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CN118562875B - RhTIP1;1蛋白及其编码基因在月季花瓣脱落/活性氧积累调控中的应用 - Google Patents

RhTIP1;1蛋白及其编码基因在月季花瓣脱落/活性氧积累调控中的应用 Download PDF

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CN118562875B CN202411035592.0A CN202411035592A CN118562875B CN 118562875 B CN118562875 B CN 118562875B CN 202411035592 A CN202411035592 A CN 202411035592A CN 118562875 B CN118562875 B CN 118562875B
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Abstract

本发明公开了一种RhTIP1;1蛋白及其编码基因在月季花瓣脱落/活性氧积累调控中的应用，所述RhTIP1;1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明从月季基因组数据库中筛选出8个TIP基因，并在月季花瓣中鉴定出液泡膜水通道蛋白RhTIP1;1基因，经研究发现RhTIP1;1基因的沉默使花瓣从5级到完全脱落的速度延缓。此外，在RhTIP1;1沉默的花瓣中，离层中的活性氧积累也显著减少。本发明的研究结果揭示了RhTIP1;1在花瓣脱落中的作用，为调控植物花瓣脱落尤其是月季鲜切花的采后保鲜提供了新的思路和技术手段，开辟了新的花朵调控研究领域，具有重大的学术价值和重要的生产应用前景。

Description

RhTIP1;1蛋白及其编码基因在月季花瓣脱落/活性氧积累调 控中的应用
技术领域
本发明涉及一种RhTIP1;1蛋白及其编码基因在月季花瓣脱落/活性氧积累调控中的应用，属于分子生物技术领域。
背景技术
花卉产业是大农业的重要组成部分，集经济、社会、生态效益于一体的绿色产业。发展花卉产业，对增加农民收入、提高人民生活质量，具有重大的意义。鲜切花是花卉产业中最重要的产品，月季在全球四大切花中居于首位。我国切花月季生产主要集中在云南和广东等气候适宜地区，而消费主要在北京、上海、广州等大中城市。因此，月季切花的供给主要依赖于长距离运输。然而，月季切花极不耐长距离运输，采后流通中的损耗通常超过30%，有时甚至高达50%，采后贮运损耗大已经成为制约我国月季切花产业提质增效的瓶颈问题。因此，培育耐贮运新品种和研发高效采后保鲜技术是突破“月季切花采后损耗高”这一产业瓶颈的有效途径，而花瓣衰老关键基因的挖掘及其生物学机制的解析是品种改良和技术创新的理论基础。
花瓣衰老从外部形态上看，主要表现为萎蔫、脱落和花色改变等。越来越多的证据表明，活性氧（ROS） 在调控脱落中起着关键作用。首先，不同物种在脱落过程中存在大量的ROS 积累，如木薯和棉花的叶片脱落、拟南芥的花瓣脱落等。ROS 并非只有一种物质，而是一类分子的总称，包括羟基自由基、单线态氧、过氧化氢（H2O2）和超氧自由基。
液泡膜固有蛋白（Tonoplast intrinsic proteins, TIPs) 属于水通道蛋白的一个亚家族，在促进水和不带电的小分子通过色质体膜的过程中起着至关重要的作用。有报道证明TIPs可以转运尿素、氨、甘油及H2O2等小分子。通过酵母存活试验筛选植物 TIPs 的研究表明，AtTIP1;1、AtTIP1;2 和 AtTIP2;3 可以转运 H2O2。然而，TIPs是否参与花瓣脱落及是否介导离层ROS积累仍不清楚。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是在月季花瓣中鉴定出一个水通道蛋白RhTIP1;1，编码其蛋白的基因表达随着花瓣衰老进程的发生而下降，且其表达影响离层中活性氧的积累，进而发现RhTIP1;1基因是影响花瓣脱落中重要的蛋白。
技术方案：本发明的RhTIP1;1蛋白在月季花瓣脱落/活性氧积累调控中的应用，所述RhTIP1;1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的编码上述RhTIP1;1蛋白的RhTIP1;1基因或其特异性片段在月季花瓣脱落/活性氧积累调控中的应用，所述RhTIP1;1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示，所述RhTIP1;1基因的特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
进一步地，所述月季品种为‘萨曼莎’。
本发明的包含RhTIP1;1基因或其特异性片段的沉默载体、RhTIP1;1基因或其特异性片段的沉默菌株在月季花瓣脱落/活性氧积累中的应用，所述RhTIP1;1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述RhTIP1;1基因的特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
进一步地，所述沉默载体包括将所述RhTIP1;1基因或其特异性片段构建到载体pTRV-2中得到。
进一步地，将所述RhTIP1;1基因的特异性片段构建到载体中所用的引物为序列如SEQ ID NO.25~26所示。
进一步地，所述RhTIP1;1基因或其特异性片段的沉默菌株是将所述RhTIP1;1基因或其特异性片段的沉默载体导入农杆菌中得到。
进一步地，所述农杆菌为GV3101。
本发明的延长月季花朵开放时间的方法，所述方法包括抑制或下调月季RhTIP1;1蛋白的表达或活性来延长月季花朵开放时间，所述RhTIP1;1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
进一步地，所述下调月季RhTIP1;1蛋白的表达或活性包括：在月季的基因组中敲除或沉默RhTIP1;1基因；或下调RhTIP1;1基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入月季中，或采用RhTIP1;1基因缺失的月季品种与普通月季品种进行杂交，所述RhTIP1;1基因序列如SEQ ID NO.1或2所示。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明从月季基因组数据库中筛选出8个TIP基因，并在月季花瓣中鉴定出液泡膜水通道蛋白RhTIP1;1基因，经研究发现RhTIP1;1基因的沉默使花瓣从5级到完全脱落的速度延缓。此外，在RhTIP1;1沉默的花瓣中，离层中的活性氧积累也急剧减少。本发明的研究结果揭示了RhTIP1;1在花瓣脱落中的作用，为调控植物花瓣脱落尤其是月季鲜切花的采后保鲜提供了新的思路和技术手段，开辟了新的花朵调控研究领域，具有重大的学术价值和重要的生产应用前景。
附图说明
图1 显示了RhTIP1;1基因的筛选及获得。(A). 月季与拟南芥TIP家族基因进化树分析。（B）月季TIP基因家族各成员基因半定量检测。
图2显示了RhTIP1;1在花朵不同开放阶段的表达检测。以RhUBI2为内对照。所有数值均为5个生物重复的平均值±SD。图中展示经Tukey-Kramer检验，字母表示差异显著（P<0.05）。
图3显示了RhTIP1;1沉默影响花瓣的脱落进程。 (A)记录对照(TRV)和沉默植物(TRV-RhTIP1;1)的开花表型，并在不同时间点拍照。(B) 采用qRT-PCR方法检测了RhTIP1;1沉默植株(TRV-RhTIP1;1)和TRV对照植株中RhTIP1;1的表达。(C)花朵从5 级到花瓣完全脱落的开放天数。图中展示经Student’s t-test检验的结果，其中星号表示差异有统计学意义(***P<0.001)。
图4显示了RhTIP1;1沉默可以降低花瓣离层中的活性氧积累。(A) RhTIP1;1沉默植株(TRV-RhTIP1;1)和TRV对照植株离层中ROS积累情况。(B) 对 (A)中荧光结果进行量化分析。图中展示经Student’s t-test检验的结果，其中星号表示差异有统计学意义(****P<0.0001)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是一种转录后基因沉默技术，作为一种有效的反向遗传学技术已经广泛应用于植物基因工程的研究中，其中较为常用的病毒载体为烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）。TRV由两个载体pTRV1和pTRV2共同行使功能。本发明的载体pTRV-1和 pTRV-2由清华大学刘玉乐教授赠与。在本发明中将对照pTRV-1和 pTRV-2的组合命名为TRV，将pTRV-1和 pTRV-2- RhTIP1;1的组合命名为TRV- RhTIP1;1。
实施例1 RhTIP1;1基因的筛选和序列分析
本发明利用拟南芥中TIP基因，在月季(Rosa hybrida‘Samantha’)基因组数据库(https://lipmbrowsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/)中使用Blast进行比对，并结合NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中的注释，最后筛选得到8个TIP基因（图1）。
