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CN118557807A - 一种用于肩袖止点损伤修复的可注射式功能化水凝胶 - Google Patents

一种用于肩袖止点损伤修复的可注射式功能化水凝胶 Download PDF

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CN118557807A
CN118557807A CN202410569403.1A CN202410569403A CN118557807A CN 118557807 A CN118557807 A CN 118557807A CN 202410569403 A CN202410569403 A CN 202410569403A CN 118557807 A CN118557807 A CN 118557807A
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rotator cuff
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邵振兴
付浩
梁子彧
陈海峰
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Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
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Abstract

本发明涉及一种用于肩袖止点损伤修复的可注射式功能化水凝胶，该水凝胶通过原料交联得到；所述原料包括第一材料、第二材料和第三材料；所述第一材料选自丝素蛋白或甲基丙烯酰化多臂聚乙二醇，所述第二材料包括甲基丙烯酰化透明质酸，所述第三材料包括多巴胺接枝透明质酸或多巴胺接枝氧化透明质酸。该水凝胶具有良好的生物相容性和组织粘合能力，并且其力学特性能够均匀分布肩袖止点处手术缝线的张力，显著改善肩袖止点处的腱‑骨愈合。

Description

一种用于肩袖止点损伤修复的可注射式功能化水凝胶
技术领域
本发明涉及医学材料技术领域，具体涉及一种用于肩袖止点损伤修复的可注射式功能化水凝胶。
背景技术
肩袖撕裂是肩关节最常见的一种运动损伤和退行性疾病，通常都发生在止点区域，一旦发生会造成肩关节疼痛、僵硬、力弱，甚至丧失关节功能。针对肩袖撕裂最有效的治疗方法是手术修复，但肩袖修复术后止点的腱-骨愈合不良以及再撕裂仍然是一个亟待解决的难题。随着组织工程技术的不断发展，研究者们尝试了若干的技术和方法试图来解决这一难题，但至今仍然没有一种公认有效的治疗方法。
目前临床上常用的可注射医用胶可分为两大类：以氰基丙烯酸酯为核心的快速医用胶和以天然材料为核心的可降解水凝胶。氰基丙烯酸酯医用胶具有优异的力学强度和粘黏能力，但是由于其降解能力差且含有刺激性官能团，因此并不适用于需要组织愈合与再生的缺损区。此外，氰基丙烯酸酯水凝胶无法添加生物活性因子，无法实现对生物功能的调控。以天然材料为核心的可降解水凝胶包括纤维蛋白胶体系和多糖体系。而纤维蛋白胶降解过快，多糖体系水凝胶强度差且存在致敏问题都是无法回避的缺陷。如何制备具有水下粘接能力的生物胶一直是本领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肩袖止点损伤修复的可注射式功能化水凝胶，该水凝胶具有良好的生物相容性和组织粘合能力，并且其力学特性能够均匀分布肩袖止点处手术缝线的张力，显著改善肩袖止点处的腱-骨愈合。
为此，第一方面，本发明提供一种水凝胶，其通过原料交联得到；所述原料包括第一材料、第二材料和第三材料；所述第一材料选自丝素蛋白或甲基丙烯酰化多臂聚乙二醇，所述第二材料包括甲基丙烯酰化透明质酸，所述第三材料包括多巴胺接枝透明质酸或多巴胺接枝氧化透明质酸。
在一些实施方式中，所述第一材料、第二材料和第三材料的质量比为5～7:2～3:1～2；例如可以为5:2:1。
在一些实施方式中，所述原料还包括光引发剂；所述水凝胶通过原料光交联得到。
