CN118562829A - 一种木薯MeMYB基因、病毒诱导基因沉默及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种木薯MeMYB基因，来自木薯品种SC9品种，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。以华南9号（SC9）木薯叶片cDNA为模板，采用木薯MeMYB基因的全长扩增引物，其中正向引物F（5’‑3’）为ATGGGTCGATCGCCATGCTG，反向引物R（5’‑3’）为TTAGAAGATGGGCGAATCTG，通过沉默MeMYB基因导致叶片花青素含量显著上升的发现，有助于深化对MeMYB类转录因子在木薯花青素合成途径中的作用机制的理解，本发明MeMYB基因的沉默效果均较为显著，MeMYB在该基因的沉默株中的相对表达与对照相比分别为0.58、0.36、0.45，沉默效率分别为42%、64%、55%。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及木薯MeMYB基因、病毒诱导基因沉默及应用。
背景技术
花青素（anthocyanidin）又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，它广泛存在于植物的花、果实、茎、叶、根等器官，花青素使植物呈现五彩缤纷的颜色。花青素可分为天竺葵色素、矢车菊色素、芍药色素、飞燕草色素、牵牛色素和锦葵色素，其生物合成途径是类黄酮合成途径的一个分支，同时受多个结构基因调控，如查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄烷酮三羟化酶（F3H）、花青素合成酶（ANS）、花青素还原酶（ANR）等。除此之外，花青素的合成还受到转录因子的调控，主要有MYB、bHLH、bZIP 和WD40四类转录因子，其中MYB类转录因子形成的复合体WD40-bHLH-MYB是花青素合成的主要调控因子之一。
木薯(Manihot esculenta Crantz，Cassava)是世界三大薯类、六大粮食作物之一，全球约10亿人口的主要粮食，其叶片可作为饲料加工原料，也可饲养木薯蚕。木薯叶片中含有丰富的抗氧化物质，如类胡萝卜素、类黄酮等，其中花青素（以矢车菊素计）高达124.0 mg/hg，是医药和健康食品重要原料来源。紫色木薯叶片富含花青素，因此作为木薯蚕饲料具有较大潜力。目前有关木薯叶片花青素合成与调控的机制研究较少，仅有研究发现MeANR基因可能是木薯叶片花青素生物合成的一个负调控基因，但其具体的调控作用机制尚未明晰。深入挖掘调控木薯花青素合成的转录因子，进而探究木薯叶片花青素合成的分子机制，为木薯叶色改良及新品种培育提供理论依据。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明主要目的是采用特定的引物，通过PCR方法扩增获得含有碱基序列1194 bp片段的木薯MeMYB基因。
为实现上述目的，采用以下技术方案：提供一种木薯MeMYB基因，来自木薯品种SC9品种，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
优选地，以华南9号（SC9）木薯叶片cDNA为模板，采用木薯MeMYB基因的全长扩增引物，其中正向引物F（5’-3’）为ATGGGTCGATCGCCATGCTG，反向引物R（5’-3’）为TTAGAAGATGGGCGAATCTG。
优选地，木薯MeMYB基因的亚细胞定位引物的基因正向引物F（5’-3’）为agtggtctctgtccagtcct ATGGGTCGATCGCCATGCTG，反向引物R（5’-3’）为ggtctcagcagaccacaagt TTAGAAGATGGGCGAATCTG。
本发明另一目的在于提供一种病毒诱导基因沉默系统，筛选扩增后的木薯MeMYB基因特异性片段，300 bp MeMYB DNA片段序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，木薯MeMYB的VIGS沉默片段扩增的正向引物F（5’-3’）为GCCGCAGCGGTCTCTTGATG，反向引物R（5’-3’）为ATATGATGATCTGAATTTCC。
优选地，木薯MeMYB实时荧光定量PCR引物的正向引物F（5’-3’）为AATACTGTCGGTGGTCCTA，反向引物R（5’-3’）为CTGAGAATGTTAGAGAAGATGTTG。
本发明再一目的在于提供引物扩增出的基因片段或VIGS沉默片段在提高木薯叶片花青素含量中的应用。
本发明再一目的在于提供引物扩增出的基因片段在调控MeANR基因中的应用。
优选地，木薯MeMYB转录因子可调控MeANR启动子的活性。
