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CN118598976A - 经修饰的il-2分子及其用途 - Google Patents

经修饰的il-2分子及其用途 Download PDF

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CN118598976A
CN118598976A CN202410795252.1A CN202410795252A CN118598976A CN 118598976 A CN118598976 A CN 118598976A CN 202410795252 A CN202410795252 A CN 202410795252A CN 118598976 A CN118598976 A CN 118598976A
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赵耀
张玉
刘慧杰
朴锦华
张建军
张秋磊
张维
王国永
张天赋
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Leto Laboratories Co Ltd
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Abstract

本申请公开了经修饰的IL‑2分子，其中，所述修饰包括使用IL‑15分子中介导IL‑15分子与IL15Rα结合的区域取代IL‑2分子中介导IL‑2分子与IL2Rα结合的区域，所述IL‑15分子中介导IL‑15分子与IL15Rα结合的区域包含9个以上的氨基酸残基。本申请还公开了蛋白异二聚体，其包括本申请所述的经修饰的IL‑2分子，以及IL15Rα(sushi结构域)或其变体。本申请中的经修饰的IL‑2分子和/或包含其的蛋白异二聚体显著降低了与IL2Rα的亲和力，从而极大减少了其在临床治疗中的副作用，具有良好的成药前景。

Description

经修饰的IL-2分子及其用途
本申请是申请号为202111201233.4，名称为经修饰的IL-2分子及其用途的分案申请，该母案(202111201233.4)的申请日为2021年10月15日。
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种经修饰的IL-2分子及其用途。
背景技术
据公开资料显示，2017年2月世卫组织公布的数据表明，全球每年有1400多万新发癌症病例，预计到2030年这一数字将增加到2100多万；每年有880万人死于癌症，全球癌症死亡人数占总死亡人数的近六分之一，癌症的预防和治疗是医学领域亟需解决的世界性难题。
目前，传统的用于治疗癌症的方法包括外科手术、化疗、激素治疗和放疗(参见例如：Stockdale，1998年《癌症患者管理原则》(Principles of Cancer PatientManagement)，《科学美国人：医学》(Scientific American:Medicine)，第3卷，Rubenstein和Federman编，第12章第IV节)。然而，由于患者健康状况或疾病晚期情况，外科手术可能是不可行的，而且手术后癌细胞往往不能完全从患者体内移除；而只有当肿瘤组织对辐射的敏感性高于正常组织时，放疗才有效，同时高剂量的放疗通常会引起严重的副作用；激素治疗很少作为单一药剂使用，虽然其可能有效，但通常在其它治疗已移除了大多数癌细胞之后用于预防或延迟癌症复发；化疗最大的问题则在于患者可能很快对化疗药剂产生耐药性。
除此之外，免疫调节因子(例如白细胞介素)也可以适用于对动物模型和癌症患者发挥抗肿瘤作用，并避免了上述各种传统疗法中的缺陷，然而，与应用免疫调节因子相关的全身性毒副作用较大程度地限制了其使用。因此，开发能够降低免疫调节因子毒副作用的有效疗法十分必要。
发明内容
鉴于以上现有技术中存在的问题，一方面，本申请提供了经修饰的IL-2分子，其中，所述修饰包括使用IL-15分子中介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域取代IL-2分子中介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域，所述IL-15分子中介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包含9个以上的氨基酸残基。
在某些实施方式中，所述IL-15分子中介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域是连续的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述IL-15分子中介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域是不是连续的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述IL-15分子中介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包含1个或以上不连续的氨基酸位点。
在某些实施方式中，所述IL-2分子中介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域是连续的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述IL-2分子中介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域是不是连续的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述IL-2分子中介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包含1个或以上不连续的氨基酸位点。
在某些实施方式中，所述修饰能够降低所述经修饰的IL-2分子与IL2Rα的亲和力。
在某些实施方式中，所述修饰能够消除所述经修饰的IL-2分子与IL2Rα的亲和力。
在某些实施方式中，所述亲和力通过生物膜干涉技术(biolayerinterferometry，BLI)测得。
在某些实施方式中，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括环M(loop M)或其变体，所述环M包含如SEQ ID NO.1所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括环N(loop N)或其变体，所述环N包含如SEQ ID NO.5所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括螺旋B或其变体，所述螺旋B包含如SEQ ID NO.2所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括环M(loop M)或其变体、螺旋B或其变体，所述环M包含如SEQ ID NO.1所示的序列，所述螺旋B包含如SEQ IDNO.2所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括螺旋B或其变体、环N(loop N)或其变体，所述螺旋B包含如SEQ ID NO.2所示的序列，所述环N包含如SEQ IDNO.5所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括环M(loop M)或其变体、环N(loop N)或其变体，所述环M包含如SEQ ID NO.1所示的序列，所述环N包含如SEQID NO.5所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域自N端至C端依次包含：环M(loop M)或其变体、螺旋B或其变体、环N(loop N)或其变体，所述环M包含如SEQ IDNO.1所示的序列，所述螺旋B包含如SEQ ID NO.2所示的序列，所述环N包含如SEQ ID NO.5所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括环m(loop m)或其变体，所述环m包含如SEQ ID NO.8所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括环n(loop n)或其变体，所述环n包含如SEQ ID NO.12所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括螺旋b或其变体，所述螺旋b包含如SEQ ID NO.9所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括环m(loop m)或其变体、螺旋b或其变体，所述环m包含如SEQ ID NO.8所示的序列，所述螺旋b包含如SEQ IDNO.9所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括螺旋b或其变体、环n(loop n)或其变体，所述螺旋b包含如SEQ ID NO.9所示的序列，所述环n包含如SEQID NO.12所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括环m(loop m)或其变体、环n(loop n)或其变体，所述环m包含如SEQ ID NO.8所示的序列，所述环n包含如SEQ ID NO.12所示的序列。
在某些实施方式中，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域自N端至C端依次包含：环m(loop m)或其变体、螺旋b或其变体、环n(loop n)或其变体，所述环m包含如SEQ IDNO.8所示的序列，所述螺旋b包含如SEQ ID NO.9所示的序列，所述环n包含如SEQ ID NO.12所示的序列。
在某些实施方式中，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环m(loop m)或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环M(loop M)或其变体。
在某些实施方式中，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的螺旋b或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的螺旋B或其变体。
在某些实施方式中，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环n(loop n)或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环N(loop N)或其变体。
在某些实施方式中，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环m(loop m)或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环M(loop M)或其变体，以及，使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的螺旋b或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的螺旋B或其变体。
在某些实施方式中，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的螺旋b或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的螺旋B或其变体，以及，使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环n(loop n)或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环N(loop N)或其变体。
在某些实施方式中，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环m(loop m)或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环M(loop M)或其变体，以及，使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环n(loop n)或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环N(loop N)或其变体。
在某些实施方式中，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环m(loop m)或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环M(loop M)或其变体、使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的螺旋b或其变体取代所述螺旋B或其变体，以及，使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环n(loop n)或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环N(loop N)或其变体。
在某些实施方式中，所述修饰使得所述经修饰的IL-2分子能够与IL15Rα或IL15Rα的sushi结构域结合。
在某些实施方式中，所述修饰还包括使用IL-15分子中的环x(loop x)或其变体取代IL-2分子中的环X(loop X)或其变体，所述环x包含如SEQ ID NO.10所示的序列，所述环X包含如SEQ ID NO.3所示的序列。
在某些实施方式中，所述修饰还包括使用IL-15分子中的螺旋c或其变体取代IL-2分子中的螺旋C或其变体，所述螺旋c包含如SEQ ID NO.11所示的序列，所述螺旋C包含如SEQ ID NO.4所示的序列。
在某些实施方式中，与不包含所述取代的经修饰的IL-2分子相比，所述取代能够提高所述的经修饰的IL-2分子的稳定性。
在某些实施方式中，所述修饰还包括在IL-2分子的螺旋D区域进行氨基酸置换，置换后的氨基酸能够与所述螺旋b中的第43位苯丙氨酸(F)形成芳香环相互作用从而稳定疏水内核，其中氨基酸的位置以天然IL-15分子氨基酸序列为基础，根据KABAT编号的EU索引确定；所述螺旋D包含如SEQ ID NO.6所示的序列。
在某些实施方式中，所述天然IL-15分子氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在某些实施方式中，所述氨基酸置换包括W121F，其中氨基酸的位置以天然IL-2分子氨基酸序列为基础，根据KABAT编号的EU索引确定。
在某些实施方式中，所述天然IL-2分子氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在某些实施方式中，所述的经修饰的IL-2分子包含如SEQ ID NO.14所示的序列。
另一方面，本申请还提供了蛋白异二聚体，其包括本申请所述的经修饰的IL-2分子，以及IL15Rα或其变体；或者，所述蛋白异二聚体包括本申请所述的经修饰的IL-2分子，以及IL15Rα受体的sushi结构域或其变体。
在某些实施方式中，所述IL15Rα包含如SEQ ID NO.16所示的序列。
在某些实施方式中，所述sushi结构域包含如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.20所示的序列。
在某些实施方式中，所述蛋白异二聚体不与IL2Rα受体结合，并且和IL-2分子相比与IL2Rβ具有更高的亲和力，所述IL-2分子包括天然IL-2分子及其功能性变体。
