法，其中淋巴细胞表达CD123。
[144.][142]或[143]的方法，其中淋巴细胞是B淋巴细胞。
[145.]一种治疗癌症的方法，其包括：向有需要的患者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[146.][145]的方法，其中癌症是血液癌症。
[147.][146]的方法，其中血液癌症是急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、毛细胞白血病或骨髓增生异常。
[148.][146]的方法，其中血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。
[149.][146]的方法，其中血液癌症是AML。
[150.][146]的方法，其中血液癌症是BPDCN。
[151.]一种治疗自身免疫性疾病或病症的方法，其包括：向有需要的患者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[152.][146]的方法，其中自身免疫性疾病或病症是红斑狼疮。
[153.][137]至[152]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含选自SEQID NO：8-32和338-33、99和100的氨基酸序列。
[154.][137]至[152]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含选自SEQID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。
[155.][137]至[152]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列。
[156.][137]至[155]中任一项的方法，其中跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28跨膜结构域。
[157.][137]至[156]中任一项的方法，其中细胞内信号传导结构域选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合。
[158.][137]至[157]中任一项的方法，其中细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其任意组合。
[159.][137]至[152]中任一项的方法，其中包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。
[160.][137]至[152]中任一项的方法，其中包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。
[161.][137]至[160]中任一项的方法，其中表达CAR的细胞是免疫细胞。
[162.][161]的方法，其中表达CAR的细胞是免疫效应细胞。
[163.][161]的方法，其中表达CAR的细胞是T细胞。
[164.][161]的方法，其中表达CAR的细胞是自然杀伤(NK)细胞。
[165.][137]至[164]中任一项的方法，其中施用表达CAR的细胞包括施用包含表达CAR的细胞的药物组合物。
[166.]一种递送针对患者中的靶细胞的免疫应答的方法，其包括：向患者施用包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子。
[167.]一种杀死有需要的患者中的靶细胞的方法，其包括：向患者施用包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子。
[168.][166]或[167]的方法，其中靶细胞表达CD123。
[169.][166]至[168]中任一项的方法，其中靶细胞是癌细胞。
[170.][168]的方法，其中靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞、骨髓增生异常细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞，优选急性髓系白血病(AML)细胞。
[171.]一种耗竭有需要的患者中的淋巴细胞的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。
[172.][171]的方法，其中淋巴细胞表达CD123。
[173.][171]或[172]的方法，其中淋巴细胞是B淋巴细胞。
[174.]一种治疗癌症的方法，其包括：向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。
[175.][174]的方法，其中癌症是血液癌症。
[176.][175]的方法，其中血液癌症是急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、毛细胞白血病或骨髓增生异常。
[177.][175]的方法，其中血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。
[178.][175]的方法，其中血液癌症是AML。
[179.][175]的方法，其中血液癌症是BPDCN。
[180.]一种治疗自身免疫性疾病或病症的方法，其包括：向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD。
[181.][180]的方法，其中自身免疫性疾病或病症是红斑狼疮。
[182.][166]至[181]中任一项的方法，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[183.][166]至[181]中任一项的方法，其中患者包括表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[184.][166]至[181]中任一项的方法，还包括施用表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[185.]一种递送针对患者中的靶细胞的免疫应答的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[186.]一种杀死有需要的患者中的靶细胞的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)结合AFP p26抗原决定簇(AD)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[187.][185]或[186]的方法，其中靶细胞表达CD123。
[188.][185]至[187]中任一项的方法，其中靶细胞是癌细胞。
[189.][187]的方法，其中靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞、骨髓增生异常细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞，优选急性髓系白血病(AML)细胞。
[190.]一种耗竭有需要的患者中的淋巴细胞的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[191.][190]的方法，其中淋巴细胞表达CD123。
[192.][190]或[191]的方法，其中淋巴细胞是B淋巴细胞。
[193.]一种治疗癌症的方法，其包括：向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[194.][193]的方法，其中癌症是血液癌症。
[195.][194]的方法，其中血液癌症是急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、毛细胞白血病或骨髓增生异常。
[196.][194]的方法，其中血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。
[197.][194]的方法，其中血液癌症是AML。
[198.][194]的方法，其中血液癌症是BPDCN。
[199.]一种治疗自身免疫性疾病或病症的方法，其包括：向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[200.][199]的方法，其中自身免疫性疾病或病症是红斑狼疮。
[201.][185]至[200]中任一项的方法，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[202.][185]至[200]中任一项的方法，其中患者包含表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[203.][185]至[200]中任一项的方法，其还包括施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[204.]一种递送针对患者中的靶细胞的免疫应答的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[205.]一种杀死有需要的患者中的靶细胞的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[206.][204]或[205]的方法，其中靶细胞表达CD123。
[207.][204]至[206]中任一项的方法，其中靶细胞是癌细胞。
[208.][206]的方法，其中靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞、骨髓增生异常细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞，优选急性髓系白血病(AML)细胞。
[209.]一种耗竭需要的患者中的淋巴细胞的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[210.][209]的方法，其中淋巴细胞表达CD123。
[211.][209]或[210]的方法，其中淋巴细胞是B淋巴细胞。
[212.]一种治疗癌症的方法，其包括：向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[213.][212]的方法，其中癌症是血液癌症。
[214.][213]的方法，其中血液癌症是急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、毛细胞白血病或骨髓增生异常。
[215.][213]的方法，其中血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。
[216.][213]的方法，其中血液癌症是AML。
[217.][213]的方法，其中血液癌症是BPDCN。
[218.]一种治疗自身免疫性疾病或病症的方法，其包括：向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)结合除CD123之外的抗原决定簇(AD)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[219.][218]的方法，其中自身免疫性疾病或病症是红斑狼疮。
[220.]一种递送针对患者中的靶细胞的免疫应答的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者包括表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[221.]一种杀死有需要的患者中的靶细胞的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者包括表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)结合除CD123之外的抗原决定簇(AD)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[222.][220]或[221]的方法，其中靶细胞表达CD123。我们可以包括[220]至[222]中任一项的方法，其中靶细胞是内皮细胞。
[223.][220]至[222]中任一项的方法，其中靶细胞是癌细胞或其中靶细胞是内皮细胞。
[224.][222]的方法，其中靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞、骨髓增生异常细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞，优选急性髓系白血病(AML)细胞。
[225.]一种耗竭有需要的患者中的淋巴细胞的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者包含表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[226.][225]的方法，其中淋巴细胞表达CD123。
[227.][225]或[226]的方法，其中淋巴细胞是B淋巴细胞。
[228.]一种治疗癌症的方法，其包括：向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者包括表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[229.][228]的方法，其中癌症是血液癌症。
[230.][229]的方法，其中血液癌症是急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、毛细胞白血病或骨髓增生异常。
[231.][229]的方法，其中血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。
[232.][229]的方法，其中血液癌症是AML。
[233.][229]的方法，其中血液癌症是BPDCN。
[234.]一种治疗自身免疫性疾病或病症的方法，其包括：向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者包括表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)结合除CD123之外的抗原决定簇(AD)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[235.][234]的方法，其中自身免疫性疾病或病症是红斑狼疮。
[236.]一种递送针对患者中的靶细胞的免疫应答的方法，其包括：向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[237.]一种杀死有需要的患者中的靶细胞的方法，其包括：向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[238.][236]或[237]的方法，其中靶细胞表达靶AD。
[239.][236]至[238]中任一项的方法，其中靶细胞是癌细胞。
[240.]一种耗竭有需要的患者中的淋巴细胞的方法，其包括：向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[241.][240]的方法，其中淋巴细胞表达靶AD。
[242.][240]或[241]的方法，其中淋巴细胞是B淋巴细胞或T淋巴细胞。
[243.]一种治疗癌症的方法，其包括：向有需要的患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[244.][243]的方法，其中癌症是血液癌症。
[245.][244]的方法，其中血液癌症是急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、毛细胞白血病或骨髓增生异常。
[246.][244]的方法，其中血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。
[247.][244]的方法，其中血液癌症是AML。
[248.][244]的方法，其中血液癌症是BPDCN。
[249.]一种治疗自身免疫性疾病或病症的方法，其包括：向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFPp26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。
[250.][249]的方法，其中自身免疫性疾病或病症是类风湿性关节炎。
[251.][236]至[250]中任一项的方法，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[252.][236]至[250]中任一项的方法，其中患者包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[253.][236]至[250]中任一项的方法，还包括施用表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
[254.][166]至[253]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含选自SEQID NO：8-32和338-33、99和100的氨基酸序列。
[255.][166]至[253]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含选自SEQID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。
[256.][166]至[253]中任一项的方法，其中与CD123结合的D结构域包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列。
[257.][166]至[256]中任一项的方法，其中跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28跨膜结构域。
[258.][166]至[257]中任一项的方法，其中细胞内信号传导结构域选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合。
[259.][166]至[258]中任一项的方法，其中细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其任意组合。
[260.][166]至[259]中任一项的方法，其中AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。
[261.][166]至[260]中任一项的方法，其中AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
[262.][166]至[260]中任一项的方法，其中AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
[263.][166]至[262]中任一项的方法，其中与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFPp26 AD结合的scFv。
[264.][166]至[262]中任一项的方法，其中与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFPp26 AD结合的D结构域。
[265.][264]的方法，其中与AFP p26 AD结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。
[266.][264]的方法，其中与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。
[267.][264]的方法，其中与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
[268.][264]的方法，其中包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ IDNO：68的氨基酸序列。
[269.][264]的方法，其中包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ IDNO：69的氨基酸序列。
[270.][166]至[269]中任一项的方法，其中CAR包含与除CD123之外的AD结合的ADBD，该ADBD与肿瘤抗原结合。
[271.][270]的方法，其中肿瘤抗原选自以下组：BCMA、CD19、CD22、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。
[272.][270]的方法，其中肿瘤抗原是BCMA。
[273.][270]的方法，其中肿瘤抗原是CD19。
[274.][270]的方法，其中肿瘤抗原选自以下组：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。
[275.][166]至[274]中任一项的方法，其中包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列。
[276.][166]至[274]中任一项的方法，其中包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。
[277.][166]至[274]中任一项的方法，其中包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列。
[278.][166]至[274]中任一项的方法，其中包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列。
[279.][166]至[278]中任一项的方法，其中靶AD选自：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。
[280.][166]至[278]中任一项的方法，其中靶AD选自：CD19、CD22、CD123、BCMA、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。
[281.][166]至[278]中任一项的方法，其中靶AD是BCMA。
[282.][166]至[278]中任一项的方法，其中靶AD是CD19。
[283.][166]至[278]中任一项的方法，其中靶AD是CD45。
[284.][166]至[278]中任一项的方法，其中表达CAR的细胞是免疫细胞。
[285.][284]的方法，其中表达CAR的细胞是免疫效应细胞。
[286.][284]的方法，其中表达CAR的细胞是T细胞。
[287.][284]的方法，其中表达CAR的细胞是自然杀伤(NK)细胞。
[288.][166]至[287]中任一项的方法，其中靶细胞是癌细胞。
[289.][288]的方法，其中靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞、骨髓增生异常细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。
[290.][288]的方法，其中靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞。
[291.][166]至[290]中任一项的方法，其中表达CAR的细胞和衔接子以任何顺序分开施用。
[292.][166]至[291]中任一项的方法，其中施用衔接子包括施用包含衔接子的药物组合物。
[293.][166]至[291]中任一项的方法，其中施用衔接子和表达CAR的细胞包括施用包含衔接子的药物组合物和包含表达CAR的细胞的药物组合物。
附图说明
图1.作为MBP融合体的8W9C突变体的筛选。通过ELISA针对与CD123的结合(CD123结合)和表达(MBP结合)筛选8W9C突变体(突变体8W9C)的各克隆。测定了野生型(8W9C)、高亲和力(5B7L)、低亲和力(5S5W)和非结合(a3D)对照的一个或多个重复以进行比较。
图2.作为MBP融合体的8W9C突变体的CD123结合。通过ELISA针对与CD123的结合(CD123结合)测定8W9C突变体(6Z5E和4H2H)。测定了野生型(8W9C)、高亲和力(5B7L)和低亲和力(5S5W)对照以进行比较。
图3.作为MBP融合体的8W9C突变体的CD123结合。通过ELISA针对与CD123的结合(CD123结合)测定8W9C突变体(1J1K)。测定了野生型(8W9C)、高亲和力(5B7L)和低亲和力(5S5W)对照以进行比较。
图4.作为衔接子的6T1D突变体的细胞结合。通过流式细胞术针对与表达CD123的OCI-AML2细胞的结合测定了不同浓度的各种变体6T1D突变体。通过平均荧光强度(MFI)测量结合。
图5.sparX蛋白对CAR T细胞的NFAT激活。在存在表达CD123的MOLM13靶细胞和不同浓度的CD123特异性衔接蛋白的情况下，对JNL10/8G8V-CAR的活化进行测定。样品包括6T1D的亲和力修饰变体(例如3F4N和4R8U)。对亲本D结构域(6T1D)和非结合(a3D)对照进行测定以进行比较。
图6.与CD123特异性衔接蛋白一起培养的CAR T细胞的NFAT活化。在缺乏CD123表达的MOLM13细胞(MOLM13(CD123-/-))和不同浓度的sparX蛋白的存在下，对JNL10/8G8V-CAR的活化进行测定。样品包括6T1D的亲和力修饰变体(例如3F4N和4R8U)。对亲本D结构域(6T1D)和非结合(a3D)对照进行测定以进行比较。
图7.与CD123特异性衔接蛋白一起培养的CAR T细胞的IL-2产生。在MOLM13靶细胞和不同浓度的衔接蛋白的存在下，对表达8G8V-CAR的原代T细胞针对IL-2表达进行测定。样品包括6T1D的亲和力修饰变体(例如3F4N和4R8U)。对亲本D结构域(6T1D)和非结合(a3D)对照进行测定以进行比较。
图8.与CD123特异性衔接蛋白一起培养的CAR T细胞的IFNγ产生。在MOLM13靶细胞和不同浓度的衔接蛋白的存在下，对表达8G8V-CAR的原代T细胞针对IFNγ表达进行测定。样品包括6T1D的亲和力修饰变体(例如3F4N和4R8U)。对亲本D结构域(6T1D)和非结合(a3D)对照进行测定以进行比较。
图9.与CD123特异性衔接蛋白和靶细胞一起培养的8G8V-CAR T细胞的NFAT活化。在存在MOLM13靶细胞和不同浓度的衔接蛋白的情况下，对JNL10/8G8V-CAR的活化进行了测定。样品包括6T1D的亲和力修饰变体(例如3F4N、4R8U、0C8S和5B1Q)。对亲本D结构域(6T1D)和非结合(a3D)对照进行测定以进行比较。
图10.与CD123特异性衔接蛋白一起培养的8G8V-CAR T细胞对靶细胞的裂解。在存在不同浓度的衔接蛋白的情况下对原代8G8V-CAR T细胞对MOLM13靶细胞的裂解进行了测定。样品包括6T1D的亲和力修饰变体(例如3F4N、4R8U、0C8S和5B1Q)。对亲本D结构域(6T1D)和非结合(a3D)对照进行测定以进行比较。
图11.8G8V-CAR T细胞的IFNγ产生。在存在MOLM13靶细胞和不同浓度的CD123特异性衔接子蛋白的情况下，通过ELISA测定原代8G8V-CAR T细胞的IFNγ产生情况。样品包括亲和力修饰的6T1D变体(例如3F4N、4R8U、0C8S和5B1Q)。对亲本D结构域(6T1D)和非结合(a3D)对照进行测定以进行比较。
图12.8G8V-CAR T细胞产生IL-2。在存在MOLM13靶细胞和不同浓度的CD123特异性衔接蛋白的情况下，通过ELISA针对IL-2产生测定原代8G8V-CAR T细胞。样品包括6T1D的亲和力修饰变体(例如3F4N、4R8U、0C8S和5B1Q)。测定亲本D结构域(6T1D)和非结合(a3D)对照以进行比较。
图13.8G8V-CAR T和CD123特异性衔接蛋白对靶细胞的裂解。在存在不同浓度的衔接蛋白的情况下，NALM6-CD123+细胞被原代8G8V-CAR T细胞裂解。样品包括由低亲和力(4G0D)、高亲和力(5B1Q)和亲本D结构域(6T1D)组成的单价和双价形式的衔接蛋白。对非结合(a3D)对照进行测定以进行比较。
图14.使用MOLM14-GFP/萤光素酶肿瘤模型测定Dd-X CD123特异性D结构域的体内功效。阴影区域表示Dd-X衔接子撤回。q.o.d.为每隔一天；q.d.为每天。
图15.使用播散性MV4-11肿瘤模型测定Dd-X CD123特异性D结构域的体内功效。阴影区域表示Dd-X衔接子撤回。q.d.为每天。
图16.患者来源的AML异种移植模型。
图17.Dd-X CD123特异性D结构域清除或控制多个患者来源的AML异种移植物。显示了治疗后骨髓中代表移植的AML细胞(hCD45+CD3-)的活细胞的比例。
发明详述
本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为以任何方式限制所描述的主题。
术语的定义
应理解无论在本文中将实施方案用语言“包含”来描述的情况如何，都提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的另外类似的实施方案。然而，当在权利要求中作为过渡性短语使用时，每一个都应该被单独地且在适当的法律和事实背景下进行解释(例如，“包含”被认为是更开放的短语，而“由……组成”是更封闭的，而“基本上由……组成”则处于中间地带)。
如本文所用，除非另外指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数个/种指代物。
如本文中例如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，在例如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
本文使用的术语“约”在指可测量值(例如量、时距和本领域已知的其他可测量值)时，旨在涵盖与指定值±20％或在一些实施方案中±10％、或在一些实施方案中±5％、或在一些实施方案中±1％、或在一些实施方案中±0.1％的变化，因为这种变化适合于执行所公开的方法。
本文使用的“嵌合抗原受体”或“CAR”或“CARs”是指工程化的受体，其将抗原或靶特异性移植到细胞(例如T细胞，如幼稚T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、NK细胞、NKT细胞或其组合)上。CAR也被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。
本文使用的术语“衔接子”是指包含抗原决定簇(AD)和抗原决定簇结合结构域(ADBD)的多结构域可溶性蛋白，其中ADBD与第二AD结合。除了AD和ADBD之外，衔接子还可以包含额外的AD、额外的ADBD和/或其他额外的结构域。
本文使用的术语“抗原决定簇结合结构域”或“ADBD”是指足以赋予对靶抗原决定簇(AD)的识别和特异性结合的多肽序列(例如衔接子或CAR)。在一些实施方案中，ADBD是抗原结合抗体片段、scFv或不基于抗体或抗体片段序列(例如，D结构域或亲和体)的抗原结合肽。在一些实施方案中，ADBD包含非基于抗体的结合支架(例如，D结构域、亲和体、纤连蛋白结构域、纳米抗体、脂质运载蛋白结构域、锚蛋白结构域、maxybody、蛋白A结构域或affilin结构域)。在一些实施方案中，ADBD是D结构域。在一些实施方案中，ADBD是基于抗体的结合序列。在一些实施方案中，ADBD是scFv或结构域抗体(dAb)。在一些实施方案中，ADBD具有结合细胞表面上的靶抗原的能力。在一些实施方案中，ADBD具有结合免疫效应细胞表面上的靶抗原的能力。在一些实施方案中，ADBD具有结合生长因子受体、免疫调节受体或激素受体的能力。
在特定实施方案中，ADBD是非基于抗体支架的多肽序列，其足以赋予对靶抗原决定簇的识别和特异性结合。在一些实施方案中，非基于抗体的ADBD是具有结合细胞表面上的靶抗原的能力的多肽。在一些实施方案中，非基于抗体的ADBD具有结合生长因子受体、免疫调节受体或激素受体的能力。在一些实施方案中，ADBD是基于D结构域的多肽。在特定实施方案中，ADBD是足以赋予对靶抗原决定簇的识别和特异性结合的基于D结构域的多肽。在一些实施方案中，ADBD是具有结合细胞表面上的靶抗原的能力的基于D结构域的多肽。在一些实施方案中，ADBD是能够结合生长因子受体、免疫调节受体或激素受体的基于D结构域的多肽。在一些实施方案中，ADBD是能够结合血清蛋白上的靶抗原的基于D结构域的多肽。
术语“D结构域”是指共有参考支架序列的某些序列和某些结构特征的靶结合多肽，该参考支架序列是：MGSWAEFKQRLAAIKTRLQALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO：2)(参见WO2016/164305和WO2016/164308，其各自以引用的方式整体并入本文中)。参考支架是最初被设计为蛋白质折叠练习的非天然存在的且无靶标的反向平行三螺旋束参考多肽的变体(参见Walsh等人,PNAS 96:5486-5491(1999)，其以引用的方式整体并入本文中)。尽管参考支架不具有已知的靶结合活性，但已发现包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的参考支架的修饰的多肽能够特异性结合感兴趣的靶标。因此，D结构域或包含D结构域的分子可以特异性地(非随机地)结合靶分子。虽然不希望受理论的束缚，但据信，在设计D结构域时，表面暴露残基(其可被修饰)的结构约束赋予表面暴露残基特异性结合感兴趣的靶标的能力。在一些实施方案中，D结构域通常由70-75个氨基酸残基组成。在一些实施方案中，D结构域包含与具有SEQ ID NO：2的序列的参考支架的氨基酸序列不同(例如，由于氨基酸修饰)的氨基酸序列，具有多至20个取代。在特定实施方案中，D结构域不包含序列LAAIKTRLQ(SEQ ID NO：49)。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，是指包含通过肽键连接的来源于氨基酸的单元的生物聚合物；蛋白质可以由两条或更多条多肽链构成。
本文可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括全长抗体和抗体片段，其包括抗体的任何功能结构域，例如抗原结合片段或其单链、效应结构域、补救受体结合表位或其部分。典型的抗体包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域Cl构成。VH区和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FW)。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按照以下顺序布置的三个CDR和四个FW构成：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括各种免疫系统细胞(例如，效应细胞)或经典补体系统的第一组分(C1q)。本公开内容的抗体的实例包括典型的抗体、scFv及其组合，其中例如DDpp共价连接(例如，通过肽键或通过化学接头)至典型的完整(全长)抗体的重链和/或轻链的N末端，或插入全长抗体的H链和/或L链中。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指抗体的任何功能结构域，例如抗原结合片段或其单链、效应结构域或其部分、补救受体结合表位或其部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、线性抗体，单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用，“抗体片段”包含抗原结合位点或表位结合位点。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含效应结构域或其部分。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含补救受体结合表位或其部分。
本文所用的术语“单链可变片段”或“scFv”抗体是指包含由接头肽连接的仅重链和轻链的可变区的抗体形式(例如，抗体片段)。scFv可以包含VL-接头-VH，或可以包含VH-接头-VL。ScFv抗体通常长度为220-250个氨基酸，并且包含长度为10-25个氨基酸的接头。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含DDpp和scFv。
如本文所用，术语“Fc区”或简单地“Fc”应理解为意指免疫球蛋白链恒定区的羧基末端部分，优选免疫球蛋白重链恒定区或其部分的羧基末端部分。例如，免疫球蛋白Fc区可以包含(1)CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，(2)CH1结构域和CH2结构域，(3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，或(5)两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。因此，在各种实施方案中，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的柔性铰链N末端。对于IgA和IgM，Fc可包含J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1与Cγ2之间的铰链。在一个优选的实施方案中，免疫球蛋白Fc区至少包含免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域，并且优选缺少CH1结构域。在一个实施方案中，重链恒定区来源的免疫球蛋白的类别是IgG(Igγ)(γ亚类1、2、3或4)。可以使用其他类别的免疫球蛋白，IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)和IgM(Igμ)。尽管Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基末端包含残基C226或p260，其中编号是根据Kabat中阐述的EU索引(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,NIH,Bethesda,Md.(1991))。Fc可以单独地指此区域，或者在全长抗体、抗体片段或Fc融合蛋白的背景中指此区域。已在多个不同的Fc位置(包括但不限于如通过EU索引编号的位置270、272、312、315、356和358)处观察到多态性，并且因此呈现的序列与现有技术中的序列之间可能存在细微差异。适当的免疫球蛋白重链恒定区的选择在美国专利号5,541,087和5,726,044中详细讨论，其各自通过引用整体并入本文。认为从某些免疫球蛋白类别和亚类选择特定免疫球蛋白重链恒定区序列以达到特定结果在本领域的技术水平内。编码免疫球蛋白Fc区的DNA构建体的部分优选包含铰链结构域的至少一部分，并且优选Fcγ的CH3结构域或者IgA、IgD、IgE或IgM中的任一种中的同源结构域的至少一部分。此外，预期免疫球蛋白重链恒定区内的氨基酸的取代或缺失可用于实施本文公开的方法和组合物。一个实例是在上面的CH2区中引入氨基酸取代以产生对Fc受体具有降低的亲和力的Fc变体(Cole,J.Immunol.159:3613(1997))。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合的抗体，并且随后引起靶细胞的裂解(或其他细胞毒性效应)。为了评估目的分子的ADCC活性，可以使用在本领域中已知的任何体外ADCC测定，例如在美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的测定。用于此类测定的可用的效应细胞包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地或另外地，可以在体内(例如，在动物模型中)评估目的分子的ADCC活性，例如在Clynes等人,PNAS 95:652-656(1998)中所公开动物模型中。
术语“接头”、“间隔物”和“铰链”在本文中可互换使用，是指位于DDpp融合蛋白、衔接子或CAR的两个或更多个原本独立的功能结构域之间的肽或其他化学连接。例如，接头可以位于衔接子的抗原决定簇(AD)结构域和抗原决定簇结合结构域(ADBD)之间。类似地，接头可以位于CAR的两个抗原决定簇结合结构域或抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在一些实施方案中，接头是位于DDpp和DDpp融合蛋白的另一个多肽之间的肽或其他化学连接。用于偶联衔接子的两个或更多个结构域的合适接头在本文中描述和/或对于本领域技术人员而言将是清楚的。
如本文所用，术语“可操作地连接”指示附接两个分子以便每个分子保留至少一定水平的每个分子单独具有的功能活性(假定每个分子具有功能活性)。在一个分子不具有功能活性的实施方案中，如果另一个分子保留其至少一定水平的功能活性，则所述分子与另一个分子可操作地连接。可操作地连接也可以是指两个非功能分子的连接。两个分子可以“可操作地连接”，无论它们是直接还是间接地(例如，通过接头)附接。
术语“特异性结合”、“对其具有选择性亲和力”、“结合(bind)”或“结合(binding)”可互换使用，意指相比于与可选的物质(包括与靶表位、蛋白质或靶分子无关的蛋白质)的反应或缔合，例如DDpp的结合剂更频繁、更快速、以更长的持续时间、更大的亲和力或以上述的某种组合与表位、蛋白质或靶分子发生反应或缔合。由于不同物种中同源蛋白质之间的序列同一性，在一些实施方案中，特异性结合可以包括识别多于一个物种中的蛋白质或靶标的结合剂。同样，由于不同蛋白质的多肽序列的某些区域内的同源性，特异性结合可以包括识别多于一种蛋白质或靶标的结合剂。应理解的是，在某些实施方案中，特异性结合第一靶标的结合剂可以或可以不特异性结合第二靶标。因此，“特异性结合”不一定需要(尽管其可以包括)排他性结合，例如，结合单个靶标。因此，在某些实施方案中，结合剂可以特异性结合多于一个靶标。在某些实施方案中，多个靶标可以由结合剂上的相同抗原结合位点结合。
“靶标”是指能够被DDpp(例如DDpp融合蛋白)、DDpp融合蛋白的其他组分(例如抗体或抗体可变结构域片段)、衔接子或CAR、或DDpp融合蛋白、衔接子或CAR的组分(例如抗原决定簇结合结构域)结合的任何分子或分子组合。
术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可互换使用，并且是指能够被特定结合剂(例如，DDpp或抗体)识别并特异性结合的任何分子(例如，感兴趣的靶标，例如CD123或AFPp26)的部分。当所识别的分子是多肽时，表位可以由连续的氨基酸和通过蛋白质的三级折叠而并置的非连续的氨基酸和/或分子(例如碳水化合物)的其他化学活性表面基团形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时丧失。表位通常在独特的空间构象中包含至少3个氨基酸，并且更通常地，包含至少5个或8-10个氨基酸。
如本文所用，“肽标签”是指作为另一种蛋白质的一部分或附接(例如，通过遗传工程)到另一种蛋白质以为所得的融合体提供功能的肽序列。肽标签和与其融合的蛋白质相比通常较短；举例来说，在一些实施方案中，肽标签的长度为4个或更多个氨基酸，例如5、6、7、8、9、10、15、20或25或更多个氨基酸。在一些实施方案中，DDpp是含有肽标签的融合蛋白。在其他实施方案中，DDpp特异性结合肽标签。具有本文提供的用途的许多肽标签是本领域已知的。可以是DDpp融合蛋白的组分或被DDpp结合的靶标的肽标签(例如，DDpp融合蛋白)的实例包括但不限于HA(血凝素)、c-myc、单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)、T7、GST、GFP、MBP、Strep标签、His标签、Myc标签、TAP标签和标签(Eastman Kodak,Rochester,N.Y.)。同样，针对标签表位的抗体允许使用本领域已知的技术(例如蛋白质印迹、ELISA测定和细胞免疫染色)检测和定位融合蛋白。
本文使用的术语“源自”表示第一和第二分子之间的关系。它通常指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并且不表示或包括对源自第二分子的第一分子的过程或来源限制。例如，在源自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它并不表示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意味着为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或施加突变，以达到细胞内信号传导结构域。
术语“天然存在的”当与例如核酸分子、多肽、抗原决定簇和宿主细胞的生物材料结合使用时，是指在自然界中发现的并且未被人类改性的那些。相反地，“非天然的”或“合成的”当与生物材料结合使用时，是指在自然界中未发现的并且已经被人类改性的那些。
如本文所用，关于参考序列的序列的“修饰”包括参考序列(例如，本文公开的DD)的对应氨基酸位置的序列的取代、缺失、插入和/或添加。
关于参考序列的序列的“取代”是指在参考序列的对应氨基酸位置用不同的氨基酸残基替代特定的氨基酸残基。
“保守”氨基酸取代是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替代的一种取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中已经定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H))，酸性侧链(例如，天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C))，非极性侧链(例如，丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)，β-分支侧链(例如，苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I))和芳族侧链(例如，酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H))。例如，苯丙氨酸取代成酪氨酸是保守取代。在特定实施方案中，DDpp序列中的保守取代导致含有所述取代的DDpp与其结合的感兴趣的靶标(例如，CD123或AFP p26)的改变或未改变的特异性结合。在一个实施方案中，DDpp序列中的保守取代不消除含有所述取代的DDpp与其结合的感兴趣的靶标的结合。鉴定赋予、改变或维持选择性结合亲和力的核苷酸和氨基酸保守取代和非保守取代的方法是本领域已知的(参见，例如，Brummell,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks,PNAS 94:412-417(1997))。
“非保守”氨基酸取代是其中一个氨基酸残基被另一个具有相异侧链的氨基酸残基替代的一种取代。在一个实施方案中，DDpp序列中的非保守取代导致含有所述取代的DDpp与其结合的感兴趣的靶标(例如，CD123或AFP p26)的特异性结合。在一个实施方案中，DDpp序列中的非保守取代不消除含有所述取代的DDpp与其结合的感兴趣的靶标的结合。在一个实施方案中，DDpp、衔接子或CAR的序列中的非保守取代导致含有所述取代的DDpp、衔接子或CAR与其所结合的感兴趣的靶标的保留的特异性结合。
“非天然氨基酸”、“氨基酸类似物”和“非标准氨基酸残基”在本文中可互换使用。可以在如本文提供的DDpp中被取代的非天然氨基酸是本领域已知的。在一个实施方案中，所述非天然氨基酸是可以取代脯氨酸的4-羟基脯氨酸、可以取代赖氨酸的5-羟基赖氨酸、可以取代组氨酸的3-甲基组氨酸、可以取代丝氨酸的高丝氨酸以及可以取代赖氨酸的鸟氨酸。可以在本文公开的DDpp中被取代的非天然氨基酸的其他实例包括但不限于例如以下的分子：常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、A-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁酸、硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸氟代氨基酸、设计的氨基酸(例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸和Nα-甲基氨基酸)或非天然氨基酸的组合。其他非天然氨基酸可以包括例如，4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。如本文所讨论，在一些实施方案中，非天然氨基酸或氨基酸类似物可以包括序列中一个或多个氨基酸的缺失。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式：核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但不限于DNA、RNA、cDNA(互补DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、shRNA(小发夹RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(短核仁RNA)、miRNA(微RNA)、基因组DNA、合成DNA、合成RNA和/或tRNA。在一些实施方案中，分离的多核苷酸是包含非天然存在的核苷或核苷酸的修饰的mRNA。在一些实施方案中，修饰的mRNA包含2-硫尿苷、假尿苷或1-甲基假尿苷。
如本文所用，术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指如下媒介物，通过所述媒介物，核酸序列(例如，所公开的DDpp、衔接子或CAR编码序列)可以在宿主细胞(例如，克隆载体)中维持或扩增，或被引入宿主细胞，以便转化宿主并促进引入的序列的表达(例如，转录和翻译)。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。
“宿主细胞”包括可以是或已经是编码所公开的DDpp、衔接子或CAR的核酸的接受体的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括但不限于细菌、酵母植物、动物和哺乳动物细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、意外的或故意的突变和/或改变，后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或总DNA互补物方面)。宿主细胞包括用编码所公开的DDpp、衔接子或CAR的核酸体内、体外或离体转染或感染的细胞。在一些实例中，宿主细胞能够在其表面上表达并展示所公开的DDpp或CAR，例如在噬菌体展示或CAR T细胞中。在一些实施方案中，宿主细胞能够表达衔接子。在一些实施方案中，宿主细胞能够表达和分泌衔接子。在一些实施方案中，宿主细胞能够表达CAR。在一些实施方案中，宿主细胞能够在其表面上表达和展示CAR。“表达”包括转录和/或翻译。
如本文所用，术语“固体支持物”、“支持物”、“基质”和“树脂”可互换使用，并且是指但不限于任何柱(或柱材料)、珠子、试管、微量滴定盘、固体颗粒(例如，琼脂糖或琼脂糖凝胶)、微芯片(例如，硅、硅-玻璃或金芯片)或膜(例如，生物膜或滤膜)，DDpp、抗体或其他蛋白质可以直接或间接(例如，通过其他结合配偶体中间体，例如其他抗体或蛋白质A)附接(例如，偶联、连接或附着)至所述支持物，或者DDpp或抗体可以嵌入(例如，通过受体或通道)其中。用于将多肽附接至固体支持物(例如基质、树脂、塑料等)的试剂和技术是本领域公知的。合适的固体支持物包括但不限于色谱树脂或基质(例如，SEPHAROSE-4FF琼脂糖珠)、塑料微量滴定盘中孔的壁或底部、基于二氧化硅的生物芯片、聚丙烯酰胺、琼脂糖、二氧化硅、硝酸纤维素、纸、塑料、尼龙、金属及其组合。DDpp和其他组合物可以使用本领域已知的试剂和技术通过非共价缔合或通过共价键合附接在支持物材料上。在一个实施方案中，DDpp使用接头偶联至色谱材料。
如本文所用，术语“药学上可接受的”或“生理上可耐受的”及其语法变型形式，因为它们是指组合物、载剂、稀释剂和试剂，因此可互换使用，并表示所述材料能够施用到人而没有产生治疗上禁止的不希望的生理效应，例如恶心、头晕、胃不适等。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。
“调节”是指对振幅、频率、程度或活性的调整或调控。在另一个相关方面，这种调节可以是正调节(例如，频率、程度或活性的增加)或负调节(例如，频率、程度或活性的降低)。在一些实施方案中，与施用治疗剂之前的细胞、组织或器官功能相比，称为正向或负向的调节。在另外的实施方案中，相对于正常健康的细胞、组织或器官，称为正向或负向的调节。
本文提供的DDpp(例如DDpp融合蛋白)、CAR细胞、衔接子和/或CAR细胞/衔接子组合物的“有效量”是足以实现具体说明的目的的量，例如引起与DDpp(例如DDpp融合蛋白)、CAR细胞和/或衔接子结合的靶相关的一种或多种生物学活性水平的可观察的改变的量。在某些实施方案中，所述改变增加靶活性的水平。在其他实施方案中，所述改变降低靶活性的水平。根据所说明的目的，“有效量”可凭经验并以常规方式来确定。术语“治疗有效量”是指有效“治疗”(例如，减轻)受试者(哺乳动物)中的疾病或病症(的症状)的DDpp(例如DDpp融合蛋白)、CAR细胞和/或衔接子或其他治疗剂的量。术语“治疗有效量”也是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需的预防结果的量。
“患者”、“受试者”、“动物”和“哺乳动物”可互换使用，并且是指哺乳动物，例如人患者和非人灵长类动物，以及实验动物(例如兔子、大鼠和小鼠)，和其他动物。动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，例如鸡、两栖动物和爬行动物。如本文所用的“哺乳动物”是指哺乳动物纲(Mammalia)的任何成员，包括但不限于人和非人灵长类动物，例如黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠等。在特定的实施方案中，患者为人。所述术语不指示特定年龄或性别。因此，成年和新生儿受试者以及胚胎和胎儿，无论是男性还是女性，都旨在包括在此术语的范围内。
如本文所用的术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施，其中目的是预防或减缓(减轻或延迟)疾病、病状或病症的症状、并发症或生化指标，从而缓解症状或者阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。治疗可以是预防性的(预防或延迟疾病的发作，或预防其临床或亚临床症状的显现)，或治疗抑制或缓解在疾病、病状或病症靶向的病理状况显现后的症状，预防病理状况，追求或获得有益的结果，或者即使治疗最终不成功也降低个体发展病状的机会。需要治疗的对象包括已经患有病状的对象，以及易患所述病状的对象或要预防所述病状的对象。治疗可以用DDpp融合蛋白、CAR细胞、衔接子和/或CAR细胞/衔接子组合物单独或与另外的治疗剂组合进行。在一些实施方案中，术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)在本文中用于指治疗性治疗和预防性或预防措施，其中目的是预防或减缓(减轻或延迟)增生性病症的症状、并发症或生化指标，或改善增生性病症的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。在具体实施方案中，术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)是指改善增生性病症的至少一个可测量而患者不一定能辨别的物理参数，例如肿瘤的生长。在其他实施方案中，术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)是指抑制增生性病症的进展，无论是物理上(例如，可辨别的症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)还是两者。在其他实施方案中，术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)是指肿瘤大小、肿瘤细胞增殖或存活或癌细胞计数的减小或稳定。
“癌症”、“肿瘤”或“恶性肿瘤”用作同义词，是指许多疾病中的任何一种(其特征是细胞不受控制的异常增殖，受影响的细胞局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位(转移)的能力)，以及许多特征性结构和/或分子特征中的任何一种。本文使用的“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。“癌性肿瘤”或“恶性细胞”应理解为具有特定结构特性、缺乏分化并能够侵袭和转移的细胞。可使用本文提供的DDpp融合蛋白、CAR细胞、衔接子和/或CAR细胞/衔接子组合物治疗的癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌、脑癌、宫颈癌、皮肤癌、骨癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、造血细胞(例如白血病)和前列腺癌以及淋巴瘤。可使用DDpp融合蛋白、CAR细胞、衔接子和/或CAR细胞/衔接子组合物治疗的其他类型的癌症和肿瘤在本文中描述或以其他方式在本领域中已知。特定“类型”的癌症、肿瘤或肿瘤细胞的提及应理解为以特定疾病为特征的癌症、肿瘤或肿瘤细胞。例如，在一些实施方案中，相同类型的第一和第二癌症是混合细胞性霍奇金淋巴瘤和富含淋巴细胞的霍奇金淋巴瘤。在其他实施方案中，相同类型的第一和第二癌症是前体B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)和成熟B细胞ALL。不同类型的第一和第二癌症的例子包括，例如，霍奇金淋巴瘤和ALL。
术语“肿瘤抗原”是指特定过度增生性病症(例如癌症)所共有的抗原。术语“肿瘤抗原”或“癌症抗原”在本文中可互换使用。在某些方面，抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌(例如NSCLC或SCLC)、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、子宫癌、宫颈癌、肾癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、间皮瘤和腺癌例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌和本领域已知的其他癌症。在一些实施方案中，所述癌症为急性髓系白血病(AML)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，所述癌症为B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓系白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其他血液系统癌症或血液系统疾病，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症。
肿瘤和癌症抗原可进一步定义为“肿瘤特异性抗原(TSA)”、“癌症特异性抗原(CSA)”、“肿瘤相关抗原(TAA)”或“癌症相关抗原(CAA)”。TSA是肿瘤细胞特有的抗原，不会出现在体内其他细胞上。TAA是存在于肿瘤和一些正常细胞上的抗原。TAA可在无法诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。TAA在肿瘤上的表达可在使免疫系统能够对抗原作出反应的条件下发生。TAA可在胎儿发育期间(此时免疫系统尚未成熟且无法作出反应)在正常细胞上表达，或者可以在正常细胞上通常以极低的水平存在，但在肿瘤细胞上表达的水平要高得多。由于肿瘤的动态性质，在一些情况下，肿瘤细胞可能在某些阶段表达独特抗原，而在其他阶段还表达在非肿瘤细胞上也表达的抗原。因此，将某种标记物纳入为TAA并不妨碍将其视为TSA。在一些实施方案中，包含与本文提供的CAR细胞、衔接子和/或CAR细胞/衔接子组合物特异性结合的抗原决定簇的TAA和/或TSA选自：BCMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33/lL3Ra、CD70、CD123、CD171(L1-CAM)、CS1、EGFRvIII、GD2、LewisY、ROR 1、间皮素、IL13Ra2、cMet、PSMA、叶酸受体α(FR-α)、CEA、ErbB2(HER-2/neu)；EGFR(HER)、PSCA、PSA、MUC1、MUC16、CD44v6、CD44v6/7、CD44v7/8、CD55、IL11Ra、EphA2、EGP40、TAG72、CAIX、HMW-MAA(CSPG4)、MAGEA4、NKG2D配体、β-HCG、糖脂F77、HLA-A2(NY-ESO-1)、HMW-MAA、GD3、TCR、MAGE A3、MARTI、WT1、甲状腺球蛋白、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP1、TRP2、HLA-A1、MAGE1、MAGE3、BAGE、GAGE1、GAGE2、pi5、p53、Ras、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；VEGFR2、FAP、FAR、EBVA、HPV抗原E6、HPV抗原E7、TSP-180、MAGE4、MAGE5、MAGE6、RAGE、pl85erbB2、pl80erbB3、nm-23H1、CA 19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、甲胎蛋白、BCA225、BTAA、CA125、CA 15-3、CA 27.29(BCAA)、CA195、CA242、CA50、CAM43、CD68、CO-029、FGF5、G250、HTgp-175、M344、MA50、MG7-Ag、NB/70K、NY-CO-1，RCAS1、SDCCAG16、M2BP、TAAL6、TLP、TPS、FcRH5、GPCR5d、LILBR4、CLL1和FLT3。
本文所用的术语“自身免疫性疾病”定义为由自身免疫应答引起的疾病。自身免疫性疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫性疾病的例子包括但不限于：Addison病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等。
本文使用的术语“靶细胞”是指涉及疾病的一种或多种细胞，并且其可被含有DDpp的组合物或本文提供的CAR、衔接子和/或CAR/衔接子组合物靶向。靶细胞包括受试者(例如，人或动物)中可被DDPP、CAR、衔接子和/或CAR/衔接子组合物靶向的任何细胞。靶细胞可以是表达或过表达由CAR、衔接子和/或CAR/衔接子组合物特异性结合的靶标的细胞。靶细胞可以是表达或过表达由DDpp融合蛋白、CAR、衔接子和/或CAR/衔接子组合物特异性结合的靶标的细胞。
本文使用的术语“自体”是指来自同一个体的任何材料，之后会将该材料重新引入该个体。
本文使用的术语“同种异体”是指源自与材料被引入至的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不相同时，两个或更多个个体被称为彼此同种异体。在一些方面，来自同一物种的个体的同种异体材料可能在遗传上足够不同以抗原性相互作用。
如本文所用，术语“效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达Fc(RIII并执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中，在某些实施方案中，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如，从如本文所述或本领域中另外已知的血液或PBMC中分离。在一个具体的实施方案中，效应细胞是人效应细胞。
术语“效应功能”是指分化细胞的特化免疫功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，其包括细胞因子的分泌。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指哺乳动物免疫系统的细胞，包括但不限于抗原呈递细胞、B细胞、嗜碱性粒细胞、细胞毒性T细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、辅助T细胞、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、记忆细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、吞噬细胞、浆细胞和T细胞。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”可互换，并且在本文中同义使用。实例包括但不限于初始T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合。
如本文所用，术语“免疫应答”是指包括但不限于先天免疫、体液免疫、细胞免疫、免疫、炎性应答、获得性(适应性)免疫、自身免疫和/或过度活跃免疫的免疫。
如本文所用，术语“转导”是指使用病毒载体将外来核酸引入细胞中。如本文所用，“转染”是指使用重组DNA技术将外来核酸引入细胞中。术语“转化”是指将“外来的”(例如，外在的，细胞外的或其他非内源性的)核酸(DNA或RNA)序列引入宿主细胞中，使得宿主细胞将表达引入的核酸以产生所需的物质，例如由引入的编码序列编码的蛋白质或酶。引入的核酸序列也可以被称为“克隆”或“外来”基因或序列，可以包括调控或控制序列，例如起始、终止、启动子、信号、分泌序列或由细胞遗传机制使用的其他序列。核酸序列可以包括非功能性序列或不具有已知功能的序列。接收和表达引入的核酸(例如，DNA或RNA)的宿主细胞已经被“转化”并且是“转化体”或“克隆”。引入宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与宿主细胞属于相同的属或种的细胞，或不同的属或种的细胞，或者可以是非天然存在的。
本文使用的“共表达”是指由同一细胞或细胞群表达两个或更多个蛋白质编码序列。编码序列可以是例如各自编码单个蛋白质或作为单个多肽链的嵌合蛋白的核酸。
“细胞表面受体”是指能够接收信号以及穿过细胞质膜传递这种信号的分子和分子复合物。本文提供的细胞表面受体的实例是活化的整合素受体，例如转移细胞上的活化的αvβ3整合素受体。如本文所用，“细胞表面受体”还包括在细胞表面上表达的分子，其含有能够结合感兴趣的靶标(例如，CD123或AFP p26)的DDpp。术语“受体”表示与分子(例如，配体)结合或以其他方式相互作用并介导配体对细胞的作用的细胞相关蛋白。在一些实施方案中，与受体相互作用的分子是生物学活性分子。膜结合的细胞表面受体的特征通常在于包含胞外配体结合结构域、跨膜结构域和通常参与信号转导的胞内效应结构域的多结构域结构。
如本文所用，“抗原丢失逃逸变体”是指表现出靶抗原表达减少或丧失的细胞，所述抗原是本文提供的CAR所靶向的。
A.抗原决定簇(AD)
抗原决定簇(AD)是能够被抗原决定簇结合区(ADBD)(例如，抗体的抗原结合片段或替代支架结合结构域(ASBD)(例如，D结构域))识别并特异性结合的表位。本文提供的衔接子中和靶细胞上的AD可以被下文讨论的CAR结合。
在一些实施方案中，AD(例如，在衔接子中和/或在靶细胞上)是存在于天然存在的蛋白质或其他分子中的AD。在一些实施方案中，AD是人内源性的AD。
在一些实施方案中，衔接子中的AD是存在于靶细胞上的AD。
在一些实施方案中，AD(例如，在衔接子中和/或在靶细胞上)是存在于跨膜蛋白中的AD，例如，存在于跨膜蛋白的细胞外部分中的AD。在一些实施方案中，AD是肿瘤抗原。在一些实施方案中，AD是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，AD是肿瘤特异性抗原。
在一些实施方案中，AD(例如，在衔接子中和/或在靶细胞上)是癌症抗原。在一些实施方案中，AD是癌症相关抗原。在一些实施方案中，AD是癌症特异性抗原。
在一些实施方案中，AD(例如，在衔接子中和/或在靶细胞上)是BCMA的表位。在一些实施方案中，AD是CD19的表位。在一些实施方案中，AD是CD20的表位。在一些实施方案中，AD是CD22的表位。在一些实施方案中，AD是CD123的表位。在一些实施方案中，AD是CD37的表位。在一些实施方案中，AD是CS1的表位。在进一步的实施方案中，AD是被埃罗妥珠单抗(elotuzumab)结合的CS1的表位。在一些实施方案中，AD是HER2的表位。在一些实施方案中，AD是AFP的表位。在一些实施方案中，AD是AFP p26的表位。在一些实施方案中，AD是CD45的表位。在一些实施方案中，AD是人CD45的表位，其被UCHL-1、A6或ODP4抗体结合。在一些实施方案中，AD是人CD45的表位，其被4KB5、MB1、KiB3、2H4或MT2抗体结合。在一些实施方案中，AD是CD26的表位。在一些实施方案中，AD是CD30的表位。在一些实施方案中，AD是CD33的表位。在一些实施方案中，AD是CD38的表位。