使用热硼酸盐法从月季花瓣中提取总RNA (Ma, N., Tan, H., Liu, X., Xue,J., Li, Y.,&Gao, J. (2006). Transcriptional regulation of ethylene receptorand CTR genes involved in ethylene-induced flower opening in cut rose (Rosahybrida) cv. Samantha. Journal of experimental botany, 57(11), 2763–2773)。用HiScript III逆转录酶 (Vazyme) 从1μg总RNA中得到cDNA。以cDNA为模板，利用引物RhTIP1;1-RT-F(SEQ ID NO .4)和 RhTIP1;1-RT-R(SEQ ID NO.5); RhTIP1;3-1-RT-F(SEQ ID NO.6), RhTIP1;3-1-RT-R (SEQ ID NO.7); RhTIP1;3-2-RT-F (SEQ ID NO.8),RhTIP1;3-2-RT-R (SEQ ID NO.9); RhTIP2;1-RT-F (SEQ ID NO.10), RhTIP2;1-RT-R(SEQ ID NO.11); RhTIP2;2-RT-F (SEQ ID NO.12), RhTIP2;2-RT-R (SEQ ID NO.13);RhTIP3;1-RT-F (SEQ ID NO.14), RhTIP3;1-RT-R (SEQ ID NO.15); RhTIP4;1-RT-F(SEQ ID NO.16), RhTIP4;1-RT-R (SEQ ID NO.17); RhTIP5;1-RT-F (SEQ ID NO.18),RhTIP5;1-RT-R (SEQ ID NO.19)分别扩增8个TIP基因。最终从‘萨曼莎’花瓣cDNA 中只扩增出与拟南芥TIP1;1基因亲缘关系最近的基因RchiOBHm_Chr3g0470701（命名为RhTIP1;1）结果见图1B。RchiOBHm_Chr3g0470701的全长序列参见SEQ ID NO.1。RchiOBHm_Chr3g0470701的ORF长度为762 bp (参见SEQ ID NO.2)，可编码一个含253个氨基酸的蛋白（参见SEQ ID NO.3）。
PCR扩增：
将PCR管置于PCR仪中，执行PCR扩增反应程序如下：
实施例2 RhTIP1;1基因表达含量的检测
根据之前发表文章定义花开放阶段(Ma, N., Cai, L., Lu, W., Tan, H.,&Gao,J. (2005). Exogenous ethylene influences flower opening of cut roses (Rosahybrida) by regulating the genes encoding ethylene biosynthesis enzymes.Science in China. Series C, Life sciences, 48(5), 434–444. https://doi.org/10.1360/062004-37) , Stage 1，花朵萼片裂开，露出花瓣；Stage 2，花朵萼片完全张开，花瓣未张开；Stage 3，级花朵开放初期，呈杯状；Stage 4，花朵，花瓣完成扩张，接近开放至最大花径，但未露花心；Stage 5，花朵漏出花心。待月季分别开放至S1、S3和S5阶段后采集月季花瓣，提取月季的总RNA，检测RhTIP1;1基因的表达水平。荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Low ROX Premixed)试剂 (Vazyme) 在AppliedBiosystems StepOnePlusTM实时定量PCR系统中进行反应。以RhUBI2基因作为内对照，至少3 个生物学重复。用2-ΔΔCT法计算相关基因表达。其中，定量引物包括：RhTIP1;1-qRT-F(SEQ ID NO.20)，RhTIP1;1-qRT-R (SEQ ID NO.21); RhUBI2-qRT-F (SEQ ID NO.22)，RhUBI2-qRT-R (SEQ ID NO.23)。
结果如图2所示，RhTIP1;1的转录水平随花朵开放级数增加而降低，这表明RhTIP1;1可能参与花瓣衰老脱落过程，并且在花朵衰老阶段发挥主要作用。
实施例3 RhTIP1;1的沉默
月季‘萨曼莎’组培苗培养在含1.0 mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、0.05 mg/Lα-萘乙酸(NAA)和3 mg/L赤霉素(GA3)的MS培养基上，在22 ± 1℃，长日照(光照16h/黑暗8h)条件下培养至四周龄。将四周龄的小苗移至含有0.1 mg/L NAA的1/2MS培养基上生根。接下来，将生根幼苗移栽到蛭石与泥炭苔藓的1:1比例的培养土中，在22 ± 1℃，相对湿度～60％，长日照(光照16h/黑暗8h)的条件下继续培养。
实验方法参考本发明人之前的研究(Tian, J., Pei, H., Zhang, S., Chen,J., Chen, W., Yang, R., Meng, Y., You, J., Gao, J.,&Ma, N. (2014). TRV-GFP: amodified Tobacco rattle virus vector for efficient and visualizable analysisof gene function. Journal of experimental botany, 65(1), 311–322.)。具体地说，利用含有EcoR I和BamH I酶切位点插入400 bp的RhTIP1;1 特异性片段 (ORF区201 bp和3’非翻译区199 bp) 构建pTRV2- RhTIP1;1载体，序列如SEQ ID NO.24。引物为RhTIP1;1-TRV-F (SEQ ID NO.25)，RhTIP1;1-TRV-R (SEQ ID NO.26)。PCR条件同实施例1。
分别将pTRV-1、pTRV-2、pTRV-2-RhTIP1;1载体转化进根癌农杆菌菌株GV3101中，在添加50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平的Luria-Bertani (LB) 培养基中生长至菌斑直径约1 mm，接着在28℃，200 rpm的液体培养基中振荡14 h，4000 rpm离心收集农杆菌细胞，重悬在渗透缓冲液 (10 mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(2-(N-Morpholino) ethanesulfonicacid, MES)，200 mM乙酰丁香酮 (acetosyringone) 和10 mM氯化镁 (MgCl2)，pH 5.6)，菌的终浓度为OD600＝0.8-1.0。
将携带pTRV-1载体和 pTRV-2-RhTIP1;1载体的农杆菌菌液以1:1 (v/v) 的比例混合作为实验组（TRV- RhVPE1），(对照组为携带pTRV-1和 pTRV-2载体的农杆菌以1:1 (v/v) 的比例混合的混合菌液)，在室温条件下黑暗培养3～4 h。将月季幼苗浸泡在含有上述农杆菌菌液的渗透缓冲液中，置于-25KPa真空中转化5 min。去离子水冲洗试管苗，然后在8℃黑暗中培养3天。移栽至培养土中，在22 ± 1℃、相对湿度60％、长日照(光照16 h/黑暗8h)条件下生长。培养40天。
1、首先对1级花朵的花朵表型进行持续监测。RhTIP1;1沉默植株TRV- RhTIP1;1与TRV对照植株开花过程的差异表现在5级(完全开放蕾期)到完全脱落(图3A)，开花时间可从TRV对照植株的3.6 ± 0.5天延长到RhTIP1;1沉默植株的6.3 ± 0.8天，延长了约75％(图3C)。
参照实施例2中的qRT-PCR体系和程序，在花朵处于2级时取样，对RhTIP1;1的相对表达量进行检测。与TRV对照相比，RhTIP1;1沉默的花瓣中RhTIP1;1的表达降低了46.7％，表明RhTIP1;1沉默的植株可以用于后续的研究(图3B)。
2、离层荧光检测
（1）花瓣离区的徒手切片：从月季切花或组培苗植株子房下2 cm剪下花朵，摘除萼片，去除4/5的花瓣，用锋利的双面刀片将剩余花瓣切除，留下1 mm左右花瓣基部粘连于花托上，再将子房纵向切开，用尖头摄子快速去除雌、雄蕊，最后留取花瓣和花托连接处为离区样本。
（2）荧光检测：将离区组织放置于2 μM DCFH-DA溶液中浸泡，室温避光孵育15-30min后用清水漂洗2次，洗去组织表层残留的多余探针。将载玻片滴上清水，摄子夹住离区薄片小心放在载玻片上展平，用盖玻片迅速固定，立即用激光共聚焦扫描显微镜（OlympusDP73）观察并扫描拍照，激发波长：488 nm，发射波长：515-530 nm。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
与TRV对照相比，RhTIP1;1沉默的花瓣离层中活性氧信号显著降低（图4A），降低了约91.7％（图4B）。
综上所述，液泡膜水通道蛋白RhTIP1;1在调控花瓣脱落进程中发挥着重要的作用。