在某些实施方式中，所述天然IL-2分子的功能性变体包括所述经修饰的IL-2分子。
在某些实施方式中，所述IL15Rα变体或所述sushi结构域变体包含Fc片段。
在某些实施方式中，所述Fc片段位于所述IL15Rα或所述sushi结构域的C端。
在某些实施方式中，所述Fc包括人IgG1Fc、人IgG4Fc和鼠IgG2aa.1Fc中的任意一种。
在某些实施方式中，所述Fc包含如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25所示的序列。
在某些实施方式中，所述蛋白异二聚体包含如SEQ ID NO.14所示的序列，以及如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22所示的序列。
在某些实施方式中，本申请所述的经修饰的IL-2分子和所述蛋白异二聚体与未经所述修饰的IL-2分子相比，能够降低Treg细胞的增殖活性。
另一方面，本申请还提供了核酸分子，其编码本申请所述的经修饰的IL-2分子。
另一方面，本申请还提供了核酸分子组合，其编码a)本申请所述的经修饰的IL-2分子，以及b)本申请中所述的IL15Rα或其变体，或所述的sushi结构域或其变体。
另一方面，本申请还提供了载体，其包含本申请所述的核酸分子，或本申请所述的核酸分子组合。
在某些实施方式中，编码本申请所述的经修饰的IL-2分子的核酸分子与编码本申请中所述的IL15Rα或其变体，或所述的sushi结构域或其变体的核酸分子位于同一载体中。
在某些实施方式中，所述载体包括第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码本申请所述的经修饰的IL-2分子的核酸分子，所述第二载体包含编码本申请中所述的IL15Rα或其变体，或所述的sushi结构域或其变体的核酸分子。
另一方面，本申请还提供了细胞，其包含本申请所述的经修饰的IL-2分子、本申请所述的蛋白异二聚体、本申请所述的核酸分子、本申请所述的核酸分子组合或本申请所述的载体。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含本申请所述的经修饰的IL-2分子、本申请所述的蛋白异二聚体、本申请所述的核酸分子、本申请所述的核酸分子组合、本申请所述的载体或本申请所述的细胞。
另一方面，本申请还提供了本申请所述的经修饰的IL-2分子、本申请所述的蛋白异二聚体、本申请所述的核酸分子、本申请所述的核酸分子组合、本申请所述的载体、本申请所述的细胞用于制备药物的用途，其中所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括肛门癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、实体瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、小细胞肺癌、胸腺癌、甲状腺癌、结肠癌和/或黑色素瘤。
临床上在IL-2低剂量的条件下，其会优先和Treg细胞表面上带有α链的高亲和力受体结合，从而产生免疫抑制，达不到治疗的效果。高剂量的IL-2会通过激活大量的效应T细胞从而中和Treg激活带来的免疫抑制，同时也会出现更多的毒副作用，以及细胞凋亡(activation induced cell apoptosis)。本申请中通过将IL-2中与其受体α链结合的多肽序列置换为IL-15中与其受体α链结合的多肽序列，从而减弱或消除了与α受体结合，从而有减少IL-2促进的抑制T细胞增殖活性的功能，同时还可减少对内皮细胞α受体的结合，从而降低或消除IL-2治疗引起的毒副作用，鉴于该优势，本申请提供的经修饰的IL-2分子具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1是本申请实施例1中SEC-HPLC对IL-2/15嵌合体1与sushi-Fc蛋白的异二聚体纯化产物进行鉴定的结果图，图1a为复合物1，图1b为复合物2，图1c为复合物3；
图2是本申请实施例1中SEC-HPLC对IL-2/15嵌合体2与sushi-hIgG4Fc蛋白的异二聚体纯化产物进行鉴定的结果图；
图3是本申请实施例4中复合物1蛋白对CTLL-2(T细胞)增殖作用的结果图；
图4是本申请实施例6中预毒理实验结果；
图5是本申请实施例7中复合物在代表癌种中的抗肿瘤效果图；
图6是IL-2和IL-15的四螺旋结构示意图，其中将IL-2的4个α螺旋分别命名A\B\C\D螺旋，IL-15的4个α螺旋分别命名a\b\c\d螺旋；
图7是IL-15和IL-2与各受体形成复合物的结构叠加比较示意图，其中间IL-2或IL-15区域：灰色代表IL-2，黑色代表IL-15。
具体实施方式
在本申请中，术语“IL-2”通常是指天然白介素-2或其功能性变体。天然白介素-2是一类主要由T细胞(B细胞、NK细胞及单核－巨噬细胞也能产生)的细胞因子，是一种在维持T淋巴细胞和NK细胞的正常功能中起着重要作用的球状糖蛋白。它于1976年被发现，当时被称为T细胞生长因子(TCGF)。在人类中IL-2由第4号染色体上的基因编码，IL-2是一个具有133个氨基酸残基组成的多肽，分子量大约15kD，有三个半胱氨酸残基，分别位于第58、105和125位。翻译后修饰包括第3位的Thr糖基化，第58位和105位半胱氨酸残基形成二硫键，并形成其功能必不可少的主要由4个α螺旋以及一些连接序列(loop)组成的高级结构(Bazan等，Science257，410-413(1992)),例如在本申请中(如图6所示)，IL-2中自N端到C端的4个α螺旋依次命名为螺旋A、螺旋B、螺旋C、螺旋D，螺旋AB之间的连接序列(loop，环)命名为环M，螺旋BC之间的连接序列(loop，环)命名为环X，CD螺旋间的连接序列(loop，环)命名为环N；例如，螺旋B可以包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，螺旋C可以包含如SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列、螺旋D可以包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，环M可以包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，环X可以包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，环N可以包含如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
IL-2通过结合IL-2受体(IL2R)来介导其作用，天然IL-2受体由3个亚基组成，分别为α(CD25)、β(CD122)和γ(CD132)受体亚基(如图7所示)，其中α受体主要表达在T抑制细胞(Treg)和一些内皮细胞(endothelial cells)表面，而β和γ受体亚基则多表达于效应性T细胞(Teff)和NK细胞。IL-2对不同受体亚基的复合物形式的亲和力不同，IL-2对α、β和γ受体亚基组成的复合体的亲和力最高，对由β和γ受体亚基组成的复合体的亲和力则为中等(约降低100倍)，IL-2与两种形式的受体亚基组合结合后均能传递信号(Minami等，AnnuRev Immunol11，245-268(1993))。