在一些实施方案中，AD是CD123的表位。在进一步的实施方案中，AD包含SEQ IDNO：1的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基，超过150个氨基酸残基，或所有氨基酸残基。
在一些实施方案中，AD是AFP p26的表位。在进一步的实施方案中，AD包含SEQ IDNO：37的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基、超过150个氨基酸残基或所有氨基酸残基。在进一步的实施方案中，AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，AD包含SEQ ID NO：39的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基、超过150个氨基酸残基或所有氨基酸残基。在进一步的实施方案中，AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，AD包含SEQ ID NO：37-43或44的氨基酸残基。
在一些实施方案中，AD(例如，在衔接子中和/或在靶细胞上)被嵌合抗原受体(CAR)结合。在一些实施方案中，AD被表达嵌合抗原受体的细胞结合。在一些实施方案中，AD(例如，在靶细胞上)被衔接子结合。在一些实施方案中，AD被scFv结合。在一些实施方案中，AD被替代支架结合结构域(ASBD)结合。在一些实施方案中，AD被D结构域结合。在一些实施方案中，AD被抗体或其抗原结合片段结合。
适用于与本文公开的DDpp(例如，衔接子和CAR)结合使用的AD已在国际申请公开号WO2016164305、WO2016164308A1、WO2019099440和WO2019099433、美国专利号10,662,248和10,647,775以及美国专利申请号20200223934和20210002381中公开，其各自出于所有目的以引用的方式并入本文。
B.抗原决定簇结合结构域(ADBD)
与抗原决定簇(AD)结合的蛋白质结构域在本文中称为“抗原决定簇结合结构域”或“ADBD”。在一些实施方案中，ADBD足以赋予对感兴趣的靶标的识别和特异性结合。本文所述的ADBD可以存在于DDpp融合蛋白、衔接子和/或嵌合抗原受体(CAR)中。
在一些实施方案中，ADBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ADBD)是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，ADBD是scFv。在一些实施方案中，ADBD是替代支架结合结构域。在一些实施方案中，ADBD是D结构域。
适合与本文公开的DDpp(例如，衔接子和CAR)结合使用的ADBD已在国际申请公开号WO2016164305、WO2016164308A1、WO2019099440和WO2019099433、美国专利号10,662,248和10,647,775以及美国专利申请号20200223934和20210002381中公开，其各自出于所有目的以引用的方式并入本文。
i.抗体来源的抗原决定簇结合结构域(ADBD)
在一些实施方案中，一个或多个ADBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ADBD)可源自抗体分子，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体中的一种或多种，例如，来自例如人或骆驼科动物来源的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，ADBD源自衔接子或CAR最终将用于的同一物种，例如，用于人。衔接子和/或CAR包含人或人源化ADBD可能是有益的。常规生成此类ADBD的组合物和技术是本领域已知的。
在一些实施方案中，ADBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ADBD)包含足以赋予对靶抗原的识别和特异性结合的抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2或Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(例如sdAb(VL或VH))、骆驼科动物VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一些实施方案中，ADBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ADBD)是“scFv”，其可以包含融合蛋白，该融合蛋白包含抗体的VL链和VH链，其中VH和VL例如通过短柔性多肽接头(例如，本文所述的接头)连接。scFv可以按照本领域已知的方法常规制备(参见，例如，Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988))。
在一些实施方案中，ADBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ADBD)是单结构域抗原结合(SDAB)分子。SDAB分子包括含有互补决定区的分子，这些互补决定区是单结构域多肽的一部分。实例包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4链抗体的单结构域、工程化结构域和除源自抗体的单结构域支架之外的单结构域支架。SDAB分子可源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、兔子和牛。该术语还包括来自骆驼科动物和鲨鱼以外物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一些实施方案中，ADBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ADBD)包含人抗体或其片段。在一些实施方案中，ADBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ADBD)包含人源化抗体或其片段。
抗体的人源化是本领域所熟知的，并且可以基本上按照Winter和同事(Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988))的方法，通过用人抗体的相应序列取代啮齿动物CDR或CDR序列，即CDR移植(EP239,400；国际申请公开号WO91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；和6,548,640；其内容通过引用整体并入本文)进行。抗体的人源化还可以通过镶合或重塑(EP592,106；EP519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；和Roguska等人,PNAS 91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)来实现，其内容通过引用整体并入本文中。
ii.替代支架结合结构域
在一些实施方案中，ADBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ADBD)是替代支架结合结构域(ASBD)。本文使用的“替代支架结合结构域”或“ASBD”是源自或对应于非基于抗体的结合支架的抗原决定簇结合结构域。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含作为ASBD的ADBD的CAR。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含含有作为ASBD的ADBD的CAR的细胞。在进一步的实施方案中，提供了包含含有ASBD的CAR的免疫效应细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含作为ASBD的ADBD的衔接子。
在进一步的实施方案中，本公开内容提供了包含各自包含ASBD的衔接子和CAR的组合物。
在一些实施方案中，ASBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ASBD)与靶AD的结合由结合支架的二级结构(例如α螺旋或β片层)介导。在一些实施方案中，ASBD是基于三螺旋束的结合结构域。在一些实施方案中，ASBD是基于D结构域的结合结构域。在其他实施方案中，ASBD是基于Z结构域(亲和体)的结合结构域。
在一些实施方案中，ASBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ASBD)是基于D结构域(从头结合结构域)的AD结合结构域。在一些实施方案中，D结构域包含选自以下组的序列：SEQ ID NO：8-33、99和100。在一些实施方案中，D结构域包含选自以下组的序列：SEQID NO：8、13、14、31、32和33。在一些实施方案中，D结构域包含SEQ ID NO：14的序列。在一些实施方案中，D结构域包含选自以下组的序列：SEQ ID NO：74-93和94。在一些实施方案中，D结构域包含选自以下组的序列：SEQ ID NO：70-73和92-94。在一些实施方案中，D结构域包含SEQ ID NO：73的序列。
在一些实施方案中，ASBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ASBD)是基于Z结构域支架(亲和体)的AD结合结构域。基于Z结构域支架的结合结构域通常由58个氨基酸残基组成，其中位于三个α螺旋的第一和第二个中的多达13个位置的取代赋予结合赋予靶标(AD)识别和对感兴趣的靶标(AD)的结合特异性。基于Z结构域(亲和体)支架的结合结构域在美国专利号5,831,012中进一步描述，其全部内容通过引用整体并入本文。
显示二级结构介导的靶结合的ASBD的其他实例包括基于DARPins、affilins和armadillo重复的结合支架。
在一些实施方案中，ASBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ASBD)是基于DARPin的AD结合结构域。
在一些实施方案中，ASBD是基于adnectin的AD结合结构域。基于adnectin的结合结构域源自纤连蛋白III型(10Fn3)的第十个结构域。该ADBD通常是94个氨基酸的结合结构域，其采用包含由六个环连接的七条链的β夹层折叠。Adnectin结构域一侧上的三个表面暴露环中的取代产生靶标(AD)特异性结合部分。
在一些实施方案中，ASBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ASBD)是基于脂质运载蛋白、affilin或抗运载蛋白的AD结合结构域。抗运载蛋白支架显示由八个反向平行β链组成的保守β桶状结构，并且通常由160-180个氨基酸组成。基于抗运载蛋白的结合支架的配体结合口袋由四个环组成，每个环包含多达24个取代，它们共同赋予靶标(AD)识别和结合特异性。
在一些实施方案中，ASBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ASBD)是基于Avimer支架的AD结合结构域。基于Avimer支架的结合结构域源自细胞表面受体的A结构域，长度通常为35个氨基酸。基于Avimer支架的结合结构域在美国申请公开号20040175756、20050053973、20050048512和20060008844中进一步描述，每个申请的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，ASBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ASBD)是基于fynomer支架的AD结合结构域。fynomer结合结构域通常长度为60-75个氨基酸，并由一对由两个柔性环连接的反向平行β片层组成。环中的取代/插入赋予AD靶标识别和结合特异性。
在一些实施方案中，ASBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ASBD)是基于knottin支架的AD结合结构域。基于knottin支架的结合结构域对应于由三个反向平行β链组成的30个氨基酸的蛋白质折叠，所述β链由长度可变的环和多个二硫键连接。
在一些实施方案中，ASBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ASBD)是基于Kunitz结构域的AD结合结构域。基于Kunitz结构域的结合结构域源自Kunitz型蛋白酶抑制剂的活性基序，并且通常长度为约60个氨基酸。该ADBD的疏水核心由扭曲的双链反向平行β片层和两个α螺旋(通过三对二硫键稳定)组成。三个环中的取代和插入赋予AD靶标识别和结合特异性。基于Kunitz支架的结合结构域在国际申请公开号WO2004063337中进一步描述，其全部内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，ASBD(例如，DDpp融合蛋白、衔接子和/或CAR的ASBD)是基于WW结构域的AD结合结构域。
C.接头
接头是位于DDpp融合蛋白、衔接子或CAR的两个或更多个原本独立的功能结构域之间的肽或其他化学连接。
用于在单链氨基酸序列中可操作地连接DDpp和DDpp融合蛋白的额外组分或衔接子的两个或更多个功能结构域的合适接头包括但不限于多肽接头，例如甘氨酸接头、丝氨酸接头、混合甘氨酸/丝氨酸接头、富含甘氨酸和丝氨酸的接头或由大量极性多肽片段组成的接头。
在一个实施方案中，接头由选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸的大多数氨基酸组成。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白、衔接子或CAR中的一个或多个接头由选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸的大多数氨基酸组成。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白、衔接子或CAR中的一个或多个接头由选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸的一个或多个氨基酸组成。在另一个实施方案中，DDpp融合蛋白、衔接子或CAR中的一个或多个接头由空间上不受阻碍的大多数氨基酸组成。在另一个实施方案中，接头中大多数氨基酸是甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸。在一些实施方案中，肽接头选自聚甘氨酸(例如(Gly)5(SEQ IDNO:45)和(Gly)8(SEQ ID NO:46)、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。在一些实施方案中，肽接头含有Gly-Gly-Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：47)的序列。在一些实施方案中，肽接头含有Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：48)的序列。在一些实施方案中，肽接头含有SEQ ID NO：118或119的序列。
在一个实施方案中，DDpp融合蛋白、衔接子或CAR包含分别直接附接(即，没有接头)至DDpp融合蛋白、衔接子或CAR的另一个组分的ADBD(例如，D结构域)。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白、衔接子或CAR包含至少2个、至少3个、至少4个或至少5个ADBD(例如，D结构域)，其分别直接附接至DDpp融合蛋白、衔接子或CAR的另一个结构域。
在另一个实施方案中，ADBD(例如，D结构域)可以通过接头可操作地连接至DDpp融合蛋白、衔接子或CAR的另一个组分。DDpp融合蛋白、衔接子或CAR可以包含单个接头、多个接头或无接头。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白、衔接子或CAR包含通过接头肽分别可操作地连接至DDpp融合蛋白、衔接子或CAR的另一个组分的ADBD(例如，D结构域)。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白、衔接子或CAR包含至少2个、至少3个、至少4个或至少5个ADBD(例如，D结构域)，其通过相同或不同的接头分别可操作地连接至DDpp融合蛋白、衔接子或CAR的另一个结构域。
接头可以是任何大小或组成，只要它们能够以使得功能结构域能够发挥功能(例如，抗原决定簇结合结构域结合感兴趣的靶标的能力)的方式可操作地连接DDpp融合蛋白、衔接子或CAR的功能结构域。在一些实施方案中，接头为约1至约100个氨基酸、约1至50个氨基酸、约1至20个氨基酸、约1至15个氨基酸、约1至10个氨基酸、约1至5个氨基酸、约2至20个氨基酸、约2至15个氨基酸、约2至10个氨基酸或约2至5个氨基酸。应该清楚的是，接头的长度、柔性程度和/或其他性质可能对本发明的最终多肽的性质产生一些影响，包括但不限于对感兴趣的靶标或对一种或多种感兴趣的其他靶蛋白的亲和力、特异性或亲合力。当在DDpp融合蛋白、衔接子或CAR中使用两个或更多个接头时，这些接头可以相同或不同。在本文提供的上下文和公开内容中，本领域技术人员将能够常规地确定用于可操作地连接DDpp融合蛋白、衔接子或CAR的功能结构域的目的的最佳接头组成和长度。
接头还可以是非肽接头，例如烷基接头或PEG接头。例如，可以使用烷基接头，例如-NH-(CH2)s-C(0)-，其中s＝2-20。这些烷基接头还可以被任何非空间位阻基团取代，例如低级烷基(例如C1-C6)低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。示例性的非肽接头是PEG接头。在某些实施方案中，PEG接头的分子量为约100至5000kDa，或约100至500kDa。
适合通过化学交联偶联DDpp融合蛋白、衔接子或CAR功能结构域的接头包括但不限于同双功能化学交联化合物，例如戊二醛、亚氨酸酯例如己二亚氨酸二甲酯(DMA)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)和庚二亚氨酸二甲酯(DMP)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯例如二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)和二硫代双(磺化琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)。适合偶联DDpp融合蛋白、衔接子或CAR功能结构域的接头的实例包括但不限于具有一个胺反应端和另一端的巯基反应部分的交联剂，或具有一端的NHS酯和SH反应基团(例如马来酰亚胺或吡啶基)的交联剂。
在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白、衔接子或CAR中的一个或多个接头是可切割的。可切割接头的实例包括但不限于由各种类型的蛋白酶(体外或体内)识别的肽序列，例如Tev、凝血酶、Xa因子、纤溶酶(血液蛋白酶)、金属蛋白酶、组织蛋白酶(例如GFLG等)和在其他身体区室中发现的蛋白酶。
在一些实施方案中，接头是“可切割接头”，其促进DDpp融合蛋白功能结构域、衔接子功能结构域或细胞毒性剂在细胞中或细胞表面的释放。例如，可使用酸不稳定接头(例如，腙)、蛋白酶敏感(例如，肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(参见例如，Chari,Can.Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020；和美国申请公布号20090110753；其各自内容以引用方式整体并入本文)，其中希望当组合物内化到细胞中时，DDpp或细胞毒剂与融合配偶体之间的共价附接在细胞内被切割。术语“细胞内切割”和“细胞内裂解”是指细胞内对DDpp药物缀合物的代谢过程或反应，其中共价附接(即通过DDpp与细胞毒性剂、DDpp与融合配偶体之间或两个DDpp之间的接头连接)被破坏，导致游离DDpp和/或细胞毒性剂在细胞内解离。
在另外的实施方案中，CAR中的一个或多个接头是可切割的。可切割接头的例子包括但不限于由不同类型的蛋白酶(例如Tev、凝血酶、因子Xa、纤溶酶(血液蛋白酶)、金属蛋白酶、组织蛋白酶(例如GFLG等)和在其他身体区室中发现的蛋白酶)(体外或体内)识别的肽序列。
在一些实施方案中，使用长度为约1至100个氨基酸的短寡核苷酸或多肽接头将CAR的任何结构域连接在一起。接头可以由柔性残基如甘氨酸和丝氨酸(或任何其他氨基酸)组成，使得相邻的蛋白质结构域可以自由地相对于彼此移动。可以选择接头的氨基酸序列组成以最小化CAR的潜在免疫原性。当需要确保两个相邻结构域不会在空间上相互干扰时，可以使用较长的接头。
在一些实施方案中，优选在2至10个氨基酸的长度形成CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。在进一步的实施方案中，接头的长度为10至15个氨基酸，或15至20个氨基酸，或20至30个氨基酸，或30至60个氨基酸，或60至100个氨基酸(或所列范围之间的任何范围)。在进一步的实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸双链序列。在一些实施方案中，细胞外间隔结构域(ESD)对应于人T细胞表面糖蛋白CD8α链ESD区域(例如，氨基酸残基138至182CD8α链；Swiss-Prot登录号P01732)。在一些实施方案中，ESD对应于已通过氨基酸取代进一步修饰以改善表达功能或免疫原性的CD8 ESD区域。在进一步的实施方案中，ESD对应于CD28 ESD或含有赋予改善的表达功能或免疫原性的CD28 ESD修饰的序列。
可以使用本文所述和/或本领域已知的技术来评估接头优化。在一些实施方案中，接头不会破坏DDpp融合蛋白、衔接子或CAR结合靶抗原决定簇和/或另一个衔接子或CAR功能结构域适当发挥作用的能力(例如，衔接子中的效应功能结构域引发效应功能的能力或衔接子中的FcRn结合结构域结合FcRn的能力)。
D结构域多肽(DDpp)
根据各种实施方案，本公开内容提供了特异性结合CD123的DDpp。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合CD123的D结构域(DD)，并且包含SEQ ID NO：8-32或33的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。还提供了包含保留特异性结合其各自靶标的能力的D结构域的变体的蛋白质。
在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合AFP p26的D结构域(DD)，并且包含SEQID NO：74-93或94的氨基酸序列。还提供了包含保留特异性结合其各自靶标的能力的D结构域的变体的蛋白质。
在一些实施方案中，DDpp与异源多肽融合。在一些实施方案中，异源多肽包括全长抗体或抗体片段。在一些实施方案中，DD与以下融合：全长抗体重链的氨基末端；全长抗体轻链的氨基末端；全长抗体重链的羧基末端；或全长抗体轻链的羧基末端。在其他实施方案中，DD与Fc抗体片段融合。在另外的实施方案中，异源多肽包括选自以下组的成员：(i)跨膜结构域；(ii)膜缔合结构域；(iii)人血清白蛋白或其片段；(iv)AFP或其片段；(v)AFP p26或其片段；(vi)受体的细胞外结构域或其片段；和(vii)细胞内受体(例如，核蛋白)的细胞外结构域或其片段。在一些实施方案中，该蛋白质含有异源多肽，该异源多肽包含BCMA(SEQID NO：34)或CD123(SEQ ID NO：1)或CD19(SEQ ID NO：95)或CS1(SEQ ID NO：35)的细胞外结构域或细胞外结构域的片段。在一些实施方案中，该蛋白质含有异源多肽，该异源多肽包含选自以下组的受体的细胞外结构域或细胞外结构域的片段：CD19、CD20、CD22、HVEM、BTLA、DR3、CD37；TSLPR、IL7R和gp96。在一些实施方案中，该蛋白质含有异源多肽，该异源多肽包含血清蛋白的抗原部分(例如，AFP和AFP p26)。在一些实施方案中，该蛋白质含有异源多肽，该异源多肽包括细胞内蛋白质(例如，核蛋白质)的抗原部分。在一些实施方案中，该蛋白质被标记。在进一步的实施方案中，标记选自酶标记、荧光标记、发光标记、生物发光标记和生物素部分。在另外的实施方案中，该蛋白质与治疗剂或细胞毒性剂缀合。在一些实施方案中，该蛋白质含有异源多肽，该异源多肽与一种或多种主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类复合物结合。
在一些实施方案中，DDpp的DD是选自SEQ ID NO：8-33、99和100的CD123结合DD参考序列的变体，其保留了特异性结合CD123的能力。在一些实施方案中，变体DD的序列包括与选自SEQ ID NO：8-33、99和100的参考DD序列具有至少75％、80％、85％、87％、89％、90％、92％、94％、96％或98％序列同一性的变体的氨基酸序列，并且变体DD保留特异性结合CD123的能力。
在一些实施方案中，DDpp的DD是选自SEQ ID NO：74-93和94的AFP p26结合DD参考序列的变体，其保留特异性结合AFP p26的能力。在一些实施方案中，变体DD的序列包括与选自SEQ ID NO：74-93和94的参考DD序列具有至少75％、80％、85％、87％、89％、90％、92％、94％、96％或98％序列同一性的变体的氨基酸序列，并且变体DD保留特异性结合AFPp26的能力。
在特定实施方案中，变体DD(查询)序列与参考DD序列之间的同一性，也称为全局序列比对，使用基于Brutlag等人,Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序来确定。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数为：矩阵(Matrix)＝PAM 0，k元组(k-tuple)＝2，错配罚分(Mismatch Penalty)＝1，连接罚分(Joining Penalty)＝20，随机分组长度(Randomization Group Length)＝0，截断分数(Cutoff Score)＝1，窗口大小(Window Size)＝序列长度，空位罚分(Gap Penalty)＝5，空位大小罚分(Gap SizePenalty)＝0.05，窗口大小＝500或主题氨基酸序列的长度，以较短者为准。根据本实施方案，如果参考DD序列由于N或C末端缺失而不是因为内部缺失而比变体DD查询序列短，则对结果进行人工校正以考虑以下事实：FASTDB程序在计算全局同一性百分比时不考虑参考DD序列的N末端和C末端截短。对于在N末端和C末端截短的参考序列，相对于查询序列，同一性百分比通过以下来校正：计算查询序列中的在参考序列N末端和C末端与对应的主题残基不匹配/对齐的残基的数量，作为查询序列总碱基的百分比。通过FASTDB序列比对的结果来确定残基是否匹配/对齐。然后，从通过使用指定参数的以上FASTDB程序计算的同一性百分比减去这个百分比以获得最终同一性百分比得分。此最终同一性百分比得分是用于本实施方案的目的使用的最终同一性百分比得分。
在一些实施方案中，所公开的DDpp(例如，DDpp融合蛋白)被标记。可用于标记DDpp的标记包括但不限于酶标记、荧光标记、发光标记和生物发光标记。在一些实施方案中，标记是生物素部分。在一些实施方案中，标记是链霉亲和素部分。在一些实施方案中，标记是His标签或FLAG标签。在一些实施方案中，标记是萤光素酶、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或其他类似药剂。在一些实施方案中，DDpp包含CD123结合DD，所述DD包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含DD，所述DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含DD，所述DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含p26结合DD，所述DD包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。
在其他实施方案中，DDpp融合蛋白附着于固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物选自珠子、载玻片、芯片、明胶和琼脂糖。在一些实施方案中，DDpp包含CD123结合DD，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含DD，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含DD，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含p26结合DD，其包含选自SEQID NO：74-93和94的氨基酸序列。
在一些实施方案中，DDpp(例如，DDpp融合蛋白)与脂质体缔合。在一些实施方案中，DDpp通过共价结合与脂质体缔合。在一些实施方案中，DDpp是融合蛋白。在进一步的实施方案中，DDpp是CAR。在另外的实施方案中，DDpp通过离子结合而不是共价结合与脂质体缔合。在一些实施方案中，DDpp包含CD123结合DD，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含DD，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含DD，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含p26结合DD，其包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。
在一些实施方案中，靶结合DDpp与治疗剂或细胞毒剂(例如化疗剂或放射治疗剂)缀合。在一些实施方案中，DDpp包含CD123结合DD，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含DD，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含DD，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含p26结合DD，其包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。
表1-示例性靶特异性结合DD
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含表1中公开的一个或多个DD序列的组合物。在其它实施方案中，本公开内容提供了包含一个或多个DD的组合物，所述DD包含与表1中公开的序列具有60-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、95-99％同源性(以及其中的重叠范围)的序列。在一些实施方案中，具有此类同源性的DD与表1中的相应参考序列相比在功能上相似或相同。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含一个或多个DD的多肽，所述DD与表1中公开的一个或多个DD序列(参考序列)竞争(全部或部分)其相应靶标。可以使用本领域已知的标准竞争测定法常规地确定一种多肽与参考多肽竞争结合相应靶标的能力。在一些实施方案中，竞争不要求多肽与表1的多肽(DD)竞争相同的表位，而是多肽可以通过结合空间抑制表位、重叠表位等进行竞争。
A.CD123结合DDpp
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种蛋白质，其包含特异性结合CD123(SEQID NO：1)的D结构域(DD)靶结合结构域(DDpp)并且包含氨基酸序列SEQ ID NO：8-32或33。在一些实施方案中，DDpp包含含有选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列的DD。在一些实施方案中，DDpp包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：14的DD。
在一些实施方案中，DDpp的DD特异性结合CD123。在进一步的实施方案中，DD特异性结合具有由SEQ ID NO：8组成的氨基酸序列的CD123。在一些实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在其他实施方案中，DDpp包含选自SEQID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，DDpp特异性结合CD123(SEQID NO：1)并且包含SEQ ID NO：8、13、14、31、32或33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
在其他实施方案中，CD123结合DDpp包含选自SEQ ID NO：8-32和33的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含与单个靶标结合的多个靶结合结构域(例如，二聚体、三聚体等)。在一些实施方案中，DDpp包含2、3、4、5个或多于5个特异性结合CD123且具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的DD。在一些实施方案中，DDpp包含2、3、4、5个或多于5个具有相同序列的DD。在一些实施方案中，DDpp包含2、3、4、5个或多于5个特异性结合CD123的不同表位且具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的DD。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合CD123的DD，并且还包含特异性结合CD123或不同靶抗原的2、3、4、5个或多于5个额外不同DD或靶结合结合结构域(例如scFv)。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合CD123的DD(例如具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的DD)，并且还包含结合B谱系细胞表面上表达的一种或多种抗原的一个或多个额外DD或其他靶结合结合结构域。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合CD123的DD(例如，具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的DD)，并且还包含结合一种或多种癌症抗原的一个或多个额外的DD或其他靶结合结合结构域。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合CD123的DD(例如，具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的DD)，并且特异性结合2、3、4、5种或多于5种不同的靶标。在进一步的实施方案中，DDpp包含特异性结合CD123的DD(例如，具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的DD)并且特异性结合2、3、4、5种或多于5种不同的癌症抗原。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合CD123的DD(例如，具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的DD)并且特异性结合在癌细胞表面上表达的2、3、4、5种或多于5种不同的癌症抗原。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合CD123的DD(例如，具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的DD)并且特异性结合在不同癌细胞表面上表达的2、3、4、5种或多于5种癌症抗原。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，DDpp包含本文公开的CD123结合DD(参考DD)的变体，其保留了特异性结合CD123的能力。在一些实施方案中，与具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考CD123结合DD相比，CD123结合DD变体的序列含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守或非保守取代。在一些实施方案中，与具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考CD123结合DD相比，CD123结合DD变体的序列含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守取代。在一些实施方案中，与具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考CD123结合DD相比，CD123结合DD变体含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个非保守取代。在一些实施方案中，参考CD123结合DD包含选自SEQ IDNO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考CD123结合DD包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD123结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考CD123结合DD的氨基酸残基1-22、29-46和52-72的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守或非保守取代。在一些实施方案中，CD123结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考CD123-DD的氨基酸残基1-22、29-46和52-72的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守取代。在一些实施方案中，CD123结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考CD123结合DD的氨基酸残基1-22、29-46和52-72的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个非保守取代。在一些实施方案中，参考CD123结合DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考CD123结合DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD123结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考CD123结合DD的氨基酸残基2-6、8-10、12、13、15-17、19、20、29、30、32-34、36、37、39-41、43、44、52-55、57-59、61、62、64-66和68-70的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守或非保守取代。在一些实施方案中，CD123结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考DD的氨基酸残基2-6、8-10、12、13、15-17、19、20、29、30、32-34、36、37、39-41、43、44、52-55、57-59、61、62、64-66和68-70的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守取代。在一些实施方案中，CD123结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考DD的氨基酸残基2-6、8-10、12、13、15-17、19、20、29、30、32-34、36、37、39-41、43、44、52-55、57-59、61、62、64-66和68-70的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个非保守取代。在一些实施方案中，参考CD123结合DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考CD123结合DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD123结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考CD123结合DD的氨基酸残基7、11、14、18、21、28、31、35、38、42、45、53、56、60、63和67的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守或非保守取代。在一些实施方案中，CD123结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考DD的氨基酸残基7、11、14、18、21、28、31、35、38、42、45、53、56、60、63和67的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守取代。在一些实施方案中，CD123结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的参考DD的氨基酸残基7、11、14、18、21、28、31、35、38、42、45、53、56、60、63和67的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个非保守取代。在一些实施方案中，参考CD123结合DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考CD123结合DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了完全或部分(例如，与表位重叠)阻断参考DD与CD123的结合的CD123结合DDpp，其中参考DD具有选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在其他实施方案中，本公开内容提供了与由选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列组成的参考DD结合CD123的相同表位的CD123结合DDpp。在一些实施方案中，参考CD123结合DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考CD123结合DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，DDpp是包含特异性结合CD123的DD的融合蛋白。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白的DD特异性结合具有由SEQ ID NO：1组成的氨基酸序列的CD123。在一些实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在其他实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含全长抗体或抗体的一部分(片段)。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含全长IgG抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG2或IgG4)。在进一步的实施方案中，DDpp融合蛋白包含特异性结合癌症抗原的全长抗体。在进一步的实施方案中，DDpp包含商业批准的治疗性抗体(例如，利妥昔单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、MEDI-551、依帕珠单抗(epratuzumab)、贝利木单抗(belimumab)、他巴鲁单抗(tabalumab)、AMG-557、MEDI-570和NN882)。在其他实施方案中，CD123结合DDpp是Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，DDpp是包含可操作地连接至血清蛋白的CD123结合DD的融合蛋白。在一些实施方案中，所述CD123结合DDpp融合蛋白包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DDpp包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DDpp包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DDpp包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DDpp包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DDpp包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DDpp包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DDpp包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述CD123结合DDpp融合蛋白包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白包含人血清白蛋白的全部或部分。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含AFP(SEQ IDNO：36)或其片段。在一些实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白包含AFP p26(SEQ ID NO：37)或其片段。在一些实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白包含具有SEQ ID NO：37-43或44的序列的多肽。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白含有血清蛋白的片段或血清蛋白的抗原性片段(例如，AFP和AFP p26)。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含由血清蛋白的5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100或10-50个氨基酸组成的片段。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白包含受体的细胞外结构域或其片段。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含DD，所述DD包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在其他实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的变体。在进一步的实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白包含CD123的细胞外结构域(SEQ ID NO：1)，或其片段。在一些实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白包含选自以下的受体的细胞外结构域或其片段：CD19、CD20、CD22、HVEM、BTLA、DR3、CD37；TSLPR、IL7R、NKG2D和gp96。
在一些实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白含有由细胞表面受体的细胞外结构域的5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100或10-50个氨基酸组成的片段。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白含有BCMA的细胞外结构域的片段(SEQ ID NO：34)。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白含有CD123的细胞外结构域的片段(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白含有CS1的细胞外结构域的片段(SEQ IDNO：35)。在一些实施方案中，DDpp包含选自以下组的受体的细胞外结构域的片段：CD19、CD20、CD22、HVEM、BTLA、DR3、CD37；TSLPR、IL7R和gp96。
在另外的实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白包含细胞内蛋白质(例如，核蛋白质)或其片段。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含DD，所述DD包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DDpp包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在其它实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，CD123结合DDpp融合蛋白包含由细胞内蛋白质(例如，核蛋白质)的5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100或10-50个氨基酸残基组成的片段。
B.AFP p26结合DDpp
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含特异性结合AFP p26(SEQ ID NO：37)的D结构域(DD)靶结合结构域(DDpp)并且包含SEQ ID NO：74-93或94的氨基酸序列的蛋白质。
在一些实施方案中，DDpp的DD特异性结合AFP p26。在进一步的实施方案中，DDpp的DD特异性结合具有由SEQ ID NO：37组成的氨基酸序列的AFP p26。在一些实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在另外的实施方案中，AFP p26结合DDpp包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：92、93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：70-73、92、93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的变体。在进一步的实施方案中，DD特异性结合具有由SEQ ID NO：37组成的氨基酸序列的AFPp26，但不特异性结合具有由SEQ ID NO：36组成的氨基酸序列的AFP。在一些实施方案中，AFP p26结合DDpp包含结合单个靶标的多个靶结合结构域(例如，二聚体、三聚体等)。在一些实施方案中，DDpp包含2、3、4、5个或多于5个特异性结合AFP p26并且具有选自SEQ IDNO：74-93和94的氨基酸序列的DD。在一些实施方案中，DDpp包含2、3、4、5个或多于5个具有相同序列的DD。在一些实施方案中，DDpp包含2、3、4、5个或多于5个特异性结合AFP p26的不同表位且具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的DD。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合AFP p26的DD，并且还包含特异性结合AFP p26或不同靶抗原的2、3、4、5个或多于5个额外的不同DD或靶结合结合结构域(例如scFv)。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合AFP p26的DD(例如具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的DD)，并且还包含结合B细胞表面上表达的一种或多种抗原的一个或多个额外的DD或其他靶结合结合结构域。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合AFP p26的DD(例如，具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的DD)，并且还包含结合一种或多种癌症抗原的一个或多个额外的DD或其他靶结合结构域。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合AFP p26的DD(例如，具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的DD)，并且特异性结合2、3、4、5种或多于5种不同靶标。在进一步的实施方案中，DDpp包含特异性结合AFP p26的DD(例如，具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的DD)，并且特异性结合2、3、4、5种或多于5种不同的癌症抗原。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合AFP p26的DD(例如，具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的DD)并且特异性结合在癌细胞表面上表达的2、3、4、5种或多于5种不同癌症抗原。在一些实施方案中，DDpp包含特异性结合AFP p26的DD(例如，具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的DD)并且特异性结合在不同癌细胞表面上表达的2、3、4、5种或多于5种癌症抗原。
在一些实施方案中，DDpp包含本文公开的AFP p26结合DD(参考DD)的变体，其保留特异性结合AFP p26的能力。在一些实施方案中，与具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考AFP p26结合DD相比，AFP p26结合DD变体的序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守或非保守取代。在一些实施方案中，与具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考AFP p26结合DD相比，AFP p26结合DD变体的序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守取代。在一些实施方案中，与具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考AFP p26结合DD相比，AFP p26结合DD变体的序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个非保守取代。
在一些实施方案中，AFP p26结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考AFP p26结合DD的氨基酸残基1-22、29-46和52-72的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守或非保守取代。在一些实施方案中，AFP p26结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考AFP p26结合DD的氨基酸残基1-22、29-46和52-72的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守取代。在一些实施方案中，AFP p26结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考AFP p26结合DD的氨基酸残基1-22、29-46和52-72的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个非保守取代。在一些实施方案中，参考p26结合DD包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考p26结合DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AFP p26结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考AFP p26结合DD的氨基酸残基2-6、8-10、12、13、15-17、19、20、29、30、32-34、36、37、39-41、43、44、52-55、57-59、61、62、64-66和68-70的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守或非保守取代。在一些实施方案中，AFPp26结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考DD的氨基酸残基2-6、8-10、12、13、15-17、19、20、29、30、32-34、36、37、39-41、43、44、52-55、57-59、61、62、64-66和68-70的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守取代。在一些实施方案中，AFP p26结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考DD的氨基酸残基2-6、8-10、12、13、15-17、19、20、29、30、32-34、36、37、39-41、43、44、52-55、57-59、61、62、64-66和68-70的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个非保守取代。在一些实施方案中，参考AFP p26结合DD包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考AFP p26结合DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AFP p26结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考AFP p26结合DD的氨基酸残基7、11、14、18、21、28、31、35、38、42、45、53、56、60、63和67的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守或非保守取代。在一些实施方案中，AFP p26结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ IDNO：74-93和94的氨基酸序列的参考DD的氨基酸残基7、11、14、18、21、28、31、35、38、42、45、53、56、60、63和67的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个保守取代。在一些实施方案中，AFP p26结合DD变体的序列在对应于具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的参考DD的氨基酸残基7、11、14、18、21、28、31、35、38、42、45、53、56、60、63和67的位置处包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10、1-3、1-5或1-10个非保守取代。在一些实施方案中，参考AFP p26结合DD包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考AFP p26结合DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了AFP p26结合DDpp，其完全或部分(例如，与表位重叠)阻断参考DD与AFP p26的结合，其中参考DD具有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在其他实施方案中，本公开内容提供了AFP p26结合DDpp，其与由选自SEQ IDNO：74-93和94的氨基酸序列组成的参考DD结合到AFP p26的相同表位。在一些实施方案中，参考p26结合DD包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考p26结合DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，DDpp是包含特异性结合AFP p26的DD的融合蛋白。在一些实施方案中，DD特异性结合具有由SEQ ID NO：37组成的氨基酸序列的AFP p26。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含选自由SEQ ID NO：74-93和94组成的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白的DD特异性结合AFP p26，但不特异性结合具有由SEQ ID NO：36组成的氨基酸序列的AFP。在其他实施方案中，DDpp包含选自由SEQ ID NO：74-93和94组成的氨基酸序列的变体。在其他实施方案中，AFP p26结合DDpp是Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，DDpp是包含特异性结合AFP p26的DD的融合蛋白。在一些实施方案中，DDpp是包含特异性结合具有由SEQ ID NO：37组成的氨基酸序列的AFP p26的DD的融合蛋白。在进一步的实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在其他实施方案中，DDpp是包含AFP p26结合DD的融合蛋白，所述DD是包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的DD的变体。在一些实施方案中，DDpp是包含特异性结合AFP p26的DD的融合蛋白，所述DD可操作地连接至全长抗体或抗体的一部分(片段)。在一些实施方案中，DDpp是Fc融合蛋白。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含全长IgG抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG2或IgG4)。在进一步的实施方案中，DDpp融合蛋白包含特异性结合癌症抗原的全长抗体。在进一步的实施方案中，DDpp包含商业批准的治疗性抗体(例如，利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗、MEDI-551、依帕珠单抗、贝利木单抗、他巴鲁单抗、AMG-557、MEDI-570、NN882、埃罗妥珠单抗和达雷木单抗(daratumumab))。在其他实施方案中，AFP p26结合DDpp是Fc融合蛋白。在进一步的实施方案中，Fc融合蛋白包含变体人Fc结构域。
在一些实施方案中，DDpp是包含可操作地连接至血清蛋白的AFP p26结合DD的融合蛋白。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在其他实施方案中，AFP p26结合DDpp融合蛋白包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的变体。在进一步的实施方案中，DDpp融合蛋白包含人血清白蛋白或其片段。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含血清蛋白的片段或血清蛋白的抗原性片段。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含由血清蛋白的5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100或10-50个氨基酸组成的片段。
在一些实施方案中，AFP p26结合DDpp融合蛋白包含受体的细胞外结构域或其片段。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含DD，所述DD包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在其他实施方案中，AFP p26结合DDpp融合蛋白包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的变体。在进一步的实施方案中，AFP p26结合DDpp融合蛋白包含BCMA(SEQID NO：34)或CD123(SEQ ID NO：1)的细胞外结构域或其片段。在进一步的实施方案中，AFPp26结合DDpp融合蛋白包含BCMA(SEQ ID NO：34)或CD123(SEQ ID NO：1)或CS1(SEQ ID NO：35)的细胞外结构域或其片段。在一些实施方案中，AFP p26结合DDpp融合蛋白包含选自以下组的受体的细胞外结构域或其片段：CD19、CD20、CD22、HVEM、BTLA、DR3、CD37；TSLPR、IL7R和gp96。
在一些实施方案中，AFP p26结合DDpp融合蛋白含有由细胞表面受体的细胞外结构域的5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100或10-50个氨基酸组成的片段。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白含有BCMA(SEQ ID NO：34)或CD123(SEQ ID NO：1)的细胞外结构域的片段。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白含有BCMA(SEQ ID NO：34)或CD123(SEQ ID NO：1)或CS1(SEQ ID NO：35)的细胞外结构域的片段。在一些实施方案中，DDpp含有选自以下组的受体的细胞外结构域的片段：CD19、CD20、CD22、HVEM、BTLA、DR3、CD37；TSLPR、IL7R和gp96。
在另外的实施方案中，AFP p26结合DDpp融合蛋白包含细胞内蛋白(例如，核蛋白)或其片段。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含含有选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的DD。在其它实施方案中，AFP p26结合DDpp融合蛋白包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，AFP p26结合DDpp融合蛋白包含由细胞内蛋白质(例如，核蛋白质)的5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100或10-50个氨基酸残基组成的片段。在一些实施方案中，AFP p26结合DDpp融合蛋白包含由5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100或10-50个氨基酸残基组成的血清蛋白(例如HSA)的片段、受体(例如BCMA、CS1、CD123和CD19)的细胞外结构域或细胞内蛋白(例如核蛋白)。
还提供了编码DDpp的核酸和含有该核酸的载体。还提供了含有该核酸的宿主细胞和含有该核酸的载体(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示变体DD的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面展示变体DD。在进一步的实施方案中，宿主细胞是在其表面展示变体DD的噬菌体。在进一步的实施方案中，宿主细胞是在其表面表达变体DD融合蛋白的人免疫细胞。
DDpp激动剂是指以某种方式增加或增强DDpp靶标(例如CD123)的生物活性或具有与DDpp靶标的已知激动剂相当的生物活性的DDpp。在另一个实施方案中，DDpp是其结合的靶标(例如CD123)的拮抗剂。DDpp拮抗剂是指完全或部分阻断或以某种方式干扰DDpp靶蛋白的生物活性或具有与DDpp靶蛋白的已知拮抗剂或抑制剂相当的生物活性的DDpp。
DDpp融合蛋白
本文提供了DDpp融合蛋白。包含/含有异源多肽的“融合蛋白”、“嵌合多肽”、“嵌合蛋白”、“嵌合抗原”和DDpp是一种多肽，其由至少两个多肽和任选的接头构成，所述接头可操作地将所述两个多肽连接成例如通过重组方法产生的一个连续多肽。两种多肽可以直接或间接可操作地附接。