在一些实施方式中，所述光引发剂包括LAP光引发剂：所述LAP光引发剂在原料中的浓度为0.5％～1％。
在一些实施方式中，所述甲基丙烯酰化透明质酸的分子量为40～80万。
在一些实施方式中，所述甲基丙烯酰化多臂聚乙二醇为甲基丙烯酰化四臂聚乙二醇，其中四臂聚乙二醇的分子量为8000～1万。
在一些实施方式中，所述水凝胶中还包括药物。
在一些实施方式中，所述药物包括抗生素、骨诱导生物活性因子(例如骨形成蛋白BMP、骨诱导因子OIF等)、E7短肽(氨基酸序列为EPLQLKM)等。
本发明的第二方面，提供所述水凝胶的制备方法，包括：通过将第一材料溶解于磷酸盐缓冲液，配制得到溶液A；将所述第二材料、第三材料和光引发剂溶解于磷酸盐缓冲液，配制得到溶液B；将所述溶液A和溶液B混合均匀，然后经光交联制备得到所述水凝胶。
在一些实施方式中，所述溶液A中，所述第一材料的浓度为5％～7％；在所述溶液B中，所述第二材料的浓度为2％～3％，所述第三材料的浓度为1％～2％，所述光引发剂的浓度为1％～2％。
在一些实施方式中，当使所述溶液B基本溶解后再与溶液A混合。如此，当所述第一材料为丝素蛋白时，可以避免不均匀的溶液B引起丝素蛋白变性；当所述第一材料为甲基丙烯酰化多臂聚乙二醇时，可以降低后续溶液A与溶液B混合均匀的难度。
在一些实施方式中，所述溶液A与所述溶液B等体积混合。
在一些实施方式中，将所述溶液A和溶液B混合均匀之后还包括以下步骤：加入药物并混合均匀。在一些实施例中，将所述溶液A和溶液B混合均匀之后，加入E7短肽，然后经光交联制备得到所述水凝胶。
本发明的第三方面，提供所述水凝胶在制备肩袖止点损伤修复药物方面的应用。
与现有技术相比，本发明的方法至少具有以下进步：
本发明提供一种可注射式功能化水凝胶，其包括由聚多巴胺(PDA)形成的交联结构，具有良好的生物相容性与组织粘合能力。
本发明提供的水凝胶与现有技术中用于药物递送、止血或软组织损伤修复的水凝胶不同，其粘性、力学性能针对肩袖止点的组织学特点进行了功能优化，具有良好的粘性，并且其力学特性能够均匀分布肩袖止点处手术缝线的张力，从物理层面改善腱-骨愈合。当该水凝胶中含有E7短肽时，还能够募集内源性骨髓间充质干细胞(MBSC)，有利于进一步改善腱-骨愈合质量。
本发明优选由丝素蛋白、甲基丙烯酰化透明质酸、多巴胺接枝氧化透明质酸和E7短肽形成的水凝胶，其与专利文献CN114949346A公开的丝素蛋白/透明质酸支架进行实验对照，可以发现本发明的水凝胶注射至实验动物体内形成支架后，支架内存活细胞数量增加，干细胞附着完整，实验动物腱骨止点生物力学强度更大，并且因为多巴胺接枝氧化透明质酸的加入，使得凝胶在光引发条件下更易成胶，方便术中使用。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1：根据本发明一实施例，将水凝胶与骨髓干细胞共培养，经酯化钙黄绿素和碘化丙啶染色后的显微成像结果；
图2：根据本发明一实施例，采用水凝胶进行小鼠CD68炎性实验的结果；
图3：根据本发明一实施例，使用水凝胶浸提液与家兔骨髓间充质干细胞共培养后的细胞相对活性统计结果；
图4：根据本发明一实施例，对采用水凝胶修复的肩袖腱骨位置进行核磁影像成像的结果；
图5：根据本发明一实施例，采用水凝胶进行肩袖腱骨修复，对修复后肩袖腱骨的最大破坏张力(maximum failure tension)的测试结果；
图6：根据本发明一实施例，采用水凝胶进行肩袖腱骨修复，对修复后肩袖腱骨的破坏载荷(failure load)的测试结果；
图7-9：根据本发明一实施例，采用水凝胶进行肩袖腱骨修复，修复部位中目的基因的mRNA表达量检测结果；其中，图7为Col1的检测结果，图8为Ocn的检测结果；图9为Runx2的检测结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例中所涉及的设备及材料均为可通过常规市售途径获得。其中，甲基丙烯酰化四臂聚乙二醇(4-arm PEGMA)，四臂聚乙二醇的分子量为1万；甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)，透明质酸分子量40～80万。E7(EPLQLKM C)溶液：通过商业合成(Scilight PeptideInk.,Beijing,China)得到E7(EPLQLKM C)，制备为浓度为0.25mg/mL的肽溶液。