在本申请中，术语“IL-15”通常是指天然白介素-15或其功能性变体。白细胞介素15(IL-15)是一种细胞因子，可由活化的单核－巨噬细胞、表皮细胞或成纤维细胞等多种细胞产生。天然人白介素15成熟肽含有114个氨基酸，约为12-14kD，由4个α螺旋以及一些连接序列(loop)组成，并包括4个半胱氨酸残基，其中Cys35与Cys85、Cys42与Cys88连接，形成的两对分子内二硫键可以对于保持IL-15的空间构象和生物学活性起重要作用(Lowe D.C.,et al J.Mol.Biol.406:160-175，2011)，例如在本申请中(如图6所示)，IL-15中自N端到C端的4个α螺旋依次命名为螺旋a、螺旋b、螺旋c、螺旋d，螺旋ab之间的连接序列(loop，环)命名为环m，螺旋bc之间的连接序列(loop，环)命名为环x，螺旋cd间的连接序列(loop，环)命名为环n；例如，螺旋b可以包含如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，螺旋c可以包含如SEQ IDNO.11所示的氨基酸序列、环m可以包含如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，环x可以包含如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，环n可以包含如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
IL-15可在机体正常的免疫应答中发挥作用，如促进T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞的发育和增殖等。IL-15与IL-2拥有共有的IL2/15Rβ链和γ链受体，拥有不同α链受体(图7)，从而使得IL-2可以活化Treg细胞和细胞凋亡(AICD)，而同家族的IL-15则不具有Treg活化和AICD的功能(Waldmann TA et al,Nature Reviews Immunol 6:595-601,2006)，此外，由于由不同的受体亚基组成，IL-15对NK细胞增殖和维持记忆性T细胞有更明显的作用。因此本申请中利用IL-2和IL-15的特点，使用IL-15的部分序列取代IL-2中的部分序列，从而封闭与IL2Rα受体的结合，而保留与IL2/15Rβ和γ受体的结合。
在本申请中，术语“介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域”通常是指IL-15分子(包括天然IL-15分子或其功能性变体)中能够使得IL-15分子与其受体α亚基结合的序列全长或其中的一部分；所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域可以是IL-15分子多肽序列中连续的氨基酸序列，也可以是其中不连续的氨基酸序列，例如若干不相邻的氨基酸位点的组合。
在本申请中，术语“介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域”通常是指IL-2分子(包括天然IL-2分子或其功能性变体)中能够使得IL-2分子与其受体α亚基结合的序列全长或其中的一部分；所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域可以是IL-2分子多肽序列中连续的氨基酸序列，也可以是其中不连续的氨基酸序列，例如若干不相邻的氨基酸位点的组合。
在本申请中，术语“生物膜干涉技术(biolayer interferometry，BLI)”也称作生物膜层干涉技术，通常是指一种广泛应用于生物分子间的动力学实验以及定量检测实验的实验技术。例如，利用其可以实时检测生物分子之间的相互作用，从而被广泛的用于蛋白质、核酸和其他生物分子的动力学常数的测定。例如，它可提供包括结合速率常数(Ka)、解离速率常数(Kd)和亲和力常数(KD)在内的动力学信息。举例说明，其原理可以包括：生物分子A结合到生物传感器末端(例如光纤材质)可以形成一层生物膜，当传感器末端的分子A与待检测分子B结合时会引起传感器末端分子量的改变，从而导致生物膜厚度的改变。光通过传感器的生物膜层后发生透射和反射形成干涉光波，生物膜厚度的变化导致干涉光波发生相对位移。生物分子结合前后的干涉光波被光谱仪检测到，形成干涉光谱，以干涉图谱的实时位移(nm)显示出来，最后根据分子结合前后图谱的变化对待检测分子进行分析。
在本申请中，术语“天然”或“天然的”通常是指存在于自然界中的物质(例如蛋白质、核酸等化合物分子)，经过了分离、鉴定，而没有经人工改变其结构的情形。例如，“天然IL-15分子”、“天然IL-2分子”。
在本申请中，术语“变体”通常是指在天然多肽序列上进行氨基酸修饰(例如基团取代等)或者进行一个或多个氨基酸的插入、取代、和/或缺失(例如缺失一段氨基酸序列的截短体)从而得到的多肽序列。其可以全部或部分保留原天然多肽序列的功能，也可以不保留原天然多肽序列的功能，还可以具有比原天然多肽序列改进的功能(例如与相应配体或受体的亲和力提高)。其中，全部或部分保留原天然多肽序列的功能或者具有比原天然多肽序列改进的功能的变体可称为“功能性变体”例如，所述功能性变体可以比原序列具有更好的生物活性(或功能)。例如，所述保留不必是完全保留。例如，所述功能性变体可以基本保留原序列功能，例如，保留原序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，或99％的功能。例如，具有原序列105％、110％、115％、125％、140％、160％、180％、200％、230％、260％的功能。例如，所述功能性变体的氨基酸序列可以与原氨基酸序列至少70％，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同。
在本申请中，术语“C端”通常是指多肽链的两个末端之一，此末端的氨基酸残基携带游离的α羧基(—COOH)。
在本申请中，术语“N端”通常是指多肽链的两个末端之一，此末端的氨基酸残基携带游离的α氨基(—NH2)。
在本申请中，术语“自N端至C端依次包含”通常是指包含的各序列片段或元件位置顺序关系。其中各序列片段或元件不必是直接连接的。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指涉及适合施用于患者、例如人患者的组合物。例如，本申请所述的药物组合物，其可以包含本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及病毒载体等。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不限于只有这些物质。
在本申请中，术语“预防”通常是指对健康患者预防性地施用组合，以预防本申请所述疾病和病症的爆发。此外，术语“预防”指对处于待治疗变应性疾病前期的患者预防性地施用这种组合。术语“预防”不需要100％消除事件的可能性。更准确地说，它表示在所述药物组合物或方法存在下事件发生的可能性降低了。
在本申请中，术语“治疗”通常是指将治疗剂施加或给予患者，或将治疗剂施加或给予由患者分离的组织或细胞系，该患者患有疾病、具有疾病症状或疾病倾向，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、提高或影响该疾病、疾病症状或疾病倾向。可以包括改善病状态、消除病灶或改善的预后。
在本申请中，术语“肿瘤”和“癌症”通常是指在正常生长和/或发育中呈现出至少部分失去增殖控制的细胞。例如，常见的肿瘤或癌细胞通常已经失去了接触抑制并可能是入侵性的和/或具有转移的能力。
本申请的某些实施方式中，利用生物信息学和蛋白质工程学技术，将IL-2分子中主要负责与IL2Rα结合的氨基酸用IL-15的相应序列替换掉，即将IL-2分子中螺旋A和螺旋B之间的环M(SEQ ID NO.1)、螺旋B(SEQ ID NO.2)以及螺旋C和螺旋D之间的环N(SEQ IDNO.5)用IL-15的相应序列(即环m(SEQ ID NO.8)、螺旋b(SEQ ID NO.9)、环n(SEQ IDNO.12))替换掉，从而封闭IL-2与IL2Rα的结合；进一步为了提高IL-2/15嵌合体(经修饰的IL-2分子)结构的稳定性，将IL-2的螺旋B和螺旋C之间的环X(SEQ ID NO.3)、螺旋C(SEQ IDNO.4)同样用IL-15的环x(SEQ ID NO.10)、螺旋c(SEQ ID NO.11)替换，再进一步地将螺旋D中的第115位色氨酸(W)突变成苯丙氨酸(F)，目的是与引入的IL-15螺旋b中的第55位苯丙氨酸(F)形成芳香环相互作用同时稳定疏水内核，继而稳定四螺旋束结构，最终实现新形成的蛋白分子IL-2/15嵌合体不与IL2Rα受体结合，而保留了与β链和γ链受体的结合。