本文提供的“DDpp融合蛋白”包含至少一种特异性结合感兴趣的靶标(例如，BCMA(SEQ ID NO：34)、CD123(SEQ ID NO：1)、CS1(SEQ ID NO：35)、HER2、AFP(SEQ ID NO：36)、AFP p26(SEQ ID NO：37)或其片段)的本文公开的DDpp。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白含有一种DDpp。
在一些实施方案中，DDpp融合蛋白是包含一种或多种靶结合DDpp和p26蛋白(例如，具有SEQ ID NO：37-43或44的序列)的可溶性蛋白。在一些实施方案中，可溶性DDpp融合蛋白具有至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少16小时、至少32小时、至少64小时或更久的体内血浆半衰期。在一些实施方案中，可溶性融合蛋白在小鼠中具有至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少16小时、至少32小时、至少64小时、或多于65小时、或1-10小时、2-10小时、4-10小时、6-10小时或6-9小时的体内血浆半衰期。在一些实施方案中，可溶性DDpp融合蛋白在人体中具有至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少16小时、至少32小时、至少64小时、或多于65小时、或1-10小时、2-10小时、4-10小时、6-10小时或6-9小时的体内血浆半衰期。
在一些实施方案中，本公开内容提供一种用于修饰包含p26蛋白(例如，具有SEQID NO：37-43或44的序列)的可溶性融合蛋白的体内半衰期(例如，在小鼠或人体内)的方法。在一些实施方案中，可溶性p26融合蛋白包含一种或多种靶结合DDpp。在一些实施方案中，p26可溶性融合蛋白的半衰期通过取代或缺失一个或多个在人p26蛋白中正常存在的氨基酸残基，或通过插入一个或多个在人p26蛋白中正常不存在的氨基酸残基而增加或减少。在另一个实施方案中，可溶性融合蛋白的p26序列通过1、2、3、4、5、10或1-20、1-10、3-10或3-5处氨基酸取代(保守和/或非保守取代)、缺失和/或插入来修饰，以便增加或减少可溶性融合蛋白的体内半衰期。在一个特定的实施方案中，对应于p26的SEQ ID NO：37的217位的谷氨酰胺(Gln，Q)的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。在另一个实施方案中，取代是Gln217Pro。在另一个实施方案中，可溶性融合蛋白的p26序列通过缺失1-150、1-100、1-50、1-25或1-10个氨基酸残基来修饰，以便增加或减少可溶性融合蛋白的体内半衰期。在另外的实施方案中，可溶性融合蛋白的p26序列通过1、2、3、4、5、10或1-20、1-10、3-10或3-5个氨基酸取代(保守和/或非保守取代)、缺失和/或插入来修饰，以便增加或减少可溶性融合蛋白与FcRn的相互作用。
A.多聚体DDpp融合蛋白
在一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含多于一种DDpp，其中两种或更多种DDpp具有相同或不同的特异性。在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含相同或不同DD的串联重复，其允许DDpp融合蛋白结合多个靶和/或在同一靶上的重复表位或不同表位。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含至少2、3、4或5个或多于5个DDpp。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白含有1-3、1-4、1-5个或多于5个不同的DDpp。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白含有至少2、3、4或5个或多于5个不同的DDpp。因此，DDpp融合蛋白可以是单体DDpp(即，含有一个DDpp)或多聚体DDpp(即，含有多于一个任选地通过接头可操作地连接的串联的DDpp)。在一些实施方案中，多聚体DDpp的使用提供增强的(例如，协同的)靶结合。在另外实施方案中，多聚体DDpp允许使用单个DDpp构建体靶向多于一个靶标(例如，双特异性、三特异性等)。两个或更多个相同的DDpp的连接产生多价分子，其提供与单价组合物相比明显的优点(例如，增加的结合亲合力、靶聚集和受体活化)。两个或更多个不同的DDpp的连接产生多价且多特异性的分子，其具有独立或同时地结合多于一种靶抗原的潜力。
多聚体DDpp融合蛋白可以是DDpp同多聚体(即，含有多于一个任选地通过接头连接的串联的相同的DDpp(例如，同二聚体、同三聚体、同四聚体等)，或者DDpp异多聚体(即，含有两个或更多个DDpp，其中存在至少两个不同的DDpp蛋白。包含在多聚体组合物内的单体DDpp的数量可以根据所述实施方案而变化，并且可以至少部分地由其中产生DDpp的表达系统来定义。然而，在一些实施方案中，融合蛋白可以包含约5个至约10个DDpp亚基、约10个至约15个亚基、约15个至约20个亚基、约20个至约25个亚基或约25个至约30个亚基(包括所列数量之间的数量以及端点)的多聚体。此外，DDpp融合蛋白的多个串联组分可以含有相同或不同的DDpp。在一些DDpp融合体中，DDpp以单体形式存在，或者以同多聚体或异多聚体形式存在，例如，同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体、同四聚体或异四聚体。
DDpp融合蛋白可以是“单特异性的”或“多特异性的”。“多特异性的”(例如，双特异性、三特异性或更大的多特异性)的DDpp融合蛋白识别并结合至存在于一种或多种不同分子(例如，蛋白质、固体支持物结构等)上的两个或更多个不同表位。
在一些实施方案中，将两个或更多个DD融合在一起作为多价DDpp。多价DDpp的DD可以相同或不同。因此，本公开内容提供了DDpp同二聚体(即，包含两个相同DD的DDpp)、DDpp同多聚体(即，包含三个或更多个相同DD的DDpp)、DDpp异二聚体(即，包含两个不同DD的DDpp)以及DDpp异多聚体(即包含三个或更多个DD的DDpp，其中DD中的至少两个是不同的)，它们包含任选地通过一个或多个接头附接的本文所述的DD中的任一种。
在一些实施方案中，两个或更多个DD通过多聚化结构域连接或通过化学连接附接，以产生多价DD复合物。多价DD复合物的DD可以相同或不同。因此，本公开内容提供了DD同二聚体复合物(即，包含两个相同DD的DD复合物)、DD同多聚体复合物(即，包含三个或更多个相同DD的DD复合物)、DD异二聚体复合物(即，包含两个不同DD的DD复合物)以及DDpp异多聚体复合物(即包含三个或更多个DD的DD复合物，其中DD中的至少两个是不同的)，它们包含任选地通过一个或多个接头附接的本文所述的DD中的任一种。
在一个实施方案中，多特异性DDpp融合蛋白含有结合至单个感兴趣的靶标(例如，CD123、CD33、LeY、CD38、BCMA或CS1，优选CD123、CD33、LeY或CD38)上的至少两个不同表位的至少两个DDpp。在另一个实施方案中，DDpp融合体是双特异性的，并且特异性结合至在两种不同的细胞类型的表面上表达的两种不同的靶标。在一个实施方案中，双特异性DDpp融合蛋白特异性结合至癌细胞上的靶标和免疫效应细胞上的靶标。在一个实施方案中，双特异性DDpp融合蛋白特异性结合在癌细胞上表达的靶标(例如，CD123)和在T淋巴细胞的表面上表达的靶标(例如，CD3)。在一个实施方案中，双特异性DDpp融合蛋白特异性结合CD123和CD33。在一个实施方案中，双特异性DDpp融合蛋白特异性结合CD123和CD38。在一个实施方案中，双特异性DDpp融合蛋白特异性结合CD123和LeY。
在另外的实施方案中，多特异性DDpp融合蛋白包含特异性结合感兴趣的靶标上的一个表位的至少一个DDpp和特异性结合至相同感兴趣的靶标上的不同表位的至少一个其他结构域或赋予功能的序列(例如，抗体片段或结构域，例如scFv)。在一个实施方案中，多特异性DDpp融合蛋白包含特异性结合至感兴趣的靶标上的表位的至少一个DDpp和特异性结合至不同感兴趣的靶标上的表位的至少一个结构域或赋予功能的序列，例如抗体片段或结构域(例如，scFv)。在一个实施方案中，多特异性DDpp融合蛋白包含特异性结合至感兴趣的靶标上的表位的至少一个DDpp和特异性结合至相同细胞上的不同靶标上的表位的至少一个结构域或序列。在其他实施方案中，DDpp融合蛋白包含至少一个DDpp和至少一个其他DDpp或赋予功能的结构域序列，例如特异性结合至固体支持物的抗体片段或结构域。
在另一个实施方案中，将包含2个或更多个DDpp的多聚体DDpp融合体依次与其他异源蛋白(或其子结构域)融合，并且在这样做时，赋予融合配偶体多价且多特异性的特性。DDpp的融合配偶体的实例包括但不限于抗体、抗体子结构域(例如，scFv或Fc结构域)、血清白蛋白、血清白蛋白子结构域、细胞表面受体、T细胞受体(TCR)的α链、T细胞受体的β链、细胞表面受体子结构域、肽、肽标签(例如，FLAG或myc)、III型纤连蛋白重复序列、z结构域、弹性蛋白样多肽。DDpp的数量和位置及其在融合蛋白内的相应位置可以变化。例如，DDpp可以位于融合配偶体的一个或所有末端和/或散布在DDpp融合配偶体内的异源亚基内。
在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含DDpp和含有其他结构域的多肽序列。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含DDpp和选自以下的成员：抗体、抗体片段(例如，抗原结合结构域或其部分(例如，scFv)、效应结构域或其部分、FcRn结合结构域或其部分以及Fc或其部分)、血清蛋白(例如，白蛋白或其部分)、细胞因子、生长因子、激素、成像剂、标记剂和肽标签。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含免疫球蛋白的Fc结构域(例如，人Fc结构域)或其一部分。在另外的实施方案中，Fc结构域是变体人Fc结构域。
在一些实施方案中，DDpp与异源多肽融合。在一些实施方案中，异源多肽包含全长抗体或抗体片段。在一些实施方案中，DD与以下融合：全长抗体重链的氨基末端；全长抗体轻链的氨基末端；全长抗体重链的羧基末端；或全长抗体轻链的羧基末端。在其他实施方案中，DD与作为Fc的抗体片段融合。在另外的实施方案中，异源多肽包含选自以下的成员：(i)跨膜结构域；(ii)膜缔合结构域；(iii)人血清白蛋白或其片段；(iv)AFP或其片段；(v)AFPp26或其片段；(vi)受体的胞外结构域或其片段；和(vii)胞内受体(例如，核蛋白)的胞外结构域或其片段。在一些实施方案中，DDpp含有异源多肽，所述异源多肽包含细胞表面受体的胞外结构域或胞外结构域的片段。
在一些实施方案中，将DDpp融合蛋白的DDpp掺入更大的多结构域分子复合物(例如，单体或多聚体DDpp融合蛋白)中，并且在这样做时，将掺入的DDpp的功能属性赋予所得的融合蛋白。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含DDpp和来自以下的多肽序列：抗体、抗体片段、血清蛋白(例如，人血清白蛋白)或血清蛋白片段、或细胞表面受体、T细胞受体(TCR)的α链、T细胞受体的β链、细胞因子、生长因子、激素、或酶、或其片段。使用本领域已知的技术通过与另一种多肽重组融合、与另一种化学部分结合以及与另一种多肽(或其他期望的化合物)共价化学连接，可以常规地将DD掺入多结构域和/或多功能复合物中。DDpp融合蛋白可以另外含有其他任选的组分，例如接头和本文所述的其他组分。
B.衔接子
在一些实施方案中，本文所述的DDpp融合蛋白是衔接子蛋白。衔接子包含抗原决定簇(AD)和抗原决定簇结合结构域(ADBD)。衔接子还可以包含额外的AD、额外的ADBD和/或其他额外的结构域。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含至少一个包含D结构域的ADBD。
在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含(a)结合CD123的D结构域(DD)和(b)抗原决定簇(AD)。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包括选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包括选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子是包含结合CD123的单个D结构域的单价衔接子。在一些实施方案中，衔接子是包含结合CD123的两个D结构域的二价衔接子。在一些实施方案中，结合CD123的两个D结构域是相同的。在一些实施方案中，结合CD123的两个D结构域是不同的。在一些实施方案中，衔接子是二价衔接子，其包含结合CD123的第一D结构域和结合第二AD的第二D结构域。在一些实施方案中，第二AD是CD33或LeY。在一些实施方案中，单价衔接子包含D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，单价衔接子包含D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含DD，所述DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含两个相同的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含两个相同的D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含AFP p26抗原决定簇(AD)。在一些实施方案中，AFP p26AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在一些实施方案中，单价衔接子包含SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列。在一些实施方案中，单价衔接子包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列。在一些实施方案中，单价衔接子包含SEQ IDNO：61的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个接头。在一些实施方案中，衔接子能够在体外测定中将免疫应答导向至表达CD123的细胞，所述体外测定包括衔接子、表达CD123的细胞和表达包含与衔接子所包含的AD结合的ADBD的CAR(例如包含与AFP p26结合的D结构域的CAR)的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含(a)与CD123结合的D结构域和(b)与AFP p26 AD结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的D结构域。在一些实施方案中，结合AFP p26 AD的D结构域包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合AFP p26 AD的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个接头。在一些实施方案中，衔接子能够在体外测定中将免疫应答导向至表达CD123的细胞，所述体外测定包括衔接子、表达CD123的细胞和表达包含AFP p26AD的CAR的免疫效应细胞。
在本文提供的衔接子中，AD可以是ADBD的N端。或者，ADBD可以是AD的N端。在一些实施方案中，AD和ADBD直接融合。在一些实施方案中，AD和ADBD通过接头(蛋白质接头或化学接头)或另一个蛋白质结构域(例如，功能结构域)融合。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。
在一些实施方案中，衔接子包括位于衔接子的ADBD和另一个功能结构域之间的接头。在一些实施方案中，接头位于衔接子的两个ADBD之间。在一些实施方案中，接头位于衔接子的AD和ADBD之间。用于偶联衔接子的两个或更多个功能结构域的合适接头对于本领域技术人员来说是清楚的，并且通常可以是本领域中用于连接肽、蛋白质或其他有机分子的任何接头。本文提供了示例性接头。在特定实施方案中，接头适用于构建用于药物用途的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。
除了AD(或多个AD)和ADBD(或多个ADBD)之外，本文提供的衔接子还可以包含一个或多个额外的结构域，例如赋予延长半衰期的结构域。
在一些实施方案中，衔接子或衔接子中的ADBD是去免疫化的。
本文提供的衔接子的用途包括但不限于诊断、分析和治疗应用。在特定实施方案中，衔接子与本文提供的在细胞表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)组合使用，例如，以杀死靶细胞。
适合与本文公开的DDpp(例如，衔接子和CAR)结合使用的衔接子已在国际申请公开号WO2016164305、WO2016164308A1、WO2019099440和WO2019099433、美国专利号10,662,248和10,647,775以及美国专利申请号20200223934和20210002381中公开，其各自出于所有目的以引用的方式并入本文。
i.抗原决定簇(AD)
本文提供的衔接子包含至少一个抗原决定簇(AD)。在一些实施方案中，衔接子包含单个AD。在一些实施方案中，衔接子包含两个或更多个AD。当衔接子包含两个或更多个AD时，所述AD可以相同或不同。
在一些实施方案中，所述AD是AFP p26的表位。在进一步的实施方案中，所述AD包含SEQ ID NO：37的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基、超过150个氨基酸残基或所有氨基酸残基。在进一步的实施方案中，AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，AD包含SEQ ID NO：39的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基、超过150个氨基酸残基或所有氨基酸残基。在进一步的实施方案中，AD包含SEQ IDNO：39的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，AD包含SEQ ID NO：37-43或44的氨基酸残基。
在一些实施方案中，衔接子包含BCMA的细胞外结构域(例如，包含SEQ ID NO：34的序列的多肽)。在一些实施方案中，衔接子包含SEQ ID NO：34的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基、超过150个氨基酸残基或所有氨基酸残基。
在一些实施方案中，衔接子包含CD123的细胞外结构域(例如，包含SEQ ID NO：1的序列的多肽)。在一些实施方案中，衔接子包含SEQ ID NO：1的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基，超过150个氨基酸残基，或所有氨基酸残基。
在一些实施方案中，衔接子包含CD19的细胞外结构域(例如，包含SEQ ID NO：95的序列的多肽)。在一些实施方案中，衔接子包含SEQ ID NO：95的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基，超过150个氨基酸残基，或所有氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述衔接子包含CS1的细胞外结构域(例如，包含SEQ ID NO：35的序列的多肽)。在一些实施方案中，所述衔接子包含SEQ ID NO：35的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基，超过150个氨基酸残基，或所有氨基酸残基。在一些实施方案中，所述衔接子包含CD20的细胞外结构域。在一些实施方案中，所述衔接子包含CD22的细胞外结构域。在一些实施方案中，所述衔接子包含CD37的细胞外结构域。在一些实施方案中，所述衔接子包含HER2的细胞外结构域。在一些实施方案中，所述衔接子包含CD45的细胞外结构域。在一些实施方案中，衔接子包含CD26、CD30、CD33或CD38的细胞外结构域。
在一些实施方案中，AD是AFP的表位。在进一步的实施方案中，AD包括SEQ ID NO：36的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基、超过150个氨基酸残基或所有氨基酸残基。
在一些实施方案中，衔接子包括p26蛋白(例如，具有SEQ ID NO：37-43或44的序列)。在一些实施方案中，衔接子的体内血浆半衰期为至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少16小时、至少32小时、至少64小时或更长。在一些实施方案中，所述衔接子在小鼠中的体内血浆半衰期为至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少16小时、至少32小时、至少64小时、或超过65小时、或1-10小时、2-10小时、4-10小时、6-10小时、或6-9小时。在一些实施方案中，所述衔接子在人中的体内血浆半衰期为至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少16小时、至少32小时、至少64小时、或超过65小时、或1-10小时、2-10小时、4-10小时、6-10小时、或6-9小时。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于修改包含p26蛋白(例如，具有SEQID NO：37-43或44的序列)的衔接子的体内半衰期(例如，在小鼠或人中)的方法。在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个靶结合DDpp。在一些实施方案中，通过取代或缺失通常在人p26蛋白中发现的一个或多个氨基酸残基，或通过插入通常在人p26蛋白中不存在的一个或多个氨基酸残基来增加或减少衔接子的半衰期。在另一个实施方案中，所述衔接子的p26序列通过1、2、3、4、5、10、或1-20、1-10、3-10、或3-5个氨基酸取代(保守和/或非保守取代)、缺失和/或插入进行修饰，以增加或减少所述衔接子的体内半衰期。在一个具体实施方案中，p26(SEQ ID NO：37)的位置217处的谷氨酰胺(Gln，Q)对应的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。在进一步的实施方案中，取代为Gln217Pro。在另一个实施方案中，衔接子的p26序列通过1-150、1-100、1-50、1-25或1-10个氨基酸残基的缺失进行修饰，以增加或减少所述衔接子的体内半衰期。在另外的实施方案中，衔接子的p26序列通过1、2、3、4、5、10或1-20、1-10、3-10或3-5个氨基酸取代(保守和/或非保守取代)、缺失和/或插入进行修饰，以增加或减少衔接子与FcRn的相互作用。
在一些实施方案中，AD(例如，在衔接子中和/或在靶细胞上)是存在于天然存在的蛋白质或其他分子中的AD。在一些实施方案中，AD是人内源性的AD。
在一些实施方案中，AD是人细胞内蛋白质的表位。在进一步的实施方案中，AD是选自以下的人细胞内蛋白质的表位：Tyk2、Jak1、Jak2、Jak3、LCK、ZAP-70和GRB2。在进一步的实施方案中，AD包含细胞内蛋白质的5-25、5-50、5-75、5-100、5-125或5-150个氨基酸残基、超过150个氨基酸残基或所有氨基酸残基。
在一些实施方案中，由衔接子的ADBD特异性结合的感兴趣的靶标本身是具有不同序列的另一个衔接子的AD。
ii.抗原决定簇结合结构域(ADBD)
本文提供的衔接子包含至少一个抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，衔接子包含一个ADBD。在一些实施方案中，衔接子包含至少2、3、4或5个或多于5个ADBD。在一些实施方案中，衔接子包含1-3、1-4、1-5个或多于5个不同的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包含至少2、3、4或5个或多于5个不同的ADBD。因此，衔接子可以包含单体ADBD(即，包含一个抗原决定簇结合结构域)或多聚ADBD(即，包含串联的多于一个抗原决定簇结合结构域，任选地通过接头可操作地连接)。在一些实施方案中，使用多聚衔接子提供增强的(例如，协同的)靶结合。在另外的实施方案中，使用多聚衔接子允许使用单个衔接子构建体靶向多于一个靶标(例如，双特异性、三特异性等)。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
多聚衔接子是同多聚体(即，包含多于一个相同的ADBD，任选地通过接头连接(例如，同二聚体、同三聚体、同四聚体等))或衔接子异多聚体(即，包含两个或更多个抗原决定簇结合结构域，其中存在至少两个不同的抗原决定簇结合结构域)。任何特定衔接子中包含的ADBD的数量可能取决于实施方案而异，并且可能至少部分地由产生衔接子的表达系统定义。然而，在几个实施方案中，融合蛋白可包含约5至约10个ADBD、约10至约15个ADBD、约15至约20个ADBD、约20至约25个ADBD或约25至约30个ADBD的多聚体(包括所列数量之间以及端点的数量)。此外，衔接子的多个结构域可以包含相同或不同的ADBD。在一些实施方案中，2、3、4、5个或多于5个结构域串联。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在一个实施方案中，衔接子包括两个或更多个可操作地连接的ADBD。在一个实施方案中，衔接子包括两个与靶抗原上的相同或不同AD结合的ADBD。与相同靶抗原结合的两个或更多个相同ADBD的连接产生多价分子，其与仅包含一个靶抗原ADBD的组合物相比提供明显的优势(例如，增加的结合亲合力、靶标聚集和受体活化)。在另一个实施方案中，衔接子包括两个与不同抗原结合的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包括两个与同一细胞上的不同抗原结合的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包括两个与不同细胞上的不同抗原结合的ADBD。两个或更多个ADBD的连接产生多价和多特异性衔接子，其具有独立或同时结合多于一个靶抗原的潜力。在一些实施方案中，多价衔接子能够同时结合相同的靶抗原。在一些实施方案中，多价衔接子能够同时结合不同的靶抗原。在一些实施方案中，衔接子包括两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由抗原决定簇隔开。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为5-500、5-400、10-300、5-200、50-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-75、100-500、100-400、100-300、100-200或100-150个氨基酸。在进一步的实施方案中，衔接子包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由BCMA抗原决定簇隔开。在进一步的实施方案中，衔接子包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由AFP P26抗原决定簇隔开。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
本文提供的衔接子中的ADBD可以结合任何AD。在一些实施方案中，ADBD结合CD123(例如，包含SEQ ID NO：1的序列的多肽)。在一些实施方案中，ADBD结合AFP p26(例如，包含SEQ ID NO：37-43或44的序列，优选SEQ ID NO：37或39的多肽)。在一些实施方案中，ADBD结合BCMA(例如，包含SEQ ID NO：34的序列的多肽)。在一些实施方案中，ADBD结合CD22。在一些实施方案中，ADBD结合CD19。在一些实施方案中，ADBD结合CD20。在一些实施方案中，ADBD结合CD37。在一些实施方案中，ADBD结合CS1。在一些实施方案中，ADBD结合HER2。在一些实施方案中，ADBD结合CD45。在一些实施方案中，本文提供的衔接子中的ADBD特异性结合人CD26、CD30、CD33或CD38的AD。衔接子可以是“单特异性”或“多特异性”。“多特异性”(例如，双特异性、三特异性或更高多特异性)的衔接子识别并结合存在于一个或多个不同分子上的两个或更多个不同表位。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在一些实施方案中，衔接子包含CD123(例如，包含SEQ ID NO：1的序列的多肽)的结构域(例如，细胞外结构域)。在一些实施方案中，衔接子包含BCMA(例如，包含SEQ ID NO34的序列的多肽)的结构域(例如，细胞外结构域)。在一些实施方案中，衔接子包含CD22的结构域(例如，细胞外结构域)。在一些实施方案中，衔接子包含CD19的结构域(例如，细胞外结构域)。在一些实施方案中，衔接子包含CS1的结构域(例如，细胞外结构域)。在一些实施方案中，衔接子包含HER2的结构域(例如，细胞外结构域)。在一些实施方案中，衔接子包含CD45的结构域(例如，细胞外结构域)。在一些实施方案中，衔接子包含CD26、CD30、CD33或CD38的结构域(例如，细胞外结构域)。在一些实施方案中，衔接子包含结构域的片段。在一些实施方案中，衔接子包含长度为至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸的结构域的片段。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为5-500、5-400、10-300、5-200、50-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-75、100-500、100-400、100-300、100-200或100-150个氨基酸。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在一些实施方案中，衔接子包含至少两个ADBD，其结合并交联由ADBD结合的一种或多种靶抗原和/或含有靶抗原的复合物。在一些实施方案中，交联的抗原位于同一细胞上。在一些实施方案中，交联的抗原位于不同细胞上。在一些实施方案中，衔接子包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由抗原决定簇(例如，上述结构域)隔开。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为5-500、5-400、10-300、5-200、50-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-75、100-500、100-400、100-300、100-200或100-150个氨基酸。在进一步的实施方案中，衔接子包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由BCMA抗原决定簇隔开。在进一步的实施方案中，所述衔接子包括两个或更多个由CD123抗原决定簇隔开的可操作地连接的ADBD。在进一步的实施方案中，所述衔接子包括两个或更多个由CD26、CD30、CD33或CD38抗原决定簇隔开的可操作地连接的ADBD。在进一步的实施方案中，所述衔接子包括两个或更多个由AFPp26抗原决定簇隔开的可操作地连接的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在一些实施方案中，所述衔接子包含至少两个相同的ADBD(即，是多价的)。在一些实施方案中，多价衔接子能够同时结合两个或更多个相同的靶抗原。在一些实施方案中，衔接子是多价的，并且能够同时结合相同的靶抗原。在一些实施方案中，多价衔接子包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由抗原决定簇隔开。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为5-500、5-400、10-300、5-200、50-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-75、100-500、100-400、100-300、100-200或100-150个氨基酸。在进一步的实施方案中，衔接子包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由CD123抗原决定簇隔开。在进一步的实施方案中，多价衔接子包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由BCMA抗原决定簇隔开。在进一步的实施方案中，多价衔接子包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由AFP p26抗原决定簇隔开。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在一些实施方案中，衔接子包含至少两个与不同抗原结合的ADBD(即，是多特异性的)。在一些实施方案中，多特异性衔接子能够同时结合不同的靶抗原。在一些实施方案中，衔接子也是多价的，并且能够同时结合相同的靶抗原。在一些实施方案中，多特异性衔接子包括两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由抗原决定簇隔开。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为5-500、5-400、10-300、5-200、50-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-75、100-500、100-400、100-300、100-200或100-150个氨基酸。在进一步的实施方案中，衔接子包括两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由CD123抗原决定簇隔开。在进一步的实施方案中，衔接子包括两个或更多个由BCMA抗原决定簇隔开的可操作地连接的ADBD。在进一步的实施方案中，衔接子包括两个或更多个由AFP p26抗原决定簇隔开的可操作地连接的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在一个实施方案中，多特异性衔接子包括至少两个与单个感兴趣的靶标(例如CD123)上的至少两个不同表位结合的ADBD。在另外的实施方案中，多特异性衔接子包括至少一个与感兴趣的靶标上的一个表位特异性结合的ADBD和至少一个与相同靶抗原上的不同表位特异性结合的其他ADBD。在一个实施方案中，多特异性衔接子包括至少一个特异性结合第一靶抗原上的表位的ADBD和至少一个特异性结合第二抗原上的表位的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包括至少一个特异性结合细胞上的第一靶抗原上的表位的ADBD和至少一个特异性结合同一细胞上的第二抗原上的表位的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包括至少一个特异性结合细胞上的第一靶抗原上的表位的ADBD和至少一个特异性结合不同细胞上的第二抗原上的表位的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在进一步的实施方案中，衔接子包括2个或更多个ADBD，这些ADBD与其他异源蛋白(或其子结构域)可操作地连接，从而将融合配偶体的多价、多特异性和/或功能特性(例如，药代动力学，例如增加的半衰期或药效学，例如增加的功能)赋予衔接子融合蛋白。衔接子的融合配偶体的实例包括但不限于抗体、抗体子结构域(例如，scFv或Fc结构域)、血清白蛋白、血清白蛋白子结构域、细胞表面受体、T细胞受体(TCR)的α链、T细胞受体的β链、细胞表面受体子结构域、肽、肽标签(例如，FLAG或myc)。ADBD的数量和位置以及它们在衔接子内的对应位置可以变化。例如，ADBD可以位于融合配偶体的一个或所有末端和/或散布在衔接子融合配偶体内的异源亚基内。在一些实施方案中，衔接子包括2个或更多个ADBD，其被异源蛋白(例如抗原决定簇)隔开。在一些实施方案中，异源蛋白的长度为至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸。在一些实施方案中，异源蛋白的长度为5-500、5-400、10-300、5-200、50-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-75、100-500、100-400、100-300、100-200或100-150个氨基酸。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在一个实施方案中，衔接子是双特异性的，并且包含特异性结合两种不同靶抗原的ADBD。在进一步的实施方案中，双特异性衔接子特异性结合在两种不同细胞类型表面上表达的两种不同靶抗原。在进一步的实施方案中，双特异性衔接子特异性结合在肿瘤细胞表面上表达的两种不同靶抗原。在进一步的实施方案中，双特异性衔接子特异性结合在AML细胞表面上表达的两种不同靶抗原(例如，CD123和CD33或LeY)。在一个实施方案中，双特异性衔接子结合在不同细胞上表达的靶抗原。在进一步的实施方案中，双特异性衔接子结合在肿瘤的不同细胞上表达的靶抗原。在另一个实施方案中，双特异性衔接子结合在肿瘤血管或肿瘤微环境内的不同细胞上表达的靶抗原。在一个实施方案中，双特异性衔接子特异性结合癌细胞靶标和免疫效应细胞靶标。在一个实施方案中，双特异性接头特异性结合在癌细胞上表达的靶标(例如CD123)和在T淋巴细胞表面上表达的靶标(例如CD3)。在一些实施方案中，双特异性接头能够同时结合不同的靶抗原。在一些实施方案中，双特异性接头包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由抗原决定簇隔开。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为5-500、5-400、10-300、5-200、50-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-75、100-500、100-400、100-300、100-200或100-150个氨基酸。在进一步的实施方案中，衔接子包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由CD123抗原决定簇隔开。在进一步的实施方案中，衔接子包括两个或更多个由BCMA抗原决定簇隔开的可操作地连接的ADBD。在进一步的实施方案中，衔接子包括两个或更多个由AFP P26抗原决定簇隔开的可操作地连接的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在一些其中衔接子包括多于一个ADBD的实施方案中，ADBD可以是本文讨论的任何类型的ADBD。例如，ADBD可以是抗体、其抗原结合片段、ScFv、替代支架结合结构域、D结构域、T细胞受体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包含多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在一些实施方案中，当衔接子包含多于一个ADBD时，这些ADBD可以是相同类型的抗原结合分子，或可以是不同的。例如，衔接子可以包含两个作为D结构域的ADBD。两个作为D结构域的ADBD可以相同或不同。衔接子还可以包含作为D结构域的ADBD和作为scFv的ADBD。衔接子还可以包含作为T细胞受体或其抗原结合片段的ADBD和作为scFv的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包含两个或更多个由抗原决定簇隔开的可操作地连接的ADBD。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度为5-500、5-400、10-300、5-200、50-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-75、100-500、100-400、100-300、100-200或100-150个氨基酸。在进一步的实施方案中，衔接子包含两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由CD123抗原决定簇隔开。在进一步的实施方案中，所述衔接子包括两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由BCMA抗原决定簇隔开。在进一步的实施方案中，所述衔接子包括两个或更多个可操作地连接的ADBD，其由AFP P26抗原决定簇隔开。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括至少一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子包括多于一个包含D结构域的ADBD。在一些实施方案中，本文提供的衔接子的所有ADBD均包含D结构域。
在一些实施方案中，衔接子的ADBD被去免疫化。在一些实施方案中，通过替换预测的T细胞表位中的一个或多个氨基酸残基来减少与宿主MHC分子的结合，衔接子的ADBD被去免疫化。
在一些实施方案中，衔接子包括与含有感兴趣的AD的抗原靶结合的ADBD，并且对靶标的功能没有明显的影响。或者，在一些实施方案中，衔接子包括与含有感兴趣的AD的抗原靶结合的ADBD，并且完全或部分抑制、拮抗、激动、阻断、增加、刺激或干扰靶标的生物活性。结合可以被识别为激动或拮抗，并使用或常规修改本领域中已知的用于评估此类活性的测定、生物测定和/或动物模型来确定。
衔接子激动剂是指以某种方式增加或增强衔接子靶标的生物活性或具有与衔接子靶标的已知激动剂相当的生物活性的衔接子。在另一个实施方案中，衔接子是其结合的靶标的拮抗剂。衔接子拮抗剂是指完全或部分阻断或以某种方式干扰衔接子靶标的生物活性或具有与衔接子靶标的已知拮抗剂或抑制剂相当的生物活性的衔接子。
在一个实施方案中，衔接子特异性结合感兴趣的靶标，该靶标是血清蛋白。在一个实施方案中，衔接子特异性结合选自以下的血清蛋白：血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA))、甲状腺素结合蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和免疫球蛋白(例如，IgG、IgE和IgM)。不受理论的束缚，衔接子与载体蛋白的结合被认为赋予衔接子改进的药效学特征谱，其包括但不限于与缺少载体蛋白结合序列的衔接子相比改进的肿瘤靶向性、肿瘤渗透性、肿瘤内扩散性和增强的治疗活性(参见例如WO01/45746，其内容通过引用整体并入本文)。
iii.衔接子功能结构域
在一些实施方案中，衔接子包含第一抗原决定簇(AD)、与第二抗原决定簇结合的结构域(ADBD)，并且还包含赋予一种或多种额外所需特性(例如改进的制造)和/或药代动力学或药效学特性(例如改进的半衰期)的功能结构域。衔接子的功能结构域可以位于AD和ADBD之间。衔接子还可位于AD和ADBD两者的N端或AD和ADBD两者的C端。在衔接子包含两个或更多个AD的一些实施方案中，衔接子的功能结构域可位于两个或更多个AD之间、两个或更多个AD的N端或两个或更多个AD的C端。在衔接子包含两个或更多个ADBD的一些实施方案中，衔接子的功能结构域可位于两个或更多个ADBD之间、两个或更多个ADBD的N端或两个或更多个ADBD的C端。
在一些实施方案中，衔接子包含选自以下的功能结构域：Fc或变体Fc(例如，人Fc或变体Fc结构域)或其片段、血清蛋白(例如，人血清白蛋白)或其片段；FcRn结合结构域；血清蛋白结合结构域；细胞因子、生长因子、激素或酶；成像剂；标记剂；和肽标签。
衔接子的功能结构域可以是天然来源的或是重组工程化(例如，噬菌体展示、xenomouse或合成)的结果。在某些实施方案中，衔接子的功能结构域增加半衰期、增加或减少抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加或减少补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
在一些实施方案中，衔接子包含选自以下的功能结构域：Fc或变体Fc(例如，人Fc或变体人Fc结构域)或其片段或衍生物、血清蛋白(例如，人血清白蛋白)或其片段或衍生物(例如，血清蛋白结合结构域)；FcRn结合结构域；和血清蛋白结合结构域。
在一个实施方案中，衔接子包括功能结构域，该功能结构域包括抗体效应结构域或抗体效应结构域的衍生物，其赋予衔接子一种或多种效应功能，例如结合一种或多种Fc受体的能力。在一些实施方案中，功能结构域包括具有由CH2和CH3结构域提供的效应功能的抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域。在一些实施方案中，功能结构域包括具有由CH2和CH3结构域提供的效应功能的抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域的衍生物。可以包含在衔接子中以提供效应功能并且由本发明涵盖的其他序列对于本领域技术人员将是清楚的，并且可以根据所需的效应功能常规地选择和设计到本文涵盖的衔接子中。
在一个实施方案中，衔接子包含增加衔接子赋予的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的功能结构域(参见，例如，Bruhns等人,Blood 113:3716-3725(2009)；Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Lazar等人,PNAS103:4005-4010(2006)；Stavenhagen等人,Cancer Res.67:8882-8890(2007)；Horton等人,Cancer Res.68:8049-8057(2008)；Zalevsky等人,Blood 113:3735-3743(2009)；Bruckheimer,Neoplasia 11:509-517(2009)；WO2006/020114；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和WO2004/074455，其各自以引用的方式整体并入本文)。增加ADCC的衔接子的功能结构域中包含的Fc的效应功能赋予部分的片段工程化修饰的实例包括对应于以下的一种或多种修饰：IgG1-S298A、E333A、K334A；IgG1-S239D、I332E；IgG1-S239D、A330L、I332E；IgG1-P247I、A339D或Q；IgG1-D280H、K290S(具有或不具有S298D或V)；IgG1-F243L、R292P、Y300L；IgG1-F243L、R292P、Y300L、P396L；和IgG1-F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L；其中Fc区中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences of proteins of Immunological Interest,1991第5版)的EU索引编号。
因此，在一些实施方案中，衔接子包含功能结构域，该功能结构域包含赋予衔接子免疫球蛋白的生物学或生化特征的抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段赋予选自以下的特征：非共价二聚化的能力、定位于肿瘤部位的能力、和与没有抗体片段的衔接子相比增加的血清半衰期。在某些实施方案中，衔接子与不含衔接子的相应抗体片段至少一样稳定。在某些实施方案中，衔接子比不含衔接子的相应抗体片段更稳定。衔接子蛋白的稳定性可使用已建立的方法测量，包括例如ELISA技术。在一些实施方案中，衔接子在37℃下在全血(体内或离体)中稳定至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约24小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约48小时、至少约50小时、至少约55小时、至少约60小时、至少约65小时、至少约70小时、至少约72小时、至少约75小时、至少约80小时、至少约85小时、至少约90小时、至少约95小时或至少约100小时(包括所列时间之间的任何时间)。在一个实施方案中，衔接子包含免疫球蛋白效应结构域或半衰期影响结构域，其对应于免疫球蛋白结构域或片段，其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分已被改变以提供所需的生化特性，例如与具有相应未改变的免疫球蛋白序列的免疫球蛋白片段相比，降低或增加的效应功能、非共价二聚化的能力、增加的定位于肿瘤部位的能力、减少的血清半衰期或增加的血清半衰期。恒定区结构域的这些改变可以是氨基酸取代、插入或缺失。
在一个实施方案中，衔接子包含功能结构域，该功能结构域包含免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列，其赋予衔接子抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。在另外的实施方案中，衔接子包含已经被修饰以增加ADCC的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如，Bruhns,Blood 113:3716-3725(2009)；Shields,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Lazar,PNAS103:4005-4010(2006)；Stavenhagen,Cancer Res.67:8882-8890(2007)；Horton,Cancer Res.68:8049-8057(2008)；Zalevsky,Blood 113:3735-3743(2009)；Bruckheimer,Neoplasia 11:509-517(2009)；WO 06/020114；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和WO04/074455，其各自的内容通过引用整体并入本文)。包含在衔接子中的氨基酸序列中的增加ADCC的免疫球蛋白片段工程化修饰的实例包括具有对应于以下的一个或多个修饰的免疫球蛋白效应结构域序列:IgG1-S298A、E333A、K334A；IgG1-S239D、I332E；IgG1-S239D、A330L、I332E；IgG1-P247I、A339D或Q；IgG1-D280H、K290S(具有或不具有S298D或V)；IgG1-F243L、R292P、Y300L；IgG1-F243L、R292P、Y300L、P396L；和IgG1-F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L；其中Fc区中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences of proteins of Immunological Interest,1991第5版,其以引用的方式并入本文)的EU索引的编号。
在另外的实施方案中，衔接子包含功能结构域，该功能结构域包含免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列，其赋予衔接子抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在另外的实施方案中，衔接子包含已被修饰以增加抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的免疫球蛋白效应结构域的序列；(参见例如Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Lazar等人,PNAS103:4005-4010(2006)；Stavenhagen等人,CancerRes.67:8882-8890(2007)；Richards等人,Mol.Cancer Ther.7:2517-2527(2008)；Horton等人,Cancer Res.68:8049-8057(2008),Zalevsky等人,Blood 113:3735-3743(2009)；Bruckheimer等人,Neoplasia 11:509-517(2009)；WO 06/020114；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和WO04/074455，其各自内容通过引用整体并入本文)。包含在衔接子中的氨基酸序列中以增加ADCP的免疫球蛋白片段工程化修饰的例子包括具有对应于以下的一个或多个修饰的免疫球蛋白效应结构域序列：IgG1-S298A、E333A、K334A；IgG1-S239D、I332E；IgG1-S239D、A330L、I332E；IgG1-P247I、A339D或Q；IgG1-D280H、K290S(具有或不具有S298D或V)；IgG1-F243L、R292P、Y300L；IgG1-F243L、R292P、Y300L、P396L；IgG1-F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L；和IgG1-G236A、S239D、I332E；其中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences of proteins of ImmunologicalInterest,1991第5版，其以引用的方式并入本文)的EU索引的编号。
在另外的实施方案中，衔接子包含功能结构域，该功能结构域包含免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列，其赋予衔接子补体依赖性细胞毒性(CDC)。在另外的实施方案中，衔接子包含已被修饰以增加补体依赖性细胞毒性(CDC)的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如Idusogie等人,J.Immunol.166:2571-2575(2001)；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Natsume等人,CancerRes.68:3863-3872(2008)，其各自的内容通过引用整体并入本文)。例如，衔接子可以包含抗体片段或结构域，其包含增加CDC的一个或多个以下修饰：IgG1-K326A、E333A；IgG1-K326W、E333S、IgG2-E333S；其中残基的编号是Kabat等人(Sequences of proteins ofImmunological Interest,1991第5版,其以引用的方式并入本文)的EU索引的编号。
在另外的实施方案中，衔接子包含功能结构域，该功能结构域包含免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列，其赋予衔接子结合FcγRIIb受体的能力。在另外的实施方案中，衔接子包含免疫球蛋白效应结构域的序列，该序列已被修饰以增加对FcγRIIb受体的抑制性结合(参见，例如，Chu等人,Mol.Immunol.45:3926-3933(2008))。衔接子中的氨基酸序列中包含的增加与抑制性FcγRIIb受体的结合的免疫球蛋白片段工程化修饰的例子是IgG1-S267E、L328F。
IgG的半衰期由其与新生儿受体FcRn的pH依赖性结合介导。在某些实施方案中，衔接子包含功能结构域，该功能结构域包含免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列，其赋予衔接子结合新生儿受体FcRn的能力。在某些实施方案中，衔接子含有功能结构域，该功能结构域包含已被修饰以增强与FcRn的结合的免疫球蛋白FcRn结合结构域的序列(参见例如Petkova等人,Int.Immunol.18:1759-1769(2006)；Dall'Acqua等人,J.Immunol.169:5171-5180(2002)；Oganesyan等人,Mol.Immunol.46:1750-1755(2009)；Dall'Acqua等人,J.Biol.Chem.281:23514-23524(2006),Hinton等人,J.Immunol.176:346-356(2006)；Datta-Mannan等人,Drug Metab.Dispos.35:86-94(2007)；Datta-Mannan等人,J.Biol.Chem.282:1709-1717(2007)；WO 06/130834；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Yeung等人,J.Immunol.182:7663-7671(2009)，其各自的内容以引用的方式全文并入本文)。
在另外的实施方案中，衔接子包含功能结构域，该功能结构域包含已被修饰以在pH6.0而不是pH7.4下对FcRn具有选择性亲和力的免疫球蛋白效应结构域的序列。举例来说，衔接子功能结构域可以包含抗体片段或结构域，其包含增加半衰期的一个或多个以下修饰：IgG1-M252Y、S254T、T256E；IgG1-T250Q、M428L；IgG1-H433K、N434Y；IgG1-N434A；和IgG1-T307A、E380A、N434A；其中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,1991第5版，其以引用的方式入本文)的EU索引的编号。
根据另一个实施方案，衔接子包含功能结构域，该功能结构域包含对应于已被修饰以在其对应于Fc区(例如，Fcγ)位置的序列中包含至少一个取代的免疫球蛋白效应结构域的氨基酸序列，所述位置选自：238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438和439，其中Fc区中残基的编号根据Kabat等人(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,1991第5版，其以引用的方式入本文)的EU编号系统。在特定实施方案中，衔接子包含功能结构域，该功能结构域包含免疫球蛋白效应结构域衍生物的序列，其中对应于位置434的至少一个残基是选自以下的残基：A、W、Y、F和H。根据另一个实施方案，衔接子包含具有以下对应取代S298A/E333A/K334A的免疫球蛋白效应片段衍生物的序列。在另一个实施方案中，衔接子包含具有对应于K322A的取代的免疫球蛋白效应结构域衍生物。在另一个实施方案中，衔接子包含具有以下取代K246H、H268D、E283L、S324G、S239D和I332E之一或任意组合的免疫球蛋白效应结构域衍生物的序列。根据又一实施方案，衔接子包含具有对应于D265A/N297A的取代的免疫球蛋白效应结构域衍生物的序列。
在某些实施方案中，衔接子包含功能结构域，该功能结构域包含免疫球蛋白效应结构域的序列，其已使用本领域已知的技术进行糖基工程化或突变以增加效应功能。例如，衔接子中包含的恒定区结构域序列的失活(通过点突变或其他方式)可以降低循环衔接子的Fc受体结合，从而增加肿瘤定位。在其他情况下，与本发明的某些实施方案一致的恒定区修饰可以缓和补体结合，从而减少缀合的细胞毒素的非特异性结合和血清半衰期。恒定区的其他修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分，其由于增加的抗原特异性或抗体灵活性而允许增强的定位。修饰所产生的生理特征谱、生物利用度和其他生化效应例如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期可以使用众所周知的免疫学技术轻松测量和量化，而无需过度实验。
可用于实践所提供的方法的衔接子的产生可使用本领域已知的多种标准化学合成技术、半合成方法和重组DNA方法进行。在几个实施方案中，用于产生衔接子的总体生产方案包括获得参考蛋白质支架并鉴定用于修饰的支架内的多个残基。取决于实施方案，参考支架可包括具有一个或多个α螺旋区域或其他三级结构的蛋白质结构。一经鉴别，可修饰多个残基，例如通过氨基酸的取代。在一些实施方案中，取代是保守的，而在其它实施方案中，进行非保守取代。在一些实施方案中，天然氨基酸(例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸之一)被取代到目标位置的参考支架中以进行修饰。在某些实施方案中，修饰不包括取代半胱氨酸或脯氨酸。在特定实施方案中所需的所有已鉴别位置处进行修饰后，所得的修饰多肽(例如，候选衔接子)可以被重组表达，例如在质粒、细菌、噬菌体或其他载体中(例如，以增加每个修饰的多肽的数量)。然后，可以纯化和筛选修饰的多肽以鉴定具有与特定感兴趣的靶标特异性结合的修饰的多肽。在几个实施方案中，某些修饰的多肽将显示出相对于参考支架对感兴趣的靶标的增强的结合特异性，在一些实施方案中，所述参考支架可能对给定的感兴趣的靶标表现出很少或没有结合。在其他实施方案中，取决于感兴趣的靶标，参考支架可能显示出与感兴趣的靶标的一些相互作用(例如非特异性相互作用)，而某些修饰的多肽将表现出对感兴趣的靶标的至少约两倍、至少约五倍、至少约十倍、至少约二十倍、至少约五十倍或至少约一百倍(或更多)增加的结合特异性。任选地，参考序列和/或修饰的多肽(例如，衔接子)可以被去免疫化。例如，可以鉴定和修饰具有潜在免疫原性的残基或基序，以减少或消除对衔接子的潜在免疫应答。关于衔接子的生产、选择和分离的各种实施方案的其他细节将在下文中更详细地提供。
表2-示例性的含AFP p26的衔接子
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含表2中公开的一种或多种衔接子的组合物。在其它实施方案中，本公开内容提供了包含一种或多种衔接子的组合物，所述衔接子包含与表2中公开的序列具有60-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、95-99％同源性(以及其中的重叠范围)的序列。在一些实施方案中，具有此类同源性的衔接子与表2中的相应参考序列相比在功能上相似或相同。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含一种或多种衔接子的多肽，所述衔接子与表2(参考序列)中公开的一种或多种衔接子(全部或部分)竞争CD123结合。可以使用本领域已知的标准竞争测定法常规地确定一种多肽与参考多肽竞争结合相应靶标的能力。在一些实施方案中，竞争不需要衔接子与表2的衔接子竞争相同的表位，而是多肽可以通过结合空间抑制表位、重叠表位等进行竞争。
C.嵌合抗原受体
本文还提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CAR包含含有抗原决定簇(AD)的细胞外结构域。在一些实施方案中，本文公开的CAR包含含有至少一个本文公开的D结构域(DD)的细胞外结构域以赋予结合特异性。在一些实施方案中，本文公开的CAR包含含有ADBD的细胞外结构域。CAR可以由任何细胞类型表达。
在一些实施方案中，本文公开的嵌合抗原受体(CAR)包含与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的嵌合抗原受体(CAR)包含结合AFP p26AD的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，与AFPp26 AD结合的ADBD包括与AFP p26 AD结合的scFv。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包括与AFP p26 AD结合的D结构域。在一些实施方案中，AFP p26 AD包括选自SEQ IDNO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包括SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的嵌合抗原受体(CAR)包含AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的CAR包括包含抗原决定簇(AD)的细胞外结构域。此类CAR可在细胞(例如，免疫细胞或免疫效应细胞)的表面上表达，并与包含结合AD的第一ADBD(例如，D结构域)和结合靶细胞上的靶标的第二ADBD(例如，D结构域)的衔接子组合使用，例如，以杀死靶细胞。在一些实施方案中，AD包括AFP或其片段。在一些实施方案中，AD包括p26或其片段。在一些实施方案中，AD包括SEQ ID NO：37-43或44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AD包括SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，AD包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的CAR包括包含至少一个D结构域(DD)的细胞外结构域。在一些实施方案中，D结构域可以识别靶细胞上的抗原决定簇(AD)(例如CD123)或衔接子所包含的AD(例如p26)。在一些实施方案中，包含能够结合靶细胞上的AD的DD的CAR可以在细胞(例如免疫细胞或免疫效应细胞)表面上表达，并用于例如杀死表达AD的靶细胞。在一些实施方案中，本文公开的CAR包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含至少一个CD123结合D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含能够结合第一AD(例如，p26)的DD的CAR可在细胞(例如，免疫细胞或免疫效应细胞)表面上表达，并与包含第一AD和结合靶细胞上的第二AD的ADBD(例如，D结构域)的衔接子组合使用，例如，以杀死靶细胞。在一些实施方案中，本文公开的CAR包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含至少一个p26结合D结构域，所述p26结合D结构域包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的CAR包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含至少一个p26结合D结构域，所述p26结合D结构域包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，p26结合DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，p26包含SEQ ID NO：37-43或44的氨基酸序列。在一些实施方案中，p26包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，p26包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的CAR包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含ADBD。在几个实施方案中，ADBD至少部分地由本文公开的靶结合多肽(例如，D结构域)组成。在一些实施方案中，ADBD可以识别靶细胞上的抗原决定簇(AD)(例如，CD123)或衔接子所包含的AD(例如，p26)。在一些实施方案中，包含能够结合靶细胞上的AD的ADBD的CAR可以在细胞(例如，免疫细胞或免疫效应细胞)的表面上表达，并且例如用于杀死表达AD的靶细胞。在一些实施方案中，包含能够结合第一AD(例如，p26)的第一ADBD的CAR可以在细胞(例如，免疫细胞或免疫效应细胞)的表面上表达，并且与包含第一AD和结合靶细胞上的第二AD的第二ADBD(例如，D结构域)的衔接子组合使用，例如用于杀死靶细胞。在一些实施方案中，p26包含SEQ ID NO：37-43或44的氨基酸序列。在一些实施方案中，p26包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，p26包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
本发明还提供了一种创建细胞相关DDpp的方法，所述细胞相关DDpp由至少一种DDpp组成，所述DDpp被设计用于赋予膜结合融合蛋白结合特异性。DDpp受体可以由任何细胞类型表达。在一个实施方案中，DDpp受体融合蛋白包括嵌合抗原受体(CAR)或DDpp-CAR，其包括：细胞外靶向结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在另一个实施方案中，DDpp-CAR由细胞外靶向结构域、跨膜结构域和细胞质结构域组成，其中细胞质结构域包括信号传导结构域。在进一步的实施方案中，DDpp-CAR细胞外结构域包括一个或多个DDpp，其中每个DDpp构成具有相同或不同特异性的特异性结合结构域。在一些实施方案中，靶特异性结构域针对本文公开的癌症或肿瘤抗原中的一种或多种，例如作为非限制性实例的BCMA、CD123和CS1。在一些实施方案中，靶特异性结构域针对AFP p26。