实施例1
配制溶液A：将4-arm PEGMA溶解在1×PBS(pH＝7.4)，配制得到浓度为5％的4-armPEGMA溶液，即为溶液A。
配制溶液B：将HAMA、多巴胺接枝氧化透明质酸(ODOHA)以及LAP光引发剂加入1×PBS溶解，经反复吹打，得到溶液B，其中，HAMA的浓度为2.0％，ODOHA的浓度为1.0％，LAP的浓度为1.0％。
配制混合溶液：当溶液B基本溶解后，加入等体积的溶液A并立即吹打，然后加入E7(EPLQLKM C)溶液，得到混合溶液；该混合溶液的体系中，HAMA浓度为1.0％，ODOHA浓度为0.5％，LAP浓度为0.5％，E7的浓度为25μg/mL。
交联：通过真空除去上述混合溶液体系中的气泡，然后使用蓝光照射30s使其形成水凝胶4-arm PEGMA/HAMA/ODOHA，简称为水凝胶PHO。
实施例2
除以下区别以外，按照与实施例1相同的方法操作：
溶液A：配制丝素蛋白(SF)溶液。由于SF溶液无法精确配制，按照约7％质量分数称取SF固体，加入1×PBS，剧烈上下振摇，然后在4℃、3500rpm下离心5分钟，取澄清溶液，即制备得到溶液A。
制备得到水凝胶SF/HAMA/ODOHA，简称为水凝胶SHO。
实施例3
本实施例将水凝胶PHO和水凝胶SHO与骨髓干细胞共培养，以评价水凝胶对骨髓干细胞是否存在细胞毒性。具体步骤包括：
在超净台中取出共聚焦显微镜专用细胞培养皿，加入1μL骨髓干细胞悬液，并于培养皿底部中央分别加入水凝胶PHO和水凝胶SHO(同时设置空白对照组，不加入凝胶)。盖上皿盖，放入培养箱中静置培养，培养7天后取出，进行免疫荧光染色。进行实验时，细胞的密度为1.77×102个/cm2。加入2μM酯化钙黄绿素(calcein AM)与8μM碘化丙啶(PI)作为工作液后，即可开始共聚焦显微成像观察。在该项实验中，死细胞将被染色为红色，活细胞将被染色为绿色。
成像结果如图1所示，可见，本发明提供的水凝胶对骨髓干细胞无毒性作用。
实施例4
本实施例采用水凝胶PHO和水凝胶SHO进行小鼠CD68炎性实验。具体步骤包括：
将水凝胶PHO和水凝胶SHO分别植入C57小鼠背部的皮下脂肪处，分别于3d、7d取材，进行切片染色观察，采用CD68抗体观察其炎性反应变化，，并观察胶体酶解状况。成像结果如图2所示，可见，本发明提供的水凝胶未引起炎性反应，具有良好的生物相容性。
实施例5
本实施例通过使用水凝胶的浸提液与家兔骨髓间充质干细胞BMSC进行CCK-8检测，对水凝胶体系的细胞毒性进行评价。具体步骤包括：
分别将水凝胶PHO和水凝胶SHO浸泡在等体积的MEMα培养液(含10％FBS，1％p/s)中24h，得到浸提液PHO和浸提液SHO。将得到的浸提液与MEMα培养液等体积混合，作为试液，按照CCK-8的标准实验流程在96孔板中进行检测(同时设置空白对照组BLANK)。BMSC细胞种植密度为2000细胞/100μL，预培养1d，在1、3、5、7d每孔加入10μL CCK-8试液，37℃孵育2h后测定450nm处的吸光度值。将测定出的吸光度值对0d的吸光度值做比进行归一化，以归一化后的数值描述细胞活性并作图。
结果如图3所示，可以看出水凝胶的浸提液对细胞生长无明显负面影响。
实施例6
本实施例采用兔实验动物模型，对水凝胶促进骨愈合能力进行测试。具体步骤包括：
一、采用经典的双排固定缝合方式进行造模。
1、麻醉体质量2.0～3.0kg的成年雄性新西兰大白兔，以速眠新Ⅱ注射液0.2mL/kg对实验动物进行肌肉注射以施行全身麻醉，麻醉成功后将其置于俯卧位。术区备皮、清洁，常规消毒，铺无菌单。
2、分离三角肌，切除肌腱组织在肩关节做长约2cm的纵行皮肤切口。钝性分离三角肌，显露冈下肌肌腱在大结节上的止点。于大结节止点处，锐性切断冈下肌肌腱，并切除0.5cm×0.5cm的肌腱组织造成全层肩袖损伤模型。
3、缝合检查无活动性出血后逐层关闭伤口。