临床上在IL-2低剂量的条件下，是会优先和Treg细胞表面上带有α链的高亲和力受体结合，从而产生免疫抑制，达不到治疗的效果。高剂量的IL-2会通过激活大量的效应T细胞从而中和Treg激活带来的免疫抑制，同时也会出现更多的毒副作用，以及细胞凋亡(activation induced cell apoptosis)。所以本申请采用的技术方案能够减弱或消除与α受体结合，从而有减少IL-2促进抑制T细胞增殖活性的功能，同时还可减少对内皮细胞α受体的结合，从而降低或消除IL-2治疗引起的毒副作用；而IL-15没有Treg活化和AICD的功能(Waldmann TA et al,Nature Reviews Immunol 6:595-601,2006)，并且，由于不同的受体亚基组成，IL-15对NK细胞增殖和维持记忆性T细胞有更明显的作用。因此本发明利用IL-2和IL-15的特点，封闭与IL2Rα受体的结合，而保留与IL2/15Rβ和γ受体的结合。
在某些实施方式中，引入IL-2的IL-15蛋白序列可以与IL15Rα结合，所以可以将IL15Rα受体(sushi结构域)与IL-2/15嵌合体共表达形成异源二聚体复合物，可以稳定IL-2/15嵌合体的同时可以提高与IL2/15Rβ受体的亲和力，以达到更好的生物效能；进一步可在sushi结构域(如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.20)的C端融合表达Fc，可以是人IgG1Fc、人IgG4Fc或鼠IgG2aa.1Fc，以达到长效的目的。
以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
实施例1从哺乳细胞中进行IL-2/15嵌合体的制备
1.1表达质粒的合成与构建
委托苏州金唯智生物科技有限公司分别合成IL-2/15嵌合体1(SEQ ID NO.14)、sushi-hIgG1Fc(SEQ ID NO.19)、sushi-hIgG4Fc(SEQ ID NO.21)、sushi-mIgG2aa.1Fc(SEQID NO.22)4个蛋白的目的基因片段并克隆到pZD载体的EcoRI和HindIII位点之间，从而得到4个表达质粒，编号分别为PM619、PM432、PM657、PM599，在质粒PM619的基础上，按《分子克隆》描述的方法进行点突变，将第115位(对应天然IL-2分子氨基酸序列的第121位)苯丙氨酸(F)突变成色氨酸(W)，进而得到IL-2/15嵌合体2(SEQ ID NO.23)的质粒，质粒编号为PM824。然后将合成或构建的质粒分别转化DH10B、测序和保菌。
1.2质粒提取及HEK293细胞准备
1.2.1质粒提取
按照《Qiagen Mini-prep Kit》和《Qiagen Endofree Maxi-prep Kit》提到的操作方法，进行以上两种IL-2/15嵌合体和三种sushi-Fc的质粒制备。
1.2.2HEK293细胞准备
使用新鲜传代的密度为1-1.2×106/mL的HEK293细胞(National ResearchCouncil,Canada)用于瞬时表达。
1.3HEK293瞬时表达
1.3.1试剂制备
A)G418溶液：称取250mg GeneticinTM加入4.5mL超纯水溶解，超纯水定容至5mL，0.22μm滤膜过滤，-20℃保存；
B)PEI溶液：称取50mgPEI加入45mL超纯水溶解，1M NaOH调节pH至7.0，超纯水定容至50mL，0.22μm滤膜过滤，-20℃保存；
C)培养基：在1L FreeStyleTM 293Expression Medium中加入10mL、10％的PluronicdTM F-68和500μL的G418；
D)质粒提前准备在2mL去内毒素离心管中；
E)根据转染需要体积准备好新鲜传代至1-1.2×106个/mL的细胞悬液。
1.3.2配制转染试剂-质粒复合物
A液：质粒1μg/mL+Opti-MEMTM 33.3μL/mL
B液：PEI 2μg/mL+Opti-MEMTM 33.3μL/mL
将1mL的B液倒入1mL的A液混匀孵育10min后，加入细胞悬液。
将IL-2/15嵌合体1和三种sushi-Fc分别按质量比1：1混合后(总量为1μg/mL)，进行转染。将IL-2/15嵌合体2和sushi-hIgG4Fc按质量比1:1混合后(总量为1μg/mL)，进行转染。
1.3.3换液
在115rpm，36.8℃，5％CO2培养4h后，800g 5min离心，换成未添加PluronicdTM F-68和G418的FreeStyleTM 293Expression Medium。
1.3.4表达培养和收获
在115rpm，36.8℃，5％CO2培养5天后，离心8500rpm 15min，收集细胞上清纯化。
1.4纯化制备
IL-2/15嵌合体1分别和sushi-hIgG1Fc、sushi-hIgG4Fc以及sushi-mIgG2aa.1Fc共表达，在表达过程中能够形成异源二聚体的复合物，分别命名为复合物1、复合物2、复合物3，三种复合物都带有Fc标签。利用Mabselect sure(Protein A，GE healthcare)进行亲和纯化，纯化方法参照纯化填料说明书；然后再经过凝胶过滤层析(Superdex200 pg，GEHealthcare)进行进一步纯化得到纯度较高的蛋白，并去除聚合体。利用高效液相色谱分子筛柱子(SEC-HPLC)进行纯度分析，结果如图1(a～c)所示，纯化后蛋白SEC主峰为单一峰，说明IL-2/15嵌合体1和三种sushi-Fc分别都形成了复合物，且纯度较好，聚合物和片段整体小于5％，利用液相质谱法分析可见，纯化后的蛋白含有两种组分，分别为sushi-Fc和IL-2/15，说明蛋白表达及纯化成功。IL-2/15嵌合体2也和sushi-hIgG4Fc共表达形成了复合物，并被纯化出来(如图2所示)。
实施例2从大肠杆菌中制备IL-2/15嵌合体
2.1表达质粒的合成和构建
委托苏州金唯智生物科技有限公司合成IL-2/15嵌合体1基因片段(SEQ IDNO.26)，并克隆到pET41a载体的NdeI和XhoI位点之间，从而得到表达所用质粒，编号为1187。
2.2IL-2/15嵌合体在大肠杆菌中的表达以及纯化
按照《分子克隆》提到的操作方法，进行质粒提取，转化表达菌株BL21(DE3)。按照蛋白原核表达常规方法进行IL-2/15嵌合体1的表达。之后通过经典的变复性技术和层析色谱法等技术(如参见：Yunieret al,Preparative Biochemistryand Biotechnology,47:9,889-900)纯化得到较纯的嵌合体蛋白。
实施例3IL-2/15嵌合体与IL2Rα和IL2/15Rβ的结合力测定
采用生物膜干涉技术(biolayer interferometry，BLI)测定目的蛋白与受体间的亲和力，方法参见(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement ofantibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)进行。实验所用受体蛋白IL-15Rα-his、IL2Rα-his和IL2/15Rβ-Fc/Fc均为本公司生产，无IL2Rα结合IL-2衍生物和无IL2Rα结合IL-2复合物均根据专利公开文本CN111018961A的记载制备。IL-15(N72D)/sushi-hIgG1Fc复合物按照文献(K.-p.Han et al./Cytokine 56(2011)804–810)制备完成。缓冲液配方为10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.1％BSA和0.05％tween20；受体蛋白都预先分别固定化在相应的传感器上，然后按照建立的方法(参见Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigenaffinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)，以基线(baseline)，载入(loading)，基线(baseline)，联合(Association)和解离(Dissociation)的步骤进行。数据获取和分析工作分别采用Fortebio Octet RED96软件Data acquisition 11.0和Dataanalysis 11.0进行。结果如表1所示(数值越小亲和力越强)，相比于IL-2，IL-2/15嵌合体1、IL-2/15嵌合体1-sushi-Fc(复合物1、复合物2或复合物3)不与IL2Rα受体结合；相比于IL-15，IL-2/15嵌合体1与IL-15Rα受体的亲和力下降不到10倍，而复合物1、复合物2或复合物3与IL-15Rα不结合；对于与IL2/15Rβ的亲和力比较，IL-2/15嵌合体1要明显弱于IL-15，稍弱于IL-2，而复合物1、复合物2或复合物3的亲和力要强于IL-2或IL-15，但要弱于IL-15(N72D)/sushi-hIgG1Fc复合物。