在几个实施方案中，细胞内信号传导结构域或其片段选自：人CD3ζ结构域、41BB结构域、CD28结构域及其任意组合。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO：115、116的序列或其组合。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：117的序列。根据实施方案，共刺激信号传导区包括选自以下组的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7H3、与CD83特异性结合的配体及其任何组合。
在几个实施方案中，CAR包括融合蛋白，该融合蛋白包括额外的靶结合多肽。
在一些实施方案中，CAR的ADBD包括至少一个替代支架结合结构域(例如，D结构域或亲和体)，其被设计用于赋予膜结合CAR结合特异性。包括替代支架结合结构域的受体可以由任何细胞类型表达。
在一个实施方案中，CAR由以下元件组成：细胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域，其中胞质结构域包含信号传导结构域。在另一个实施方案中，CAR由细胞外结构域和跨膜结构域组成。在进一步的实施方案中，CAR由细胞外结构域组成，所述细胞外结构域由具有相同或不同特异性的一个或多个ADBD(例如，D结构域)组成。在一个实施方案中，CAR的细胞内结构域(例如，胞质结构域)包含CD3ζ链的细胞内结构域。在另一个实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域由CD3ζ链的细胞内结构域的一部分组成。在进一步的实施方案中，CAR的细胞内结构域包含CD3ζ链的细胞内结构域和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指CAR的一部分，其包含共刺激分子的细胞内结构域的全部或部分。共刺激分子和这些分子的能够赋予CAR共刺激特性的部分是本领域已知的，并且可以常规地掺入CAR中。此外，可以掺入这些细胞内信号传导和共刺激结构域的截短或突变以进一步增强或减少受体信号传导。在优选的实施方案中，T细胞被遗传修饰以稳定地表达CAR。在这样的实施方案中，CAR的细胞质结构域可以被设计为仅包含CD28和/或41BB信号传导结构域，或者与在本发明的背景下有用的任何其他所需细胞质结构域组合。在一个实施方案中，CAR的细胞质结构域可以被设计为进一步包括CD3-ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞质结构域包含SEQ ID NO：115、116的序列或其组合。在一些实施方案中，细胞质结构域包含SEQ ID NO：117的序列。在一个实施方案中，CAR包括细胞外结构域、具有穿过细胞膜的跨膜结构域的细胞外蛋白接头(例如在T细胞或NK细胞中发现的)和细胞质结构域，任选地包含多个信号传导模块。在几个实施方案中，CAR还可以包含表位标签。在几个实施方案中，CAR的细胞质结构域可以包括但不限于CD3-ζ、41BB和CD28信号传导模块及其组合。在一些实施方案中，细胞质结构域包含SEQ ID NO：115、116或其组合的序列。在一些实施方案中，细胞质结构域包含SEQ ID NO：117的序列。
还提供了编码CAR的分离的核酸序列，所述CAR包括靶结合多肽作为靶向区域的一部分(或全部)。
在一些实施方案中，CAR的靶向结构域包含多个结合结构域(例如，DD，或一个或多个DD和scFv)，其包括额外的靶结合多肽。
本公开内容还提供了包含编码CAR的核酸序列的细胞，其中CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域至少部分地由结合感兴趣的靶标(例如，CD123和AFP p26)的公开的DDpp、跨膜结构域和信号传导结构域组成。在一些实施方案中，CAR特异性结合肿瘤抗原(因此起到将表达CAR的细胞递送至肿瘤的作用。在一些实施方案中，肿瘤抗原与血液系统恶性肿瘤相关。在一些实施方案中，肿瘤抗原是CD123。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞或其他免疫细胞类型。在一些实施方案中，表达CAR的细胞(无论是T细胞、NK细胞还是其他细胞类型)在多肽结合其相应的肿瘤抗原时表现出抗肿瘤免疫力。
i.细胞外结构域
本文提供的CAR包含一个或多个抗原决定簇结合结构域(ADBD)(例如，D结构域)。CAR的ADBD可以是本文所述的任何ADBD(例如，D结构域)。示例性ADBD包含多肽，例如抗体分子(其包括抗体及其抗原结合片段，例如，免疫球蛋白、单结构域抗体(sdAb)和scFv)或非抗体支架(例如D结构域或亲和体)。
取决于要靶向的所需抗原，CAR的细胞外结构域可以被工程化为包括一个或多个特异性结合所需抗原靶标的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。例如，在一个实施方案中，CAR被工程化为靶向CD123，并且CD123结合ADBD(例如，D结构域)被整合到CAR的细胞外结构域中。或者，CAR的细胞外结构域可以包括多于一个的ADBD，从而赋予CAR多特异性或多价性。
CAR的细胞外结构域中ADBD的选择取决于要靶向的一种或多种细胞的身份。例如，CAR的细胞外结构域可以被工程化为特异性结合同一细胞或另一细胞上的细胞表面蛋白，例如受体。在其他实施方案中，CAR的细胞外结构域被工程化为特异性结合可溶性分子，例如免疫球蛋白。
在其他实施方案中，CAR的细胞外结构域包含一个或多个ADBD(例如，D结构域)，其结合作为与癌症相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。在一些实施方案中，ADBD靶向并结合肿瘤或癌症抗原(例如，本文所述或本领域已知的TAA、TSA、CAA、CSA或其他肿瘤抗原)。因此，本文提供了用于创建CAR的方法、它们在创建嵌合细胞(例如，人T细胞和自然杀伤细胞)中的用途以及这些嵌合T细胞和NK细胞在过继免疫疗法中的用途。
ADBD(例如，D结构域)的选择可以取决于定义靶细胞表面的配体或受体的类型和数量。例如，可以选择ADBD来识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体或受体。可以充当配体或受体的细胞表面标记的例子包括与特定疾病状态相关的细胞表面标记，例如病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫感染、自身免疫性疾病和与不想要的细胞增殖相关的疾病(例如癌症，如本文所述的癌症)的细胞表面标记。
在一些实施方案中，ADBD与CD123(例如包含SEQ ID NO：1序列的多肽)结合。在一些实施方案中，ADBD包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的DD序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ADBD(例如，D结构域)与AFP(例如，包含SEQ ID NO：36的序列的多肽)或其片段结合。在一些实施方案中，ADBD(例如，D结构域)与AFP p26(例如，包含SEQID NO：37-43或44的序列的多肽)结合。在一些实施方案中，ADBD(例如，D结构域)与包含SEQID NO：37的序列的多肽结合。在一些实施方案中，ADBD包含选自SEQ ID NO：74-93和94的DD序列。在一些实施方案中，DD与AFP p26结合并且包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，DD与AFP p26结合并且包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR包含作为抗体或其抗原结合片段的ADBD。在一些实施方案中，CAR包含作为scFv的ADBD。在一些实施方案中，CAR包含作为替代支架结合结构域的ADBD。在一些实施方案中，CAR包含作为D结构域的ADBD。在一些实施方案中，CAR包含T细胞受体或其抗原结合片段。
本文还提供了CAR，其中CAR包含多个ADBD。在一些实施方案中，CAR包含多个相同的ADBD。在一些实施方案中，CAR包含多个不同的ADBD。在一些实施方案中，CAR包含结合相同抗原决定簇的多个ADBD。在一些实施方案中，CAR包含结合不同AD的多个ADBD。在一些实施方案中，CAR包含结合相同细胞上的不同AD的多个ADBD。在一些实施方案中，CAR包含结合不同细胞上的不同AD的多个ADBD。
在一些实施方案中，CAR包含多个，例如2、3、4、5个或多于5个ADBD(例如，D结构域、亲和体或scFv)，其中每个ADBD能够结合靶抗原。在一个实施方案中，CAR的两个或更多个ADBD可以结合不同的AD。在另一个实施方案中，CAR的两个或更多个ADBD可以结合相同抗原，例如，相同抗原上的相同或不同表位。在一个实施方案中，CAR的多个ADBD彼此连接，例如，第一个ADBD的C端连接到第二个ADBD的N端。在一个实施方案中，第一个ADBD的C端通过共价键(例如，肽键)连接到第二个ADBD的N端。
在一些实施方案中，接头或铰链区包含在一个或多个ADBD之间，例如，接头或铰链区位于第一个ADBD的C末端和第二个ADBD的N末端之间。举例来说，包含两个ADBD(例如，ADBD1和ADBD2)的抗原结合成员可以按以下配置排列：[ADBD1]-[接头/铰链]-[ADBD2]。可以以类似的方式添加额外的ADBD，任选地，接头或铰链区位于ADBD的C末端和下一个ADBD的N末端之间。适用于连接多个抗原结合成员的接头或铰链区是柔性的、不可切割的，并且允许每个ADBD独立于其他ADBD进行近乎自由的运动，以促进同时与多个靶AD结合。可以使用本领域已知的任何柔性接头或铰链区。接头的例子包括包含甘氨酸和丝氨酸残基的肽接头，例如(GGGGS)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(SEQ IDNO：96)。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO：45-48、118或119的序列。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO：45-48、118或119的序列。
在一些实施方案中，CAR包含CD123结合DD。在一些实施方案中，CAR包含BCMA结合DD和CD123结合DD。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合部分特异性结合CD123和CD33。在一些实施方案中，CAR的抗原结合部分特异性结合CD123和LeY。在另外的实施方案中，CAR的抗原结合部分进一步结合选自以下的靶标：BCMA、CS1、HVEM、BTLA、DR3、CD19、CD20和CD22。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合部分进一步结合肿瘤抗原。在另外的实施方案中，CAR的抗原结合部分进一步结合CD33或LeY。在另外的实施方案中，CAR的抗原结合部分进一步结合选自以下的靶标：BCMA、CD123、CS1、HER2、HVEM、BTLA、DR3、CD19、CD20和CD22。
在一些实施方案中，CAR包含2、3、4、5个或多于5个DD和/或其他结合结构域(例如，scFv)，其特异性结合在癌细胞表面上表达的感兴趣的靶标(例如，CD123)。在另外的实施方案中，CAR包含2、3、4、5个或多于5个DD或其他结合结构域(例如，scFv)，其特异性结合在癌细胞表面上表达的第二个不同的感兴趣的靶标。在另外的实施方案中，施用的CAR还包含2、3、4、5个或多于5个DD或其他结合结构域(例如，scFv)，其特异性结合由第二个不同的癌细胞或血管内皮细胞表达的第二个不同的感兴趣的靶标。在一些实施方案中，CAR包含2、3、4、5个或多于5个特异性结合AFP p26的DD和/或其他结合结构域(例如scFv)。在一些实施方案中，CAR包含2、3、4、5个或多于5个特异性结合CD123的DD和/或其他结合结构域(例如scFv)。在一些实施方案中，CD123结合DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123结合DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
ii.细胞外间隔结构域
在一些实施方案中，CAR包含细胞外间隔结构域。如本文所用，术语“细胞外间隔结构域”或“ESD”是指位于ADBD和跨膜结构域之间的CAR的多肽序列。在一个实施方案中，细胞外间隔结构域允许与细胞的外表面和ADBD保持足够的距离以及灵活性以最小化细胞和ADBD之间的空间位阻。
在特定实施方案中，细胞外间隔结构域足够短或灵活，以至于它不会干扰包括CAR的细胞与带有AD的细胞(例如靶细胞)的接合。在一个实施方案中，细胞外间隔结构域的长度为2至20、5至15、7至12或8至10个氨基酸。在一些实施方案中，ESD结构域包括至少50、20或10个残基。在一些实施方案中，ESD的长度为10至300、10至250或10至200个残基。
在一些实施方案中，ESD从细胞延伸的距离足够短，使得铰链不会阻碍CAR ADBD与靶细胞表面的接合。在一些实施方案中，ESD从细胞毒性细胞的表面延伸小于20、15或10纳米。因此，ESD的适用性可能受线性长度、氨基酸残基数和ESD的灵活性的影响。举例来说，IgG4 ESD的长度可以长达200个氨基酸，但由于Ig结构域折叠，它从细胞毒性细胞表面延伸的距离较小。CD8αESD，长度为～8纳米的～43个氨基酸。相比之下，IgG4 C2&C3 ESD的长度为约200个氨基酸，但与细胞毒性细胞表面的距离与CD8αESD相当。虽然不希望受理论的束缚，但延伸的相似性受灵活性的影响。
在一些实施方案中，细胞外间隔结构域包括但不限于抗体的Fc片段或其片段或衍生物、抗体的铰链区或其片段或衍生物、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工间隔序列或其组合。细胞外间隔结构域的其他例子包括但不限于CD8a铰链和由多肽制成的人工间隔物，其可能与例如IgG(例如人IgG4)的CH1和CH3结构域或Gly3一样小。在一些实施方案中，细胞外间隔结构域是以下中的任一个或多个：(i)IgG4的铰链、CH2和CH3区，(ii)IgG4的铰链区，(iii)IgG4的铰链和CH2区，(iv)CD8a的铰链区，(v)IgG1的铰链、CH2和CH3区，(vi)IgG1的铰链区或(vi)IgG1的铰链和CH2区。其他细胞外间隔结构域对于本领域技术人员来说是明显的，并且可以与本文提供的替代实施方案结合使用。
在一些实施方案中，ESD是天然存在的序列。在一些实施方案中，CAR的ESD对应于来自人蛋白质的ESD、其片段或短寡核苷酸或多肽接头。在一些实施方案中，CAR ESD对应于人Ig(免疫球蛋白)ESD(铰链)或其片段。在一个实施方案中，ESD包含(例如，由其组成)IgG4ESD的氨基酸序列。在一个实施方案中，例如，铰链包含(例如，由其组成)IgD铰链的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链可以是人CD8铰链或其片段。在一个实施方案中，例如，铰链包含(例如，由其组成)CD8铰链的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ESD是人工序列。在一个实施方案中，ESD是包含甘氨酸-丝氨酸双联体的短寡肽接头。
在一些实施方案中，CAR包含CD8a细胞外间隔结构域。
在一些实施方案中，CAR不包含细胞外间隔结构域。
iii.跨膜结构域
本文使用的术语“跨膜结构域”(TMD)是指细胞表面表达的蛋白质(例如CAR)的跨越质膜的区域。在一些实施方案中，TMD连接细胞外序列(例如，细胞外ADBD或细胞外AD)和细胞内序列(例如，细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域是跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白)的跨膜区、人工疏水序列或其组合。其他跨膜结构域对于本领域技术人员来说是明显的，并且可以与本发明的替代实施方案结合使用。在一些实施方案中，细胞外ADBD是CD123结合ADBD(例如，D结构域)。在一些实施方案中，细胞外ADBD包含SEQ IDNO：8、13、14、31、32或33的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外ADBD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外ADBD是p26结合ADBD(例如，D结构域)。在一些实施方案中，细胞外ADBD包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外ADBD包含SEQ ID NO 73的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外AD包含p26。在一些实施方案中，细胞外AD包含SEQ ID NO：37-43或44的氨基酸序列。
CAR可以被设计为包含与受体的细胞外结构域融合的跨膜结构域。如上所述，细胞外结构域和跨膜结构域的融合可以在有或没有接头的情况下完成。在一个实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然缔合的跨膜结构域。在特定实施方案中，CAR中的跨膜结构域是CD8a跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列。在一些情况下，CAR的跨膜结构域包含CD8a铰链结构域。在一些实施方案中，CD8a铰链结构域，也称为细胞外间隔结构域(ESD)，包含SEQ ID NO：112的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域通过氨基酸取代来选择或修饰，以促进或抑制与其他表面膜蛋白的缔合。
跨膜结构域可以来自天然或合成来源。当来源是天然时，该结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。对于本文的目的特别有用的跨膜区可以源自(即，至少包含其跨膜区)选自以下组的成员：T细胞受体的α、β或ζ链；CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8a、CD8b、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一些实施方案中，跨膜结构域源自NKR的跨膜区。在一些实施方案中，跨膜结构域源自CD8a的跨膜区。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，跨膜结构域源自选自以下的分子的跨膜区：KIRDS2、OX40、TNFR2、LFA1(CD11a、CD18)、ICOS、41BB、GITR、LTBR、BAFFR、HVEM、NKp80(KLRF1)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGB7、VLA1、VLA6、IA4、ITGAX、CD11c、ITGB1 CD27、CD29、ITGB2、CD2、CD11a、CD11b、CD11d、CD18、CD19、CD40、CD49a、CD49d、CD49f、CD84、CD96、CD100、CD103、CD160、CD162、CD226、CD229、CEACAM1、CRTAM、PSGL1、SLAM(SLAMF1)、SLAMF4、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLAMF8、SELPLG和PAG/Cbp。或者，跨膜结构域可以是合成的，并且优选主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在进一步的实施方案中，跨膜结构域在跨膜结构域的每一端包含FWV(苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸)的三联体。
示例性的NKR结构域例如跨膜结构域、铰链结构域或茎结构域、或细胞内(例如细胞质)结构域(通过该结构域所源自的NKR鉴别)，杀伤免疫球蛋白KIR2DL1受体(KIR)包括KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、KIR2DP1、NCR:、NKp30、NKp44、NKp46、SLAM；受体SLAM、CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、CD2F-10、SLAMF6、SLAMF7；Fc结合受体CD16、FcgRIII、CD64、Ly49；受体Ly49、凝集素相关NK Ly49A细胞受体、Ly49C；其他NK受体NKG2D、CD160(含TM的剪接变体)DNAM1、CRTAM、CD27、PSGL1、CD96、CD100、NKp80、CEACAM1和CD244。
iv.细胞内信号传导结构域
本文描述了可用于根据本发明的嵌合抗原受体(CAR)的细胞内信号传导结构域。
本文使用的“细胞内信号传导结构域”(ISD)或“细胞质结构域”是指CAR中传递效应功能信号并指示细胞执行其专门功能(例如，细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子分泌)的部分。
CAR的细胞质结构域(即细胞内信号传导结构域)负责激活经工程化以表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应功能包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指CAR蛋白的转导效应功能信号并指示细胞执行专门功能的部分。虽然通常可以使用对应于天然存在的受体的整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，没有必要使用整条链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的范围内，只要它能转导效应功能信号，这种截短部分就可以代替完整链使用。因此，术语细胞内信号传导结构域意味着包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。在一个实施方案中，CAR中的细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列以及协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导的共受体的序列，或这些序列的任何具有功能能力的衍生物或变体。转导效应功能信号的结构域的实例包括但不限于T细胞受体复合物的ζ链或其任何同源物(例如，η链、FcsRly和β链、MB1(Iga)链、B29(Ig)链等)、人CD3ζ链、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和参与T细胞转导的其他分子，例如CD2、CD5和CD28。
在一些实施方案中，当与CAR的细胞内信号传导结构域融合的细胞外结构域(例如，ADBD)与同源AD结合时，CAR的细胞内信号传导结构域产生细胞内信号。CAR的细胞内信号传导结构域可以包括主要细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，CAR被构建用于在免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)中表达，使得表达的CAR包含结构域例如主要细胞内信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其源自通常与免疫细胞相关的多肽。例如，在一些实施方案中，CAR用于在T细胞中表达并且包含41BB结构域和CD3ζ结构域。在另一个实施方案中，CAR分子被构建用于在免疫细胞中表达，使得表达的CAR包含源自通常不与免疫细胞相关的多肽的结构域。例如，在一些实施方案中，用于在T细胞中表达的CAR包含源自NK细胞的KIR结构域。在替代实施方案中，用于在NK细胞中表达的CAR包含41BB结构域和源自T细胞的CD3ζ结构域(参见例如WO2013/033626，以引用的方式并入本文)。
CAR的细胞内信号传导结构域包含足够的初级刺激分子序列以产生细胞内信号，例如当与其融合的ADBD结合同源AD时。在特定实施方案中，CAR的细胞内信号介导选自以下组的T细胞应答：增殖、细胞因子分泌、杀伤、活化和分化。
在一个实施方案中，CAR的细胞内信号传导区包含含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的结构域。在进一步的实施方案中，CAR的细胞内信号传导区包含来自选自以下的分子的一个或多个含ITAM的结构域：TCRζ(CD3ζ)、FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FCER1B)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12、CD32(FcγRIIa)、CD79a和CD79b。在具体实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。在另一具体实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域包含DAP12信号传导结构域。在一些实施方案中，含有ITAM的信号传导结构域与天然存在的含有ITAM的结构域的相应残基具有至少70、75、80、85、90、95、98或99％的序列同一性，或与天然存在的含有ITAM的结构域的相应残基在不超过30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基上不同。
在本发明中特别有用的含有ITAM的主要细胞质信号传导序列的例子包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选的是，CAR中的细胞质信号传导分子包括源自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
在优选实施方案中，CAR的细胞质结构域包含单独的或与在CAR的背景下有用的任何其他所需细胞质结构域组合的CD3-ζ信号传导结构域。例如，CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指CAR的一部分，其包含共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效反应所必需的。此类分子的例子包括CD27、CD28、41BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7H3、TIM1和LAG3。
本文使用的“共刺激结构域”(CSD)是指CAR中增强记忆细胞增殖、存活和/或发育的部分。CAR可以包含一个或多个共刺激结构域。每个共刺激结构域包含任何一个或多个例如TNFR超家族成员(选自CD28、CD137(41BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM1、LFA1(CD1 la/CD18)、Lck、TNFRI、TNFRII、Fas、CD30和CD40或其组合)的共刺激结构域。其他共刺激结构域(例如来自其他蛋白质)对于本领域技术人员来说是明显的，并且可以与本发明的替代实施方案结合使用。
在一些实施方案中，CAR的细胞内结构域包含含有ITAM的结构域和共刺激信号传导结构域，其包含当与其融合的细胞外ADBD结合同源配体时足以产生细胞内信号的共刺激分子的功能片段或类似物。在一些实施方案中，CAR包含与在选自以下的分子中发现的共刺激信号传导结构域相对应的共刺激信号传导结构域：CD137(41BB)、OX40、LIGHT、TNFR2、TRANCE/RANKL、GITR、BAFFR、HVEM、B7H3、CDS、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、VLA1、VLA6、C49f、IA4、LFA1、CD2、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11A、CD11B、CD11C、CD11D、CD18、CD19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49A、CD49D、CD69、CD84、CD96，CD100、CD103、CD150、CD160、CD162、CD226、CD229、CD278、ICAM1、CEACAM1、CRTAM、PSGL1、SLAMF1、SLAMF4、SLAMF6、SLAMF7、SLAMF8、LTBR、LAT、GADS、PAG/Cbp、SLP76、NKG2C、NKp30、NKp44、NKp46和NKp80。
在一些实施方案中，CAR包含与选自41BB、CD28、CD27、ICOS和OX40的分子中发现的共刺激结构域相对应的共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR包含多个共刺激结构域。在特定实施方案中，CAR包含以下共刺激信号传导结构域，从细胞外到细胞内方向：41BB-CD27、CD27-41BB、41BB-CD28、CD28-41BB、OX40-CD28、CD28-OX40、CD28-41BB；或41BB-CD28。
在一些实施方案中，CAR的共刺激信号传导结构域与天然存在的共刺激结构域的相应残基具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的同一性，或与天然存在的共刺激结构域的相应残基在不超过30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基上不同。
在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO：115、116或其组合的序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO：117的序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含具有与SEQ ID NO：115、116或117具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO：115、116或117的序列的细胞内信号传导结构域，所述序列包含1、2、3、4、5、7、8、9、10、15或20个插入、缺失或取代。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO：115、116或117的序列的细胞内信号传导结构域，所述序列包含1、2、3、4、5、7、8、9或10个插入、缺失或取代。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO：115、116或117的序列的细胞内信号传导结构域，所述序列包含1、2、3、4、5、7、8、9或10个取代。
多肽接头可以位于CAR的相邻元件之间。例如，接头可以位于相邻ADBD之间或ADBD与跨膜结构域之间或跨膜结构域与细胞质结构域之间或相邻细胞质结构域之间。CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以以随机或指定的顺序彼此连接。任性地，短接头(优选长度为2至10个氨基酸)可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双链体提供特别合适的接头。
在一些实施方案中，CAR包括靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR跨膜结构域包括CD8a、41BB或CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR跨膜结构域包括CD8a跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR包括CD8a跨膜结构域和CD8a细胞外间隔结构域。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8a细胞外间隔结构域(ESD)，也称为铰链结构域，包含SEQ ID NO：112的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQID NO：115、116或其组合的序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO：117的序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含具有与SEQID NO：115、116或117具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO：115、116或117的序列的细胞内信号传导结构域，所述序列包含1、2、3、4、5、7、8、9、10、15或20个插入、缺失或取代。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO：115、116或117的序列的细胞内信号传导结构域，所述序列包含1、2、3、4、5、7、8、9或10个插入、缺失或取代。在一些实施方案中，CAR包含具有SEQ ID NO：115、116或117序列的细胞内信号传导结构域，所述序列包含1、2、3、4、5、7、8、9或10个取代。在一些实施方案中，CAR细胞内信号传导结构域包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体以及它们的任意组合。在一些实施方案中，CAR还包含具有与DD靶结合结构域相同或不同的靶标的第二靶结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含结合CD123的第一靶结合结构域和结合不同靶标的第二靶结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含结合CD123的第一和第二靶结合结构域。在一些实施方案中，CAR在免疫效应细胞中表达。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，免疫效应细胞是自体细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，CAR与脂质体缔合。在一些实施方案中，CAR包含靶结合结构域，该靶结合结构域包含本文公开的DD(例如，包含SEQ ID NO：8-33或74-94的氨基酸序列的DD)。在一些实施方案中，DD与CD123结合并且包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，DD与AFP p26结合并且包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，DD与AFP p26结合并且包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，DD与AFP p26结合并且包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含含有p26的细胞外AD。在一些实施方案中，细胞外AD包含SEQ ID NO：37-43或44的氨基酸序列。
适合与本文公开的DDpp结合使用的CAR(例如，衔接子和CAR)已在国际申请公开号WO2016164305、WO2016164308A1、WO2019099440和WO2019099433、美国专利号10,662,248和10,647,775以及美国专利申请号20200223934和20210002381中公开，其中每一个均出于所有目的以引用的方式并入本文。
表3-示例性嵌合抗原受体
D.另外的DDpp融合蛋白
在一些实施方案中，DDpp含有异源多肽，所述异源多肽包含由细胞表面受体的细胞外结构域的5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100或10-50个氨基酸组成的片段。在一些实施方案中，DDpp含有异源多肽，所述异源多肽包含BCMA(SEQ ID NO：34)或CD123(SEQ ID NO：1)的细胞外结构域或细胞外结构域的片段。在一些实施方案中，DDpp含有异源多肽，该异源多肽包含BCMA(SEQ ID NO：34)或CD123(SEQ ID NO：1)或CS1(SEQ ID NO：35)的细胞外结构域或细胞外结构域的片段。在一些实施方案中，DDpp含有异源多肽，该异源多肽包含选自以下组的受体的细胞外结构域或细胞外结构域的片段：CD19、CD20、CD22、HVEM、BTLA、DR3、CD37；TSLPR、IL7R和gp96。
在一些实施方案中，蛋白质含有异源多肽，所述异源多肽包含血清蛋白或血清蛋白的抗原片段(例如，AFP和AFP p26)。在一些实施方案中，DDpp含有异源多肽，所述异源多肽包含由血清蛋白的5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100或10-50个氨基酸组成的片段。在一些实施方案中，蛋白质含有异源多肽，所述异源多肽包含细胞内蛋白或细胞内蛋白的抗原部分(例如，核蛋白)。在一些实施方案中，DDpp含有异源多肽，所述异源多肽包含由细胞内蛋白的5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100或10-50个氨基酸组成的片段。在一些实施方案中，DDpp含有异源多肽，所述异源多肽具有SEQ ID NO：37-43或44的序列。
在一些实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合CD123和/或AFP p26，并且还结合一种或多种其他感兴趣的靶标。由DDpp融合蛋白特异性结合的感兴趣的靶标可以是DDpp期望结合的任何分子。例如，由DDpp融合蛋白特异性结合的靶标可以是CD123和/或AFP p26，以及另外具有制造、配制、治疗、诊断或预后相关性或价值的任何其他靶标。本文通过举例的方式提供了许多示例性的其他靶标，并且它们旨在进行说明而不是限制。由DDpp融合蛋白结合的其他感兴趣的靶标可以是天然存在的或合成的。其他感兴趣的靶标可以是细胞外组分或细胞内组分、可溶性因子(例如，酶、激素、细胞因子、和生长因子、毒素、毒液、污染物等)或跨膜蛋白(例如，细胞表面受体)。在一些实施方案中，由DDpp融合蛋白结合的感兴趣的靶标是人蛋白质。在一个实施方案中，DDpp(例如，DDpp融合蛋白)结合人蛋白质感兴趣的靶标及其猴(例如，食蟹猴(cynomolgous monkey))、小鼠、兔、仓鼠和/或兔直系同源物。在一些实施方案中，另外的感兴趣的靶标是BCMA、CS1或HER2。
在一个实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合CD123和/或AFP p26以及血清蛋白。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合选自以下的血清蛋白：血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA))、甲状腺素结合蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和免疫球蛋白(例如，IgG、IgE和IgM)。不受理论的束缚，认为DDpp与载剂蛋白的结合赋予DDpp(或其融合蛋白)改善的药效动力学概况，其包括但不限于与其中载剂蛋白结合序列缺失的DDpp融合蛋白相比改善的肿瘤靶向、肿瘤渗透、肿瘤内扩散和增强的治疗活性(参见，例如，WO01/45746，其内容通过引用整体并入本文)。
E.基于抗体的DDpp融合蛋白
在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含全长抗体或抗体的片段或子结构域。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含全长IgG抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG2或IgG4)。在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含特异性结合癌抗原的全长抗体。在另外的实施方案中，DDpp包含商业上认可的治疗抗体(例如，利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗、MEDI-551、依帕珠单抗、贝利木单抗、他巴鲁单抗、AMG-557、MEDI-570和NN882)。在进一步的实施方案中，DDpp包含与T细胞上的T细胞受体(TCR)复合物结合(例如，与CD3ε链结合)的抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，DDpp是Fc融合蛋白。在另外的实施方案中，Fc蛋白包含变体人Fc结构域。
在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含全长抗体或抗体片段或子结构域(例如，IgG1抗体、IgG3抗体、抗体可变区、CDR3、scFv、Fc、FcRn结合子结构域和其他抗体子结构域)。DDpp蛋白可以可操作地彼此连接和/或与抗体、抗体链、抗体片段或抗体子结构域的一个或多个末端连接，以形成DDpp融合蛋白。
DDpp融合蛋白的抗体组分可以是任何合适的全长免疫球蛋白或抗体片段(例如，抗原结合结构域和/或效应结构域)或其片段。在一个实施方案中，DDpp-抗体融合蛋白保留传统单克隆抗体的结构和功能特性。因此，在一些实施方案中，DDpp-抗体融合蛋白保留表位结合特性，但是有利地还通过DDpp融合掺入一种或多种其他靶结合特异性。可用于DDpp融合的抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、灵长类抗体和嵌合抗体。本文提供的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在特定的实施方案中，抗体是Fc优化的抗体。抗体可以来自或来源于任何动物来源(包括鸟类和哺乳动物)，或者通过合成产生。DDpp-抗体融合蛋白的抗体组分可以是天然来源的，或者是重组工程化(例如，噬菌体展示、xenomouse和合成)的结果。在某些实施方案中，抗体-DDpp融合体的抗体组分增强半衰期，并增加或减少抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在一些实施方案中，抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在特定的实施方案中，抗体是人抗体。
一般理解的是，恒定区介导若干种效应功能。例如，补体的C1组分与抗体的结合活化补体系统。补体的活化对细胞病原体的调理作用和裂解很重要。补体的活化还刺激炎性响应并且还可涉及自身免疫性超敏反应。此外，抗体通过Fc区与细胞结合，其中抗体Fc区上的Fc受体位点与细胞上的Fc受体(FcR)结合。存在许多对于不同类别的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)以及IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要的和不同的生物响应，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包覆的靶细胞的裂解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移以及免疫球蛋白产生的控制。
在某些实施方案中，DDpp-Fc融合蛋白具有改变的效应功能，其进而影响所施用的DDpp-Fc融合蛋白的生物学特征。例如，恒定区子结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可以减少循环修饰抗体的Fc受体结合。在其他情况下，恒定区修饰可减弱补体结合并且因此降低缀合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。恒定区的又其他修饰可以用于消除二硫键或寡糖部分，其由于增加的抗原特异性或抗体柔性而允许增强的定位。相似地，根据本公开内容的对恒定区的修饰可使用本领域普通技术人员已知的生物化学或分子工程技术来容易地进行。
在一些实施方案中，DDpp-Fc融合蛋白不具有一种或多种效应功能。例如，在一些实施方案中，DDpp-Fc融合蛋白不具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或不具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方案中，DDpp-Fc融合蛋白不结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中，DDpp-Fc融合蛋白不具有效应功能。降低或消除ADCC和/或CDC活性和Fc受体和/或补体因子结合的Fc序列工程化修饰的实例在本文中描述或在本领域中是另外已知的，用于测试所述修饰的测定和程序也是如此。
在一些实施方案中，将DDpp-Fc融合蛋白工程化以将CH3结构域与相应修饰的抗体的铰链区直接融合。在其他构建体中，在铰链区与修饰的CH2和/或CH3结构域之间插入肽间隔区。例如，可表达相容的构建体，其中CH2结构域已缺失并且剩余的CH3结构域(修饰的或未修饰的)以5-20个氨基酸间隔区连接到铰链区。可添加这种间隔区以便例如确保恒定结构域的调控元件保持自由和可及或使铰链区保持柔性。在一些情况下，氨基酸间隔区可证明是免疫原性的并且引发针对构建体的非需要的免疫应答。因此，在某些实施方案中，添加到构建体中的任何间隔区可以是相对非免疫原性的，或者甚至可以完全省略，以便维持修饰的DDpp-Fc融合蛋白的所需生化质量。
在另外的实施方案中，通过在恒定区中几个或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来修饰DDpp-Fc融合蛋白。例如，在CH2结构域的选定区域中的单个氨基酸的突变可能足以基本上减少Fc结合并且因此。相似地，可以完全或部分删除控制效应功能(例如，补体C1Q结合)的一个或多个恒定区结构域。恒定区的此类部分缺失可以改善DDpp-Fc融合蛋白的所选择的特性(例如，血清半衰期)，同时使与对应的恒定区结构域缔合的其他期望功能保持完整。在一些实施方案中，DDpp-Fc融合蛋白的恒定区通过一个或多个氨基酸的突变或取代来修饰，这增强了所得构建体的特征。在这方面，可以破坏由保守结合位点提供的活性(例如，Fc结合)，同时基本上维持修饰的DDpp-Fc融合蛋白的构型和免疫原性特征。本公开内容还提供了DDpp-Fc融合蛋白，其包含向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强期望的特性，例如减少或增加效应功能，或者提供一种或多种细胞毒素、标记或碳水化合物部分的附接位点。在此类实施方案中，可能期望插入或复制来源于所选择的恒定区结构域的特定序列。
在一些实施方案中，DDpp可操作地连接至抗体片段或子结构域(例如，scFv、双抗体，EP 404,097；WO93/111161；WO14/028776；以及Holliger等人,PNAS 90:6444-6448(1993)，其各自的内容通过引用整体并入本文)。抗体片段或子结构域可以是抗体的任何片段或结构域。参见例如，WO04/058820、WO99/42077和WO05/017148，其各自的内容通过引用整体并入本文。例如，DDpp融合蛋白可含有抗体效应结构域或抗体效应结构域的衍生物，其赋予DDpp一种或多种效应功能和/或赋予DDpp融合蛋白结合一种或多种Fc受体的能力。在一些实施方案中，DDpp-抗体融合蛋白包含抗体的抗原结合片段或其片段。在另外的实施方案中，DDpp-抗体融合蛋白含有免疫球蛋白效应结构域，其包含由CH2和CH3结构域提供的具有效应功能的抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域。提供效应功能并且被本发明所涵盖的DDpp融合体中的其他序列对于本领域技术人员将是清楚的，并且可以基于所需的效应功能常规地选择和设计到本文涵盖的DDpp融合蛋白中。
在一个实施方案中，DDpp融合体含有全长抗体或作为抗原结合片段的抗体片段。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段结合疾病相关抗原。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含特异性结合癌抗原的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含特异性结合以下的抗体或抗体片段：特定病原体(例如，细菌细胞(例如，结核、天花，炭疽))、病毒(例如，HIV)、寄生虫(例如，疟疾和利什曼病)、真菌感染、霉菌、支原体、朊病毒抗原，在另一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含特异性结合以下的抗体或抗体片段：特定病原体(例如，细菌细胞(例如，结核、天花，炭疽))、病毒(例如，HIV)、寄生虫(例如，疟疾和利什曼病)、真菌感染、霉菌、支原体或朊病毒抗原。在另一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含特异性结合与免疫系统的疾病或病症相关的抗原的抗体或抗体片段。
在优选的实施方案中，含有抗体片段或结构域的DDpp融合蛋白保留亲本抗体的活性。因此，在某些实施方案中，含有抗体片段或结构域的DDpp融合蛋白能够诱导补体依赖性细胞毒性。在某些实施方案中，含有抗体片段或结构域的DDpp融合蛋白能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
因此，在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含赋予DDpp融合蛋白免疫球蛋白的生物学或生物化学特性的抗体片段。在一些实施方案中，在与其中所述一种或多种DDpp已被缺失的DDpp融合蛋白相比时，所述抗体片段赋予选自以下的特性：非共价二聚化的能力、定位在肿瘤位点的能力以及增加的血清半衰期。在某些实施方案中，DDpp融合蛋白至少与没有附接的DDpp的对应抗体一样稳定。在某些实施方案中，DDpp融合蛋白比没有附接的DDpp的对应抗体更稳定。DDpp融合蛋白稳定性可以使用包括例如ELISA技术的已建立的方法来测量。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白在37℃下在全血中(体内或离体)中稳定至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约24小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时、至少约48小时、至少约50小时、至少约55小时、至少约60小时、至少约65小时、至少约70小时、至少约72小时、至少约75小时、至少约80小时、至少约85小时、至少约90小时、至少约95小时或至少约100小时(包括所列出的那些时间之间的任何时间)。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白含有免疫球蛋白效应结构域或半衰期影响结构域，其对应于其中恒定区结构域中的一个或多个的至少一部分已被改变以便提供所需的生物化学特性的免疫球蛋白结构域或片段，所述生物化学特性例如在与具有对应的未改变的免疫球蛋白序列的免疫球蛋白片段相比时，降低或增加的效应功能、非共价二聚化的能力、增加的定位在肿瘤位点的能力、降低的血清半衰期或增加的血清半衰期。恒定区结构域的这些改变可以是氨基酸取代、插入或缺失。
在一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列，其赋予DDpp融合蛋白抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含已经被修饰以增加ADCC的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如，Bruhns,Blood 113:3716-3725(2009)；Shields,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Lazar,PNAS103:4005-4010(2006)；Stavenhagen,Cancer Res.67:8882-8890(2007)；Horton,Cancer Res.68:8049-8057(2008)；Zalevsky,Blood 113:3735-3743(2009)；Bruckheimer,Neoplasia 11:509-517(2009)；WO06/020114；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和WO04/074455；其各自的内容通过引用整体并入本文)。DDpp融合蛋白中的氨基酸序列中含有的增加ADCC的免疫球蛋白片段工程化修饰的实例包括具有一个或多个对应于以下的修饰的免疫球蛋白效应结构域序列：IgG1-S298A、E333A、K334A；IgG1-S239D、I332E；IgG1-S239D、A330L、I332E；IgG1-P247I、A339D或Q；IgG1-D280H、K290S(具有或不具有S298D或V)；IgG1-F243L、R292P、Y300L；IgG1-F243L、R292P、Y300L、P396L；以及IgG1-F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L；其中Fc区中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences of proteins of Immunological Interest,1991第5版，其内容通过引用整体并入本文)的EU索引的编号。
在其他实施方案中，DDpp融合蛋白包含已经被修饰以减少ADCC的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如，Idusogie等人,J.Immunol.166:2571-2575(2001)；Sazinsky等人,PNAS105:20167-20172(2008)；Davis等人,J.Rheumatol.34:2204-2210(2007)；Bolt等人,Eur.J.Immunol.23:403-411(1993)；Alegre等人,Transplantation 57:1537-1543(1994)；Xu等人,Cell Immunol.200:16-26(2000)；Cole等人,Transplantation 68:563-571(1999)；Hutchins等人,PNAS 92:11980-11984(1995)；Reddy等人,J.Immunol.164:1925-1933(2000)；WO97/11971；WO07/106585；US 2007/0148167A1；McEarchern等人,Blood109:1185-1192(2007)；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Kumagai等人,J.Clin.Pharmacol.47:1489-1497(2007)，其各自的内容通过引用整体并入本文)。DDpp融合蛋白中的氨基酸序列中含有的减少ADCC的免疫球蛋白片段序列工程化修饰的实例包括具有一个或多个对应于以下的修饰的免疫球蛋白效应结构域序列：IgG1-K326W、E333S；IgG2-E333S；IgG1-N297A；IgG1-L234A、L235A；IgG2-V234A、G237A；IgG4-L235A、G237A、E318A；IgG4-S228P、L236E；IgG2-118-260；IgG4-261-447；IgG2-H268Q、V309L、A330S、A331S；IgG1-C220S、C226S、C229S、p268S；IgG1-C226S、C229S、E233P、L234V、L235A；或IgG1-L234F、L235E、P331S；其中残基的编号是Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,1991第5版，其内容通过引用整体并入本文)的EU索引的编号。
在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列，其赋予DDpp融合蛋白抗体-依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含已经被修饰以增加抗体-依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的免疫球蛋白效应结构域的序列；(参见例如，Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Lazar等人,PNAS103:4005-4010(2006)；Stavenhagen等人,CancerRes.67:8882-8890(2007)；Richards等人,Mol.Cancer Ther.7:2517-2527(2008)；Horton等人,Cancer Res.68:8049-8057(2008),Zalevsky等人,Blood 113:3735-3743(2009)；Bruckheimer等人,Neoplasia 11:509-517(2009)；WO06/020114；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和WO04/074455，其各自的内容通过引用整体并入本文)。DDpp融合蛋白中的氨基酸序列中含有的增加ADCP的免疫球蛋白片段工程化修饰的实例包括具有一个或多个对应于以下的修饰的免疫球蛋白效应结构域序列：IgG1-S298A、E333A、K334A；IgG1-S239D、I332E；IgG1-S239D、A330L、I332E；IgG1-P247I、A339D或Q；IgG1-D280H、K290S(具有或不具有S298D或V)；IgG1-F243L、R292P、Y300L；IgG1-F243L、R292P、Y300L、P396L；IgG1-F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L；以及IgG1-G236A、S239D、I332E；其中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,1991第5版，其内容通过引用整体并入本文)的EU索引的编号。
在其他实施方案中，DDpp融合蛋白包含已经被修饰以减少ADCP的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如，Sazinsky等人,PNAS105:20167-20172(2008)；Davis等人,J.Rheumatol.34:2204-2210(2007)；Bolt等人,Eur.J.Immunol.23:403-411(1993)；Alegre等人,Transplantation 57:1537-1543(1994)；Xu等人,Cell Immunol.200:16-20(2000)；Cole等人,Transplantation 68:563-571(1999)；Hutchins等人,PNAS 92:11980-11984(1995)；Reddy等人,J.Immunol.164:1925-1933(2000)；WO97/11971；WO07/106585；US2007/0148167A1；McEarchern等人,Blood 109:1185-1192(2007)；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Kumagai等人,J.Clin.Pharmacol.47:1489-1497(2007)，其各自的内容通过引用整体并入本文)。举例来说，DDpp融合蛋白可含有抗体片段或结构域，所述抗体片段或结构域含有减少ADCC的以下修饰中的一种或多种：IgG1-N297A；IgG1-L234A、L235A；IgG2-V234A、G237A；IgG4-L235A、G237A、E318A；IgG4-S228P、L236E；IgG2 EU序列118-260；IgG4-EU序列261-447；IgG2-H268Q、V309L、A330S、A331S；IgG1-C220S、C226S、C229S、p268S；IgG1-C226S、C229S、E233P、L234V、L235A；以及IgG1-L234F、L235E、P331S；其中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,1991第5版，其内容通过引用整体并入本文)的EU索引的编号。
在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列，其赋予DDpp融合蛋白补体依赖性细胞毒性(CDC)。在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含已经被修饰以增加补体依赖性细胞毒性(CDC)的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如，Idusogie等人,J.Immunol.166:2571-2575(2001)；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Natsume等人,Cancer Res.68:3863-3872(2008)，其各自的内容通过引用整体并入本文)。举例来说，DDpp融合蛋白可含有抗体片段或结构域，所述抗体片段或结构域含有增加CDC的以下修饰中的一种或多种：IgG1-K326A、E333A；IgG1-K326W、E333S、IgG2-E333S；其中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,1991第5版，其内容通过引用整体并入本文)的EU索引的编号。
在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列，其赋予DDpp融合蛋白结合FcγRIIb受体的能力。在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含已被修饰以增加对FcγRIIb受体的抑制性结合的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如，Chu等人,Mol.Immunol.45:3926-3933(2008))。DDpp融合蛋白中的氨基酸序列中含有的增加与抑制性FcγRIIb受体的结合的免疫球蛋白片段工程化修饰的实例是IgG1-S267E、L328F。
在其他实施方案中，DDpp融合蛋白包含已经被修饰以减少CDC的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如，WO97/11971；WO07/106585；US 2007/0148167A1；McEarchern等人,Blood 109:1185-1192(2007)；Hayden-Ledbetter等人,Clin.Cancer 15:2739-2746(2009)；Lazar等人,PNAS103:4005-4010(2006)；Bruckheimer等人,Neoplasia 11:509-517(2009)；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Sazinsky等人,PNAS105:20167-20172(2008)；其各自的内容通过引用整体并入本文)。举例来说，DDpp融合蛋白可含有抗体片段或结构域，所述抗体片段或结构域含有减少CDC的以下修饰中的一种或多种：IgG1-S239D、A330L、I332E；IgG2-118-260；IgG4-261-447；IgG2-H268Q、V309L、A330S、A331S；IgG1-C226S、C229S、E233P、L234V、L235A；IgG1-L234F、L235E、P331S；以及IgG1-C226S、p260S；其中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences of proteins ofImmunological Interest,1991第5版，其内容通过引用整体并入本文)的EU索引的编号。
IgG的半衰期由其与新生儿受体FcRn的pH依赖性结合介导。在某些实施方案中，DDpp融合蛋白包含免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列，其赋予DDpp融合蛋白结合新生儿受体FcRn的能力。在某些实施方案，DDpp融合蛋白包含已被修饰以增强与FcRn的结合的免疫球蛋白FcRn结合结构域的序列(参见例如，Petkova等人,Int.Immunol.18:1759-1769(2006)；Dall'Acqua等人,J.Immunol.169:5171-5180(2002)；Oganesyan等人,Mol.Immunol.46:1750-1755(2009)；Dall'Acqua等人,J.Biol.Chem.281:23514-23524(2006)；Hinton等人,J.Immunol.176:346-356(2006)；Datta-Mannan等人,Drug Metab.Dispos.35:86-94(2007)；Datta-Mannan等人,J.Biol.Chem.282:1709-1717(2007)；WO06/130834；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Yeung等人,J.Immunol.182:7663-7671(2009)；其各自的内容通过引用整体并入本文)。
在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含已被修饰以在pH 6.0而不是pH 7.4下对FcRn具有选择性亲和力的免疫球蛋白效应结构域的序列。举例来说，DDpp融合蛋白可含有抗体片段或结构域，所述抗体片段或结构域含有增加半衰期的以下修饰中的一种或多种：IgG1-M252Y、S254T、T256E；IgG1-T250Q、M428L；IgG1-H433K、N434Y；IgG1-N434A；以及IgG1-T307A、E380A、N434A；其中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,1991第5版，其内容通过引用整体并入本文)的EU索引的编号。
在其他实施方案，DDpp融合蛋白包含已被修饰以减少与FcRn的结合的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如，Petkova等人,Int.Immunol.18:1759-1769(2006)；Datta-Mannan等人,Drug Metab.Dispos.35:86-94(2007)；Datta-Mannan等人,J.Biol.Chem.282:1709-1717(2007)；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Vaccaro等人,Nat.Biotechnol.23:1283-1288(2005)；其各自的内容通过引用整体并入本文)。举例来说，DDpp融合蛋白可含有抗体片段或结构域，所述抗体片段或结构域含有减少半衰期的以下修饰中的一种或多种：IgG1-M252Y、S254T、T256E；H433K、N434F、436H；IgG1-I253A；以及IgG1-P257I、N434H和D376V、N434H；其中残基的编号是Kabat等人(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,1991第5版，其内容通过引用整体并入本文)的EU索引的编号。
根据另一个实施方案，DDpp融合蛋白包含对应于免疫球蛋白效应结构域的氨基酸序列，其已被修饰以在对应于选自以下的Fc区(例如，FCγ)位置在其序列中含有至少一个取代：238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438和439，其中Fc区中的残基的编号根据Kabat等人(Kabat等人,Sequences of proteins of Immunological Interest,1991第5版，其内容通过引用整体并入本文)的EU编号系统。在一个具体的实施方案中，DDpp融合蛋白包含免疫球蛋白效应结构域衍生物的序列，其中至少一个对应于位置434的残基是选自以下的残基：A、W、Y、F和H。根据另一个实施方案，DDpp融合蛋白包含具有以下相应取代的免疫球蛋白效应子片段衍生物的序列：S298A/E333A/K334A。在另一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含具有对应于K322A的取代的免疫球蛋白效应结构域衍生物。在另一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含具有以下取代中的一个或任意组合的免疫球蛋白效应结构域衍生物的序列：K246H、H268D、E283L、S324G、S239D和I332E。根据又一实施方案，DDpp融合蛋白包含具有对应于D265A/N297A的取代的免疫球蛋白效应结构域衍生物的序列。