Claims (9)

1.一种RhTIP1;1蛋白在月季花瓣脱落或活性氧积累调控中的应用，其特征在于，所述RhTIP1;1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述月季品种为‘萨曼莎’。
2.编码权利要求1所述RhTIP1;1蛋白的RhTIP1;1基因或其特异性片段在月季花瓣脱落或活性氧积累调控中的应用，其特征在于，所述RhTIP1;1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述RhTIP1;1基因的特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述月季品种为‘萨曼莎’。
3.一种包含RhTIP1;1基因或其特异性片段的沉默载体、RhTIP1;1基因或其特异性片段的沉默菌株在月季花瓣脱落或活性氧积累中的应用，其特征在于，所述RhTIP1;1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述RhTIP1;1基因的特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述月季品种为‘萨曼莎’。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述沉默载体包括将所述RhTIP1;1基因或其特异性片段构建到载体pTRV-2中得到。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述RhTIP1;1基因的特异性片段构建到载体中所用的引物为序列如SEQ ID NO.25~26所示。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述RhTIP1;1基因或其特异性片段的沉默菌株是将所述RhTIP1;1基因或其特异性片段的沉默载体导入农杆菌中得到。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述农杆菌为GV3101。
8.一种延长月季花朵开放时间的方法，其特征在于，所述方法包括抑制或下调月季RhTIP1;1蛋白的表达或活性来延长月季花朵开放时间，所述RhTIP1;1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述月季品种为‘萨曼莎’。
9.根据权利要求8所述的延长月季花朵开放时间的方法，其特征在于，所述下调月季RhTIP1;1蛋白的表达或活性包括：在月季的基因组中敲除或沉默RhTIP1;1基因；或下调RhTIP1;1基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入月季中，或采用RhTIP1;1基因缺失的月季品种与普通月季品种进行杂交，所述RhTIP1;1基因序列如SEQ ID NO.1或2所示。
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修剪对月季生长发育的影响;迟东明;果朋忠;岳玲;;吉林蔬菜;20090425(第02期);88-89 *

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