表1
注：N.B.,no binding，在100nM下不结合。
实施例4促进T细胞的增殖实验
CTLL-2(T细胞)的增殖实验是普遍应用的细胞水平测定白介素刺激免疫细胞活性的实验。本实施例通过CTLL-2细胞的增殖实验检测实施例1制备的IL-2/15嵌合体1的生物活性。用含有FBS和Rat-T-Stim的培养液重悬CTLL-2细胞(购自ATCC，货号No.TIB-214TM)，将定量至21000个/孔的CTLL-2细胞接种于96孔培养板，同时将阳性对照(IL-2)和待测样品复合物1蛋白分别做倍比稀释，加入孔板中，起始工作浓度为0.0078125nM，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔(100μL细胞+100μL培养液)。37度，5％CO2孵育72小时，之后每孔加入20μlAQueous One Solution Reagent(购自Promega，货号Cat#G3581)，37℃，5％CO2孵育2～4小时，用酶标测定仪于波长490nm测吸光值(A)并计算EC50值，结果如表2及图3所示，复合物1蛋白具有明显的促进CTLL-2(T细胞)增殖活性，且活性要高于阳性对照IL-2。
表2各组EC50值
阳性对照(IL-2) 复合物1
EC50nM 0.07011 0.03469
实施例5促进Mo7e细胞的增殖实验
Mo7e细胞株(表达IL-2/15Rβ和γ受体)于37℃,5％CO2条件下培养于完全培养基(RPMI1640+10％FBS+GM-CSF(10ng/mL))。收获处于对数生长期的细胞。使用PBS洗涤细胞两次，洗掉细胞因子，然后用不含细胞因子的培养基重悬细胞。使用不含细胞因子的培养基调整细胞密度，随后接种于96孔细胞培养板，每孔接种90μL，共5000个细胞。将96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2条件下培养，待用。配制10倍药物溶液，使得最后工作浓度为0.020116μM，9个浓度，3.16倍稀释，然后转移连续稀释样品各10μL至96孔细胞板的相应实验孔中，每个药物浓度设置三个复孔。将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2条件下继续培养72小时，之后进行CTG(Celltiter Glo assay kit，Promega)分析。每孔加入等体积的CTG溶液。将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号。读取冷光值，收集数据。使用GraphPadPrism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC50值。
细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养基对照)/(Lum溶剂对照-Lum培养基对照)×100％。
本实验中hIgG1和hIgG4作为对照，都不能促进细胞的增殖。从结果上看，单独IL-2/15嵌合体1活性介于IL-15和IL-2之间，比IL-15活性低10倍左右；而IL-2/15嵌合体1与sushi的复合物活性要弱于IL-15(N72D)/sushi-hIgG1Fc复合物。由于早先的关于IL-2/15Rβγ受体激动剂在临床上出现过活性太高而导致的药物毒性，所以有可能IL-2/15嵌合体1与sushi的复合物的安全性更好。
表3促Mo7e细胞增殖实验结果
蛋白名称 EC50(nM)
IL-2 2.557
IL-15 0.267
复合物2 0.329
复合物3 0.319
IL-15(N72D)/sushi-hIgG1Fc复合物 0.090
IL-2/15嵌合体1 2.251
hIgG1对照 N/A
hIgG4对照 N/A
实施例6在食蟹猴中的预毒理试验
实验分为两个组别，分别为复合物2和IL-15(N72D)/sushi-hIgG1Fc复合物组别，每个组别随机分有雄性和雌性各一只，给药剂量为1mg/kg，静脉注射，每周给药一次，共给药两次，每天观察动物临床表现，并进行称重，分析药物是否耐受。
经过实验发现，复合物2组雌性动物在D2-D4天有黄色少量稀便，但雌雄14天的体重都比较稳定(如图4所示)，显示1mg/kg的剂量是耐受的；而IL-15(N72D)/sushi-hIgG1Fc复合物组的雌、雄动物在D3-D4天时精神不振、自发活动减少、黄色少量/中量稀便、眼窝凹陷，并在D4时死亡，显示在1mg/kg的剂量是不耐受的。
实施例7IL-2/15嵌合体复合物在小鼠皮肤黑色素瘤B16F10皮下移植C57BL/6小鼠肿瘤模型中的药效学评价
将B16F10细胞悬液5.0×106细胞/mL，吹打至均匀，置于冰上。小鼠右侧后肢剔除体毛并用碘伏棉球消毒，用1mL注射器在小鼠右侧后肢皮下接种0.1mL细胞悬液，5×105细胞/点。接种肿瘤细胞当日，依据动物体重随机分为3组，每组5只。分组当日视为实验Day0，分组后第二日(Day1)开始给药。给药及分组信息见下表4。
表4分组及给药信息
在肿瘤接种后，日常检查动物的肿瘤生长情况、活动能力、饮食、体重、眼睛、毛发和其他异常行为，并相应给予人道终点。分组给药后，每周测量2次动物肿瘤体积。肿瘤体积测量采用双向测量法，首先利用游标卡尺测量肿瘤长短径，再使用公式T＝0.5×a×b2计算肿瘤体积。a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
相对肿瘤抑制率TGI(％)：TGI＝1-T/C(％)。T/C％为相对肿瘤增殖率，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(RTV)。计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组平均RTV；CRTV：溶媒对照组平均RTV；RTV＝Vt-V0，V0为分组时该动物的瘤体积，Vt为治疗后该动物的瘤体积)。
结果如图5所示，本实验中在小鼠黑色素瘤B16F10细胞皮下接种的C57BL/6雌性小鼠模型中验证了受试药单独给药的药效。其中：G1对照组动物至Day13，动物平均肿瘤体积为2942±545.3mm3。G2复合物22mg/kg BIW给药至Day13，该组TGI％＝95％，与对照组相比呈极显著性差异(p<0.01)。G3复合物32mg/kg BIW给药至Day13，该组TGI％＝92％，与对照组相比呈极显著性差异(p<0.01)。通过数据表明，在小鼠黑色素肿瘤细胞B16F10接种的C57BL/6小鼠模型上给药13天实验中，复合物2或复合物3受试药均呈现强药效，与对照组相比都具有统计学差异(p<0.01)；而复合物2和复合物3未呈现出差异，都具有明显的抑瘤作用。

Claims (53)