在某些实施方案中，DDpp融合蛋白包含已经使用本领域已知的技术进行糖工程化或突变以增加效应功能的免疫球蛋白效应结构域的序列。例如，包含在DDpp中的恒定区结构域序列的失活(通过点突变或其他手段)可以降低循环DDpp融合蛋白的Fc受体结合，从而增加肿瘤定位。在其他情况下，恒定区修饰可能与某些所提供的实施方案一致减轻补体结合，并因此降低缀合细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。恒定区的又其他修饰可以用于修饰二硫键或寡糖部分，其由于增加的抗原特异性或抗体柔性而允许增强的定位。所述修饰所产生的生理特征、生物利用度和其他生化效应(例如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期)可以使用公知的免疫学技术容易地测量和定量，而无需过多的实验。
在一些实施方案中，免疫效应细胞包含免疫球蛋白或其他肽结合分子的细胞表面受体，例如免疫球蛋白恒定区的受体，并且包括通常称为“Fc受体”(“FcR”)的受体类别。许多FcR已经在结构和/或功能上得到表征，并且是本领域已知的，包括具有与免疫球蛋白重链同种型的限制性亚组相互作用的特异性能力的FcR，或者以不同亲和力与Fc结构域相互作用和/或可以在某些条件下在免疫效应细胞的限制性亚组上表达的FcR(例如，Kijimoto-Ochichai等人,Cell Mol.Life.Sci.59:648(2002)；Davis等人,Curr.Top.Microbiol.Immunol.266:85(2002)；Pawankar,Curr.Opin.Allerg.Clin.Immunol.1:3(2001)；Radaev等人,Mol.Immunol.38:1073(2002)；Wurzburg等人,Mol.Immunol.38:1063(2002)；Sulica等人,Int.Rev.Immunol.20:371(2001)；Underhill等人,Ann.Rev.Immunol.20:825(2002)；Coggeshall,Curr.Dir.Autoimm.5:1(2002)；Mimura等人,Adv.Exp.Med.Biol.495:49(2001)；Baumann等人,Adv.Exp.Med.Biol.495:219(2001)；Santoso等人,Ital.Heart J.2:811(2001)；Novak等人,Curr.Opin.Immunol.13:721(2001)；Fossati等人,Eur.J.Clin.Invest.31:821(2001))；其各自的内容通过引用整体并入本文。
能够介导ADCC的细胞是免疫效应细胞的实例。其他免疫效应细胞包括自然杀伤细胞、肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋巴细胞和粒细胞，例如包含过敏反应机制的细胞。因此，免疫效应细胞包括但不限于造血来源的细胞，包括在骨髓和淋巴谱系内处于各种分化阶段并且可以(但不是必需)表达一种或多种类型的功能细胞表面FcR的细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、红细胞和前体、祖细胞(例如，造血干细胞)以及此类细胞的静止、活化和成熟形式。其他免疫效应细胞可以包括能够介导免疫功能的非造血来源的细胞，例如内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、破骨细胞、上皮细胞和其他细胞。免疫效应细胞还可以包括介导细胞毒性或细胞抑制事件，或内吞、吞噬或胞饮事件，或实现细胞凋亡诱导，或实现微生物免疫或微生物感染中和的细胞，或者介导过敏性、炎性、超敏性和/或自身免疫应答的细胞。
F.具有增加的半衰期的DDpp融合蛋白
所公开的DDpp可以与第二肽结构域融合或复合，增加DDpp的半衰期或稳定性。
在一方面，DDpp还包含一个或多个促进肽的合成、处理或使用的氨基酸，其包括但不限于在N末端和/或C末端的一个或两个赖氨酸以增加多肽的溶解度。合适的融合蛋白包括但不限于包含与一个或多个多肽、多肽片段或通常不被认为是蛋白质序列的一部分的氨基酸连接的DDpp的蛋白质。在一方面，融合肽包含两个或更多个肽的整个氨基酸序列，或者任选地，包含两个或更多个肽的部分(片段)。在一些方面，肽(例如，蛋白质S结合肽)可操作地连接至例如以下中的一种或多种：标记蛋白、促进纯化的肽、促进多聚体蛋白形成的肽序列或前述任一种的片段。合适的融合配偶体包括但不限于His标签、FLAG标签、strep标签和myc标签。
在一些实施方案中，DDpp与一个或多个增强多肽的半衰期的部分融合。可以通过例如增加DDpp的分子量以避免肾脏清除和/或掺入FcRn介导的再循环途径的结合域结构域来增加半衰期。在一个实施方案中，DDpp与白蛋白多肽或其片段(例如，人血清白蛋白(HSA))融合或化学缀合。在特定的实施方案中，融合的或化学缀合的白蛋白片段占全长白蛋白蛋白质的10％、25％、50％或75％。在另外的或可选的实施方案中，当在体内施用时，DDpp与白蛋白结合结构域或结合白蛋白的脂肪酸融合或复合。白蛋白结合结构域的实例是“albu标签”，其是来源于4-(对碘苯基)-丁酸的部分(Dumelin等人,Angew Chem.Int.EdEngl.47:3196-3201(2008))。
在一个实施方案中，DDpp与转铁蛋白多肽或其片段(例如，人转铁蛋白)融合或化学缀合。在特定的实施方案中，融合的或化学缀合的转铁蛋白片段占全长转铁蛋白的10％、25％、50％或75％。在另外的或可选的实施方案中，当在体内施用时，DDpp与结合转铁蛋白的转铁蛋白结合结构域融合或复合。
在一些实施方案中，DDpp与以下融合或化学缀合：脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体(PAS化；XL-蛋白质GmbH)、非精确重复肽序列(XTEN化，rPEG)、甘氨酸残基的均聚物(HAP化)、弹性蛋白样重复序列(ELP化；参见例如，美国专利申请号61/442,106，其内容通过引用整体并入本文)、人工GLK(GLK融合；Huang等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.72:435-41(2010))或来自人CGβ亚基的CTP肽(CTP融合体)。
G.另外的DDpp融合蛋白
在一些实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合CD123和/或AFP p26，并且还结合疾病相关的抗原。所述疾病相关的抗原可以是以下的特征性抗原：癌症和/或特定细胞类型(例如，过度增殖细胞)和/或病原体(例如，细菌细胞(例如，结核、天花和炭疽)、病毒(例如，HIV)、寄生虫(例如，疟疾和利什曼病)、真菌感染、霉菌、支原体、朊病毒抗原，或者与免疫系统病症缔合的抗原。在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白与治疗剂或细胞毒性剂缀合。
在一个另外的实施方案中，DDpp融合蛋白与促进检测、多聚化、与相互作用配偶体结合或表征DDpp活性的一个或多个化学部分(例如，标记)连接。示例性的化学部分是生物素。适用于与DDpp缀合的其他部分包括但不限于光敏剂、染料、荧光染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素和细胞毒性剂。光敏剂包括例如Photofrin、Visudyne、Levulan、Foscan、Metvix、Hexvix.RTM.、Cysview.TM.、Laserphyrin、Antrin、Photochlor、Photosens、Photrex、Lumacan、Cevira、Visonac、BF-200ALA和Amphinex。在另外的实施方案中，His标签、FLAG标签、strep标签或myc标签与DDpp缀合。
在另一个实施方案中，DDpp融合蛋白包含结合CD123、AFP p26或其片段并且还结合存在于感兴趣的靶标上的肽标签的DD。此类肽标签提供一种有用的手段，通过所述手段检测和/或附接含有所述肽标签的感兴趣的靶标。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合选自以下组的肽标签：六组氨酸(His6)标签、myc标签或FLAG标签。其他肽标签在本文中描述或在本领域中另外已知。
H.具有表位标签的DDpp融合蛋白
在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含肽表位标签。在一些实施方案中，肽标签选自以下：六组氨酸(His6)标签、myc标签和FLAG标签。在另外的实施方案中，肽标签包括但不限于avitag(允许标签生物素化和用链霉亲和素分离)、钙调蛋白、E标签、血凝素(HA)、S标签、SBP标签、softag 1、链霉亲和素、四半胱氨酸或多半胱氨酸、V5、VSV和Xpress标签。另外，可以使用多组氨酸标签(除6个残基之外)。在另外的实施方案中，可以使用共价肽标签、蛋白质标签等。共价肽标签包括但不限于isopeptag(共价结合pilinC蛋白)、Spytag(共价结合SpyCatcher蛋白)和Snooptag(共价结合SnoopCatcher蛋白)。在再另外的实施方案中，可以任选地使用蛋白质标签，包括但不限于生物素羧基载剂蛋白(BCCP)、谷胱甘肽-s-转移酶、绿色荧光蛋白(或其他荧光团)、Halo标签、Nus标签、硫氧还蛋白和Fc标签。在再另外的实施方案中，可以使用多种类型的标签。在再另外的实施方案中，不使用标签。在再另外的实施方案中，DDpp融合蛋白包含可移除的标签。根据所述实施方案，可以使用本文公开的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的任意组合。
I.作为化学缀合物的DDpp
促进与感兴趣的靶标的特异性结合的DDpp融合蛋白(例如衔接子)可以与多种化合物化学缀合，所述化合物例如荧光染料、放射性同位素、色谱组合物(例如，珠子、树脂、凝胶等)和化学治疗剂。DDpp融合蛋白缀合物具有包括但不限于诊断、分析、制造和治疗应用的用途。
DD序列中半胱氨酸的固有缺乏提供了出于位点特异性缀合的目的引入独特半胱氨酸的机会。
在一些实施方案中，DDpp融合蛋白(例如衔接子)含有至少一个反应性残基。反应性残基可用作例如缀合物(例如化疗药物)的附接位点。所述反应性残基可以是例如半胱氨酸、赖氨酸或另一种反应性残基。因此，半胱氨酸可以加到DDpp的N-末端或C-末端或DDpp序列内。半胱氨酸可以取代DDpp的序列中的另一个氨基酸。另外，赖氨酸可以加到DDpp的任一端或DDpp序列内，并且/或者赖氨酸可以取代DDpp序列中的另一个氨基酸。在一个实施方案中，反应性残基(例如，半胱氨酸、赖氨酸等)位于DDpp的环序列中(例如，对应于SEQ ID NO：2的残基22-24和46-49的氨基酸残基)。在一个实施方案中，反应性残基位于DDpp融合体的组分之间，例如，位于DDpp与DDpp融合蛋白的其他组分之间的接头中。反应性残基(例如，半胱氨酸、赖氨酸等)也可以位于DDpp或DDpp融合蛋白的其他组分的序列内。在一个实施方案中，DDpp或DDpp融合蛋白包含至少一个、至少两个、至少三个反应性残基。在一个实施方案中，DDpp例如DDpp融合蛋白包含至少一个、至少两个或至少三个半胱氨酸残基。
如“对靶标的结合亲和力”、“与靶标的结合”等的表达是指多肽的特性，其可以通过确定亲和常数(例如在给定抗原浓度下缔合和解离的DDpp的量)而直接测量。可以使用不同的方法来表征分子相互作用，包括但不限于竞争分析、平衡分析和微量热分析，以及基于表面等离子共振相互作用的实时相互作用分析(例如，使用仪器)。这些方法是本领域技术人员公知的，并且例如描述于Neri等人,Tibtech 14:465-470(1996)和Jansson等人,J Biol Chem 272:8189-8197(1997)。
对于给定DDpp结合事件的亲和力要求取决于各种因素，包括但不限于：结合基质的组成和复杂性、DDpp和靶分子两者的化合价和密度以及DDpp的功能应用。在一个实施方案中，DDpp以小于或等于5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M或10-5M的解离常数(KD)结合感兴趣的靶标(例如，CD123或AFP p26)。在另外的实施方案中，DDpp以小于或等于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M或10-8M的KD结合感兴趣的靶标。在另外的实施方案中，DDpp以小于或等于5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10- 12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的KD结合感兴趣的靶标。在一些实施方案中，所提供的DDpp具有选自以下的解离常数：10-4M至10-5M，10-5M至10-6M，10-6M至10- 7M，10-7M至10-8M，10-8M至10-9M，10-9M至10-10M，10-10M至10-11M以及10-11M至10-12M。
在一些实施方案中，DDpp结合呈活性形式的感兴趣的靶标(例如，CD123或AFPp26)。在一个实施方案中，DDpp可逆地结合呈活性形式的感兴趣的靶标，并且还释放呈活性形式的结合的靶标。在一些实施方案中，DDpp结合呈天然形式的感兴趣的靶标。在具体的实施方案中，DDpp以大于或等于以下的解离速率(off-rate)或KOff结合感兴趣的靶标：10- 10sec-1、5×10-9sec-1、10-9sec-1、5×10-8sec-1、10-8sec-1、5×10-7sec-1、10-7sec-1、5×10- 6sec-1、10-6sec-1、5×10-5sec-1、10-5sec-1、5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-3sec-1、10-3sec-1、5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-1sec-1或10-1sec-1。
确定KD和解离速率的结合实验可以常规地在许多条件下执行，包括但不限于[pH6.0，0.01％Tween 2]、[pH 6.0，0.1％明胶]、[pH 5.0，0.01％Tween 2]、[pH 9.0，0.1％Tween 2]、[pH 6.0，15％乙二醇，0.01％Tween2]、[pH 5.0，15％乙二醇，0.01％Tween 2]和[pH9.0，15％乙二醇，0.01％Tween 2]。在其中制备这些溶液的缓冲剂可以常规地由本领域技术人员容易地确定，并且很大程度上取决于最终溶液的所需pH。低pH溶液(＜pH5.5)可以例如在柠檬酸盐缓冲剂、甘氨酸-HCl缓冲剂或琥珀酸缓冲剂中制备。高pH溶液可以例如在Tris-HCl、磷酸盐缓冲剂或碳酸氢钠缓冲剂中制备。出于确定例如最佳pH和/或盐浓度的目的，本领域的技术人员可以常规地使用许多条件来确定KD和解离速率。
在一个实施方案中，DDpp以在0.1至10-7sec-1、10-2至10-7sec-1或0.5×10-2至10- 7sec-1范围内的KOff特异性结合感兴趣的靶标(例如，CD123或AFP p26)。在一个具体的实施方案中，DDpp(DDpp融合蛋白)以小于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1的解离速率(KOff)结合感兴趣的靶标。在一个另外的实施方案中，DDpp以小于5×10-4sec-1、10- 4sec-1、5×10-5sec-1或10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的解离速率(KOff)结合感兴趣的靶标。
在一个实施方案中，DDpp以在103至107M-1sec-1、103至106M-1sec-1或103至105M-1sec-1范围内的KOn特异性结合感兴趣的靶标(例如，CD123或AFP p26)。在一个具体的实施方案中，DDpp(DDpp融合蛋白)以大于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1或5×104M-1sec-1的缔合速率(KOn)结合感兴趣的靶标。在一个另外的实施方案中，DDpp以大于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1或5×106M-1sec-1或107M-1sec-1的KOn结合感兴趣的靶标。
本文涵盖编码所公开的DDpp的核酸分子，含有这些核酸的载体，含有这些核酸载体的宿主细胞，以及制备DDpp-白蛋白融合蛋白并使用这些核酸、载体和/或宿主细胞的方法。本发明还涵盖包含DDpp-白蛋白融合蛋白和药学上可接受的稀释剂或载剂的药物制剂。此类制剂可用于治疗、预防、改善或诊断患者(优选哺乳动物，最优选人)的疾病或疾病症状的方法，其包括向所述患者施用所述药物制剂的步骤。
DDpp药物缀合物
在另一个实施方案中，DDpp融合蛋白可通过使用化学缀合与其他有机或无机分子或底物连接。在一个实施方案中，DDpp-药物缀合物旨在通过DDpp的靶向特异性促进细胞毒性剂的局部递送。靶向特异性和细胞毒性剂的这种组合允许药物靶向递送至肿瘤以及其中的细胞内蓄积，这些非缀合药剂的全身施用可能导致对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞的不可接受水平的毒性(Baldwin等人,Lancet pages 603-605(1986)；Thorpe,"AntibodyCarriers Of Cytotoxic agents In Cancer Therapy:A Review,"in MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人,(ed.s),pp.475-506(1985))。
细胞毒性剂包括化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)、放射性同位素(即放射性缀合物)等。可用于产生此类免疫缀合物的化疗剂包括，例如甲氨蝶呤、阿德里亚霉素、阿霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌合剂。可用于产生此类免疫缀合物的化疗剂还包括抗微管蛋白药物，例如澳瑞他汀(auristatin)，包括单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。可根据所公开的方法使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂吉菌素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecene)。
在一个实施方案中，将DDpp(例如，DDpp融合蛋白)与放射性同位素缀合。在另一个实施方案中，使用许多已知的螯合剂或直接标记中的任一种将DDpp与选自以下的同位素缀合：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。在其他实施方案中，DDpp与药物、前药或淋巴因子例如干扰素偶联。DDpp和细胞毒素的缀合物可使用多种双官能蛋白偶联剂常规地制备，所述双官能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(例如戊二醛)、双-叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一个具体的实施方案中，毒素通过酶可裂解的接头系统(例如像SGN-35中存在的)与DDpp融合蛋白缀合。也可以使用DDpp与一种或多种小分子毒素(例如卡里奇霉素、美登木素、单端孢菌烯(trichothene)和CC1065)以及具有毒素活性的这些毒素的衍生物的缀合物。
在一些实施方案中，细胞毒性剂过通接头共价附接至DDpp。在一些实施方案中，附接DDpp和细胞毒性剂的接头可被蛋白酶裂解。
DD和DDpp的亲和力成熟和去免疫化
亲和力成熟策略可用于产生本文所述的DDpp融合蛋白中可以使用的高亲和力DD和DDpp。也可以基于已知的DDpp参考序列制备特异性结合所需靶标(例如BCAM、CD123、CS1、HER2、AFP和AFP p26)的改善的DD和DDpp。例如，可以将至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸突变(例如，保守或非保守取代)、缺失或插入引入表1中公开的DD序列中(即，参考序列)，并且可以筛选所得的DDpp与相应靶标的结合和生物活性，例如拮抗相应靶标的生物活性或激动相应靶标的生物活性的能力。
所公开的DDpp，特别是向受试者施用的DDpp，优选对于受试者(例如，人)不是抗原性的。在一些实施方案中，DDpp的序列不含有人HLA-DR结合基序或蛋白酶体和免疫蛋白酶体的裂解位点。在特定的实施方案中，DDpp序列不含有由在本说明书的提交日期存在的计算机预测模型版本确定的抗原序列。在特定的实施方案中，DDpp序列不含有如由选自以下的算法所预测的MHC(I类或II类)结合位点序列：ProPred(参见例如，Singh,Bioinformatics 17(12):1236-1237(2001))、ProPred1(Singh,Bioinformatics 19(8):1009-14(2003))、SYFPEITHI(参见例如，Schuler,Immunoinf.Meth.in Mol.Biol.409(1):75-93(2007))、SMM-align(参见例如，Nielsen,BMC Bioinformatics 8:238(2007))、RANKPEP(参见例如，Reche,Hum Immunol 63:701-709.(2004))或TEPITOPE(参见，Sturniolo,Nat Biotechnol 17:555-561(1999))，其中所述算法的版本和所应用的数据库在本申请的提交日期就已经存在。在一些实施方案中，DDpp不含有与高亲和力(结合阈值小于6％)T细胞表位共有特性的序列。(Singh,Bioinformatics 17:1236-1237(2001))。在一些实施方案中，DDpp不含有与混杂(存在于大于50％的相关等位基因中)T细胞表位共有特性的序列(Singh,Bioinformatics 17:1236-1237(2001))。在一些实施方案中，DDpp不含有与高亲和力或混杂T细胞表位共有特性的序列。在特定的实施方案中，DDpp不含有序列LAAIKTRLQ(SEQ ID NO：49)。用于产生、筛选和鉴定亲和力成熟的DDpp变体和靶结合DDpp变体的技术是本领域已知的，所述DDpp变体含有去除预测的MHC(I类或II类)结合位点序列的序列改变。
多核苷酸
还提供了包含编码DDpp(例如，衔接子或CAR)的核苷酸序列的多核苷酸。此类多核苷酸任选地进一步包括一个或多个表达控制元件。例如，多核苷酸可以包括一个或多个启动子或转录增强子、核糖体结合位点、转录终止信号和多聚腺苷酸化信号作为表达控制元件。多核苷酸可以插入任何合适的载体内，所述载体可以包含在任何合适的宿主细胞内以进行表达。
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸编码包含与CD123结合的D结构域的多肽。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸编码嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸编码嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含(i)与AFP p26 AD结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸编码嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸编码衔接子，其包含(a)与CD123结合的D结构域(DD)和(b)抗原决定簇(AD)。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子是包含单个与CD123结合的D结构域的单价衔接子。在一些实施方案中，衔接子是包含两个与CD123结合的D结构域的二价衔接子。在一些实施方案中，与CD123结合的两个D结构域是相同的。在一些实施方案中，与CD123结合的两个D结构域是不同的。在一些实施方案中，衔接子是二价衔接子，其包含与CD123结合的第一D结构域和与第二AD结合的第二D结构域。在一些实施方案中，第二AD是CD33或LeY。在一些实施方案中，单价衔接子包含D结构域，所述D结构域包含选自SEQ IDNO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，单价衔接子包含D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含DD，所述DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含两个相同的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含两个相同的D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述衔接子包含AFP p26抗原决定簇(AD)。在一些实施方案中，所述AFP p26 AD包括选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AFP p26 AD包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AFP p26 AD包括SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单价衔接子包括SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单价衔接子包括SEQ ID NO：50的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述二价衔接子包括SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单价衔接子包括SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述衔接子包括一个或多个接头。
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸编码衔接子，其包含(a)与CD123结合的D结构域和(b)与AFP p26 AD结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，AFPp26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的D结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个接头。
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸编码衔接子，该衔接子包含(a)与靶细胞上的靶抗原决定簇(AD)结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(b)与AFP p26 AD结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFPp26 AD结合的ADBD包含与AFP p26结合的D结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFPp26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个接头。
在一些实施方案中，多核苷酸是DNA。
在一些实施方案中，多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，RNA，例如，mRNA包含经修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA包含编码本文公开的多肽的编码区，并且另外包含5'非翻译区、3'非翻译区、5'帽和聚腺苷酸化信号中的一个或多个。在一些实施方案中，本文公开的mRNA包含编码本文公开的多肽的编码区、5'非翻译区、3'非翻译区、5'帽和聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，本文公开的mRNA包含经修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含N1-甲基假尿苷或N1-乙基假尿苷。在一些实施方案中，5'末端帽是7mG(5')ppp(5')N1mpNp。参见例如US20200261572、US20190351040和US20190211065，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，多核苷酸是包含本文所述多核苷酸的载体。在一些实施方案中，载体是适用于产生重组慢病毒的转移载体。在一些实施方案中，载体是编码本文公开的多肽(例如，CAR)的慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体适用于转导免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)以产生表达多肽(例如，CAR)的细胞。
在一些实施方案中，多核苷酸是包含本文所述多核苷酸的重组病毒。在一些实施方案中，多核苷酸是包含编码本文所述多肽(例如，CAR)的多核苷酸的重组慢病毒。在一些实施方案中，多核苷酸是重组腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)。
DDpp的产生
可以使用可商购获得的试剂和本领域已知的技术常规地制备所公开的DDpp(例如，和衔接子)。在一个实施方案中，通过本领域已知的固相合成技术合成DDpp，例如Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(1963)；Davis等人,Biochem.Intl.10:394-414(1985)；Larsen等人,J.Am.Chem.Soc.115:6247(1993)；Smith等人,J.Peptide ProteinRes.44:183(1994)；O'Donnell等人,J.Am.Chem.Soc.118:6070(1996)；Stewart andYoung,Solid Phase Peptide Synthesis,Freeman(1969)；Finn等人,The Proteins,3.sup.rd ed.,2:105-253(1976)；和Erickson等人,The Proteins,3.sup.rd ed.,2:257-527(1976)。本公开内容预期了合成肽。任选地，肽通过将编码所公开的DDpp的核酸引入宿主细胞中来重组表达，所述宿主细胞被培养以表达所述肽。此类肽从培养基或细胞沉淀中纯化。
可用于实施所提供的方法的DDpp的产生，可以使用本领域已知的多种用于化学合成的标准技术、半合成方法和重组DNA方法学来进行。还提供了一种用于单独地或作为多结构域融合蛋白的一部分、作为可溶性试剂和细胞相关蛋白而产生DDpp的方法。
任选地，可以使参考序列和/或修饰的多肽(例如，DDpp)去免疫。例如，可以鉴定并修饰潜在免疫原性的残基或基序，以便降低或消除对DDpp的潜在免疫应答。下面更详细地提供关于DDpp的产生、选择和分离的各种实施方案的另外细节。
A.DDpp的重组表达
在一些实施方案中，DDpp例如DDpp融合蛋白(例如，衔接子)是“重组产生的”(即，使用重组DNA技术产生)。可用于合成DDpp融合蛋白的示例性重组方法包括但不限于基于聚合酶链式反应(PCR)的合成、连环化、无缝克隆和递归定向连接(RDL)(参见，例如Meyer等人,Biomacromolecules 3:357-367(2002)；Kurihara等人,Biotechnol.Lett.27:665-670(2005)；Haider等人,Mol.Pharm.2:139-150(2005)；和McMillan等人,32:3643-3646(1999)；其各自的内容通过引用整体并入本文)。
还提供了包含编码DDpp(例如衔接子或CAR)的多核苷酸序列的核酸。此类多核苷酸任选地还包含一个或多个表达控制元件。例如，多核苷酸可以包含一个或多个启动子或转录增强子、核糖体结合位点、转录终止信号和聚腺苷酸化信号作为表达控制元件。多核苷酸可以插入任何合适的载体内，所述载体可以包含在任何合适的宿主细胞内以进行表达。
编码DDpp(例如衔接子或CAR)的核酸的表达通常通过将编码DDpp的核酸与表达载体中的启动子可操作地连接来实现。典型的表达载体含有用于调控所需的核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。本领域已知的方法可以用于常规构建含有编码DDpp的核酸序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括但不限于体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。多核苷酸的表达可以在本领域已知的任何合适的表达宿主中执行，所述表达宿主包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在一个实施方案中，编码DDpp的核酸序列与合适的启动子序列可操作地连接，使得核酸序列在宿主中转录和/或翻译成DDpp。
在一个实施方案中，将包含DDpp(例如衔接子)编码核酸的载体引入宿主细胞中以表达DDpp。所述载体可以保持为游离基因或与染色体整合，只要可以转录编码治疗剂的插入序列即可。载体可以通过标准重组DNA技术构建。载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒、病毒或本领域已知的任何其他类型，其被用于在原核或真核细胞中复制和表达。本领域技术人员将了解，本领域已知的多种组件(例如表达控制元件)可以包含在这种载体中，所述组件包括多种转录信号，例如启动子和调控RNA聚合酶与启动子的结合的其他序列。任何已知的或已证明在载体将在其中表达的细胞中有效的启动子都可以用于引发DDpp的表达。合适的启动子可以是诱导型(例如，调控的)或组成型的。合适的启动子的非限制性实例包括SV40早期启动子区、包含在劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复序列中的启动子、HSV-1(单纯疱疹病毒-1)胸苷激酶启动子、金属硫蛋白基因的调控序列等，以及以下动物转录控制区，其表现出组织特异性并且已经用于转基因动物：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区，在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区，在肝脏中有活性的α-甲胎蛋白基因控制区，在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区，在红系细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区，在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区，和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区。在一个特定的实施方案中，启动子是在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区。
在一个实施方案中，编码DDpp(例如衔接子)的一种或若干种核酸在组成型启动子或另选地调控表达系统的控制下表达。合适的调控表达系统包括但不限于四环素-调控的表达系统、蜕皮激素诱导型表达系统、lac-开关表达系统、糖皮质激素-诱导型表达系统、温度-诱导型启动子系统和金属硫蛋白金属-诱导型表达系统。如果宿主细胞系统内含有编码DDpp的若干种不同的核酸，则所述核酸中的一些可以在组成型启动子的控制下表达，而其他核酸可以在调控型启动子的控制下表达。表达水平可以通过包括蛋白质印迹分析和RNA印迹分析的本领域已知的方法来确定。
可以利用多种宿主-表达载体系统来表达编码DDpp(例如衔接子)的核酸。含有编码DDpp(例如，单个DD亚基或DDpp融合体)或其部分或片段的核酸的载体包括质粒载体、单链和双链噬菌体载体以及单链和双链RNA或DNA病毒载体。噬菌体和病毒载体也可以使用已知的感染和转导技术以包装或包封病毒的形式引入宿主细胞中。此外，病毒载体可以是有复制能力的，或者，任选地，是复制缺陷的。任选地，也可以使用无细胞翻译系统，以使用来源于DNA表达构建体的RNA来产生蛋白质(参见，例如WO86/05807和WO89/01036；和美国专利号5,122,464，其各自通过引用整体并入本文)。
通常，可以使用任何类型的细胞或培养的细胞系来表达本文提供的DDpp(例如衔接子)。在一些实施方案中，用于产生工程化宿主细胞，的背景细胞系是噬菌体、细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。可以使用多种宿主-表达载体系统来表达DDpp融合蛋白的编码序列。哺乳动物细胞可以用作宿主细胞系统，所述宿主细胞系统用含有感兴趣的靶标的编码序列和融合多肽的编码序列的重组质粒DNA或粘粒DNA表达载体转染。
所述细胞可以是来自生物体(包括人)的原代分离物、培养物或者转化或转基因性质的细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞是人细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人T细胞。在一些实施方案中，宿主细胞来源于人类患者。
可用的宿主细胞包括但不限于微生物，例如用含有DDpp(例如衔接子)编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、荧光假单胞菌(P.fluorescens))；用含有DDpp编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；用含有DDpp编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒属(baculovirus))感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)，CaMV；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)，TMV)感染的或用含有DDpp编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统。在特定的实施方案中，使用哺乳动物细胞系统来产生DDpp。哺乳动物细胞系统通常利用重组表达构建体，其含有来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。
在产生DDpp例如DDpp融合蛋白(例如衔接子)时可用作宿主细胞的原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。用于原核宿主细胞的表达载体通常含有一种或多种表型选择性标记基因(例如，编码赋予抗生素抗性或提供自养需求的蛋白质的基因)。可用的原核宿主表达载体的实例包括pKK223-3(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pGEMl(Promega,Wis.,USA)、pET(Novagen,Wis.,USA)和pRSET(Invitrogen,Calif.,USA)系列的载体(参见，例如Studier,J.Mol.Biol.219:37(1991)和Schoepfer,Gene 124:83(1993))。在原核宿主细胞表达载体中经常使用的示例性启动子序列包括T7(Rosenberg等人,Gene 56:125-135(1987))、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang等人,Nature275:615(1978))；和Goeddel等人,Nature 281:544(1979))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人,Nucl.Acids Res.8:4057(1980))以及tac启动子(Sambrook等人,1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
在一个实施方案中，使用真核宿主细胞系统，其包括用含有DDpp(例如衔接子)的编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母细胞，例如美国申请号60/344,169和WO03/056914(在非人真核宿主细胞中产生人样糖蛋白的方法)(其各自的内容通过引用整体并入本文)中教导的表达系统。可以用于产生所提供的组合物(例如DD)的示例性酵母包括来自酵母属、毕赤酵母属、放线菌属(Actinomycetes)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母。酵母载体通常含有来自2mu酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动子区、聚腺苷酸化序列、转录终止序列和选择性标记基因。酵母表达构建体中启动子序列的实例包括来自金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman,J.Biol.Chem.255:2073(1980))和其他糖酵解酶的启动子，所述糖酵解酶例如为烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、葡萄糖磷酸异构酶和葡糖激酶。用于酵母表达以及酵母转化方案的另外合适的载体和启动子是本领域已知的。参见例如，Fleer,Gene 107:285-195(1991)和Hinnen,PNAS75:1929(1978)。
昆虫和植物宿主细胞培养系统也可用于产生本公开内容涵盖的组合物。此类宿主细胞系统包括，例如，用含有DD的编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有DD的编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统，包括但不限于美国专利号6,815,184；美国公开号60/365,769和60/368,047；以及WO04/057002、WO04/024927和WO03/078614中教导的表达系统，其各自的内容通过引用整体并入本文。
在一个另外的实施方案中，可以使用宿主细胞系统，包括用重组病毒表达载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒)感染的动物细胞系统，包括经工程化以含有在二重微小染色体中稳定扩增(CHO/dhfr)或不稳定扩增的编码DDpp的DNA的多个拷贝的细胞系(例如，鼠细胞系)。在一个实施方案中，包含编码DDpp的多核苷酸的载体是多顺反子。可用于产生这些组合物的示例性哺乳动物细胞包括293细胞(例如，293T和293F)、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6(Crucell,Netherlands)细胞VERY、Hela细胞、COS细胞、MDCK细胞、3T3细胞、W138细胞、BT483细胞、Hs578T细胞、HTB2细胞、BT20细胞、T47D细胞、CRL7O30细胞、HsS78Bst细胞、杂交瘤细胞和其他哺乳动物细胞。可用于实施所提供的实施方案的另外的示例性哺乳动物宿主细胞包括但不限于T细胞。表达系统和选择方法的一些实例描述于以下参考文献和其中引用的参考文献中：Borth等人,Biotechnol.Bioen.71(4):266-73(2000),Werner等人,Arzneimittel-forschung/Drug Res.48(8):870-80(1998),Andersen等人,Curr.Op.Biotechnol.13:117-123(2002),Chadd等人,Curr.Op.Biotechnol.12:188-194(2001),和Giddings,Curr.Op.Biotechnol.12:450-454(2001)。表达系统和选择方法的另外的实例描述于Logan等人,PNAS 81:355-359(1984),Birtner等人,MethodsEnzymol.153:51-544(1987))。哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译控制序列通常来源于病毒基因组。哺乳动物表达载体中常用的启动子序列和增强子序列包括来源于多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒(CMV)的序列。用于哺乳动物宿主细胞的示例性可商购获得的表达载体包括pCEP4(Invitrogen)和pcDNA3(Invitrogen)。
用于将核酸引入宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是众所周知的。参见例如，Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。
用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且特别是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物(例如，人)细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如，美国专利号5,350,674和5,585,362，其各自的内容通过引用整体并入本文。
用于将目的DNA和RNA多核苷酸引入宿主细胞中的方法包括细胞的电穿孔，其中将电场施加到细胞以便增加细胞膜的渗透性，从而允许将化学品、药物或多核苷酸引入细胞中。可以使用电穿孔将含有DDpp的DNA或RNA构建体引入哺乳动物或原核细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统，其包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。预期使用脂质制剂以将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一个方面，所述核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子附接到脂质体，截留在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含胶束或与胶束复合，或者以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构存在，作为胶束存在，或具有“坍塌”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物的化合物类别，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸双十六烷基酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以储存在大约-20℃下。可以使用氯仿作为唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质媒介物的通称。脂质体可被表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排，并将水和溶解的溶质包埋在脂质双层之间(Ghosh等人,Glycobiology 5:505-510(1991))。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的非均匀聚集体存在。还预期脂质体(lipofectamine)-核酸复合物。
不管是用于将外源性核酸引入宿主细胞中的方法，还是重组核酸序列在宿主细胞中的存在，都可以通过本领域已知的多种测定常规地确认。此类测定包括例如本领域已知的“分子生物学”测定，例如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落在所提供的实施方案范围内的试剂。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调控序列的功能性。通常，报告基因不存在于接受体生物体、组织或细胞中或不由其表达的基因，并且所述基因编码其表达由一些易于检测的性质(例如，酶活性)显现出来的多肽。在DNA已被引入接受体细胞中之后合适的时间，测定报告基因的表达。合适的报告基因的非限制性列表可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等人,FEBS Lett.479:79-82(2000))。合适的表达系统是本领域已知的，并且可以使用已知的技术制备或商业获得。通常，具有显示报告基因的最高表达水平的最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以常规地与报告基因连接，并用于评价试剂调节启动子驱动的转录的能力。
许多选择系统可以用于哺乳动物宿主-载体表达系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人,Cell 22:817(1980))基因，其可以分别用于tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞中。另外，抗代谢物抗性可以用作选择例如，dhfr、gpt、neo、hygro、trpB、hisD、ODC(鸟氨酸脱羧酶)和谷氨酰胺合酶系统的基础。
一旦通过重组表达产生了DDpp(例如，衔接子)，就可以通过本领域已知的任何重组蛋白纯化方法来纯化它，例如通过色谱法(例如，离子交换、疏水相互作用、亲和力和定型柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过任何其他标准蛋白纯化技术。在另外的实施方案中，DDpp任选地与本文所述或本领域已知的异源多肽序列(例如，FLAg标签或HIS标签)融合，以促进纯化。更具体地说，设想了使用用于亲和纯化的配体(例如，抗体和其他亲和基质)，并且任选地，在最终制备DDpp之前，使用本领域已知的技术从组合物中去除与这些配体(例如，FLAg标签或HIS标签)结合的DDpp融合组合物的组分(例如，衔接子)。
B.CAR的表达
CAR(例如，包含本文公开的细胞外D结构域或细胞外p26的CAR)被有意地与细胞缔合，并在表达其的细胞环境中使用。一个特定的实施方案涉及T细胞的过继细胞转移策略，该T细胞已被转导以表达CAR。优选地，可以对细胞进行遗传修饰以在其表面稳定地表达CAR，从而赋予MHC独立的新型靶特异性。
多种病毒源载体可以用于其中使用病毒进行转染和将其整合到哺乳动物细胞基因组中的应用中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。慢病毒载体特别适于实现长期基因转移(例如，过继性T细胞免疫疗法)，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的传代。慢病毒载体与来源于致癌逆转录病毒(例如鼠白血病病毒)的载体相比具有额外的优点，因为它们可以转导非增殖细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优点。一般来讲，合适的载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、启动子序列、便利的限制核酸内切酶位点、以及一个或多个选择性标记(例如国际专利公开号WO01/96584和WO01/29058；以及美国专利号6,326,193)。若干种载体启动子序列可用于转基因的表达。合适启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是一种强大的组成型启动子序列，其能够驱动与其操作性地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个实例是EF1a。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子(例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子)。诱导型启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，引入细胞中的表达载体也可含有选择性标记基因或报告基因或两者，以有助于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中识别和选择表达细胞。在其他方面，选择性标记可被携带在单独的DNA片段上并用于共转染方法。选择性标记和报告基因两者均可侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。可用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，例如neo，并且是本领域中已知的。
在本发明的T细胞的扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞的来源。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本文提供的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。
T细胞分离、培养、活化和扩增方法的完整讨论可以在WO2012079000中找到，其内容通过引用整体并入本文。
另外提供了包含编码本文所述CAR的核酸的宿主细胞。进一步提供了包含编码CAR的核酸序列的组合物。
在优选的实施方案中，细胞的电穿孔导致DDpp-CAR在T细胞、NK细胞和/或NKT细胞的表面上表达。这种表达在细胞的整个生命期间可以是瞬时的或稳定的。电穿孔可以用本领域已知的方法完成，包括MaxCyte和转染系统(MaxCyte,Gaithersburg,MD,USA)。
在一些实施方案中，本文公开的CAR的表达产生细胞相关组合物。在一些实施方案中，CAR包含靶结合结构域，所述靶结合结构域包含本文公开的DD(例如，包含SEQ ID NO：8-33或74-94的氨基酸序列的DD)。在一些实施方案中，DD与CD123结合并且包含选自SEQ IDNO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，DD与AFP p26结合并且包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，DD与AFP p26结合并且包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，DD与AFP p26结合并且包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含含有p26的细胞外AD。在一些实施方案中，细胞外AD包含SEQ IDNO 37-43或44的氨基酸序列。
C.DDpp的化学合成
除了重组方法，DDpp(例如，衔接子)产生也可以使用本领域已知的多种液相和固相化学方法使用所需多肽的有机化学合成来进行。各种自动合成仪是可商购获得的，并且可以根据已知的方案使用。参见例如，Tam等人,J.Am.Chem.Soc.105:6442(1983)；Merrifield,Science 232:341-347(1986)；Barany和Merrifield,The Peptides,Gross和Meienhofer,eds,Academic Press,New York,1-284；Barany等人,Int.J.Pep.ProteinRes.30:705-739(1987)；Kelley等人,Genetic Engineering Principles and Methods,Setlow,J.K.,ed.Plenum Press,NY.1990,vol.12,pp.1-19；Stewart等人,Solid-PhasePeptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,1989。这些方法学的一个优点是它们允许将非天然氨基酸残基掺入DDpp的序列中。
用于本文涵盖的方法的DDpp(例如，衔接子)可以在合成或翻译期间或之后例如通过糖基化、乙酰化、苄基化、磷酸化、酰胺化、聚乙二醇化、甲酰化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、与抗体分子连接、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、泛蛋白化等进行修饰(参见例如，Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties,2d Ed.(W.H.Freeman and Co.,N.Y.,1992)；Postranslational Covalent Modification ofProteins,Johnson,ed.(Academic Press,New York,1983),pp.1-12；Seifter,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)；Rattan,Ann.NY Acad.Sci.663:48-62(1992))。在具体的实施方案中，肽在N-末端乙酰化和/或在C-末端酰胺化。
本公开内容还提供了DDpp(例如，衔接子)衍生物，并且包括已经以与氨基酸的添加、缺失或取代不同的某种方式进行化学修饰的多肽。在这方面，DDpp与聚合物、脂质、其他有机部分和/或无机部分化学键合。示例性的多肽修饰在Hermanson,BioconjugateTechniques,Academic Press,(1996)中提供。DDpp任选地包含促进与另一个部分(例如，肽部分)缀合的官能团。示例性官能团包括但不限于异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基化剂、酰亚胺酯、碳二亚胺、酸酐、烷基卤化物衍生物(例如，卤代乙酰基衍生物)、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、芳基化剂、硫醇二硫化物交换试剂(例如，吡啶基二硫化物或TNB硫醇)、重氮烷烃、羰基二咪唑(carboyldiimadazole)、N,N’-二琥珀酰碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯和肼衍生物。马来酰亚胺可用于例如在体内产生结合白蛋白的DDpp。
在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)被共价修饰以包括一种或多种水溶性聚合物附接物。水溶性聚合物(或其他化学部分)附接至任何氨基酸残基，但是在一些实施方案中优选附接至N末端或C末端。可用的聚合物包括但不限于PEG(例如，大约40kD、30kD、20kD、10kD、5kD或1kD的PEG)、聚氧乙二醇、聚丙二醇、单甲氧基-聚乙二醇、右旋糖酐、羟乙基淀粉、纤维素、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚唾液酸(PSA)、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇以及前述任一种的混合物。在一个实施方案中，DDpp是PEG化的。PEG部分可以以不同的形状获得，例如线性或分支的。关于水溶性聚合物附接物的进一步讨论，参见美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192和4,179,337。本文描述了可用于改善肽半衰期或稳定性的其他部分，包括例如白蛋白(任选地进行修饰以允许与DDpp缀合)、脂肪酸链(例如，C12-C18脂肪酸，例如C14脂肪酸或二羧酸，例如十八烷二羧酸(oddc))、抗体或其片段(例如，抗体的Fc部分)和脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体。
在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)缀合至聚乙二醇(PEG)部分、人血清白蛋白(HSA)、抗体或抗体片段、羟乙基淀粉、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸多聚体(PAS化)、C12-C18脂肪酸或多唾液酸。
在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)在肽的N末端氨基酸处被酰化。在另一个方面，DDpp在多肽的C末端氨基酸处被酰胺化。在再一方面，肽在所述肽的N末端氨基酸处被酰化并且在所述肽的C末端氨基酸处被酰胺化。
在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含一种或多种修饰的或非蛋白原性的氨基酸或修饰的接头基团(参见例如，Grant,Synthetic Peptides:A User's Guide,Oxford University Press(1992))。修饰的氨基酸包括例如其中氨基和/或羧基基团被另一个基团取代的氨基酸。非限制性实例包括掺入硫代酰胺、脲、硫脲、酰肼、酯、烯烃、磺酰胺、磷酸酰胺、酮、醇、硼酸酰胺、苯二氮卓类和其他芳族或非芳族杂环的修饰的氨基酸(参见，Estiarte等人,Burgers Medicinal Chemistry,6.sup.th edition,Volume 1,Part 4,John Wiley&Sons,New York(2002))。非蛋白原性氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(Bal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基异丁酸(Aib)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、鸟氨酸(Orn)、羟脯氨酸(Hyp)、牛磺酸、肌氨酸、瓜氨酸(Cit)、半胱氨酸(Coh)、环己基丙氨酸(Cha)、甲硫氨酸亚砜(Meo)、甲硫氨酸砜(Moo)、高丝氨酸-甲酯(Hsm)、炔丙基甘氨酸(Eag)、5-氟色氨酸(5Fw)、6-氟色氨酸(6Fw)、3’,4’-二甲氧基苯基-丙氨酸(Ear)、3’,4’-二氟苯基-丙氨酸(Dff)、4’-氟苯基-丙氨酸(Pff)、1-萘基-丙氨酸(1Ni)、2-萘基丙氨酸(2Ni)、1-甲基色氨酸(1Mw)、青霉胺(Pen)、高丝氨酸(Hse)、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸(Phg)、苯并噻吩丙氨酸(Bta)、L-高-半胱氨酸(Hcy)、N-甲基-苯丙氨酸(Nmf)、2-噻吩丙氨酸(Thi)、3,3-二苯基丙氨酸(Ebw)、L-α-叔丁基甘氨酸(Tle)、Bpa、高苯丙氨酸(Hfe)和S-苄基-L-半胱氨酸(Ece)。这些和其他非蛋白原性氨基酸可以D-异构体或L-异构体形式存在。修饰的接头的实例包括但不限于柔性接头4,7,10-三噁唑-1,13-十三烷二胺(Ttd)，甘氨酸，6-氨基己酸，β-丙氨酸(Bal)，戊酸(Pyn)以及Ttds、甘氨酸、6-氨基己酸和Bal的组合。
多种化学修饰中的任一种可以通过已知技术进行，所述技术包括但不限于乙酰化、甲酰化等。另外，衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。
嵌合抗原受体细胞
本公开内容提供了调节经修饰以表达一种或多种不同CAR的细胞的特异性和活性的组合物和方法。
在一些实施方案中，细胞被工程化以表达本文描述的一种或多种CAR。这种含有CAR的细胞(被称为“CAR细胞”)可用于单一疗法和联合疗法，其包括其他治疗剂，例如本文所述的衔接子，例如，以杀死靶细胞。
在一些实施方案中，本文提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其中CAR包含结合CD123的D结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，细胞是自体免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是自体T细胞(CAR-T细胞)或自体自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体T细胞(CAR-T细胞)或同种异体自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞能够在体外测定中将免疫应答导向至表达CD123的细胞。
在一些实施方案中，本文提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其中CAR包含与AFP p26 AD结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的scFv。在一些实施方案中，与AFP p26AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的D结构域。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ IDNO：69的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，细胞是自体免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是自体T细胞(CAR-T细胞)或自体自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体T细胞(CAR-T细胞)或同种异体自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，该细胞能够在体外测定中将免疫应答导向至表达CD123的细胞，所述体外测定包括该细胞、表达CD123的细胞和衔接子，所述衔接子包含(1)与CD123结合的D结构域和(b)AFP p26 AD，例如包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的衔接子。
在一些实施方案中，本文提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其中CAR包含AFPp26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，AFP p26AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，细胞是自体免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是自体T细胞(CAR-T细胞)或自体自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体T细胞(CAR-T细胞)或同种异体自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞能够在体外测定中将免疫应答导向至表达CD123的细胞，所述体外测定包括所述细胞、表达CD123的细胞和衔接子，所述衔接子包含(1)与CD123结合的D结构域和(b)与AFP p26 AD结合的D结构域。
在一些实施方案中，CAR细胞包含编码CAR的核酸序列，其中CAR包含至少部分由结合感兴趣的靶标的ADBD(例如，D结构域)组成的细胞外结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。在几个实施方案中，编码的CAR多肽特异性结合肿瘤抗原(因此起到将表达CAR的细胞递送至肿瘤的作用)。在几个实施方案中，CAR结合的肿瘤抗原与血液恶性肿瘤有关。在另外的实施方案中，CAR结合的肿瘤抗原与实体肿瘤有关。在进一步的实施方案中，CAR被工程化为结合实体肿瘤和血液肿瘤两者。取决于实施方案，表达CAR的细胞可以是免疫效应细胞(例如，T细胞或自然杀伤(NK)细胞)或另一种细胞类型。在一些实施方案中，免疫效应细胞是自体细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是同种异体细胞。在几个实施方案中，当CAR的抗原结合结构域与其靶向的肿瘤抗原结合时，细胞(无论是T细胞、NK细胞或其他细胞类型)表现出抗肿瘤免疫力。
在一些实施方案中，在扩增和遗传修饰或其他修饰之前，可以使用本领域已知的技术从受试者常规地获得细胞来源(例如，T细胞或自然杀伤细胞)。术语“受试者”旨在包括可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。T细胞可以从包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤的来源获得。
在一些实施方案中，CAR细胞能够杀死靶细胞，例如当CAR的ADBD(例如，D结构域)与可以存在于靶细胞表面上和/或衔接子中的AD相互作用时。在一些实施方案中，CAR细胞能够脱颗粒，例如当CAR的ADBD与可以存在于靶细胞表面上和/或衔接子中的AD相互作用时。在一些实施方案中，CAR细胞能够分泌一种或多种细胞因子，例如当CAR的ADBD与可以存在于靶细胞表面上和/或衔接子中的AD相互作用时。