优选地，将MeANR基因的启动子和MeMYB转录因子序列分别连接在pNC-Green-Luc及pNC-Green-SubN载体上，将构建成功的双荧光素酶瞬时表达载体导入含有Psoup19的农杆菌感受态，经过菌液PCR检测正确后，按照组合SubN/LUC、SubN/MeANR:LUC、MeMYB:SubN/LUC、MeMYB:SubN/MeANR:LUC将混合菌液等体积混合后注射烟草叶片，2 d后注射反应底物，置于活体成像仪观测荧光素酶信号。
本发明具有以下的有益效果：
（1）提高对木薯叶片花青素合成的理解：通过沉默MeMYB基因导致叶片花青素含量显著上升的发现，有助于深化对MeMYB类转录因子在木薯花青素合成途径中的作用机制的理解，对于进一步研究花青素生物合成途径和调控机制具有重要意义。
（2）推动木薯花青素遗传改良：通过研究MeMYB基因对叶片花青素含量的影响，可为木薯遗传改良领域提供了新的思路和方法。这种遗传调控策略有助于培育出花青素含量更高的木薯品种，在农业生产和保健领域带来新的应用前景。
（3）本发明从调控结构基因的转录因子MeMYB出发，研究其对花青素含量的影响，转录因子调控的基因很多，该基因的效果选大于单个基因MeANR，这对探索花青素合成的调控作用方面具有创新性。
（4）本发明MeMYB基因的沉默效果均较为显著，MeMYB在该基因的沉默株中的相对表达与对照相比分别为0.58、0.36、0.45，沉默效率分别为42%、64%、55%。
附图说明
图1为MeMYB基因在SC9木薯品种中PCR电泳结果。
图2为MeMYB亚细胞定位结果。
图3为MeMYB沉默株系叶片表型。
图4为沉默株系中MeMYB的相对表达情况。
图5为MeMYB转录因子与MeANR启动子作用分析。
图6为木薯MeMYB基因核苷酸序列SEQ ID No：1。
图7为病毒诱导基因沉默系统300 bp MeMYB DNA片段序列SEQ ID NO：2。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 木薯MeMYB基因（Manes.01G093300）的获得
以华南9号（SC9）木薯叶片cDNA为模板，采用表1中的引物，通过PCR方法扩增获得的含有碱基序列1194 bp的片段（电泳图如图1所示），其在木薯品种SC9中的序列如SEQ IDNo：1所示。扩增体系：Mix 25μl：cDNA 1μl，10 μM引物F 1μl，10 μM引物R 1μl，ddH2O，22 μl。其反应程序为：95℃，5min；95℃，30s，56℃，30s，72℃，60s，进行35个循环；72℃，10min。
实施例2 木薯MeMYB的亚细胞定位
根据MeMYB基因CDS序列设计S带接头的引物（表2），以阳性克隆质粒为模板进行扩增，扩增产物经切胶回收纯化后使用Nimble Cloing Mix试剂将其连接pNC-Green-SubN表达载体中，构建植物表达载体pNC-Green-SubN-MeMYB，然后转化大肠杆菌感受态细胞，37℃过夜培养。挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液送至广州艾基生物技术有限公司测序。经测序比对分析后，选取正确的阳性克隆质粒转化农杆菌GV3101-psoup感受态细胞，使用瞬时转化法分别将pNC-Green-SubN-MYB和空载pNC-Green-SubN（对照）转入烟草叶片中。3天后使用激光共聚焦显微镜（TCS SP8，徕卡）观察荧光信号在烟草叶片细胞中的分布情况。结果如图2所示，MeMYB定位在细胞核中，与网站预测结果一致。
通过VIGS-Tool在线软件筛选300 bp MeMYB的特异性片段，300 bp MeMYB DNA片段如SEQ ID NO：2所示。用Primer5.0设计特异性扩增引物，并引物两端加20bp NC载体的通用接头序列。其扩增引物见表3之后进行序列扩增、回收。使用Nimble Cloing Mix试剂将其连接到pCsCMV-NC载体中。先将PCR回收产物与pCsCMV-NC空载质粒混合，加入5ul Mix，用移液枪吹打10-20次，充分混匀，50℃反应40min后，将5ul反应产物转化大肠杆菌感受态TOP10，后挑取单克隆进行培养、菌液PCR鉴定、阳性克隆测序，若最终测序结果比对正确则表示载体构建完成，得到含MeMYB基因片段的pCsCMV-MeMYB重组载体。