1.经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰包括使用IL-15分子中介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域取代IL-2分子中介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域，所述IL-15分子中介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包含9个以上的氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰能够降低所述经修饰的IL-2分子与IL2Rα的亲和力。
3.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰能够消除所述经修饰的IL-2分子与IL2Rα的亲和力。
4.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括环M或其变体，所述环M包含如SEQ ID NO.1所示的序列。
5.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括环N或其变体，所述环N包含如SEQ ID NO.5所示的序列。
6.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括螺旋B或其变体，所述螺旋B包含如SEQ ID NO.2所示的序列。
7.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括环M或其变体、螺旋B或其变体，所述环M包含如SEQ ID NO.1所示的序列，所述螺旋B包含如SEQ ID NO.2所示的序列。
8.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括螺旋B或其变体、环N或其变体，所述螺旋B包含如SEQ ID NO.2所示的序列，所述环N包含如SEQ ID NO.5所示的序列。
9.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域包括环M或其变体、环N或其变体，所述环M包含如SEQ ID NO.1所示的序列，所述环N包含如SEQ ID NO.5所示的序列。
10.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域自N端至C端依次包含：环M或其变体、螺旋B或其变体、环N或其变体，所述环M包含如SEQ ID NO.1所示的序列，所述螺旋B包含如SEQ ID NO.2所示的序列，所述环N包含如SEQID NO.5所示的序列。
11.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括环m或其变体，所述环m包含如SEQ ID NO.8所示的序列。
12.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括环n或其变体，所述环n包含如SEQ ID NO.12所示的序列。
13.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括螺旋b或其变体，所述螺旋b包含如SEQ ID NO.9所示的序列。
14.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括环m或其变体、螺旋b或其变体，所述环m包含如SEQ ID NO.8所示的序列，所述螺旋b包含如SEQ ID NO.9所示的序列。
15.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括螺旋b或其变体、环n或其变体，所述螺旋b包含如SEQ ID NO.9所示的序列，所述环n包含如SEQ ID NO.12所示的序列。
16.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域包括环m或其变体、环n或其变体，所述环m包含如SEQ ID NO.8所示的序列，所述环n包含如SEQ ID NO.12所示的序列。
17.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域自N端至C端依次包含：环m或其变体、螺旋b或其变体、环n或其变体，所述环m包含如SEQ ID NO.8所示的序列，所述螺旋b包含如SEQ ID NO.9所示的序列，所述环n包含如SEQ ID NO.12所示的序列。
18.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环m或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环M或其变体，所述环m包含如SEQ ID NO.8所示的序列，所述环M包含如SEQ ID NO.1所示的序列。
19.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的螺旋b或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的螺旋B或其变体，所述螺旋b包含如SEQ ID NO.9所示的序列，所述螺旋B包含如SEQID NO.2所示的序列。
20.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环n或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环N或其变体，所述环n包含如SEQ ID NO.12所示的序列，所述环N包含如SEQ IDNO.5所示的序列。
21.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环m或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环M或其变体，以及，使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的螺旋b或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的螺旋B或其变体，所述环m包含如SEQ IDNO.8所示的序列，所述环M包含如SEQ ID NO.1所示的序列，所述螺旋b包含如SEQ ID NO.9所示的序列，所述螺旋B包含如SEQ ID NO.2所示的序列。
22.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的螺旋b或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的螺旋B或其变体，以及，使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环n或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环N或其变体，所述螺旋b包含如SEQID NO.9所示的序列，所述螺旋B包含如SEQ ID NO.2所示的序列，所述环n包含如SEQ IDNO.12所示的序列，所述环N包含如SEQ ID NO.5所示的序列。
23.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环m或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环M或其变体，以及，使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环n或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环N或其变体，所述环m包含如SEQ ID NO.8所示的序列，所述环M包含如SEQ ID NO.1所示的序列，所述环n包含如SEQ ID NO.12所示的序列，所述环N包含如SEQ ID NO.5所示的序列。