在一些实施方案中，含CAR的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，含CAR的细胞是免疫效应细胞。在进一步的实施方案中，含CAR的免疫细胞是细胞毒性细胞。在进一步的实施方案中，细胞毒性细胞选自T细胞、NK细胞或培养的NK细胞(例如NK92细胞)。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在某些实施方案中，免疫效应细胞包含免疫球蛋白或其他肽结合分子的细胞表面受体，例如免疫球蛋白恒定区的受体并且包括通常被称为“Fc受体”(“FcR”)的受体类别。多种FcR已在结构和/或功能上被表征，并且是本领域中已知的，包括具有与有限的免疫球蛋白重链同种型亚群相互作用的特定能力的FcR，或与具有不同亲和力的Fc结构域相互作用的FcR，和/或可在某些条件下在有限的免疫效应细胞亚群上表达的FcR(例如，Kijimoto-Ochichai等人,Cell Mol.Life.Sci.59:648(2002)；Davis等人,Curr.Top.Microbiol.Immunol.266:85(2002)；Pawankar,Curr.Opin.Allerg.Clin.Immunol.1:3(2001)；Radaev等人,Mol.Immunol.38:1073(2002)；Wurzburg等人,Mol.Immunol.38:1063(2002)；Sulica等人,Int.Rev.Immunol.20:371(2001)；Underhill等人,Ann.Rev.Immunol.20:825(2002)；Coggeshall,Curr.Dir.Autoimm.5:1(2002)；Mimura等人,Adv.Exp.Med.Biol.495:49(2001)；Baumann等人,Adv.Exp.Med.Biol.495:219(2001)；Santoso等人,Ital.Heart J.2:811(2001)；Novak等人,Curr.Opin.Immunol.13:721(2001)；Fossati等人,Eur.J.Clin.Invest.31:821(2001))，其内容通过引用整体并入本文。
能够介导ADCC的细胞是免疫效应细胞的例子。其他免疫效应细胞包括自然杀伤细胞、肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋巴细胞和粒细胞，例如包含过敏反应机制的细胞。因此，免疫效应细胞包括但不限于造血来源的细胞，包括骨髓和淋巴谱系内处于不同分化阶段的细胞，这些细胞可能(但不一定)表达一种或多种类型的功能性细胞表面FcR，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、红细胞和前体、祖细胞(例如造血干细胞)，以及这些细胞的静止、活化和成熟形式。其他免疫效应细胞可以包括能够介导免疫功能的非造血来源的细胞，例如内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、破骨细胞、上皮细胞和其他细胞。免疫效应细胞还可以包括介导细胞毒性或细胞抑制事件、或内吞、吞噬或胞饮事件、或影响细胞凋亡诱导、或影响微生物免疫或中和微生物感染的细胞、或介导过敏、炎症、超敏性和/或自身免疫反应的细胞。
在一些实施方案中，含CAR的细胞是T细胞。在一些实施方案中，含CAR的细胞是NK细胞。在另外的实施方案中，含CAR的细胞是B细胞。可以任选地使用其他免疫细胞和/或不同免疫细胞类型的组合。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，细胞类型(例如，NK细胞和T细胞)的组合是有利的，因为它们协同作用以治疗疾病或病症(例如，过度增殖性疾病，如癌症)。当使用组合时，各种细胞类型可以靶向相同、不同或重叠的肿瘤抗原决定簇。
在一些实施方案中，含有CAR的免疫细胞是T细胞，并且CAR的ADBD与同源配体(即，感兴趣的靶标)的结合刺激T细胞启动细胞内信号传导。在进一步的实施方案中，CAR的ADBD与同源配体的结合刺激T细胞产生细胞因子和脱颗粒，导致对在其表面表达感兴趣的靶标的细胞(例如，癌细胞)的细胞毒性作用。在另外的实施方案中，含有CAR的T细胞响应于结合感兴趣的靶标而增殖。在一些实施方案中，含有CAR的T细胞的活性不会导致T细胞表现出与T细胞耗竭相关的表型。在一些实施方案中，当CAR细胞为T细胞时，CAR的跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28，而细胞质结构域包含T细胞受体α、β或ζ链。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ IDNO：114的氨基酸序列。
在一些实施方案中，含有CAR的免疫细胞是NK细胞，跨膜结构域包含CD8a、CD28或41BB，并且细胞质结构域包含T细胞受体的ζ链。在一些实施方案中，细胞质结构域包含SEQID NO：115、116或其组合的序列。在一些实施方案中，细胞质结构域包含SEQ ID NO：117的序列。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体NK细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体NK细胞。
在一些实施方案中，含有CAR的免疫细胞已被工程化以结合癌细胞表达的感兴趣的靶标。在进一步的实施方案中，含有CAR的细胞结合选自以下组的肿瘤抗原：CD137、PDL1、CD123、CTLA4、CD47、KIR、DR5、TIM3、PD1、EGFR、TCR、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33、lL3Ra、cMet、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD2、NY-ESO-1和MAGE A3。在进一步的实施方案中，含有CAR的细胞结合2、3、4、5种或更多种上述肿瘤抗原。
在一些实施方案中，CAR细胞被工程化以表达本文公开的衔接子。
在另外的实施方案中，CAR细胞被工程化以表达第二CAR。在一些实施方案中，第二CAR包含含有ADBD(例如，D结构域)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在另外的实施方案中，第二CAR包含细胞外结构域，该细胞外结构域包含具有相同或不同特异性的一个或多个ADBD。在一些实施方案中，第二CAR能够在结合感兴趣的靶标时传导效应功能信号。在进一步的实施方案中，第二CAR包含含有ADBD的细胞外结构域和跨膜或其他细胞表面结合结构域，但在结合感兴趣的靶标时无法发出信号。
在一些实施方案中，CAR细胞被工程化，使得CAR编码序列被位点特异性地引入到在相应宿主细胞中高度表达的基因的基因座中。在一些实施方案中，CAR编码序列被引入T细胞受体基因座中。在进一步的实施方案中，CAR编码序列被引入细胞的T细胞受体α恒定(TRAC)。缺乏功能性TCR和/或HLA的表达的修饰的细胞可以常规地使用本领域已知的任何合适方法获得，包括例如siRNA、shRNA、CRISPR、TALEN和/或ZFN。
在一些实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞可以是自体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。
可用于实践所提供的方法的包含遗传修饰的CAR细胞的产生可以使用本领域已知的重组DNA方法、遗传操作和基因组编辑的各种标准技术进行。缺乏AD表达的本文所述的遗传修饰的CAR细胞可以常规地使用本领域已知的任何合适方法获得，包括例如siRNA、shRNA、CRISPR、TALEN和/或ZFN。例如，在美国专利申请公开号20170204372中描述了用于遗传操作CAR细胞的方法，该专利通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，CAR细胞被工程化为消除或减少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如I类HLA和/或II类HLA)的表达。缺乏功能性TCR和/或HLA的表达的修饰的细胞可以常规地使用本领域已知的任何合适方法获得，包括例如siRNA、shRNA、CRISPR、TALEN和/或ZFN。
在一些实施方案中，CAR细胞被工程化为消除或减少可能降低CAR细胞产生免疫效应反应的能力的分子的表达。在进一步的实施方案中，CAR细胞被工程化为消除或降低选自以下的分子的表达：PD1、PDL1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一些实施方案中，CAR细胞已被工程化为消除或降低2、3、4、5种或更多种上述分子的表达。可以使用本领域已知的任何合适方法(包括例如siRNA、shRNA、CRISPR、TALEN和/或ZFN)常规获得缺乏一种或多种上述分子的表达的修饰的细胞。
在进一步的实施方案中，CAR细胞被工程化以消除或减少以下一种或多种的表达：(a)功能性TCR和HLA；和(b)选自以下的分子：PD1、PDL1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在进一步的实施方案中，CAR细胞已被工程化以消除或减少上述分子中的2、3、4、5、6或更多种的表达。
适合与本文公开的DDpp(例如，衔接子和CAR)结合使用的CAR细胞已在国际申请公开号WO2016164305、WO2016164308A1、WO2019099440和WO2019099433、美国专利号10,662,248和10,647,775以及美国专利申请号20200223934和20210002381中公开，其各自出于所有目的以引用的方式并入本文。
组合物
本文提供了包含本文公开的D结构域多肽、DDpp融合蛋白(例如，衔接子)的组合物。还提供了包含表达本文公开的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的组合物。还提供了包含编码本文公开的D结构域多肽、DDpp融合蛋白(例如，衔接子)或CAR的多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，本文提供的组合物是药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含生理上可耐受的载体。在一些实施方案中，本文提供的组合物适合于向患者施用，例如通过静脉内或皮下施用。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其中CAR包含与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ IDNO：67的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，免疫效应细胞是自体细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞能够在体外测定中将免疫应答导向至表达CD123的细胞。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其中CAR包含与AFP p26 AD结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的scFv。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的D结构域。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFPp26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞能够在体外测定中将免疫应答导向至表达CD123的细胞，所述体外测定包括所述细胞、表达CD123的细胞和衔接子，所述衔接子包含(1)与CD123结合的D结构域和(b)AFP p26 AD，例如包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的衔接子。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包括表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其中CAR包括AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，该细胞能够在体外测定中将免疫应答导向至表达CD123的细胞，该体外测定包括该细胞、表达CD123的细胞和衔接子，该衔接子包含(1)与CD123结合的D结构域和(b)与AFP p26 AD结合的D结构域。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含衔接子，该衔接子包含(a)与CD123结合的D结构域(DD)和(b)抗原决定簇(AD)。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子是包含与CD123结合的单个D结构域的单价衔接子。在一些实施方案中，衔接子是包含与CD123结合的两个D结构域的二价衔接子。在一些实施方案中，与CD123结合的两个D结构域是相同的。在一些实施方案中，结合CD123的两个D结构域是不同的。在一些实施方案中，衔接子是二价衔接子，包含结合CD123的第一D结构域和结合第二AD的第二D结构域。在一些实施方案中，第二AD是CD33或LeY。在一些实施方案中，单价衔接子包含D结构域，所述D结构域包含选自SEQ IDNO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，单价衔接子包含D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含DD，所述DD包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含两个相同的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含两个相同的D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述衔接子包括AFP p26抗原决定簇(AD)。在一些实施方案中，所述AFP p26 AD包括选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AFP p26 AD包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AFP p26 AD包括SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单价衔接子包括SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单价衔接子包括SEQ ID NO：50的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述二价衔接子包括SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单价衔接子包括SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述衔接子包括一个或多个接头。在一些实施方案中，衔接子能够在体外测定中将免疫应答引导至表达CD123的细胞，该体外测定包括衔接子、表达CD123的细胞和表达包含结合衔接子所包含的AD的ADBD的CAR(例如包含结合AFP p26的D结构域的CAR)的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含衔接子，所述衔接子包含(a)与CD123结合的D结构域和(b)与AFP p26 AD结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的D结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个接头。在一些实施方案中，衔接子能够在体外测定中将免疫应答导向至表达CD123的细胞，所述体外测定包括衔接子、表达CD123的细胞和表达包含AFP p26AD的CAR的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含衔接子，所述衔接子包含(a)与靶细胞上的靶抗原决定簇(AD)结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(b)与AFP p26 AD结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFPp26 AD结合的ADBD包含与AFP p26结合的D结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFPp26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个接头。在一些实施方案中，衔接子能够在体外测定中将免疫应答导向至表达CD123的细胞，所述体外测定包括衔接子、表达CD123的细胞和表达包含AFP p26 AD的CAR的免疫效应细胞。
在某些实施方案中，CAR包含单链可变片段(scFv)ADBD。在其他实施方案中，CAR包含替代支架结合结构域(ASBD)ADBD。在进一步的实施方案中，CAR包含D结构域。
在一些实施方案中，CAR包含2个ADBD。在其他实施方案中，CAR包含ASBD和scFv。在进一步的实施方案中，CAR包含D结构域和scFv。在一些实施方案中，CAR包含2个ASBD。在进一步的实施方案中，CAR包含2个D结构域。
在一些实施方案中，CAR细胞内结构域是信号传导结构域。在进一步的实施方案中，CAR细胞内结构域包含初级信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR细胞内结构域包含CD3ζ初级信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR细胞内结构域还包含共刺激信号传导结构域。在进一步的实施方案中，共刺激信号传导结构域选自：CD28、41BB、CD27和CD134。在特定实施方案中，CAR细胞内信号传导结构域包含41BB共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：115、116或其组合的序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：117的序列。
在一些实施方案中，靶AD选自：CD45、CD26、CD30、CD33、LeY和CD38。在一些实施方案中，靶AD选自：CD19、CD22、CD123、BCMA、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在进一步的实施方案中，靶AD是BCMA。在进一步的实施方案中，靶AD是CS1。在其他实施方案中，靶AD是CD123。在其他实施方案中，靶AD是CD19。在其他实施方案中，靶AD是CD22。在其他实施方案中，靶AD是TACI。在其他实施方案中，靶AD是BAFFR。在其他实施方案中，靶AD是PDL1。在其他实施方案中，靶AD是HER2。
在一些实施方案中，CAR包含2个结合单独靶标的ADBD。在进一步的实施方案中，CAR结合CD123和CD33。在进一步的实施方案中，CAR结合CD123和CD38。在进一步的实施方案中，CAR结合CD123和LeY。在进一步的实施方案中，CAR与CD123和BCMA结合。在进一步的实施方案中，CAR与CD123和CS1结合。在进一步的实施方案中，CAR与CD19和CD123结合。在其他实施方案中，CAR与CD22和CD123结合。在其他实施方案中，CAR与PDL1和CD123结合。
在一些实施方案中，衔接子包含肿瘤抗原的AD。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原选自以下组：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。
在一些实施方案中，衔接子包含肿瘤抗原的AD。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原选自以下组：BCMA、CD19、CD22、CS1、TACI、BAFFR和PDL1。
在一些实施方案中，衔接子包含作为scFv的ADBD。在进一步的实施方案中，衔接子包含作为ASBD的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包含D结构域。
在一些实施方案中，衔接子包括两个ADBD。在进一步的实施方案中，衔接子包括两个ADBD，它们(a)相同，(b)结合相同的抗原决定簇，(c)结合相同抗原的不同AD，(d)结合相同细胞上的不同抗原，或(d)结合不同细胞上的不同抗原。在进一步的实施方案中，衔接子包括两个ASBD。在某些实施方案中，衔接子包括两个D结构域。在一些实施方案中，衔接子包括作为scFv的ADBD和作为ASBD的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括作为scFv的ADBD和作为D结构域的ADBD。
在一些实施方案中，衔接子包括与选自以下的成员结合的ADBD：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。在某些实施方案中，所述衔接子包括与CD45结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包括与CD26结合的ADBD。在一些实施方案中，所述衔接子包括与CD30结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包括与CD33结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包括与CD38结合的ADBD。在一些实施方案中，所述衔接子包括与CD45结合的ADBD。
在一些实施方案中，所述衔接子包括与选自以下的成员结合的ADBD：BCMA、CD123、CD19、CD22、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在某些实施方案中，衔接子包含与BCMA结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包含与CD123结合的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包含衔接子包含与CD19结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包含与CD22结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包含与CS1结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包含与HER2结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包含与TACI结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包含与BAFFR结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包含与PDL1结合的ADBD。
在一些实施方案中，所述衔接子是双特异性的。在进一步的实施方案中，所述衔接子包括与CD123结合的ADBD和与CD33结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包括与CD123结合的ADBD和与CD38结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包括与CD123结合的ADBD和与LeY结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包括与PDL1结合的ADBD和与CD123结合的ADBD。
在一些实施方案中，所述靶细胞是肿瘤细胞。在进一步的实施方案中，所述肿瘤细胞选自急性髓系白血病(AML)细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、骨髓增生异常细胞和母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞的组。在一些实施方案中，肿瘤细胞是AML肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是骨髓增生异常细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是毛细胞白血病肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是BPDCN肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞表达CD123。
在本文提供的杀死靶细胞的方法中，靶细胞可以是免疫系统的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是幼稚T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是记忆T细胞。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在进一步的实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在其他实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是自体细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞杀死靶细胞。在一些实施方案中，衔接子与AD的结合阻断了包含AD的抗原的活性。在一些实施方案中，表达CAR的细胞包含降低或消除本文所述的AD的表达的遗传修饰。在一些实施方案中，表达CAR的细胞包含降低或消除人CD45 AD的表达的遗传修饰。
在一些实施方案中，CAR细胞与靶细胞和衔接子上都存在的AD结合。在其他实施方案中，CAR细胞与衔接子上存在但不存在于靶细胞上的AD结合。在一些实施方案中，AD是天然存在的蛋白质/分子。在一些实施方案中，AD是人蛋白质/分子。
在一个实施方案中，本文提供的治疗组合物包含生理上可耐受的载体以及溶解或分散在其中作为活性成分的至少一个拷贝的本文所述的DDpp融合蛋白(例如，衔接子)。在另一个实施方案中，本文提供的治疗组合物包含生理上可耐受的载体以及溶解或分散在其中作为活性成分的至少一个拷贝的本文所述的DDpp。在另一个实施方案中，本文提供的治疗组合物包含生理上可耐受的载体以及溶解或分散在其中作为活性成分的至少一个拷贝的本文所述的CAR细胞。在优选的实施方案中，当为了治疗目的而施用于人患者时，治疗组合物不具有免疫原性。
含有溶解或分散在其中的活性成分的药物组合物的制备是本领域公知的。通常，将此类组合物制备成无菌注射剂，作为水性或非水性的液体溶液或悬浮液。然而，也可以制备在使用前适于在液体中溶解或悬浮的固体形式。所述制备物也可以被乳化。因此，含有DDpp(例如，含有衔接子)的组合物可以采取溶液、悬浮液、片剂、胶囊、持续释放制剂或粉末的形式，或其他组合物形式。在一些实施方案中，配制DDpp组合物(例如，DDpp融合蛋白例如衔接子)以确保或优化体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物，并且如果需要，制备组合物以便通过例如在脂质体中配制来增加跨BBB的转移。关于制造脂质体的方法，参见例如，美国专利号4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含一种或多种选择性转运至特定细胞或器官中的部分，从而增强靶向药物递送(参见例如，Ranade,Clin.Pharmacol.29:685(1989))。
DDpp(例如DDpp融合蛋白，例如衔接子)和/或CAR细胞可以与药学上可接受且与活性成分相容并且以适用于本文所述的治疗方法的量的其他活性成分和/或赋形剂混合。合适的赋形剂是，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，所述组合物可以含有少量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等，其增强活性成分的有效性。
治疗性DDpp(例如，衔接子)制剂可以包含其中的组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与例如像盐酸或磷酸的无机酸或例如乙酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基基团形成)。由游离羧基基团形成的盐也可源自例如像钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物的无机碱和例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。
生理上可耐受的载剂是本领域已知的。液体载剂的示例是无菌水性溶液，其不含除活性成分和水之外的物质，或者含有缓冲剂(例如生理pH值的磷酸钠)、生理盐水或两者，例如磷酸盐缓冲盐水。此外，水性载剂可以含有多于一种缓冲盐，以及盐(例如氯化钠和氯化钾)、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇和其他溶质。
除了水之外并且排除水，液体组合物还可以含有液相。此类另外的液相的示例是甘油、植物油(例如棉籽油)、有机酯(例如油酸乙酯)和水-油乳剂。
在一个实施方案中，治疗组合物含有DDpp融合蛋白(例如衔接子)，通常为按总治疗组合物的重量计的至少0.1重量％的DDpp融合蛋白的量。重量百分比是按总组合物计的DDpp融合体(例如，衔接子)的重量比。因此，例如，0.1重量％是每100克总组合物中有0.1克DDpp(例如，衔接子)。
包含DDpp融合蛋白(例如，包含衔接子)的治疗组合物通常含有按组合物的体积计约10微克(μg)/毫升(ml)至约100毫克(mg)/毫升(ml)的DDpp融合蛋白(例如，衔接子)作为活性成分，并且更优选含有约1mg/ml至约10mg/ml(即，约0.1重量％至1重量％)。
用于施用DDpp(例如，DDpp融合蛋白例如衔接子)的剂量范围是大到足以产生其中由靶分子介导的疾病症状得到改善的所需效果的那些剂量范围。所述剂量不应该大到导致不良的副作用，例如高黏滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等。一般来讲，所述剂量将随着患者的年龄、病状、性别和疾病程度而变化且可由本领域的技术人员来测定。如果有任何并发症，则所述剂量可由单个医师调节。
DDpp(例如，DDpp融合蛋白例如衔接子)可以通过注射或通过随时间的逐渐输注而肠胃外施用。尽管靶分子通常可以通过全身施用进入体内，并且因此最经常通过静脉内施用治疗组合物来治疗，但是在靶向的组织可能含有靶分子的情况下，也可以预期其他组织和递送手段。因此，DDpp(例如，衔接子)可以静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内、经皮施用，并且可以通过蠕动手段递送。DDpp融合蛋白(例如，衔接子)也可以通过气雾剂递送到气道和肺。
包含DDpp(例如，衔接子)的治疗组合物可以常规地静脉内施用，例如通过注射单位剂量施用。术语“单位剂量”在提及本文提供的治疗组合物使用时，是指适合作为用于受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算产生所需治疗效果的预定量的活性物质以及所需要的稀释剂；例如，载剂或媒介物。在一些实施方案中，包含DDpp(例如，衔接子)的治疗组合物皮下施用。
DDpp(例如，DDpp融合蛋白例如衔接子)以与剂量制剂相容的方式且以治疗有效量施用。施用的量取决于待治疗的受试者、受试者系统利用所施用的组合物的活性成分的能力和所需的治疗效果的程度。施用所需要的活性成分的精确量取决于医师的判断并且是每一个个体所特有的。然而，本文公开了用于全身应用的合适剂量范围，并且其取决于施用途径。合适的施用方案也是可变的，但特点在于初始施用之后以一个或多个小时的间隔重复给药，随后进行注射或其他施用。任选地，预期足以将血液中的浓度维持在体内疗法指定的范围内的连续静脉内输注。
DDpp(例如，衔接子)组合物以符合良好医疗实践的方式进行配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、剂的递送部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业者已知的其他因素。用于施用DDpp(例如，衔接子)的剂量范围是大到足以产生其中由靶分子介导的疾病症状得到改善的所需效果的那些剂量范围。所述剂量不应该大到导致不良的副作用，如高黏滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等。一般来讲，所述剂量将随着患者的年龄、病状、性别和疾病程度而变化且可由本领域的技术人员来测定。如果有任何并发症，则所述剂量可由个体医师调节。
用于治疗和预防用途的有效剂量方案和量，即，“给药方案”，将取决于多种因素，包括疾病或病症的原因、阶段和严重性，所治疗的哺乳动物的健康状况、身体状况、年龄，以及DDpp(例如，衔接子)递送的部位和模式。复合物的治疗功效和毒性以及形成可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学、药理学和毒理学程序来确定。从这些程序获得的数据同样可以用于配制用于人使用的剂量范围。此外，治疗指数(即，在50％群体中治疗有效的剂量除以50％群体致死的剂量(ED50/LD50))可以使用已知程序容易地确定。剂量优选在包括ED50而很少毒性或没有剂量限制毒性的浓度范围内，并且可以根据所用的剂型、患者的敏感性和施用途径在此范围内变化。
剂量方案还考虑了本领域已知的药代动力学和药效学参数，例如药物吸收速率、生物利用度、代谢和清除率(参见例如，Hidalgo-Aragones,J.SteroidBiochem.Mol.Biol.58:611-617(1996)；Groning等人,Pharmazie51:337-341(1996)；Fotherby,Contraception 54:59-69(1996)；和Johnson等人,J.Pharm.Sci.84:1144-1146(1995))。临床医生确定每个所治疗的受试者的剂量方案完全在本领域和技术水平内。此外，DDpp(例如，衔接子)组合物的单次或多次施用可以根据需要的剂量和频率来施用并且被受试者所耐受。预防性治疗和治疗性治疗的持续时间将根据所治疗的特定疾病或病状而变化。一些疾病适于急性治疗，而其他疾病需要长期、慢性疗法。DDpp(例如，衔接子)可以连续施用，或与另外的治疗剂同时施用。
在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.1mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约25mg/kg、约0.1mg/kg至约20mg/kg、约0.1mg/kg至约15mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约5mg/kg施用。
在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.1mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约25mg/kg、约0.1mg/kg至约20mg/kg、约0.1mg/kg至约15mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约5mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约1μg/kg至约10mg/kg、约5μg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约10mg/kg、约20μg/kg至约10mg/kg或约50μg/kg至约10mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约10μg/kg至约10mg/kg、约50μg/kg至约10mg/kg、约100μg/kg至约10mg/kg、约200μg/kg至约10mg/kg或约500μg/kg至约10mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约100μg/kg至约10mg/kg、约100μg/kg至约5mg/kg、约100μg/kg至约2mg/kg、约100μg/kg至约1mg/kg、约100μg/kg至约5mg/kg或约100μg/kg至约2mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约1μg/kg至约10mg/kg、约5μg/kg至约5mg/kg、约10μg/kg至约2mg/kg、约20μg/kg至约1mg/kg或约5μg/kg至约0.5mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.04mg/kg、约0.07mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约1mg/kg或约2mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.07mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.01mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.1mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.2mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.3mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.4mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.5mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.6mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.7mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.8mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.9mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约1mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约2mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约3mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约4mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约5mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约6mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约7mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约8mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约9mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约10mg/kg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经静脉内施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经皮下施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.2mg至约200mg、约0.5mg至约100mg、约1mg至约50mg、约2mg至约25mg或约2mg至约12mg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约0.4mg、约0.8mg、约1.6mg、约2.8mg、约3mg、约4mg、约8mg、约12mg、约16mg、约20mg、约24mg、约28mg、约40mg或约80mg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以约1.6mg、约2.8mg、约3mg、约4mg、约8mg、约12mg、约16mg或约20mg施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经静脉内施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经皮下施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，施用多于一个剂量的DDpp(例如，衔接子)。在一些实施方案中，多于一个剂量的DDpp(例如，衔接子)是恒定剂量。在一些实施方案中，以不同剂量施用DDpp(例如，衔接子)。在一些实施方案中，施用的DDpp(例如，衔接子)的量随时间增加。在一些实施方案中，施用的DDpp(例如，衔接子)的量随时间减少。在一些实施方案中，首先以约0.01mg/kg至约0.5mg/kg的低剂量施用DDpp(例如，衔接子)，然后以约0.1mg/kg至约5mg/kg的高剂量施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经静脉内施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经皮下施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每日施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每日施用两次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每日施用三次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每日施用四次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每12小时施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每8小时施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每6小时施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每4小时施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每隔一天施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每三天施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每周施用两次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每周施用两次，例如，在周一、周三和周五。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)每周施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经静脉内施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经皮下施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)施用七天。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)施用2周。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)施用3周。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)施用4周。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)施用1个月。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)施用2个月。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)施用3个月。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经静脉内施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经皮下施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)在治疗期间以相同频率施用。在一些实施方案中，施用频率在治疗期间降低。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)首先每天施用持续约一周，然后每周施用两次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)首先每天施用一至三次持续约一周，然后每天施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)首先每天施用一至三次持续约一周，然后每周施用两次或每周施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)以连续输注形式施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)首先以连续输注形式施用约一周，然后每天施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)首先以连续输注方式施用约一周，然后每周施用两次或每周施用一次。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经静脉内施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)经皮下施用。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约10x106至约300x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约50x106至约900x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约10x106至约500x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约100x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约50x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约100x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约150x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约200x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约250x106个表达特异性结合AFPp26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约300x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约400x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约500x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约600x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp(例如，衔接子)的受试者施用约700x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受DDpp的受试者施用多于一个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞(例如，衔接子)。在一些实施方案中，在DDpp(例如，衔接子)的第一个剂量的同时向受试者施用特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR。在一些实施方案中，在DDpp(例如，衔接子)的第一个剂量之前向受试者施用特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR。在一些实施方案中，所述AFP p26抗原决定簇包含SEQID NO：37-43或44的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AFP p26抗原决定簇包含SEQ IDNO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AFP p26抗原决定簇包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR包含特异性结合AFPp26抗原决定簇的D结构域，任选地其中D结构域包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFP p26抗原决定簇的D结构域包含SEQ ID NO：70或73的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR包含SEQ ID NO：68或69的氨基酸序列。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，表达CAR的细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。本文提供的表达CAR的细胞可以单独施用，或可以作为药物组合物与稀释剂和/或与其他成分例如化学治疗剂、抗体、细胞因子或细胞群组合施用。本文提供的组合物优选配制用于可以施用一次或多次的静脉内施用。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是静脉内施用的。
在另一个实施方案中，DDpp(例如，衔接子)与一种或多种另外的治疗剂组合施用。
DDpp(例如，DDpp融合蛋白，例如衔接子)的治疗有效量可以是使得当在生理上可耐受的组合物中施用时足以实现约0.1微克(μg)/毫升(ml)至约100μg/ml(优选约1μg/ml至约5μg/ml，并且通常约5μg/ml)的血浆浓度的量。换句话说，剂量可以在持续一天或数天的每天一个或多个剂量施用中从约0.1mg/kg至约300mg/kg，优选地从约0.2mg/kg至约200mg/kg，最优选地从约0.5mg/kg至约20mg/kg变化。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，DDpp(例如，衔接子)包含与CD123结合的D结构域，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
用途
本文公开的靶结合DDpp、DDpp融合蛋白、多核苷酸和细胞具有包括诊断和治疗应用在内的用途。在一些实施方案中，DDpp、多核苷酸和细胞可用于治疗背景，例如用于治疗和/或诊断疾病或病症。治疗性治疗方法可以是体外、离体或体内方法。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症(例如，血液系统恶性肿瘤)。在一些实施方案中，疾病或病症是免疫系统的疾病或病症，例如炎症或自身免疫性疾病。
作为治疗实体的应用是DDpp的靶结合特异性的一个属性。DDpp在各种分子组合物中(例如，DD-抗体融合物、DD-药物缀合物和DD-嵌合受体)中的掺入可应用于各种治疗适应症和治疗方式，包括但不限于可溶性和细胞相关组合物。
在一个实施方案中，DDpp是由可选表位标签和靶向结构域组成的可溶性融合蛋白，该靶向结构域结合与免疫系统的疾病或病症相关的靶标。
在一些实施方案中，本文描述的DDpp可用于治疗癌症。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的DDpp(例如，DDpp融合体)。
在另外的实施方案中，本公开内容提供了嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包括靶向结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，靶向结构域至少部分地由本文公开的靶结合DDpp组成。
上文总结和/或本文阐述的方法描述了从业者采取的某些行动；然而，应该理解，它们还可以包括另一方对这些行动的指导。因此，诸如“施用包含靶特异性结合多肽-CAR的T细胞”的行动包括“指导包含靶特异性结合多肽-CAR的T细胞的施用”。
A.包括使靶细胞与CAR细胞接触的方法。
在一些实施方案中，递送针对一种或多种靶细胞的免疫应答的方法包括使包含靶细胞的组合物与表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞接触，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，杀死靶细胞的方法包括使包含靶细胞的组合物与表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞接触，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8a跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ IDNO：113的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4lBB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、DAP12、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其任意组合。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQID NO：115、116或其组合的序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO：117的序列。
在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，表达CAR的细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，例如急性髓系白血病(AML)细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在进一步的实施方案中，肿瘤细胞选自急性髓系白血病(AML)细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、脊髓发育不良细胞和母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞的组。在一些实施方案中，肿瘤细胞是AML肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是毛细胞白血病肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是BPDCN肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞表达CD123。
在本文提供的杀死靶细胞的方法中，靶细胞可以是免疫系统的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是幼稚T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是记忆T细胞。
接触可以在体外、离体或体内发生。在一个实施方案中，接触在患者，例如人患者中发生。
接触可以在体外、离体或体内发生。在一些实施方案中，该方法包括将CAR细胞施用给患者。
B.包括将靶细胞与衔接子和/或CAR细胞接触的方法。
在一些实施方案中，递送针对靶细胞的免疫应答的方法包括将包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，递送针对靶细胞的免疫应答的方法包括使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFPp26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，递送针对靶细胞的免疫应答的方法包括将包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，递送针对靶细胞的免疫应答的方法包括将包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包括表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFPp26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，靶细胞表达靶AD。
在一些实施方案中，递送针对靶细胞的免疫应答的方法包括使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，递送针对靶细胞的免疫应答的方法包括使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，递送针对靶细胞的免疫应答的方法包括将包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，递送针对靶细胞的免疫应答的方法包括将包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包括衔接子，该衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，靶细胞表达靶AD。
在一些实施方案中，杀死靶细胞的方法包括使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，杀死靶细胞的方法包括将包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，杀死靶细胞的方法包括将包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，杀死靶细胞的方法包括将包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，靶细胞表达靶AD。
在一些实施方案中，杀死靶细胞的方法包括使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，杀死靶细胞的方法包括使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，杀死靶细胞的方法包括将包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
在一些实施方案中，杀死靶细胞的方法包括使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，该衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，靶细胞表达靶AD。
在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFPp26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26AD结合的scFv。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的D结构域。
在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与AFP p26AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD的衔接子包含SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD的衔接子包含SEQ IDNO：52的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD的衔接子包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ IDNO：58的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD的衔接子包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述衔接子包含(i)与CD123结合并且包含SEQ ID NO：8、13、14、31、32或33的氨基酸序列的D结构域，以及(ii)包含SEQ ID NO：37或39的氨基酸序列的AFP p26 AD，并且CAR包含结合AFP p26 AD并包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的D结构域。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD的衔接子包含SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列，并且包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列，并且包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列，并且包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，并且包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。
在一些实施方案中，靶AD选自：CD45、CD26、CD30、CD33、LeY和CD38。在一些实施方案中，靶AD选自：CD19、CD22、CD123、BCMA、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在进一步的实施方案中，靶AD是BCMA。在进一步的实施方案中，靶AD是CD45。在其他实施方案中，靶AD是CS1。在其他实施方案中，靶AD是CD123。在其他实施方案中，靶AD是CD19。在其他实施方案中，靶AD是CD22。在其他实施方案中，靶AD是TACI。在其他实施方案中，靶AD是BAFFR。在其他实施方案中，靶AD是PDL1。在其他实施方案中，靶AD是HER2。
在一些实施方案中，其中CAR包含与除CD123之外的AD结合的ADBD，ADBD与肿瘤抗原结合。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原选自以下组：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原选自以下组：BCMA、CD19、CD22、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原是BCMA。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原是CD19。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，表达CAR的细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，例如急性髓系白血病(AML)细胞。在一些实施方案中，靶细胞是AML细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是毛细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。
接触可以在体外、离体或体内发生。在一个实施方案中，接触发生在患者(例如人患者)中，例如在向已接受表达CAR的细胞的患者施用衔接子之后或在向已接受衔接子的患者施用表达CAR的细胞之后。在一些实施方案中，方法包括向先前已施用表达CAR的细胞的患者施用衔接子。
在某些实施方案中，CAR包含单链可变片段(scFv)ADBD。在其他实施方案中，CAR包含替代支架结合结构域(ASBD)ADBD。在进一步的实施方案中，CAR包含D结构域。
在一些实施方案中，CAR包含2个ADBD。在其它实施方案中，CAR包含ASBD和scFv。在进一步的实施方案中，CAR包含D结构域和scFv。在一些实施方案中，CAR包含2个ASBD。在进一步的实施方案中，CAR包含2个D结构域。
在一些实施方案中，CAR细胞内结构域是信号传导结构域。在进一步的实施方案中，CAR细胞内结构域包含初级信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR细胞内结构域包含CD3ζ初级信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR细胞内结构域还包含共刺激信号传导结构域。在进一步的实施方案中，共刺激信号传导结构域选自：CD28、41BB、CD27和CD134。在特定实施方案中，CAR细胞内信号传导结构域包含41BB共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：115、116或其组合的序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：117的序列。
在一些实施方案中，靶AD选自：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。在一些实施方案中，靶AD选自：CD19、CD22、CD123、BCMA、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在进一步的实施方案中，靶AD是BCMA。在其他实施方案中，靶AD是CS1。在其他实施方案中，靶AD是CD123。在其他实施方案中，靶AD是CD19。在其他实施方案中，靶AD是CD22。在其他实施方案中，靶AD是TACI。在其他实施方案中，靶AD是BAFFR。在其他实施方案中，靶AD是PDL1。在其他实施方案中，靶AD是HER2。
在一些实施方案中，CAR包含2个与单独靶结合的ADBD。在进一步的实施方案中，CAR与CD19和CD123结合。在其他实施方案中，CAR与BCMA和CD123结合。在其他实施方案中，CAR与CD22和CD123结合。在其他实施方案中，CAR与PDL1和CD123结合。在进一步的实施方案中，CAR与CD33和CD123结合。在进一步的实施方案中，CAR与CD38和CD123结合。在进一步的实施方案中，CAR与LeY和CD123结合。
在一些实施方案中，衔接子包含肿瘤抗原的AD。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原选自以下组：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。
在一些实施方案中，衔接子包含肿瘤抗原的AD。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原选自以下组：BCMA、CD19、CD22、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。
在一些实施方案中，衔接子包含作为scFv的ADBD。在进一步的实施方案中，衔接子包含作为ASBD的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包含D结构域。
在一些实施方案中，衔接子包含两个ADBD。在进一步的实施方案中，衔接子包含两个ADBD，它们(a)相同，(b)结合相同的抗原决定簇，(c)结合相同抗原的不同AD，(d)结合相同细胞上的不同抗原，或(e)结合不同细胞上的不同抗原。在一些实施方案中，衔接子包含两个ASBD。在某些实施方案中，衔接子包含两个D结构域。在一些实施方案中，衔接子包含作为scFv的ADBD和作为ASBD的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包含作为scFv的ADBD和作为D结构域的ADBD。
