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CN1185339C - 用于生产生物制品的细胞的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产病毒的依赖于贴壁的动物细胞的制备方法，该方法为培养细胞达到所需的预生产批量的细胞容量，其后是一个重复的不连续过程：a)部分预生产批量的细胞用于制备至少一个生产批量，和b)其余部分预生产批量的细胞用作种子生产至少一个后续预生产批量。

Description

用于生产生物制品的细胞的制备
本发明涉及用于生产生物制品的细胞的制备方法。
对于生产基于，例如细胞系的生物制品，利用放大程序在生物反应器中制备大量细胞将是必要的。
美国专利5,017,490公开了这样一种放大程序，其特别具有降低转移污染风险的优点。然而，该方法不适用于依赖于贴壁的细胞(因此，不适合只有固定到基质上才生长的细胞)或者包埋入基质的细胞(例如，在多孔载体中)。
美国专利4,644,912公开了一种用于生产生物制品(即，病毒)的依赖于贴壁的细胞的制备方法，该方法从细胞工作种子开始，然后在1升、5升、25升、150升连续增加体积的生物反应器中进行传代，最后在1000升生物反应器中或大量的150升的生物反应器中。在所有这些传代步骤之间，均用蛋白酶稀释液使细胞从其载体上释放下来。在最后一代时，进行病毒接种。
假设平均细胞周期时间约20-24小时，传代间隔可能约3-5天。因此，为了使细胞从MWCS(生产商的工作细胞储备库)扩增到足够大量的培养物，根据终生物反应器的体积，总放大程序可能需要几周。
上述制备细胞的方法中，各种终生产批量必须从MWCS开始制备。对于巨大量生物制品的生产，需要利用几个平行的培养线直到最大容器体积。因此这种制备程序非常耗时，并为了制备细胞和制备生物制品需要相当大数目的生物反应器进行操作。
本发明的目的在于，在制备用于生产生物制品的细胞的过程中提供快得多的生产率。
因此，本发明涉及制备用于生产病毒的依赖于贴壁的动物细胞的方法，该方法为培养细胞达到所需的预生产批量的细胞容量，其后是重复的不连续过程：
a)部分预生产批量的细胞用于制备至少一个生产批量，和
b)其余部分预生产批量的细胞用作种子，以制备至少一个后续预生产批量。
更具体的是，本发明涉及制备用于生产生物制品的细胞的方法，该方法为培养细胞达到所需的预生产批量的细胞容量，其后是重复的不连续过程：
a)转移部分预生产批量的细胞，用于制备至少一个生产批量，和
b)转移其余部分预生产批量的细胞，用作种子制备至少一个后续预生产批量。
在本发明的一个优选实施方案中，从工作种子原种通过至少一步传代，制备第一预生产批量。
在本发明的进一步优选实施方案中，制备的细胞是依赖于贴壁的。在后一种情况下，通常需要使细胞在基质上生长。在每次重复过程中，当部分批量用于生产一个新批量时，另加入一定量的基质是可取的。在一个优选实施方案中，每次加入基质之前，首先使至少部分细胞从其原始基质上释放下来。
本发明使用的表示方法“生产批量”指用于生产生物制品的细胞培养物。
本发明使用的表示方法“预生产批量”指用在本发明方法中制备至少一个生产批量(如前面的定义)和一个后续预生产批量的细胞培养物。
本发明使用的表示方法“生物制品”指可以从细胞培养物生产的任何物质和有机体。“生物制品”的实例是病毒和蛋白质，例如酶。
本发明使用的表示方法“工作种子原种”指储藏用作种子的指定祖先的一定量某种类型的细胞，所有同样类型细胞的培养物来源于该种子。
本发明使用的表示方法“依赖于贴壁细胞”指其合适的生长和/或增殖需要附着于本发明定义的基质的细胞。
本发明使用的表示方法“基质”指用于吸附细胞的任何颗粒物质。