造模后处理：
常规观察直至兔自然苏醒，常规进食。始终置于兔笼(65cm×40cm×40cm)中限制活动，患肢不制动，造模后前3d，肌肉注射青霉素4×105U预防感染。
二、术后第8周进行以下相关检测：
(1)核磁影像
对采用水凝胶修复的肩袖腱骨位置进行核磁影像成像，结果如图4所示。
(2)生物力学性能测试
对采用水凝胶修复的肩袖腱骨进行取材，将测试的关节安装为两个骨隧道与拉伸载荷方向对齐。然后，完成预适应(5个周期，最大位移0.5mm)。在0-N到0.5-N的载荷作用下，以3mm/min的位移速率(直至破坏)，研究其破坏模式和极限破坏载荷。破坏模式表现为移植物破裂或从隧道中拔出。在试验过程中对试件进行润湿(生理盐水)，并通过载荷-位移曲线确定硬度。
测试结果如图5(最大破坏张力，maximum failure tension)和图6(破坏荷载，failure load)所示，通过采用本发明提供的水凝胶，显著提高了修复后肩袖腱骨的生物力学性能。
(3)基因表达的检测
取冈下肌腱(SST)末端组织，用TRIzol试剂(Invitgen)提取RNA。用GoScriptTM反转录系统(Promega，Madison，USA)和qPCR Master Mix(Promega)分别进行逆转录和扩增反应。用2,ΔΔ-Ct方法计算目的基因Col1、Ocn、Runx2的相对表达量，其检测结果依次如图7、图8、图9所示。
可以看出，在水凝胶的作用下，成骨分化中的上述关键基因的mRNA表达水平均显著提高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种水凝胶，其特征在于，所述水凝胶通过原料交联得到；所述原料包括第一材料、第二材料和第三材料；所述第一材料选自丝素蛋白或甲基丙烯酰化多臂聚乙二醇，所述第二材料包括甲基丙烯酰化透明质酸，所述第三材料包括多巴胺接枝透明质酸或多巴胺接枝氧化透明质酸。
2.如权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述第一材料、第二材料和第三材料的质量比为5～7:2～3:1～2。
3.如权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述原料还包括光引发剂；所述水凝胶通过原料光交联得到。
4.如权利要求3所述的水凝胶，其特征在于，所述光引发剂包括LAP光引发剂：所述LAP光引发剂在原料中的浓度为0.5％～1％。
5.如权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述甲基丙烯酰化透明质酸的分子量为40～80万。
6.如权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述甲基丙烯酰化多臂聚乙二醇为甲基丙烯酰化四臂聚乙二醇，其中四臂聚乙二醇的分子量为8000～1万。
7.如权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中还包括药物；
优选地，所述药物包括下组的至少一种：抗生素、骨诱导生物活性因子、氨基酸序列为EPLQLKM的E7短肽。
8.权利要求1-7中任一项所述水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：通过将第一材料溶解于磷酸盐缓冲液，配制得到溶液A；将所述第二材料、第三材料和光引发剂溶解于磷酸盐缓冲液，配制得到溶液B；将所述溶液A和溶液B混合均匀，然后经光交联制备得到所述水凝胶。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述溶液A中，所述第一材料的浓度为5％～7％；在所述溶液B中，所述第二材料的浓度为2％～3％，所述第三材料的浓度为1％～2％，所述光引发剂的浓度为1％～2％；
优选地，所述溶液A与所述溶液B等体积混合。
10.如权利要求1-7中任一项所述的水凝胶在制备肩袖止点损伤修复药物方面的应用。
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