在一些实施方案中，衔接子包括与选自以下的成员结合的ADBD：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。在某些实施方案中，衔接子包括与CD45结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CD26结合的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包括与CD30结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CD33结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CD38结合的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包括与CD45结合的ADBD。
在一些实施方案中，所述衔接子包含与选自以下的成员结合的ADBD：BCMA、CD123、CD19、CD22、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在某些实施方案中，所述衔接子包含与BCMA结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包含与CD123结合的ADBD。在一些实施方案中，所述衔接子包含与CD19结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包含与CD22结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包含与CS1结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包含与HER2结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包含与TACI结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包含与BAFFR结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包含与PDL1结合的ADBD。
在一些实施方案中，所述衔接子是双特异性的。在进一步的实施方案中，所述衔接子包括与CD123结合的ADBD和与CD33结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包括与CD123结合的ADBD和与CD38结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包括与CD123结合的ADBD和与LeY结合的ADBD。在其他实施方案中，所述衔接子包括与PDL1结合的ADBD和与CD123结合的ADBD。
在一些实施方案中，所述靶细胞是肿瘤细胞。在进一步的实施方案中，所述肿瘤细胞选自急性髓系白血病(AML)细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、骨髓增生异常细胞和母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞的组。在一些实施方案中，肿瘤细胞是AML肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是骨髓增生异常细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是毛细胞白血病肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是BPDCN肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞表达CD123。
在本文提供的杀死靶细胞的方法中，靶细胞可以是免疫系统的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是幼稚T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是记忆T细胞。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。免疫效应细胞是参与免疫应答的细胞，例如，参与促进免疫效应反应。免疫效应细胞的例子包括T细胞(例如，α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。免疫效应功能或免疫效应反应是例如增强或促进靶细胞的免疫攻击的免疫效应细胞的功能或反应。在一些实施方案中，免疫效应功能或反应是指促进杀死靶细胞或抑制靶细胞的生长或增殖的T细胞或NK细胞的特性。例如，原发刺激和共刺激是T细胞的免疫效应功能或反应的例子。在特定实施方案中，免疫效应功能或反应由所公开的CAR、衔接子和/或CAR和衔接子组合物的作用促进。此类功能或反应导致例如在增殖、细胞因子产生、细胞毒性或细胞表面标记(例如CD25、CD69和CD107a)上调方面更有效的CAR细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在其它实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞杀死靶细胞。在一些实施方案中，衔接子与AD的结合阻断了包含AD的抗原的活性。
在一些实施方案中，CAR细胞在直接结合靶细胞后杀死靶细胞。在一些实施方案中，CAR细胞在结合衔接子后杀死靶细胞，其中衔接子与靶细胞结合。
在一些实施方案中，CAR与靶细胞和/或衔接子的结合导致表达CAR的细胞中的细胞内信号传导。
在一些实施方案中，CAR与靶细胞和/或衔接子的结合导致脱颗粒。脱颗粒可导致从免疫细胞中的分泌颗粒中释放抗菌、细胞毒性或其他分子(具体取决于细胞类型)。诸如穿孔素(成孔细胞毒素)或颗粒酶(诱导靶细胞凋亡的丝氨酸蛋白酶)的分子帮助T细胞和NK细胞杀死肿瘤细胞(或其他细胞类型)。
在一些实施方案中，CAR与靶细胞和/或衔接子的结合导致表达CAR的细胞分泌细胞因子。细胞因子可以是例如干扰素γ(IFNγ)。
在一些实施方案中，CAR与靶细胞和/或衔接子的结合导致表达CAR的细胞增殖。
C.包括向患者施用CAR细胞的方法
本文描述了递送针对患者中的靶细胞的免疫应答和/或杀死患者中的靶细胞的方法，其包括向患者施用本文所述的衔接子和/或CAR细胞。本文还描述了耗竭淋巴细胞(例如，B淋巴细胞)的方法，其包括向有需要的患者施用本文所述的衔接子和/或CAR细胞。在特定实施方案中，本文提供了治疗癌症(例如，血液癌症)或自身免疫性疾病或病症的方法，其包括向有需要的患者施用本文所述的衔接子和/或CAR细胞。
在一些实施方案中，递送针对患者中的靶细胞的免疫应答的方法包括向患者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，杀死有需要的患者中的靶细胞的方法包括向患者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是毛细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。在一些实施方案中，耗竭有需要的患者中的淋巴细胞的方法包括向患者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，淋巴细胞表达CD123。在一些实施方案中，淋巴细胞是B淋巴细胞。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是AML。在一些实施方案中，血液癌症是骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)。在一些实施方案中，血液癌症是B细胞急性淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是毛细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，治疗自身免疫性疾病或病症的方法包括向有需要的患者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，自身免疫性疾病或病症是红斑狼疮。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD8a、41BB或CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD8a跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包括SEQ IDNO：113的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包括SEQ ID NO：114的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4lBB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、及其任意组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：115、116的序列或其组合。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQID NO：117的序列。
在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与CD123结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞不是T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约10x106至约300x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约50x106至约900x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约10x106至约500x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约100x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约50x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约100x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约150x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约200x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约250x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约300x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约400x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约500x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约600x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用约700x106个表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用多于一个剂量的表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞，任选地其中单个剂量包含约10x106至约300x106个细胞、约50x106至约900x106个细胞、约10x106至约500x106个细胞、约100x106个细胞、约50x106个细胞、约100x106个细胞、约150x106个细胞、约200x106个细胞、约250x106个细胞、约300x106个细胞、约400x106个细胞、约500x106个细胞、约600x106个细胞或约700x106个细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用两个剂量的表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用三个剂量的表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用四个剂量的表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用五个剂量的表达包含与CD123结合的D结构域的CAR的细胞。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，表达CAR的细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。本文提供的表达CAR的细胞可以单独施用，或可以作为药物组合物与稀释剂和/或其他组分(例如化疗剂、抗体、细胞因子或细胞群)组合施用。本文提供的组合物优选被配制用于可以施用一次或多次的静脉内施用。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是静脉内施用的。
在一些实施方案中，施用表达CAR的细胞包括施用包含表达CAR的细胞的药物组合物。
D.包括向患者施用衔接子和/或CAR细胞的方法
在一些实施方案中，递送针对患者中的靶细胞的免疫应答的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。在一些实施方案中，杀死有需要的患者中的靶细胞的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是毛细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。在一些实施方案中，耗竭有需要的患者中的淋巴细胞的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。在一些实施方案中，淋巴细胞表达CD123。在一些实施方案中，淋巴细胞是B淋巴细胞。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)。B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是AML。在一些实施方案中，血液癌症是骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)。在一些实施方案中，血液癌症是B细胞急性淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是毛细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，治疗自身免疫性疾病或病症的方法包括向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。在一些实施方案中，自身免疫性疾病或病症是红斑狼疮。在一些实施方案中，已向患者施用表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，患者包括表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，该方法还包括施用表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
在一些实施方案中，递送针对患者中的靶细胞的免疫应答的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，杀死有需要的患者中的靶细胞的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是AML细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是毛细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。在一些实施方案中，耗竭有需要的患者中的淋巴细胞的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，淋巴细胞表达CD123。在一些实施方案中，淋巴细胞是B淋巴细胞。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)结合AFP p26抗原决定簇(AD)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是AML。在一些实施方案中，血液癌症是骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)。在一些实施方案中，血液癌症是B细胞急性淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是毛细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，治疗自身免疫性疾病或病症的方法包括向有需要的患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，自身免疫性疾病或病症是红斑狼疮。在一些实施方案中，已向患者施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，患者包含表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，该方法还包括施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
在一些实施方案中，将免疫应答递送至患者的靶细胞的方法包括向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中已向患者施用了表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，杀死有需要的患者中的靶细胞的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与CAR结合的AD，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。在一些实施方案中，靶细胞是AML细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是毛细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。在一些实施方案中，耗竭有需要的患者中的淋巴细胞的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，淋巴细胞表达CD123。在一些实施方案中，淋巴细胞是B淋巴细胞。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与CAR结合的AD，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是AML。在一些实施方案中，血液癌症是骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)。在一些实施方案中，血液癌症是B细胞急性淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是毛细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，治疗自身免疫性疾病或病症的方法包括向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者已被施用表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，自身免疫性疾病或病症是红斑狼疮。
在一些实施方案中，递送针对患者的靶细胞的免疫应答的方法包括向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者包含表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，杀死有需要的患者中的靶细胞的方法包括向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与CAR结合的AD，其中患者包括表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是AML细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是毛细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。在一些实施方案中，耗竭有需要的患者中的淋巴细胞的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者包括表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，淋巴细胞表达CD123。在一些实施方案中，淋巴细胞是B淋巴细胞。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)与CAR结合的AD，其中患者包括表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是AML。在一些实施方案中，血液癌症是骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)。在一些实施方案中，血液癌症是B细胞急性淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是毛细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，治疗自身免疫性疾病或病症的方法包括向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)由CAR结合的AD，其中患者包括表达CAR的细胞，其中(a)CAR包含(i)与除CD123之外的抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，自身免疫性疾病或病症是红斑狼疮。
在一些实施方案中，递送针对患者中的靶细胞的免疫应答的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)结合靶AD的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)结合AFPp26抗原决定簇(AD)的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，杀死有需要的患者中的靶细胞的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)结合靶AD的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)结合AFP p26抗原决定簇(AD)的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，靶细胞表达靶AD。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，耗竭有需要的患者体内淋巴细胞的方法包括向患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，淋巴细胞表达靶AD。在一些实施方案中，淋巴细胞是B淋巴细胞或T淋巴细胞。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用衔接子，该衔接子包含(i)与靶AD结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是AML。在一些实施方案中，血液癌症是骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)。在一些实施方案中，血液癌症是B细胞急性淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是毛细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，治疗自身免疫性疾病或病症的方法包括向有需要的患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)结合靶AD的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(ii)结合AFP p26抗原决定簇(AD)的第二抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，自身免疫性疾病或病症是类风湿性关节炎。在一些实施方案中，患者已被施用表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，患者包括表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，该方法还包括施用表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
在一些实施方案中，本文所述方法包括向有需要的受试者施用约100x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞和多于一个剂量的约0.1mg/kg的包含结合CD123和p26抗原决定簇的D结构域的衔接子。在一些实施方案中，本文所述方法包括向有需要的受试者施用约100x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞和多于一个剂量的约0.3mg/kg的包含结合CD123和p26抗原决定簇的D结构域的衔接子。在一些实施方案中，本文中描述的方法包括向有需要的受试者施用约300x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞和多于一个剂量的约0.1mg/kg的包含结合CD123和p26抗原决定簇的D结构域的衔接子。在一些实施方案中，本文所述方法包括向有需要的受试者施用约300x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞和多于一个剂量的约0.3mg/kg的包含结合CD123和p26抗原决定簇的D结构域的衔接子。在一些实施方案中，本文所述方法包括向有需要的受试者施用约300x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞和多于一个剂量的约0.9mg/kg的包含结合CD123和p26抗原决定簇的D结构域的衔接子。在一些实施方案中，本文所述方法包括向有需要的受试者施用约900x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞和多于一个剂量的约0.1mg/kg的包含结合CD123和p26抗原决定簇的D结构域的衔接子。在一些实施方案中，本文所述方法包括向有需要的受试者施用约900x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞和多于一个剂量的约0.3mg/kg的包含结合CD123和p26抗原决定簇的D结构域的衔接子。在一些实施方案中，本文所述方法包括向有需要的受试者施用约900x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞和多于一个剂量的约0.9mg/kg的包含结合CD123和p26抗原决定簇的D结构域的衔接子。在一些实施方案中，衔接子的第一个剂量与表达CAR的细胞同一天施用。在一些实施方案中，衔接子的第一个剂量在表达CAR的细胞施用后1、2、3、4或5天施用。在一些实施方案中，该方法包括施用衔接子的每日剂量持续1周。在一些实施方案中，该方法包括施用衔接子的每日剂量持续2周。在一些实施方案中，该方法包括施用衔接子的每日剂量持续3周。在一些实施方案中，该方法包括施用衔接子的每日剂量持续4周。在一些实施方案中，所施用的衔接子的每日剂量是相同的。在一些实施方案中，该方法还包括在每日剂量完成后每周施用3个剂量的衔接子。在一些实施方案中，每周3个剂量的衔接子在周一、周三和周五施用。在一些实施方案中，单日施用的衔接子的剂量是相同的。在一些实施方案中，每周3个剂量的衔接子的施用持续约1、2、3、4、5或6个月。在一些实施方案中，每周3个剂量的衔接子的施用持续直至外周血中不再可测量到表达CAR的细胞。在一些实施方案中，受试者患有血液癌症。在一些实施方案中，受试者患有血液癌症，其中癌细胞表达CD123。在一些实施方案中，受试者患有急性髓系白血病(AML)。在一些实施方案中，受试者患有骨髓增生异常综合征(MDS)。在一些实施方案中，受试者患有高风险骨髓增生异常综合征(MDS)。在一些实施方案中，特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR包含特异性结合AFP p26抗原决定簇的D结构域，任选地，其中所述D结构域包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFP p26抗原决定簇的D结构域包含SEQ ID NO：70或73的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR包含SEQ ID NO：68或69的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含结合CD123的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含结合CD123的D结构域，其包含选自SEQID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述衔接子包含结合CD123的D结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：14。在一些实施方案中，所述AFP p26抗原决定簇包含SEQ ID NO：37-43或44的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AFP p26抗原决定簇包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26抗原决定簇包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，表达CAR的细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在本文所述方法的一些实施方案中，衔接子以约0.1mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约25mg/kg、约0.1mg/kg至约20mg/kg、约0.1mg/kg至约15mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约5mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约1μg/kg至约10mg/kg、约5μg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约10mg/kg、约20μg/kg至约10mg/kg或约50μg/kg至约10mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约10μg/kg至约10mg/kg、约50μg/kg至约10mg/kg、约100μg/kg至约10mg/kg、约200μg/kg至约10mg/kg或约500μg/kg至约10mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约100μg/kg至约10mg/kg、约100μg/kg至约5mg/kg、约100μg/kg至约2mg/kg、约100μg/kg至约1mg/kg、约100μg/kg至约5mg/kg或约100μg/kg至约2mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约1μg/kg至约10mg/kg、约5μg/kg至约5mg/kg、约10μg/kg至约2mg/kg、约20μg/kg至约1mg/kg或约5μg/kg至约0.5mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.04mg/kg、约0.07mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约1mg/kg或约2mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.07mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.01mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.1mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.2mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.3mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.4mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.5mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.6mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.7mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.8mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.9mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约1mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约2mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约3mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约4mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约5mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约6mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约7mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约8mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约9mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约10mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子通过静脉内施用。在一些实施方案中，衔接子通过皮下施用。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在本文所述方法的一些实施方案中，衔接子以约0.2mg至约200mg、约0.5mg至约100mg、约1mg至约50mg、约2mg至约25mg或约2mg至约12mg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.4mg、约0.8mg、约1.6mg、约2.8mg、约3mg、约4mg、约8mg、约12mg、约16mg、约20mg、约24mg、约28mg、约40mg或约80mg施用。在一些实施方案中，衔接子以约1.6mg、约2.8mg、约3mg、约4mg、约8mg、约12mg、约16mg或约20mg施用。在一些实施方案中，衔接子通过静脉内施用。在一些实施方案中，衔接子通过皮下施用。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在本文所述方法的一些实施方案中，施用多于一个剂量的衔接子。在一些实施方案中，多于一个剂量的衔接子是恒定剂量。在一些实施方案中，以不同剂量施用衔接子。在一些实施方案中，施用的衔接子的量随时间增加。在一些实施方案中，施用的衔接子的量随时间减少。在一些实施方案中，衔接子首先以约0.01mg/kg至约0.5mg/kg的低剂量施用，然后以约0.1mg/kg至约5mg/kg的高剂量施用。在一些实施方案中，衔接子通过静脉内施用。在一些实施方案中，衔接子通过皮下施用。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在本文所述方法的一些实施方案中，所述衔接子每日施用。在一些实施方案中，衔接子每日施用两次。在一些实施方案中，衔接子每日施用三次。在一些实施方案中，衔接子每日施用四次。在一些实施方案中，衔接子每12小时施用一次。在一些实施方案中，衔接子每8小时施用一次。在一些实施方案中，衔接子每6小时施用一次。在一些实施方案中，衔接子每4小时施用一次。在一些实施方案中，衔接子以连续输注的方式施用。在一些实施方案中，衔接子每隔一天施用一次。在一些实施方案中，衔接子每三天施用一次。在一些实施方案中，衔接子每周施用两次。在一些实施方案中，衔接子每周施用两次，例如，在周一、周三和周五施用。在一些实施方案中，衔接子每周施用一次。在一些实施方案中，衔接子通过静脉内施用。在一些实施方案中，衔接子通过皮下施用。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，所述D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在本文所述方法的一些实施方案中，衔接子施用七天。在一些实施方案中，衔接子施用2周。在一些实施方案中，衔接子施用3周。在一些实施方案中，衔接子施用4周。在一些实施方案中，衔接子施用1个月。在一些实施方案中，衔接子施用2个月。在一些实施方案中，衔接子施用3个月。在一些实施方案中，衔接子静脉内施用。在一些实施方案中，衔接子皮下施用。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在本文所述方法的一些实施方案中，衔接子在治疗期间以相同频率施用。在一些实施方案中，施用频率在治疗期间降低。在一些实施方案中，衔接子首先每天施用持续约一周，然后每周施用两次。在一些实施方案中，衔接子首先每天施用一至三次持续约一周，然后每天施用。在一些实施方案中，衔接子首先每天施用一至三次持续约一周，然后每周施用两次或每周施用一次。在一些实施方案中，衔接子首先以连续输注的方式施用持续约一周，然后每天施用。在一些实施方案中，衔接子首先以连续输注的方式施用持续约一周，然后每周施用两次或每周施用一次。在一些实施方案中，衔接子通过静脉内施用。在一些实施方案中，衔接子通过皮下施用。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，其包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含与CD123结合的D结构域，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在本文所述方法的一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约10x106至约300x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约50x106至约900x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约10x106至约500x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约100x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约50x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用多于一个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞，任选地其中单个剂量包括约10x106至约300x106个细胞、约50x106至约900x106个细胞、约10x106至约500x106个细胞、约100x106个细胞、约50x106个细胞、约100x106个细胞、约150x106个细胞、约200x106个细胞、约250x106个细胞、约300x106个细胞、约400x106个细胞、约500x106个细胞、约600x106个细胞或约700x106个细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用两个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用三个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用四个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用五个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约100x106个表达特异性结合AFPp26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约150x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约200x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约250x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约300x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约400x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约500x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约600x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，已向接受衔接子的受试者施用约700x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，在施用第一个剂量的衔接子的同时向受试者施用特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR。在一些实施方案中，在施用第一个剂量的衔接子之前向受试者施用特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR。在一些实施方案中，所述AFP p26抗原决定簇包含SEQ ID NO：37-43或44的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AFP p26抗原决定簇包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AFP p26抗原决定簇包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFPp26抗原决定簇的CAR包含特异性结合AFP p26抗原决定簇的D结构域，任选地其中D结构域包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFP p26抗原决定簇的D结构域包含SEQ ID NO：70或73的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR包含SEQ ID NO：68或69的氨基酸序列。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，表达CAR的细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。本文提供的表达CAR的细胞可以单独施用，或可以作为药物组合物与稀释剂和/或其他成分(例如化疗剂、抗体、细胞因子或细胞群)组合施用。本文提供的组合物优选配制用于可以施用一次或多次的静脉内施用。在一些实施方案中，表达CAR的细胞通过静脉内施用。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，向受试者施用约10x106至约300x106个表达特异性结合AFPp26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约50x106至约900x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约10x106至约500x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约100x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约50x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约100x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约150x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约200x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约250x106个表达特异性结合AFPp26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约300x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约400x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约500x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约600x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约700x106个表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用多于一个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞，任选地其中单个剂量包含约10x106至约300x106个细胞、约50x106至约900x106个细胞、约10x106至约500x106个细胞、约100x106个细胞、约50x106个细胞、约100x106个细胞、约150x106个细胞、约200x106个细胞、约250x106个细胞、约300x106个细胞、约400x106个细胞、约500x106个细胞、约600x106个细胞或约700x106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用两个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用三个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用四个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用五个剂量的表达特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR的细胞。在一些实施方案中，在施用第一个剂量的衔接子的同时向受试者施用特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR。在一些实施方案中，在施用第一个剂量的衔接子之前向受试者施用特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR。在一些实施方案中，AFP p26抗原决定簇包含SEQ ID NO：37-43或44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26抗原决定簇包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26抗原决定簇包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR包含特异性结合AFP p26抗原决定簇的D结构域，任选地其中D结构域包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFPp26抗原决定簇的D结构域包含SEQ ID NO：70或73的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合AFP p26抗原决定簇的CAR包含SEQ ID NO：68或69的氨基酸序列。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，表达CAR的细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。本文提供的表达CAR的细胞可以单独施用，或可以作为药物组合物与稀释剂和/或与其他成分(例如化疗剂、抗体、细胞因子或细胞群)组合施用。本文提供的组合物优选配制用于可以施用一次或多次的静脉内施用。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是静脉内施用的。
在一些实施方案中，衔接子以约10μg/kg至约10mg/kg、约50μg/kg至约5mg/kg、约10μg/kg至约2mg/kg、约20μg/kg至约1mg/kg或约50μg/kg至约0.5mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.04mg/kg、约0.07mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约1mg/kg或约2mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.07mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.1mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.1mg/kg施用。在一些实施方案中，衔接子以约1.6mg、约2.8mg、约3mg、约4mg、约8mg、约12mg、约16mg或约20mg施用。在一些实施方案中，衔接子以约0.1mg/kg。在一些实施方案中，衔接子以约0.2mg至约200mg、约0.5mg至约100mg、约1mg至约50mg、约2mg至约25mg或约2mg至约12mg施用。在一些实施方案中，衔接子皮下施用。在一些实施方案中，衔接子每天施用。在一些实施方案中，衔接子每天施用两次、每天施用三次或每天施用四次。在一些实施方案中，衔接子每隔一天施用一次。在一些实施方案中，衔接子每三天施用一次。在一些实施方案中，衔接子每周施用两次。在一些实施方案中，衔接子每周施用一次。在一些实施方案中，衔接子施用七天。在一些实施方案中，衔接子施用约一周至约2个月。在一些实施方案中，衔接子在治疗期间以相同频率施用。在一些实施方案中，施用频率在治疗期间降低。在一些实施方案中，衔接子首先每天施用持续约一周，然后每周施用两次。在一个实施方案中，已向患者施用约50x106至约300x106个表达CAR的细胞。在一个实施方案中，已向患者施用约100x106个表达CAR的细胞。
在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8a跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ IDNO：113的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8a跨膜结构域包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4lBB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、及其任意组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：115、116的序列或其组合。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQID NO：117的序列。
在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFPp26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26AD结合的scFv。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的D结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与AFP p26AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR包含与除CD123之外的AD结合的ADBD，该ADBD与肿瘤抗原结合。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自：BCMA、CD19、CD22、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在一些实施方案中，肿瘤抗原是BCMA。在一些实施方案中，肿瘤抗原是CD19。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。
在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD的衔接子包含SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD的衔接子包含SEQ IDNO：52的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD的衔接子包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ IDNO：58的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD的衔接子包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含(i)与CD123结合并且包含SEQ ID NO：8、13、14、31、32或33的氨基酸序列的D结构域，以及(ii)包含SEQ ID NO：37或39的氨基酸序列的AFP p26 AD，并且CAR包含结合AFP p26 AD并包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的D结构域。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD的衔接子包含SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列，并且包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列，并且包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列，并且包含与AFP p26 AD结合的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含(i)与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD的衔接子包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，并且包含结合AFP p26 AD的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。
在一些实施方案中，靶AD选自：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。在一些实施方案中，靶AD选自：CD19、CD22、CD123、BCMA、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在一些实施方案中，靶AD是BCMA。在一些实施方案中，靶AD是CD19。在一些实施方案中，靶AD是CD45。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫细胞。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是AML细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是毛细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞和衔接子以任意顺序分开施用。在一些实施方案中，施用衔接子包括施用包含衔接子的药物组合物。在一些实施方案中，施用衔接子和表达CAR的细胞包括施用包含衔接子的药物组合物和包含表达CAR的细胞的药物组合物。
在一些实施方案中，患者先前已用衔接子治疗(除了表达CAR的细胞以外)。在一些实施方案中，施用给患者的衔接子和先前施用给患者的衔接子结合不同的AD(例如，在相同或不同的靶细胞上)。
在一些实施方案中，靶AD选自：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。在一些实施方案中，靶AD选自：CD19、CD22、CD123、BCMA、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在进一步的实施方案中，靶AD是BCMA。在进一步的实施方案中，靶AD是CD45。在其他实施方案中，靶AD是CS1。在其他实施方案中，靶AD是CD123。在其他实施方案中，靶AD是CD19。在其他实施方案中，靶AD是CD22。在其他实施方案中，靶AD是TACI。在其他实施方案中，靶AD是BAFFR。在其他实施方案中，靶AD是PDL1。在其他实施方案中，靶AD是HER2。
在一些实施方案中，其中CAR包含与除CD123之外的AD结合的ADBD，ADBD与肿瘤抗原结合。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原选自以下组：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原选自以下组：BCMA、CD19、CD22、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原是BCMA。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原是CD19。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞不是T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是AML细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是毛细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。
接触可以在体外、离体或体内发生。在一个实施方案中，接触发生在患者(例如人患者)中，例如在向已接受表达CAR的细胞的患者施用衔接子之后或在向已接受衔接子的患者施用表达CAR的细胞之后。在一些实施方案中，方法包括向先前已施用表达CAR的细胞的患者施用衔接子。
在某些实施方案中，CAR包含单链可变片段(scFv)ADBD。在其他实施方案中，CAR包含替代支架结合结构域(ASBD)ADBD。在进一步的实施方案中，CAR包含D结构域。
在一些实施方案中，CAR包含2个ADBD。在其他实施方案中，CAR包含ASBD和scFv。在进一步的实施方案中，CAR包含D结构域和scFv。在一些实施方案中，CAR包含2个ASBD。在进一步的实施方案中，CAR包含2个D结构域。
在一些实施方案中，CAR细胞内结构域是信号传导结构域。在进一步的实施方案中，CAR细胞内结构域包含初级信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR细胞内结构域包含CD3ζ初级信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR细胞内结构域还包含共刺激信号传导结构域。在进一步的实施方案中，共刺激信号传导结构域选自：CD28、41BB、CD27和CD134。在特定实施方案中，CAR细胞内信号传导结构域包含41BB共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：115、116或其组合的序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：117的序列。
在一些实施方案中，靶AD选自：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。在一些实施方案中，靶AD选自：CD19、CD22、CD123、BCMA、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在进一步的实施方案中，靶AD是BCMA。在其他实施方案中，靶AD是CS1。在其他实施方案中，靶AD是CD123。在其他实施方案中，靶AD是CD19。在其他实施方案中，靶AD是CD22。在其他实施方案中，靶AD是TACI。在其他实施方案中，靶AD是BAFFR。在其他实施方案中，靶AD是PDL1。在其他实施方案中，靶AD是HER2。
在一些实施方案中，CAR包含2个结合单独靶标的ADBD。在进一步的实施方案中，CAR结合CD19和CD123。在其他实施方案中，CAR结合BCMA和CD123。在其他实施方案中，CAR结合CD22和CD123。在其他实施方案中，CAR结合PDL1和CD123。
在一些实施方案中，衔接子包含肿瘤抗原的AD。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原选自以下组：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。
在一些实施方案中，衔接子包含肿瘤抗原的AD。在进一步的实施方案中，肿瘤抗原选自以下组：BCMA、CD19、CD22、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。
在一些实施方案中，衔接子包含作为scFv的ADBD。在进一步的实施方案中，衔接子包含作为ASBD的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包含D结构域。
在一些实施方案中，衔接子包含两个ADBD。在进一步的实施方案中，衔接子包含两个ADBD，它们(a)相同，(b)结合相同的抗原决定簇，(c)结合相同抗原的不同AD，(d)结合相同细胞上的不同抗原，或(e)结合不同细胞上的不同抗原。在一些实施方案中，衔接子包含两个ASBD。在某些实施方案中，衔接子包含两个D结构域。在一些实施方案中，衔接子包含作为scFv的ADBD和作为ASBD的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包含作为scFv的ADBD和作为D结构域的ADBD。
在一些实施方案中，衔接子包括与选自以下的成员结合的ADBD：CD45、CD26、CD30、CD33和CD38。在某些实施方案中，衔接子包括与CD45结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CD26结合的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包括与CD30结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CD33结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CD38结合的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包括与CD45结合的ADBD。
在一些实施方案中，衔接子包括与选自以下的成员结合的ADBD：BCMA、CD123、CD19、CD22、CS1、HER2、TACI、BAFFR和PDL1。在某些实施方案中，衔接子包括与BCMA结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CD123结合的ADBD。在一些实施方案中，衔接子包括与CD19结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CD22结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CS1结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与HER2结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与TACI结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与BAFFR结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与PDL1结合的ADBD。
在一些实施方案中，衔接子是双特异性的。在进一步的实施方案中，衔接子包括与CD123结合的ADBD和与CD33结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CD123结合的ADBD和与CD38结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与CD123结合的ADBD和与LeY结合的ADBD。在其他实施方案中，衔接子包括与PDL1结合的ADBD和与CD123结合的ADBD。
在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在进一步的实施方案中，肿瘤细胞选自以下组：急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常细胞、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，肿瘤细胞是AML肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是骨髓增生异常细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是毛细胞白血病肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是BPDCN肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞表达CD123。
在本文提供的杀死靶细胞的方法中，靶细胞可以是免疫系统的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是幼稚T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是记忆T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是内皮细胞。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞是免疫效应细胞。免疫效应细胞是参与免疫应答的细胞，例如，参与促进免疫效应反应。免疫效应细胞的例子包括T细胞(例如，α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。免疫效应功能或免疫效应反应是例如增强或促进靶细胞的免疫攻击的免疫效应细胞的功能或反应。在一些实施方案中，免疫效应功能或反应是指促进杀死靶细胞或抑制靶细胞的生长或增殖的T细胞或NK细胞的特性。例如，原发刺激和共刺激是T细胞的免疫效应功能或反应的例子。在特定实施方案中，免疫效应功能或反应由所公开的CAR、衔接子和/或CAR和衔接子组合物的作用促进。此类功能或反应导致例如在增殖、细胞因子产生、细胞毒性或细胞表面标记(例如CD25、CD69和CD107a)上调方面更有效的CAR细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在其它实施例中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞不是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞杀死靶细胞。在一些实施方案中，衔接子与AD的结合阻断了包含AD的抗原的活性。