构建好的重组载体需要转化到GV3101-pSoup-p19农杆菌感受态中，经PCR检测正确后，将菌液在28°C培养箱中扩大培养，OD600值达到08-1.0后，于5000rpm离心10min收集菌体，用含有10mM MES、10mM MgCl2和100μM乙酰丁香酮液体清洗2遍，离心收集菌体，使用含有10mM MES、10mM MgCl2和100μM乙酰丁香酮液体重悬农杆菌至OD600至0.8左右，黑暗静置2-3小时。使用注射器将菌液注入SC9木薯叶片背面，置于室温生长22天后（其表型如图3），与对照相比，CsCMV-MYB沉默植株（pCsCMV- MYB载体转染植株）新生叶片颜色变紫，且每个重复间紫色程度不同。提取叶片总RNA，经过反转录后获得cDNA，利用测序引物CsCMV-F:TGGGCGCTAATTAGTTTACTGCA，CsCMV-R: GGTCAAGACGGCTCAACTCTTCA检测正确后，以MeActin为内参基因，使用MeMYB定量引物（表4），通过实时荧光定量PCR检测沉默株系中MeMYB的表达情况。qRT-PCR采用TaKaRa公司生产的SYBR试剂盒（RR820A），按说明在Thermo FisherScientific公司生产的 Real-time Thermal Cycler上操作。反应程序为：95 ℃预变性30s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40 个循环。每个样品重复 3 次，相对表达量按ΔΔCT法进行计算。沉默株系中MeMYB的相对表达情况如图4所示，具体的沉默效率见表5。
可见MeMYB基因的沉默效果均较为显著，MeMYB在该基因的沉默株中的相对表达与对照相比分别为0.58、0.36、0.45，沉默效率分别为42%、64%、55%。
实施例4 沉默植株叶片花青素含量测定
叶片中总花青素含量测定参照试剂盒分光法（G0126F，格锐思，苏州），具体操作如下所示：称取新鲜的木薯叶片约0.1g，加入1mL 提取液，75℃震荡提取25min，室温12000rpm，离心10 min，上清液待测。可见分光光度计预热30min以上，用蒸馏水调零。在EP管中依次加入测定管（上清液200 μl，试剂一600 μl），对照管（上清液200 μl，试剂二600 μl），室温避光平衡60min，取全部澄清液体至比色皿中，于530nm和700nm处读值。测定管记作A测定=A530-A700；对照管记作A对照=A530-A700；△A=A测定-A对照(每个样本需做一个自身对照)。最后按照公式计算各样品中总花青素含量。植株嫩叶叶片内总花青素含量如表6所示，可见沉默MeMYB后，叶片中花青素含量显著上升。
实施例5 MeMYB对MeANR的调控关系
前期研究发现MeANR是一个参与木薯叶片花青素合成的负调控基因，为了验证MeMYB转录因子是否会调控该基因的表达，采用烟草双荧光素酶瞬时表达系统，验证MeMYB转录因子是否可以调控MeANR启动子的活性。将MeANR基因的启动子和MeMYB转录因子序列分别连接在pNC-Green-Luc及pNC-Green-SubN载体上。将构建成功的双荧光素酶瞬时表达载体导入含有Psoup19的农杆菌感受态，经过菌液PCR检测正确后，按照组合SubN/LUC、SubN/MeANR:LUC、MeMYB:SubN/LUC、MeMYB:SubN/MeANR:LUC将混合菌液等体积混合后注射烟草叶片。2 d后注射反应底物，置于活体成像仪观测荧光素酶信号（图5）。从图5可以看出，MeMYB可调控MeANR启动子的活性。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
Claims (7)
1.一种木薯MeMYB基因，其特征在于：来自木薯品种SC9品种，其核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示；全长扩增引物的正向引物F（5’-3’）为ATGGGTCGATCGCCATGCTG，反向引物R（5’-3’）为TTAGAAGATGGGCGAATCTG。
2.根据权利要求1所述的木薯MeMYB基因，其特征在于：木薯MeMYB基因的亚细胞定位引物的基因正向引物F（5’-3’）为agtggtctctgtccagtcct ATGGGTCGATCGCCATGCTG，反向引物R（5’-3’）为ggtctcagcagaccacaagt TTAGAAGATGGGCGAATCTG。
3.一种病毒诱导基因沉默系统，其特征在于：筛选权利要求1所述扩增引物扩增后的木薯MeMYB基因特异性片段，300 bp MeMYB DNA片段序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求3所述病毒诱导基因沉默系统，其特征在于：木薯MeMYB的VIGS沉默片段扩增的正向引物F（5’-3’）为GCCGCAGCGGTCTCTTGATG，反向引物R（5’-3’）为ATATGATGATCTGAATTTCC。
5.根据权利要求3所述病毒诱导基因沉默系统，其特征在于：木薯MeMYB实时荧光定量PCR引物的正向引物F（5’-3’）为AATACTGTCGGTGGTCCTA，反向引物R（5’-3’）为CTGAGAATGTTAGAGAAGATGTTG。
6.根据权利要求1引物扩增出的基因片段或者权利要求4所述的VIGS沉默片段在提高木薯叶片花青素含量中的应用。
7.根据权利要求1引物扩增出的基因片段在调控MeANR基因中的应用，其特征在于：木薯MeMYB转录因子可调控MeANR启动子的活性。
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