本发明使用的表示方法“传代步骤”指在细胞增殖和生产过程中的连续活动，包括至少将适当量细胞和适当量培养基转移到生产容器中，容器在适合细胞生长和增殖的条件下保温足以使细胞有效生长和增殖的一段时间。传代步骤经过足以使细胞有效生长和增殖的一段时间后，任选可以包括将细胞从培养基和/或从基质中分离。
本发明的方法与本领域已知的在连续过程而不是本发明的不连续过程中生产细胞的方法本质不同，这对本领域技术人员是显而易见的。按照专利公开文本EP0417531和WO89/08701，连续培养系统也可以用于生产病毒。首先，细胞在第一生物反应器中生长，达到一定细胞密度后，将细胞连续地从所述第一生物反应器加入第二生物反应器。在该第二生物反应器中，使病毒在细胞中生长，随后将这些病毒连续地从该第二生物反应器中撤出。
按照本发明，基本工作方法是使用母生物反应器，用来自其中的细胞装填生产生物反应器。如果细胞是依赖于贴壁的，在各传代步骤之后，优选需要使细胞从其基质上解吸附。
已经研制了大生物反应器的胰蛋白酶消化程序用于该目的。生产细胞被限制在所谓ECB(扩大细胞库)的特定和特征化传代数目范围内。因为从WCS到生产细胞的放大途径可以被大大缩短，所以所述方法允许高生产率生产；且因为不再需要平行生产线，所以仅需要少得多的生物反应器。
本发明的各种实施方案如图1所示。
在一个优选实施方案中，细胞从一安瓿MWCS经一或多步传代扩增到第一预生产批量水平。该预生产批量应用的生物反应器的大小可以从几升工作体积到几百升不等。接着，部分例如10-20％由此扩增的细胞(例如，传代X)用于重新加入生物反应器，生产下一个预生产批量(传代数X+1)，而将大部分的细胞(传代X或X+1)转移到更大尺寸的生物反应器中，以便直接开始生产或者首先使其繁殖，然后开始生产。
典型的连续生产线中，收获时衍生于MWCS的细胞加倍数在一定范围内是预先已知的。在生产系统开始时设定最大允许代数。
在本发明的方法中，最大细胞代数可以通过ECB限定。因此，生产代数(生产生物制品之前使用的细胞代数)在通过ECB限定的范围内是无关紧要的。因此，考虑到调控限制，应当遵循该最大代数。结果是生产生物制品的特定批量是一个直接放大途径的终产品。
为了证明处于生产中ECB阶段的细胞的特征(specification)是否类似于MCB(主细胞库)，需要为该目的就生长特征、不同阶段的偶然性、外源和内源物质的自由度、核学同工酶分析等进行具体验证。一旦充分鉴定了该ECB特征，可以用处于MCB和ECB之间任何代数的细胞生产产品，因为可以假定细胞特征之间没有改变。因此，结果是对MWCS的测试可以限于无菌性测试。这是本发明方法的一个特别优点。
设定最大代数后，可以使用两者之间任何阶段的细胞。基于此，为了进一步最小化细胞从MWCS扩增到生产生物反应器所需要的时间，使细胞大规模启动是有利的。这可以通过例如下列方式之一实现：
●可以在环境温度(17-32℃)下使细胞在较长时期内停于一定的代数，然后通过升高温度和改变培养基使细胞复原到对数扩增生长阶段，或者
●可以大批冷冻细胞(温度＜-80℃)，然后解冻，之后将它们转移到预定体积的生物反应器中，由此显著减少必须的放大途径。
按照本发明的方法可以对动物细胞培养物实施，尤其是对依赖于贴壁细胞实施。合适的细胞类型为，例如，仓鼠细胞(CHO、BHK-1)、猴细胞(Vero)、牛细胞(MDBK)、犬细胞(MDCK)，人细胞(CaCo、A431)或者鸡细胞(CEF)。
按照本发明的生物反应器可以使用多单元的例如搅拌发酵罐、固定床发酵罐、流化床发酵罐、气升式发酵罐、或中空纤维反应器的单一单元。
上次细胞可以，并且如果某些细胞被固定到悬浮液中的固体支持物(例如微载体、或大载体)上，甚至应该在例如固定床、流化床或悬浮液、或者类似中空纤维中培养。还可以将细胞包埋入载体(例如，多孔载体)。
在本发明的方法实施过程中，尤其是利用固体支持物时，细胞将从其固体支持物上释放下来。这可以通过用于使细胞从固体支持物物上解吸附的任何方法实现。该后一步有益地可以应用蛋白酶溶液进行。任选地，该酶释放步骤之前可以进行一步或多步预处理步骤，例如用PBS和/或EDTA处理，以便增强蛋白酶解效率，和/或降低所需的蛋白酶的量。