24.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰包括使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环m或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环M或其变体、使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的螺旋b或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的螺旋B或其变体，以及，使用所述介导IL-15分子与IL15Rα结合的区域内的环n或其变体取代所述介导IL-2分子与IL2Rα结合的区域内的环N或其变体。
25.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰使得所述经修饰的IL-2分子能够与IL15Rα或IL15Rα的sushi结构域结合。
26.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰还包括使用IL-15分子中的环x或其变体取代IL-2分子中的环X或其变体，所述环x包含如SEQ ID NO.10所示的序列，所述环X包含如SEQ ID NO.3所示的序列。
27.如权利要求1所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，所述修饰还包括使用IL-15分子中的螺旋c或其变体取代IL-2分子中的螺旋C或其变体，所述螺旋c包含如SEQ ID NO.11所示的序列，所述螺旋C包含如SEQ ID NO.4所示的序列。
28.如权利要求26或27所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，与不包含所述取代的IL-2分子相比，所述取代能够提高所述的经修饰的IL-2分子的稳定性。
29.如权利要求28所述的经修饰的IL-2分子，其特征在于，包含如SEQ ID NO.23所示的序列。
30.蛋白异二聚体，其特征在于，包括如权利要求1-29中任一项所述的经修饰的IL-2分子，以及IL15Rα或其变体。
31.如权利要求30所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述IL15Rα包含如SEQ ID NO.16所示的序列。
32.蛋白异二聚体，其特征在于，包括如权利要求1-29中任一项所述的经修饰的IL-2分子，以及IL15Rα受体的sushi结构域或其变体。
33.如权利要求32所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述sushi结构域包含如SEQ IDNO.15或SEQ ID NO.20所示的序列。
34.如权利要求30或31所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述蛋白异二聚体不与IL2Rα受体结合，并且和IL-2分子相比与IL2Rβ具有更高的亲和力，所述IL-2分子包括天然IL-2分子及其功能性变体。
35.如权利要求30所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述IL15Rα变体包含Fc片段。
36.如权利要求35所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述Fc片段位于所述IL15Rα的C端。
37.如权利要求35或36所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述Fc包括人IgG1Fc、人IgG4Fc和鼠IgG2aa.1Fc中的任意一种。
38.如权利要求36所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述Fc包含如SEQ ID NO.18所示的序列。
39.如权利要求32或33所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述蛋白异二聚体不与IL2Rα受体结合，并且和IL-2分子相比与IL2Rβ具有更高的亲和力，所述IL-2分子包括天然IL-2分子及其功能性变体。
40.如权利要求32所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述sushi结构域变体包含Fc片段。
41.如权利要求40所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述Fc片段位于所述sushi结构域的C端。
42.如权利要求40或41所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述Fc包括人IgG1Fc、人IgG4Fc和鼠IgG2aa.1Fc中的任意一个。
43.如权利要求41所述的蛋白异二聚体，其特征在于，所述Fc包含如SEQ ID NO.18、SEQID NO.24或SEQ ID NO.25所示的序列。
44.如权利要求41所述的蛋白异二聚体，其特征在于，包含如SEQ ID NO.23所示的序列，以及如SEQ ID NO.21所示的序列。
45.核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-29中任一项所述的经修饰的IL-2分子。
46.核酸分子组合，其特征在于，其编码a)权利要求1-29中任一项所述的经修饰的IL-2分子，以及b)权利要求30-44中的任一项中所述的IL15Rα或其变体，或所述的sushi结构域或其变体。
47.载体，其特征在于，包含权利要求45所述的核酸分子，或权利要求46所述的核酸分子组合。
48.如权利要求47所述的载体，其特征在于，编码权利要求1-29中任一项所述的经修饰的IL-2分子的核酸分子与编码权利要求30-44中的任一项中所述的IL15Rα或其变体，或所述的sushi结构域或其变体的核酸分子位于同一载体中。
49.如权利要求48所述的载体，其特征在于，包括第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码权利要求1-29中任一项所述的经修饰的IL-2分子的核酸分子，所述第二载体包含编码权利要求30-44中的任一项中所述的IL15Rα或其变体，或所述的sushi结构域或其变体的核酸分子。
50.细胞，其特征在于，包含权利要求1-29中任一项所述的经修饰的IL-2分子、权利要求30-44中任一项所述的蛋白异二聚体、权利要求45所述的核酸分子、权利要求46所述的核酸分子组合或权利要求47-49中任一项所述的载体。
51.药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-29中任一项所述的经修饰的IL-2分子、权利要求30-44中任一项所述的蛋白异二聚体、权利要求45所述的核酸分子、权利要求46所述的核酸分子组合、权利要求47-49中任一项所述的载体或权利要求50中所述的细胞。
52.权利要求1-29中任一项所述的经修饰的IL-2分子、权利要求30-44中任一项所述的蛋白异二聚体、权利要求45所述的核酸分子、权利要求46所述的核酸分子组合、权利要求47-49中任一项所述的载体、权利要求50中所述的细胞用于制备药物的用途，其特征在于，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
53.如权利要求52所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括肛门癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、实体瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、小细胞肺癌、胸腺癌、甲状腺癌、结肠癌和/或黑色素瘤。
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