在一些实施方案中，CAR细胞在直接结合靶细胞后杀死靶细胞。在一些实施方案中，CAR细胞在与衔接子结合后杀死靶细胞，其中衔接子与靶细胞结合。
在一些实施方案中，CAR与靶细胞和/或衔接子的结合导致表达CAR的细胞中的细胞内信号传导。
在一些实施方案中，CAR与靶细胞和/或衔接子的结合导致脱颗粒。脱颗粒可导致从免疫细胞中的分泌颗粒中释放抗菌、细胞毒性或其他分子(具体取决于细胞类型)。诸如穿孔素(成孔细胞毒素)或颗粒酶(诱导靶细胞凋亡的丝氨酸蛋白酶)的分子帮助T细胞和NK细胞杀死肿瘤细胞(或其他细胞类型)。
在一些实施方案中，CAR与靶细胞和/或衔接子的结合导致表达CAR的细胞分泌细胞因子。细胞因子可以是例如干扰素γ(IFNγ)。
在一些实施方案中，CAR与靶细胞和/或衔接子的结合导致表达CAR的细胞增殖。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患者施用衔接子和表达CAR的细胞。衔接子和表达CAR的细胞可以在同一药物组合物中或不同的药物组合物中施用。衔接子和表达CAR的细胞可以在不同的药物组合物中施用。衔接子和表达CAR的细胞可以同时或连续施用。在一些实施方案中，表达CAR的细胞和衔接子同时施用。在一些实施方案中，表达CAR的细胞和衔接子连续施用。在一些实施方案中，在施用表达CAR的细胞之后施用衔接子。在一些实施方案中，将衔接子施用给先前已施用CAR免疫细胞的受试者。在一些实施方案中，表达CAR的细胞在衔接子之前施用。
在一些实施方案中，本公开内容提供了方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含嵌合抗原受体(CAR)的CAR免疫细胞，其中CAR包含含有特异性结合AFP p26的D结构域(例如，包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列)的靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域(包含信号传导结构域)。在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含嵌合抗原受体(CAR)的CAR免疫细胞，其中CAR包含含有特异性结合AFP p26的D结构域(例如，包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列)的靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域(包含信号传导结构域)。在一些实施方案中，p26结合DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞是NK细胞。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞不是T细胞或NK细胞。在进一步的实施方案中，向受试者施用不同CAR免疫细胞类型(例如，NK细胞和T细胞)的组合。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，向受试者施用特异性结合p26的CAR免疫细胞使得受试者通过施用包含(i)p26抗原决定簇和(ii)由受试者的癌细胞(例如CD123)表达的靶结合结构域的衔接子多肽而接受癌症治疗，其中衔接子引导或重定向CAR免疫细胞以产生导致对癌细胞产生细胞毒性作用的细胞毒性信号，从而治疗癌症。CAR免疫细胞和衔接子可以同时或以任何顺序连续施用。在一些实施方案中，CAR免疫细胞和衔接子同时施用。在一些实施方案中，CAR免疫细胞和衔接子连续施用。在一些实施方案中，在施用CAR免疫细胞之后施用衔接子。在一些实施方案中，将衔接子施用给先前已施用CAR免疫细胞的受试者。
在一些实施方案中，其中将CAR T细胞施用给患有癌症的受试者，感兴趣的靶标(例如，CD123或AFP p26)的结合刺激CAR T细胞启动细胞内信号传导。在进一步的实施方案中，CAR T细胞与感兴趣的靶标的结合刺激T细胞启动细胞内信号传导并产生细胞因子。在进一步的实施方案中，CAR T细胞与感兴趣的靶标的结合刺激T细胞启动细胞内信号传导、产生细胞因子和脱颗粒，导致对癌细胞的细胞毒性作用。在一些实施方案中，CAR T细胞响应于感兴趣的靶标的结合而增殖。有利地，在一些实施方案中，CAR T细胞的活性不会导致T细胞表现出与T细胞耗竭相关的表型。在一些实施方案中，CAR-T细胞的跨膜结构域包括CD8a、41BB或CD28，细胞质结构域包括T细胞受体的α链、β链或ζ链。在一些实施方案中，细胞质结构域含有SEQ ID NO：115、116或其组合的序列。在一些实施方案中，细胞质结构域含有SEQ ID NO：117的序列。
在一些实施方案中，其中将p26结合CAR免疫细胞和衔接子多肽施用给患有癌症的受试者，衔接子多肽将CAR免疫细胞引导或重定向至感兴趣的靶标(例如，CD123)刺激CAR免疫细胞启动细胞内信号传导。在进一步的实施方案中，通过衔接子多肽引导或重定向CAR免疫细胞刺激免疫细胞启动细胞内信号传导并产生细胞因子。在进一步的实施方案中，将CAR免疫细胞引导或重定向至感兴趣的靶标刺激免疫细胞启动细胞内信号传导、产生细胞因子和脱颗粒，导致对癌细胞的细胞毒性作用。在一些实施方案中，CAR免疫细胞响应于结合感兴趣的靶标而增殖。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞是NK细胞。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞不是T细胞或NK细胞。在进一步的实施方案中，向受试者施用不同CAR免疫细胞类型(例如，NK细胞和T细胞)的组合。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。有利地，在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且CAR T细胞的活性不会导致T细胞表现出与T细胞耗竭相关的表型。在一些实施方案中，CAR T细胞的跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28，并且细胞质结构域包含T细胞受体的α、β或ζ链。CAR免疫细胞和衔接子可以同时或以任何顺序连续施用。在一些实施方案中，CAR免疫细胞和衔接子同时施用。在一些实施方案中，CAR免疫细胞和衔接子连续施用。在一些实施方案中，衔接子在施用CAR免疫细胞之后施用。在一些实施方案中，衔接子施用给先前已施用CAR免疫细胞的受试者。在一些实施方案中，CAR包含p26结合DD，其包含选自SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，p26结合DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
在本文公开的方法的一些实施方案中，患者已被诊断患有癌症并且靶细胞是癌细胞。在一个实施方案中，癌细胞是前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞、骨肉瘤细胞或胶质母细胞瘤细胞。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法治疗癌症。在一些实施方案中，靶细胞是内皮细胞。
可治疗的癌症包括未血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体肿瘤。待治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
在另一个实施方案中，本文所述的方法可用于治疗患有血液癌症的患者。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓系白血病和髓母细胞白血病、早幼粒细胞白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓系白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、毛细胞白血病和脊髓发育不良。在一些实施方案中，血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是AML。在一些实施方案中，血液癌症是骨髓增生异常综合征(例如高风险骨髓增生异常综合征)。在一些实施方案中，血液癌症是B细胞急性淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是毛细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。
在一些实施方案中，癌症是复发性或难治性癌症。在一些实施方案中，癌症是复发性癌症。在一些实施方案中，癌症在化疗后复发。在一些实施方案中，癌症在用生物制剂治疗后复发。在一些实施方案中，生物制剂是治疗性抗体或CAR-T细胞。在一些实施方案中，癌症是难治性癌症。在一些实施方案中，癌症对化疗具有抗性。在一些实施方案中，癌症对用生物制剂治疗具有抗性。在一些实施方案中，生物制剂是治疗性抗体或CAR-T细胞。
在一些实施方案中，癌症是难治性血液癌症的复发。在一些实施方案中，癌症是复发性血液癌症。在一些实施方案中，癌症是化疗后复发的血液癌症。在一些实施方案中，癌症是用生物制剂治疗后复发的血液癌症。在一些实施方案中，生物制剂是治疗性抗体或CAR-T细胞。在一些实施方案中，癌症是自体骨髓移植后复发的血液癌症。在一些实施方案中，癌症是异体骨髓移植后复发的血液癌症。在一些实施方案中，癌症是造血干细胞移植(HSCT)后复发的血液癌症。在一些实施方案中，HSCT是自体HSCT。在一些实施方案中，癌症是难治性血液癌症。在一些实施方案中，癌症是化疗难治的血液癌症。在一些实施方案中，癌症是生物制剂治疗难治的血液癌症。在一些实施方案中，生物制剂是治疗性抗体或CAR-T细胞。在一些实施方案中，血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是AML。在一些实施方案中，血液癌症是骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)。在一些实施方案中，血液癌症是B细胞急性淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是毛细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是幼稚T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是记忆T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是AML细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是毛细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。在一些实施方案中，靶细胞是内皮细胞。
在一些实施方案中，可以使用靶向CD19、CD20、CD22和ROR1的衔接子或CAR细胞来治疗癌症和疾病。在一个特定实施方案中，CAR、衔接子和/或CAR/衔接子组合靶向CD22并用于治疗B细胞淋巴瘤。在另一个实施方案中，CAR、衔接子和/或CAR/衔接子组合靶向CD19并用于治疗癌症和疾病，包括但不限于前B细胞ALL(儿科适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和同种异体骨髓移植后的挽救性治疗。在另一个实施方案中，CAR、衔接子和/或CAR/衔接子组合靶向CS1并用于治疗多发性骨髓瘤。在另一个实施方案中，CAR、衔接子和/或CAR/衔接子组合靶向BCMA并用于治疗多发性骨髓瘤。在另一个实施方案中，CAR、衔接子和/或CAR/衔接子组合靶向CS1和BCMA，并用于治疗多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含嵌合抗原受体(CAR)的CAR免疫细胞，其中CAR包含含有特异性结合CD123的D结构域(例如，包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列)的靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域(包含信号传导结构域)。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞是NK细胞。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞不是T细胞或NK细胞。在进一步的实施方案中，向受试者施用不同CAR免疫细胞类型(例如，NK细胞和T细胞)的组合。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。在一些实施方案中，CD123特异性D结构域包含选自SEQID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD123特异性DD包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在一些实施方案中，施用的CAR免疫细胞的靶结合结构域特异性结合受试者的癌细胞表达的CD123并诱导CAR免疫细胞产生细胞毒信号，其对癌细胞产生细胞毒作用，从而治疗癌症。
在一些实施方案中，其中将CAR T细胞施用给患有癌症的受试者，感兴趣的靶标(例如，CD123或AFP p26)的结合刺激CAR T细胞启动细胞内信号传导。在进一步的实施方案中，CAR T细胞与感兴趣的靶标的结合刺激T细胞启动细胞内信号传导并产生细胞因子。在进一步的实施方案中，CAR T细胞与感兴趣的靶标的结合刺激T细胞启动细胞内信号传导、产生细胞因子和脱颗粒，导致对癌细胞的细胞毒性作用。在一些实施方案中，CAR T细胞响应于感兴趣的靶标的结合而增殖。有利地，在一些实施方案中，CAR T细胞的活性不会导致T细胞表现出与T细胞耗竭相关的表型。在一些实施方案中，CAR T细胞的跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28，并且细胞质结构域包含T细胞受体的α、β或ζ链。
在一些实施方案中，施用的CAR还包含2、3、4、5个或多于5个DD和/或其他结合结构域(例如scFv)，其特异性结合癌细胞表达的感兴趣的靶标(例如CD123)。在另外的实施方案中，施用的CAR还包含2、3、4、5个或多于5个DD或其他结合结构域(例如scFv)，其特异性结合癌细胞表达的不同感兴趣的靶标。在另外的实施方案中，施用的CAR还包括2、3、4、5个或多于5个DD或其他结合结构域(例如，scFv)，其特异性结合由不同的癌细胞或血管内皮细胞表达的不同感兴趣的靶标。
在一些实施方案中，施用的免疫细胞还包括具有DD或其他结合结构域(例如，scFv)的第二CAR多肽，其特异性结合由癌细胞表达的第二感兴趣的靶标。在一些实施方案中，施用的免疫细胞还包括具有DD或其他结合结构域(例如，scFv)的第二CAR多肽，其特异性结合由不同的癌细胞或血管内皮细胞表达的第二感兴趣的靶标。
在一些实施方案中，具有CAR的免疫细胞的施用是静脉内的。在其他实施方案中，具有CAR的免疫细胞通过动脉内、肌肉内、局部途径或给定治疗方案的其他可接受途径施用。
在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白结合(1)感兴趣的细胞或组织上的靶标(例如，肿瘤细胞上的肿瘤抗原)和(2)效应细胞上的靶标，例如，T细胞受体分子。根据一个实施方案，DDpp融合蛋白对一种或多种靶标的结合用于引导对患者中感兴趣的细胞、组织或其他位置的免疫应答。例如，在一些实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合效应细胞表面上的靶标。因此，在一些实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合T细胞表面上的靶标。在特定实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合CD3。在其他实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合CD2。在进一步的实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合T细胞受体(TCR)。根据另外的实施方案，DDpp融合蛋白特异性结合自然杀伤细胞表面上的靶标。因此，在一些实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合NKG2D(自然杀伤组2D)受体。在另外的实施方案中，DDpp融合蛋白特异性结合CD16(即FcγRIII)、CD64(即FcγRI)或CD32(即FcγRII)。
在一个实施方案中，DDpp融合蛋白结合白细胞上的靶标和肿瘤细胞上的肿瘤抗原。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白结合NKG2D。在进一步的实施方案中，DDpp融合蛋白结合NKG2D和选自CD123、ErbB2、EGFR、IGF1R、CD19、CD20、CD80和EPCAM的靶标。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白结合CD3。在特定实施方案中，DDpp特异性结合CD3ε。在一个实施方案中，DDpp融合蛋白与CD4结合。
在一个实施方案中，所公开的DDpp-CAR用于将转导的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)引导至由DDpp-CAR的结合特异性定义的肿瘤靶标。在一个实施方案中，用编码CAR的慢病毒载体转导原代T细胞，该CAR将DD靶结合结构域与跨膜结构域和CD3-ζ、CD28、41BB的细胞内结构域组合。因此，所得的转导T细胞群可引发DDpp-CAR介导的T细胞反应。在一些实施方案中，T细胞被遗传修饰以表达DDpp-CAR，并且DDpp-CAR T细胞被输注至有需要的接受者。在进一步的实施方案中，输注的细胞能够杀死接受者中的肿瘤细胞。DDpp-CAR的特别有利的特性包括以下一项、几项或所有益处：(i)靶结合特异性、(ii)增强的治疗效果、(iii)减少的脱靶副作用、(iv)针对特定患者或患者群体的标记物的可定制性、(v)生产和加工过程中的增强的稳定性，以及(vi)靶向一个、两个或更多个特定靶标以增强靶向治疗的能力。
本文提供的DDpp-CAR修饰的T细胞可以单独施用，或可以作为药物组合物与稀释剂和/或与其他成分(例如化疗剂、抗体、细胞因子或细胞群)组合施用。本文提供的组合物优选配制用于可以施用一次或多次的静脉内施用。
在一些实施方案中，递送针对有需要的患者的靶细胞的免疫应答的方法包括向患者施用本文所述的DDpp融合蛋白(例如，基于抗体的DDpp融合蛋白)，该DDpp融合蛋白包含特异性结合CD123的D结构域并且还包含特异性结合T细胞上的T细胞受体(TCR)复合物(例如，CD3ε链)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)(例如，抗体或抗原结合抗体片段)。在一些实施方案中，杀死有需要的患者中的靶细胞的方法包括向患者施用本文所述的DDpp融合蛋白(例如，基于抗体的DDpp融合蛋白)，所述DDpp融合蛋白包含特异性结合CD123的D结构域并且还包含特异性结合T细胞上的T细胞受体(TCR)复合物(例如，CD3ε链)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)(例如，抗体或抗原结合抗体片段)。在一些实施方案中，靶细胞表达CD123。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是急性髓系白血病(AML)细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脊髓发育不良细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞急性淋巴细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是毛细胞白血病细胞。在一些实施方案中，靶细胞是霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)细胞。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用，包括向患者施用本文所述的DDpp融合蛋白(例如，基于抗体的DDpp融合蛋白)，所述融合蛋白包含特异性结合CD123的D结构域，并且还包含特异性结合T细胞上的T细胞受体(TCR)复合物(例如，CD3ε链)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)(例如，抗体或抗原结合抗体片段)。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)。B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤或母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，血液癌症是AML。在一些实施方案中，血液癌症是骨髓增生异常综合征(例如，高风险骨髓增生异常综合征)。在一些实施方案中，血液癌症是B细胞急性淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是毛细胞白血病。在一些实施方案中，血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，血液癌症是母细胞性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白是基于抗体的DDpp融合蛋白。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白是基于抗体的DDpp融合蛋白，其能够通过同时结合靶细胞上的CD123和T细胞上的TCR复合物(例如，CD3ε链)对靶细胞发挥细胞毒作用。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含与TCR复合物结合的抗体或其抗原结合片段(例如scFv)。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含与CD3结合的抗体或其抗原结合片段(例如scFv)。在一些实施方案中，DDpp融合蛋白包含与CD3ε链结合的抗体或其抗原结合片段(例如scFv)。在一些实施方案中，特异性结合CD123的D结构域包含选自SEQ IDNO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合CD123的D结构域包含SEQ IDNO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。DDpp融合蛋白本文提供的(例如，基于抗体的DDpp融合蛋白)可以单独施用，或可以作为药物组合物与药学上可接受的赋形剂和/或与其他成分(例如化疗剂、抗体、细胞因子或细胞群)组合施用。本文提供的组合物优选配制用于可以施用一次或多次的静脉内施用。
E.分析和诊断应用
无论是单独的、作为融合蛋白、作为化学缀合物还是作为本文所述的其他实施方案，DDpp都具有多种应用。在一些实施方案中，DDpp用作检测试剂、诊断试剂或分析试剂。在一些实施方案中，DDpp用作各种不同样品类型中感兴趣的靶标的检测试剂。一些实施方案具有体内、体外和/或离体应用。体外使用DDpp的方法可以以不同的形式进行，例如在微量滴定板中、在蛋白质阵列中、在生物传感器表面上、在组织切片上，以及本领域技术人员明显的其他形式。
在一些实施方案中，DDpp用于结合、检测和/或定量含有靶标的样品中的感兴趣的靶标(例如，CD123)。在一个实施方案中，本公开内容提供了一种用于检测样品中的感兴趣的靶标(例如，CD123或AFP p26)的方法，其包括：(a)在适合DDpp与靶标特异性结合的条件下，使样品与特异性结合靶标的含有DD的DDpp接触，所述DD包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列，以形成靶标/DDpp复合物，以及(b)检测复合物和/或捕获的靶标的存在。在一些实施方案中，DDpp固定在固体支持物上。在一些实施方案中，DD包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列，并且DDpp用于结合、检测和/或定量样品中的CD123或包含CD123的融合蛋白。
还提供了一种用于定量含有靶标的样品中的感兴趣的靶标(例如，CD123)的方法，其包括:(a)在适合于DDpp与靶标特异性结合的条件下，使样品与特异性结合靶标并且固定在固体支持物上的含有DD的DDpp接触，所述DD包含选自SEQ ID NO：8-33和74-94的氨基酸序列，以形成靶标/DDpp复合物，以及(b)检测靶标/DDpp复合物和/或捕获的靶标的存在，其中产物的定量检测指示样品中的靶标或含有靶标的融合蛋白的量，或者产物的定量检测能够以其他方式与样品中的靶标或含有靶标的融合蛋白的量相关。
在一个实施方案中，DDpp用于检测制造过程中涉及的溶液中的感兴趣的靶标，例如蛋白质表达。样品可以包括但不限于水、缓冲液、工艺中纯化样品、原料药物质和最终药物产品。在另外的实施方案中，DDpp可用于检测样品中的污染物，例如供水源或制造中使用的水(或其他流体)。
在另一个实施方案中，DDpp用于检测诊断样品中的感兴趣的靶标。样品可包括但不限于组织匀浆、细胞提取物、活检样品、血清、血浆、淋巴、血液、血液级分、尿液、滑液、脊髓液、唾液、粘液、痰、胸膜液、乳头抽吸物、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的流体、泪液、乳汁、来自淋巴系统的流体、精液、脑脊液、器官内系统流体、腹水、肿瘤囊液、羊水和来自培养细胞的培养基或裂解物。
在一个实施方案中，DDpp可用于检测生物样品中一种或多种因子(例如抗原或生物体)的存在。本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞、组织或液体。在某些实施方案中，此类组织包括正常和/或癌变组织。
本领域已知各种检测格式和技术，包括但不限于蛋白质印迹分析、免疫组织化学、ELISA、FACS分析、酶促测定、放射自显影和本文提及的任何结合测定。
在一个实施方案中，提供了一种在含有靶标的溶液中检测感兴趣的靶标(例如，CD123或AFP p26)的方法，其包括：(a)在适合DDpp与靶标特异性结合的条件下使溶液与特异性结合感兴趣的靶标的DDpp接触，和(b)检测DDpp与靶标的结合。DDpp可以是游离的或固定的。留出足够的时间以允许感兴趣的靶标与DDpp结合，并去除或洗掉溶液或混合物中的非结合组分。然后可以检测DDpp与感兴趣的靶标之间的结合复合物的形成，例如，通过检测来自DDpp上的标记的信号，所述标记是结合复合物的一个组分。标记可以是产生可通过标准方法检测的信号的任何标记，例如荧光标记、放射性化合物或与底物反应以产生可检测信号的酶。用于此类目的的合适标记的实例在本文中描述和/或本领域中已知。
可以使用本领域中已知的方法，例如WO00/70023和(Harlow和Lane(1989)Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory,pp.1-726)中所述，通过使用放射性同位素、亲和标记(例如生物素、亲和素等)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)可检测地标记与感兴趣的靶标(例如CD123或AFP p26)结合的DDpp。
可检测标记或标签可以是任何能够直接或间接产生可测量信号(例如质量变化、放射性、显色、发光或荧光信号)的标记或标签，其可用于定量样品中结合的可检测部分或标签的量。本领域已知的可检测标记包括重金属、放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I、电化学发光标记(例如与底物结合的钌(Ru)基催化剂等)、发光或生物发光标记(例如铕、钒)、荧光或化学发光化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素、酶(例如酶，例如碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶)、比色标记，例如胶体金、有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)、顺磁性原子或磁性剂、电子致密试剂、含有荧光染料的纳米珠或微珠、纳米晶体、量子点、量子珠、纳米标签、具有荧光标记的树枝状聚合物、微应答物、电子供体分子或分子结构或光反射粒子，微粒可以是纳米晶体或量子点。纳米晶体是吸收光子，然后以不同波长重新发射光子的物质(荧光团)。此外，可以将额外的荧光标记或二抗缀合至纳米晶体。纳米晶体可从诸如Invitrogen和Evident Technologies(Troy,N.Y.)的来源商购获得。其他标记包括E)-5-[2-(甲氧羰基)乙烯基]胞苷，其是一种非荧光分子，当受到紫外线(UV)照射时会产生产物3β-D-呋喃核糖基-2,7-二氧吡啶并[2,3-d]嘧啶，其显示强荧光信号。
竞争性抑制可通过本领域已知的任何方法来确定，例如竞争性ELISA测定。如果DDpp(例如DDpp融合蛋白(例如DDpp-Fc、DDpp-CAR、DDpp-scFv))或其他分子与给定表位的结合程度使得其在一定程度上阻断参考分子与表位的结合，则称其“竞争性抑制”参考分子与该表位的结合。如本文所用，DDpp(例如DDpp融合蛋白)或其他分子可被称为竞争性抑制参考分子与给定表位的结合，例如，抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％或至少20％。术语“竞争”、“竞争…的能力”和“与…竞争”是用于描述DDpp(例如DDpp融合蛋白)的相对术语，其产生DDpp(例如DDpp融合蛋白(例如DDpp-Fc、DDpp CAR、DDpp-scFv和包含DDpp的抗体))对参考分子与靶标的结合的至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的抑制，其通过如本文所述或本领域中已知的标准竞争测定法测定，所述标准竞争测定法包括但不限于使用例如放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)、优选酶联免疫吸附测定法(ELISA)、“夹心”免疫测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法、发光、电化学发光和免疫电泳测定法的技术的竞争性测定系统。用于确定候选结合分子的结合和亲和力的方法是本领域已知的，并且包括但不限于亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、平衡透析、荧光探针取代和等离子体共振。
在另外的实施方案中，所提供的DDpp用于蛋白质分析。在一些实施方案中，DDpp与可检测剂和/或标签缀合。在一些实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：8-33和74-94的氨基酸序列。在其它实施方案中，DDpp包含选自SEQ ID NO：8-33和74-94的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，DDpp与可检测剂缀合。在一个实施方案中，可检测剂包含发色团。在另一个实施方案中，可检测剂包含荧光染料。在另外的实施方案中，可检测剂包含放射性核素。在一些实施方案中，DDpp通过共价结合与可检测剂缀合。在一些实施方案中，DDpp是融合蛋白。在另外的实施方案中，DDpp是多聚体的。在另外的实施方案中，DDpp与标签缀合。在一些实施方案中，标签是选自以下组中的成员：多组氨酸标签、myc标签和FLAG标签。在进一步的实施方案中，DDpp与标签的组合(例如，多组氨酸标签和FLAG标签)缀合。在一些实施方案中，DDpp通过共价结合与标签缀合。在一些实施方案中，DDpp是融合蛋白。在一些实施方案中，DDpp是多聚体的。
制品
本文提供制品，包括试剂盒。制品可以包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶或注射器。容器可以由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。容器容纳本公开内容的一种或多种DDpp、编码DDpp的核酸和/或载体或宿主细胞。标签或包装插页可以包括用于进行基于亲和力的筛选和/或检测的说明。
还提供了含有DDpp的试剂盒。此类试剂盒的用途包括但不限于检测DDpp特异性结合的感兴趣的靶标(例如CD123或AFP p26)。此类检测试剂盒可用于筛选感兴趣的靶标的存在和/或定量流体(例如生物流体(例如血液、血清或滑液))中感兴趣的靶标的浓度。
在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包含表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其中CAR包含与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD123的D结构域包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是自体免疫细胞。在一些实施方案中，CAR免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包含表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其中CAR包含与AFP p26 AD结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的scFv。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的D结构域。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFPp26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含选自SEQ ID NO：74-93和94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含SEQ ID NO：70-73或92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的DD包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，免疫细胞是自体细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其中CAR包括AFP p26抗原决定簇(AD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞(CAR-T细胞)或自然杀伤(NK)细胞(CAR-NK细胞)。在一些实施方案中，免疫细胞是自体细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体免疫细胞。
在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括衔接子，该衔接子包含(a)与CD123结合的D结构域(DD)和(b)抗原决定簇(AD)。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子是包含单个与CD123结合的D结构域的单价衔接子。在一些实施方案中，衔接子是包含两个与CD123结合的D结构域的二价衔接子。在一些实施方案中，与CD123结合的两个D结构域是相同的。在一些实施方案中，与CD123结合的两个D结构域是不同的。在一些实施方案中，衔接子为二价衔接子，其包括与CD123结合的第一D结构域和与第二AD结合的第二D结构域。在一些实施方案中，第二AD为CD33或LeY。在一些实施方案中，单价衔接子包括D结构域，其包括选自SEQ IDNO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，单价衔接子包括D结构域，其包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含含有选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列的DD。在一些实施方案中，二价衔接子包含含有SEQ IDNO：14的氨基酸序列的D结构域。在一些实施方案中，二价衔接子包含两个相同的D结构域，所述D结构域含有选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价衔接子包含两个相同的D结构域，所述D结构域含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含AFP p26抗原决定簇(AD)。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，单价衔接子包含SEQ ID NO：50-54或55的氨基酸序列。在一些实施方案中，单价衔接子包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。在一些实施方案中，二价接头包含SEQ ID NO：56-60或61的氨基酸序列。在一些实施方案中，单价衔接子包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个接头。
在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包含衔接子，所述衔接子包含(a)与CD123结合的D结构域和(b)与AFP p26 AD结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8-33、99和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的ADBD包含与AFP p26 AD结合的D结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个接头。
在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包含衔接子，该衔接子包含(a)与靶细胞上的靶抗原决定簇(AD)结合的第一抗原决定簇结合结构域(ADBD)和(b)与AFP p26 AD结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，AFP p26 AD包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFPp26 AD结合的ADBD包含与AFP p26结合的D结构域。在一些实施方案中，与AFP p26 AD结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：70-73和92-94的氨基酸序列。在一些实施方案中，与AFPp26 AD结合的D结构域包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个接头。
在一个实施方案中，预期一种DDpp测定试剂盒，其包含特异性结合感兴趣的靶标的DDpp的一个或多个容器，以及任选地用于确定靶/DDpp相互作用的存在与否或其不存在的检测装置。试剂盒还任选地含有可以用作例如对照或标准品的感兴趣的靶蛋白(例如，BCMA、CD123、CD33、CD38、LeY、CS1、HER2、AFP或AFP p26)。DDpp可以是游离的或者在宿主细胞表面或噬菌体表面上表达。在一个具体的实施方案中，试剂盒中提供的DDpp或感兴趣的靶标是标记的。可以使用本领域已知的任何标记。在一些实施方案中，标记选自以下：生物素、氟、酶、表位、生色团或放射性核素。在一些实施方案中，DDpp被固定在固体支持物上。用于检测标记的检测装置将取决于标记的性质，并且可以是本领域中任何已知的，例如，用于检测放射性核素的膜；产生或放大可检测信号以检测感兴趣的靶标的存在的酶底物。
优选地，试剂盒还包含DDpp的固体支持物，其可以作为单独的元件提供或在其上固定特异性结合感兴趣的靶标的DDpp(例如，BCMA、CD123、CS1、HER2、AFP或AFP p26)。因此，可以将特异性结合试剂盒中的感兴趣的靶标的DDpp固定在固体支持物上，或者可以将其固定在试剂盒中包括的或与试剂盒分开提供的这种支持物上。优选地，DDpp被涂覆在微量滴定板上。在一些实施方案中，检测涉及信号放大分子。在信号放大分子是酶的情况下，试剂盒任选地还包括酶所需的底物和辅因子，并且其中放大分子是荧光团。试剂盒任选地还包括提供可检测的生色团的染料前体。
试剂盒还可含有用于进行测定的说明书以及其他添加剂，例如稳定剂、洗涤和孵育缓冲剂等。试剂盒的组分将以预定的比例提供，其中各种试剂的相对量适当地变化以提供使测定的灵敏度充分最大化的试剂溶液中的浓度。具体地，试剂可以干粉末的形式提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液，用于与待测试的样品组合。
可以使用的用于结合测定的各种形式和技术在本领域中是已知的，并且包括但不限于固定至过滤器，例如尼龙或硝酸纤维素；二维阵列、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、免疫沉淀测定、荧光微体积测定技术(FMATTM)、LuminexTM系统测定、荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、电免疫测定、AlphaScreenTM、纳米颗粒衍生技术和表面等离子共振(SPR)。
结合测定可以是均质的或半均质的。均质测定是将所有成分混合在一起、孵育然后分析的测定。半均质测定是大多数反应以复杂混合物形式发生的测定，但是在添加最终试剂和分析之前需要洗涤步骤，这与典型的逐步装配夹心测定不同，后者是添加每种组分，然后在添加下一种组分之前进行冲洗。在一些实施方案中，所述测定是免疫测定。在某些实施方案中，测定是半均质酶免疫测定(EIA)。
现在将通过根据其进行的实验的描述来说明本公开内容的各种实施方案。提供以下实施例以促进所公开实施方案的实践，并且不应被解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。在实施例中，参考了附图。
实施例
实施例1.分离对CD123具有增加的亲和力的变体D结构域
分离和表征与示例性的感兴趣的靶标结合的D结构域、产生和表征包含D结构域的D结构域融合多肽、产生和表征包含D结构域的衔接子、产生和表征包含D结构域的CAR、产生和表征表达CAR的免疫细胞、以及表征表达具有或不具有衔接子的CAR的细胞的细胞毒活性的方法公开于例如国际申请公开号WO2016164305、WO2016164308A1、WO2019099440和WO2019099433、美国专利号10,662,248、10,647,775和11,008,397，其中的每一个出于所有目的以引用的方式并入本文。
提高D结构域对靶抗原(例如CD123)的亲和力的方法可以包括现有氨基酸序列的诱变。这些突变可以针对特定氨基酸或随机分布在整个序列中。随后可以对突变的D结构域进行分析以确定与特定应用或功能相关的结合特性、蛋白质表达或其他生物活性的变化。引入随机突变的一种方法是通过易错PCR(EP-PCR)。该方法用于将突变引入CD123特异性8W9C D结构域序列(SEQ ID NO：4)。简而言之，编码D结构域和侧翼区域的核苷酸序列(任性地包括信号肽、连接肽和限制酶位点)用易错PCR酶(例如Mutazyme II，AgilentTechnologies)进行PCR扩增。经过一轮或多轮连续扩增后，用适当的限制酶消化PCR产物，并将其连接到1)麦芽糖结合蛋白(MBP)融合表达载体的相应位点以生成MBP文库，或2)噬菌体pIII蛋白融合表达载体的相应位点以生成噬菌体文库。
亲本和突变变体D结构域在大肠杆菌(T7 Express，New England Biolabs)中通过在含有抗生素和0.2％葡萄糖的Luria培养基中在37℃下用IPTG(异丙硫基-β-半乳糖苷)诱导4小时或通过使用MagicMedia(Life Technologies)在30℃下自诱导16小时表达为MBP融合体。诱导后，将细胞沉淀、洗涤并重新悬浮在包含200mM Tris pH7.5和20mM EDTA的“漏出缓冲液”中。在30℃下孵育16小时后，通过ELISA测定含有MBP融合蛋白的上清液的靶标结合和表达。将上清液加入到用0.0032ug/ml的抗MBP多克隆抗体(Abcam)包被的96孔Immulon4HBX微量滴定板中。洗涤后，用CD123-Fc(Sino Biological)+抗人Fc HRP(Abcam)检测结合的MBP融合蛋白以评估CD123结合，或用抗MBP-HRP(New England Biolabs)检测结合的MBP融合蛋白以评估MBP融合蛋白表达。如图1所示，8W9C(SEQ ID NO：4)的突变变体以一系列亲和力(y轴)与CD123结合。8W9C、5S5W(SEQ ID NO：97)和5B7L(SEQ ID NO：98)分别是亲本、低亲和力和高亲和力对照D结构域。突变也可影响结构域的表达，如可变的抗MBP检测信号(x轴)所示。
在筛选中表现出增强的CD123结合的MBP融合体的所选择克隆针对蛋白质浓度进行标准化，并通过ELISA中的连续稀释进一步评估与CD123的结合。如图2和3所示，包括6Z5E(SEQ ID NO：6)(即8W9C(N50S))、4H2H(SEQ ID NO：30)(即8W9C(K48I、K55N))和1J1K(SEQID NO：7)(即8W9C(G8S))在内的几种突变体代表与CD123结合的亲和力大于亲本8W9C序列的序列。
或者，在筛选之前对8W9C(SEQ ID NO：4)的突变变体进行进一步的进化选择。为此，将8W9C的突变变体克隆为M13噬菌体展示文库，该文库编码D结构域与截短pIII的N端融合体。所得噬菌体文库用生物素化的重组人CD123-His(Sino Biological)进行两轮结合筛选，首先与BT-tris-NTA-生物素结合，然后用M-280Streptavidin Dynabeads(Invitrogen)捕获。连续几轮筛选使用具有0.1％Tween 20的10nM和5nM的CD123-HIS抗原。通过在磷酸盐缓冲液中加入300μl 500mM咪唑洗脱结合的噬菌体，并在TG1细胞(Lucigen)中用VCSM13辅助噬菌体(Agilent Technologies)繁殖。然后用PEG/NaCl沉淀每轮扩增的输出噬菌体，并在PBS中重新悬浮，作为下一轮的输入文库。
经过两轮选择后，在筛选之前，首先将噬菌体输出亚克隆为MBP融合文库。使用MagicMedia(Life Technologies)，在30℃下通过自诱导16小时，将个体MBP克隆表达为BL21(DE3)大肠杆菌(New England Biolabs)中的MBP融合体。诱导后，将细胞沉淀、洗涤并重悬于200mM Tris ph7.5、20mM EDTA(漏出缓冲液)中。在30℃下孵育16小时后，通过ELISA测定含有MBP融合体的上清液的结合和表达。将上清液加入包被有0.2ug/ml抗MBP多克隆抗体(Abcam)的96孔Immulon 4HBX微量滴定板中。随后进行洗涤，用CD123-HIS(SinoBiological)+抗-HIS-HRP(BioLegend)检测结合的MBP融合体以评估CD123结合。发现突变0N5N(SEQ ID NO：99)(即8W9C(I59L))和1H3C(SEQ ID NO：100)(即8W9C(K46E))对CD123的亲和力高于亲本结构域8W9C(数据未显示)。
利用Qin等人(Mol Ther.27(7):1262-1274(2019))描述的方法，对8W9C(SEQ IDNO：4)亲本CD123结合D结构域进行去免疫以产生6T1D(SEQ ID NO：5)D结构域。简而言之，使用基于虚拟矩阵的预测算法筛选8W9C序列的T细胞表位，以识别II类表位(Singh和Raghava,Bioinformatics.17(12):1236-7(2001))。高亲和力表位定义为6％阈值及以下的表位。共筛选了51个MHC HLA-DR等位基因。混杂表位定义为17或更多个命中的表位。根据定义，8W9C具有三个高亲和力、混杂表位，其位于Y12、W16和I63。克隆6T1D是通过引入三个突变R17Q、S24T、S65E生成的，其将高亲和力、混杂表位的数量减少到零。这些突变旨在去除潜在的II型MHC T细胞表位，但不会显著影响结构域对CD123的亲和力。
在8W9C(SEQ ID NO：4)的背景下鉴定的亲和力增强突变与6T1D的去免疫突变组合，产生一系列具有增强的亲和力的去免疫变体。因此，3F4N(SEQ ID NO：8)、6Y7D(SEQ IDNO：9)、5M5U(SEQ ID NO：10)、4R8U(SEQ ID NO：11)、1F9I(SEQ ID NO：12)、0C8S(SEQ IDNO：13)和5B1Q(SEQ ID NO：14)D结构域代表表现出比6T1D更高的与CD123的亲和力结合而不会增加预测的II型MHC介导的免疫原性的突变组合。例如，通过取代5个残基(即G8S、L21Q、K48E、N50S、I59L)而从6T1D来源的5B1Q(SEQ ID NO：14)表现出比6T1D增强约10倍的亲和力，同时具有与6T1D相当的预测免疫原性。
为了评估CD123结合的动力学，使用生物层干涉法(BLI)分析了包含D结构域的衔接蛋白。通过瞬时转染HEK-293细胞，然后进行Ni-Sepharose Excel(Cytiva)和SEC色谱分析，生成了包含CD123结合D结构域和P26(Q26-V229)AFP多肽(SEQ ID NO：39)的衔接蛋白。使用Octet RED386(Sartorius)进行BLI实验。所有实验均在25℃下在动力学缓冲液(PBS、0.1％BSA、0.02％tween 20)中以1000rpm的恒定搅拌速度进行。CD123-Fc(20nM)在AHC传感器(Sartorius)上捕获250秒至约0.8nm的负载密度。为了测量结合亲和力，将传感器浸入浓度范围为500nM至0.69nM(3倍稀释系列)的衔接蛋白中300秒，然后返回动力学缓冲液600秒。表面通过3轮10秒的10mM甘氨酸pH1.5和随后动力学缓冲液再生。使用Sartorius OctetAnalysis Studio的1:1相互作用模型使用全局拟合分析数据。代表性CD123亲和力测量结果如下所示。
表3.代表性突变变体的CD123结合亲和力
进一步评估了包含8W9C(SEQ ID NO：4)D结构域变体的衔接蛋白与表达CD123的靶细胞的结合。所有步骤均在冰上在FCS缓冲液(FBS+3％BSA)中进行。将表达CD123的OCI-AML2细胞(1e6/ml)在FCS缓冲液中阻断20分钟，然后与浓度为100、33、11、3.7、1.2、0.41、0.14和0.046ug/ml的HIS标记的衔接蛋白一起孵育30分钟。用FCS缓冲液洗涤细胞两次，然后通过与人TruStain FcX Fc受体阻断溶液(Biolegend)孵育10分钟来阻断Fc受体，随后立即用AF647-抗-HIS抗体(Biolegend)检测30分钟。用FCS缓冲液洗涤细胞两次，然后立即在FACSCelesta(BD)流式细胞仪上运行。使用FlowJo软件分析流式细胞术数据，并将MFI定义为平均荧光强度。如图4所示，通过筛选与重组CD123结合的增强的结合鉴定的突变(例如G8S、K48E、N50S和I59L)促进与肿瘤细胞表面上表达的天然CD123的增强的结合。
实施例2.对CD123具有增加的亲和力的变体D结构域的体外活性
为了评估在8W9C(SEQ ID NO：4)背景下鉴定的亲和力增加突变对增强衔接蛋白生物活性的影响，进行了T细胞报告因子测定。Jurkat NFAT(活化T细胞的核因子)报告细胞系(JNL10)是通过用包含与萤光素酶报告基因(Qiagen)偶联的NFAT增强子的Cignal LentiNFAT Reporter转导Jurkat E6.1细胞系(Sigma)生成的。为了评估NFAT信号传导活性，JNL10报告细胞通过用编码包含8G8V(SEQ ID NO：70)p26 AFP结合D结构域的8G8V-CAR(SEQID NO：69)的构建体的电穿孔进行转染，在12孔板中在37℃下培养过夜。第二天，将电穿孔的JNL10细胞与CD123+或CD123-MOLM13细胞以大约1:1的比例与在10μl培养基中稀释的滴定的CD123特异性衔接蛋白(包括p26多肽和6T1D、3F4N或4R8U D结构域，分别为SEQ ID NO：101、102和103)一起在96孔板的100μl培养基中在37℃下共培养5小时。孵育5小时后，通过添加Bright-Glo萤光素酶底物(Promega)并使用酶标仪测量相对发光单位(RLU)来监测NFAT介导的信号传导活性。JNL10/8G8V-CAR细胞以剂量和靶向特异性方式由衔接子激活(图5和6)。此外，与亲本D结构域(6T1D)相比，JNL10/8G8V-CAR T细胞在较低浓度下被包含以更高亲和力结合CD123的D结构域(例如3F4N(SEQ ID NO：8)和4R8U(SEQ ID NO：11))的衔接蛋白激活。如图6所示，在靶细胞不表达CD123的情况下未观察到JNL10/8G8V-CAR T细胞活化。
细胞因子产生可以作为T细胞活化的替代测量方法。通过在96孔板中培养表达8G8V-CAR(SEQ ID NO：69)的T细胞(活化后7天)和MOLM13-GFP/Luc靶细胞来评估细胞因子的产生。24小时后收集培养上清液，并通过Ready-Set-Go人IL2和IFNγ未包被ELISA试剂盒(eBioscience/ThermoFisher)评估细胞因子产生。在进行ELISA之前，将培养上清液进行1:5稀释。在存在表达CD123的MOLM13靶细胞的情况下，CD123特异性衔接蛋白促进表达8G8V-CAR的原代T细胞产生剂量和亲和力依赖性的IL-2(图7)和IFNγ(图8)。此外，与包含亲本D结构域(6T1D)的衔接子相比，包含以更高亲和力结合CD123的D结构域的衔接子，例如3F4N(SEQ ID NO：8)和4R8U(SEQ ID NO：11)，刺激8G8V-CAR T细胞在较低衔接子浓度下产生更多细胞因子。
通过噬菌体文库选择后的筛选鉴定的额外突变(例如G8S、L21Q和I59L)与上文所述突变(6T1D(K48E,N50S))组合，以产生0C8S(SEQ ID NO：13)(即6T1D(G8S,K48E,N50S,I59L))和5B1Q(SEQ ID NO：14)(即6T1D(G8S,L21Q,K48E,N50S,I59L))D结构域。当整合到衔接子中时，这些D结构域比亲本变体更有效，如通过NFAT活化(图9)、靶细胞裂解(图10)和IFNγ(图11)和IL-2(图12)的产生所测量的。
D结构域的亲和力和价态的组合可用于进一步拓宽CD123特异性衔接蛋白的动态范围。衔接蛋白以单价和双价形式生成，利用亲本6T1D(SEQ ID NO：5)D结构域或掺入高亲和力(例如，5B1Q(SEQ ID NO：14))或低亲和力(例如，4G0D(SEQ ID NO：32))变异的变体。使用表达高水平CD123的NALM6细胞系(NALM6-CD123+)的克隆评估这些组合。如图13所示，NALM6-CD123+细胞被原代8G8V-CAR(SEQ ID NO：69)表达T细胞的裂解可通过CD123结合衔接蛋白的剂量(浓度)、价态(单价或双价)和亲和力(高、中或低)进行调节，EC50总体跨度为3个对数。低亲和力(例如4G0D)D结构域在掺入双价衔接子形式时表现出最大的效力增益。然而，包含高亲和力5B1Q D结构域的单价衔接子比包含6T1D D结构域的双价衔接子更有效。
实施例3.对CD123具有增加的亲和力的变体D结构域的体内活性
使用MOLM14-GFP/萤光素酶肿瘤模型评估包含亲和力增强的8W9C(SEQ ID NO：4)D结构域变体的衔接子的体内功效。通过NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ小鼠(JacksonLaboratories)的尾静脉静脉注射植入肿瘤细胞(5x106)。肿瘤植入六天后，给小鼠施用单剂量的5x106个CD123特异性Dd-X-CAR表达CD3缺陷T细胞或5x106个通用8F7S-CAR(SEQ IDNO：107)表达CD3缺陷T细胞。用编码Dd-X-CAR或8F7S-CAR的慢病毒载体和编码靶向TCRβ链恒定区的gRNA的LentiCRISPRv2构建体转导天然T细胞。扩增7天后，剩余的CD3+/TCRαβ+T细胞被耗竭，CD3-细胞被扩增。接受8F7S-CAR-T细胞的小鼠还施用1mg/kg i.p.(q.o.d.)的阴性对照a3D-衔接子(SEQ ID NO：105)或1mg/kg i.p.(q.d.)、1mg/kg i.p.(q.o.d.)或0.3mg/kg i.p.(q.o.d)的CD123特异性Dd-X-衔接子28天(图14)。在治疗期间和在停用衔接子后监测动物的肿瘤负荷。通过腹膜内注射3mg D-荧光素(Caliper Life Sciences)、然后在4分钟后使用Xenogen IVIS Lumina(Caliper Life Sciences)进行荧光成像和1分钟的曝光时间来测量肿瘤负荷。使用Living Image Version 4.3.1SP2软件(Caliper LifeSciences)分析每只小鼠的生物发光信号通量(光子/s/cm2/sr，数值范围为105-107)。如通过荧光通量测量的，使用与通用8F7S-CAR T细胞组合的高亲和力单价CD123特异性衔接蛋白的肿瘤控制与CD123特异性CAR T细胞治疗组的肿瘤控制相当。该治疗导致播散性MOLM14肿瘤以计划和剂量依赖性方式完全消退，而无需同种反应的帮助。
使用亲和力增强的8W9C(SEQ ID NO：4)D结构域变体的基于T细胞的治疗导致动物模型中弥漫性MV4-11肿瘤以剂量依赖性方式完全消退。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ小鼠(Jackson Laboratories)被植入5x106个MV4-11肿瘤细胞。肿瘤植入15天后，小鼠被施用单剂量的5x106个CD123特异性Dd-X-CAR表达CD3缺陷T细胞或5x106个通用8F7S-CAR(SEQ ID NO：107)表达CD3缺陷T细胞。接受8F7S-CAR-T细胞的小鼠还施用1mg/kg i.p.(q.d.)的阴性对照a3D-衔接子(SEQ ID NO：105)或1mg/kg i.p.(q.d.)、0.3mg/kg i.p.(q.d.)或0.1mg/kg i.p.(q.d)的CD123特异性Dd-X-衔接子28天(图15)。在治疗期间和在停用衔接子后监测动物的肿瘤负荷。如通过荧光通量测量的，使用与通用8F7S-CAR T细胞组合的高亲和力单价CD123特异性衔接蛋白的肿瘤控制与CD123特异性CAR T细胞治疗组的肿瘤控制相当。治疗导致播散性MV4-11肿瘤以计划和剂量依赖性方式完全消退。
使用亲和力增强的8W9C(SEQ ID NO：4)D结构域变体的基于T细胞的治疗清除或控制了多个患者来源的AML异种移植物(PDX)。AML-PDX模型的生成：在接种AML细胞之前，用150cGy全身辐射对动物进行亚致死辐射，然后转移2x106人T细胞耗竭的AML细胞，这些细胞来源于患者白细胞分离术的冷冻保存样本。受体菌株(NOG、NOG-EXL和NCG)是先前建立的，并在图16中指示，连同患者和疾病特征。建立了模型植入动力学以定义动物在骨髓中表现出20％或更高的人肿瘤细胞植入的时间窗口。对于每个模型，在预计的植入窗口之前的间歇时间点处死一组替代动物(n＝3-5)以收集骨髓进行AML负荷分析。一旦替代动物在骨髓中达到植入标准，定义为取样动物平均的活细胞％hCD45+≥20％，其余研究前动物将根据体重随机分配以开始治疗。所有研究动物均接受单剂量由健康供体T细胞产生的8F7S-CAR-T细胞，然后每天IP注射一次阴性对照a3D或CD123特异性Dd-X衔接子，剂量为3mg/kg，持续14天。在开始治疗后第14天，对所有组的动物实施安乐死以收集骨髓进行流式细胞术分析。确定了所有研究动物骨髓中代表移植的AML细胞(hCD45+CD3-)的活细胞比例。
出于所有的目的，本文所引用的所有出版物、专利、专利申请、互联网网站以及登录号/数据库序列(包括多核苷酸与多肽序列二者)以引用的方式整体并入本文，其引用的程度犹如每个单个出版物、专利、专利申请、互联网网站或登录号/数据库序列被明确地和单独地指出以引用的方式如此并入。
预期可以做出上文公开的特定特征和方面的各种组合或子组合，并且各种组合或子组合仍然落入本公开内容所涵盖的实施方案之内。此外，与实施方案结合的任何具体特征、方面、方法、性质、特性、质量、属性、元素等等的公开内容可以用于本文所阐明的所有其他实施方案。因此，应理解公开的实施方案的各种特征和方面可以互相组合或互相取代，以便执行所公开的实施方案的不同模式。因此，意图本公开内容所涵盖的实施方案的范围不应受到本文所述的特定公开的实施方案的限制。此外，尽管所涵盖的实施方案易于进行各种修改和替代的形式，但其具体实例已经在附图中示出并且在本文中进行了详细描述。然而应理解，本公开内容的范围不限于所公开的具体形式或方法，相反，本公开内容涵盖落在各种实施方案，所述的和所附的权利要求书的精神和范围内的所有修改、等效物和替代物。本文公开的任何方法不必以所叙述的顺序执行。本文公开的方法包括从业者采取的某些动作；然而，它们也可以包括这些动作的任何第三方说明，无论是明示还是暗示。例如，例如“施用包含DDpp-CAR的T细胞”之类的动作包括“指导施用包含DDpp-CAR的T细胞”。此外，在根据Markush组描述了本公开内容的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本公开内容还因此根据Markush组的任何个别成员或成员亚组进行了描述。
本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围及其组合。例如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”、“在...之间”之类的语言包括所列的数字。数字之前的例如“约”或“大约”之类的术语包括所列的数字。例如，“约10纳米”包括“10纳米”。

Claims (20)

1.一种D结构域靶结合结构域多肽，其与CD123特异性结合并包含SEQ ID NO：14、8-13、15-32或33的氨基酸序列。
2.包含与异源多肽融合的权利要求1的D结构域的多肽，任选地其中异源多肽包含：
(a)全长抗体或抗体片段；
(b)Fc结构域；
(c)跨膜结构域；
(d)膜缔合结构域；
(e)人血清白蛋白或其片段；
(f)AFP或其片段；
(g)AFP p26或其片段；或
(h)受体的细胞外结构域或其片段。
3.权利要求1或权利要求2的多肽，其被标记或缀合至治疗剂或细胞毒性剂。
4.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含含有权利要求1的与CD123特异性结合的D结构域的靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，任选地其中
(a)跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28跨膜结构域；
(b)细胞内信号传导结构域选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合；和/或
(c)细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其任意组合。
5.权利要求4的CAR，其包含SEQ ID NO：62-66或67的氨基酸序列。
6.一种衔接子，其包含(a)特异性结合CD123的权利要求1的D结构域靶结合结构域，和(b)抗原决定簇(AD)，任选地其中AD包含AFP p26多肽，任选地其中AFP p26多肽包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列。
7.权利要求6的衔接子，其中所述衔接子包含特异性结合CD123的单个D结构域或特异性结合CD123的两个D结构域。
8.分离的多核苷酸，其编码权利要求1和权利要求2的多肽或权利要求6或权利要求7的衔接子。
9.分离的多核苷酸，其编码权利要求3-5中任一项的CAR。
10.经工程化以表达权利要求3-5中任一项的CAR的细胞，任选地其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
11.药物组合物，其包含权利要求1和权利要求2的蛋白质或权利要求6或权利要求7的衔接子以及药学上可接受的赋形剂。
12.药物组合物，其包含表达权利要求3-5中任一项的CAR的细胞以及药学上可接受的赋形剂，任选地其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
13.一种递送针对一种或多种靶细胞的免疫应答或杀死靶细胞的方法，其包括将包含靶细胞的组合物与表达权利要求3-5中任一项的嵌合抗原受体(CAR)的细胞接触，所述嵌合抗原受体包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
14.一种递送针对靶细胞的免疫应答或杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与衔接子接触，其中(a)包含靶细胞的组合物还包含表达CAR的细胞，其中CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)权利要求1的与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26AD。
15.一种杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与表达CAR的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)包含靶细胞的组合物还包含衔接子，所述衔接子包含(i)权利要求1的与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。
16.一种杀死靶细胞的方法，其包括：使包含靶细胞的组合物与表达CAR和衔接子的细胞接触，其中(a)CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；并且(b)衔接子包含(i)权利要求1的与CD123结合的D结构域和(ii)AFP p26 AD。
17.一种递送针对靶细胞的免疫应答、杀死靶细胞或治疗患者的癌症的方法，其包括：向患者施用表达权利要求3或权利要求4的嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体包含(i)与CD123结合的D结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
18.一种递送针对靶细胞的免疫应答、杀死靶细胞或治疗患者的癌症的方法，其包括：向患者施用衔接子，所述衔接子包含(i)权利要求1的与CD123结合的D结构域和(ii)AFPp26 AD。
19.权利要求18的方法，其中
(a)已向患者施用表达CAR的细胞，其中所述CAR包含(i)结合AFP p26抗原决定簇(AD)的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；
(b)患者包含表达CAR的细胞，其中所述CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域；或
(c)所述方法还包括施用表达CAR的细胞，其中所述CAR包含(i)与AFP p26抗原决定簇(AD)结合的抗原决定簇结合结构域(ADBD)、(ii)跨膜结构域和(iii)细胞内结构域。
20.权利要求13-19中任一项的方法，其中
(a)与CD123结合的D结构域包含选自SEQ ID NO：8、13、14、31、32和33的氨基酸序列；
(b)与CD123结合的D结构域包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；
(c)跨膜结构域包含CD8a、41BB或CD28跨膜结构域；
(d)细胞内信号传导结构域选自人T细胞受体α、β或ζ链的结构域；人41BB结构域；人CD28结构域；及其任意组合；
(e)细胞内信号传导结构域包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其任意组合；
(f)AFP p26 AD包含选自SEQ ID NO：37-43和44的氨基酸序列；
(g)结合AFP p26 AD的ADBD包含结合AFP p26 AD的D结构域；
(h)结合AFP p26 AD的ADBD包含含有SEQ ID NO：73、70-72或92-94的氨基酸序列的D结构域；
(i)包含结合AFP p26 AD的D结构域的CAR包含SEQ ID NO：68或69的氨基酸序列；
(j)表达CAR的细胞是免疫细胞，任选地T细胞或自然杀伤(NK)细胞；
(k)接触发生在人受试者中；
(l)表达CAR的细胞是自体免疫细胞；
(m)靶细胞是癌细胞；和/或
(n)癌症是急性髓系白血病(AML)或高风险骨髓增生异常综合征。
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