附图说明
图1是本发明各种实施方案的示意图。
实施例1
转移到下一个生物反应器之前细胞从载体上解吸附并与之分离
MDCK(Madin Darby犬肾)细胞系的依赖于贴壁细胞，于37℃，在Cytodex-3微载体(Pharmacia，Uppsala，Sweden)(5g载体/l)上，在4升搅拌式生物反应器(“母生物反应器”)中培养。生长培养基为EpiSerf(Life Technologies，Paisly，Scotland)。连续生长，直到达到最大5×106个细胞/毫升培养物。
在胰蛋白酶-EDTA溶液中(Life Technologies，Paisly，Scotland)通过胰蛋白酶消化作用使细胞从载体上解吸附下来。
载体沉淀后，将80％的解吸附细胞转移到其它3个类似大小的生物反应器中。后者这些“生产”生物反应器均含有预先加入的载体(细胞基质)。使细胞重新布居(repopulate)到载体，然后在这些生产生物反应器中进行生产。
将“母生物反应器”中的其它细胞重新布居到剩余的Cytodex-3载体上，并培养到所需细胞密度。
实施例2
转移到下一个生物反应器之前不与载体分离的细胞从载体上解吸附
如实施例1的描述进行细胞培养，但在胰蛋白酶解后，将包括载体的80％的解吸附细胞转移到3个生产生物反应器中。向所有生物反应器中另加入适当的载体。
实施例3
转移到下一个生物反应器之后不与载体分离的细胞解吸附
如实施例1的描述进行细胞培养，但将80％仍然附着的细胞转移到类似大小的生物反应器中，其随后直接用于生产产物。
接着通过胰蛋白酶消化作用使母发酵罐中附着于微载体的其余细胞解吸附，随后加入新载体，并使细胞重新布居到基质上。
实施例4
从冷冻的大批细胞启动
在该实验中，部分培养物用于再次配料(rebatch)母发酵罐和其它子发酵罐，部分培养物用于冷冻大批细胞。
在起始培养中，将冷冻的大批细胞(总共14.4×108个细胞)接种到含每升5g Cytodex和EpiSerf培养基的3升母发酵罐中，然后于37℃培养。在第1天通过更换培养基除去残留的防冻剂。在第2天进行胰蛋白酶消化，50％的细胞接受大批冷冻，其余的细胞接种到后续发酵罐的微载体上。
从表1可以推断，在第2天到第3天，细胞的确以正常速率连续生长。
在第4天，母发酵罐中的内容物用胰蛋白酶消化吸附，然后再配料到其它两个邻接母发酵罐的发酵罐中的新微载体上(10g/l)。
到第5天，出菌率(plating efficiency)约为85％。
表1
天 3升母发酵罐 3升发酵罐 3升发酵罐
细胞×100.000/ml 细胞×100.000/ml 细胞×100.000/ml
0 NOD
1 6.6
2 14
3 15.5
4 30
5 5.5 10 10
出菌率 85％ 85％ 85％
实施例5
从小规模母发酵罐转移到大规模生产发酵罐
利用5g Cytodex/升的微载体密度，在65升和550升发酵罐(工作容积分别为50升和250)中，将细胞放大到大规模。如表2所示，总细胞中的90％从800.000个细胞/ml的50升发酵罐培养物转移到大规模发酵罐(69％证明具有生存力)。
在50升母发酵罐中发现同样的结果，约69％的再增殖细胞证明具有生存力。
过程如下：
第0天，使载体在50升细胞培养物中静置，除去上清液(培养基)后，替换为PBS。将发酵罐中的内容物搅拌5-15分钟。载体沉降后，除去上清液。如果需要可以重复该步骤。
接着用PBS/EDTA重复该步骤(0.4g EDTA/升PBS)。再次搅拌该培养物5-15分钟，使载体沉降，除去上清液，重复PBS/EDTA步骤，直到细胞变圆，易于被胰蛋白酶解吸附。
然后将胰蛋白酶(0.025％终浓度)加入PBS/EDTA，保温5-15分钟。接着转移(如实施例9)含上清液的细胞(此时的“裸”载体沉降后)或者转移细胞加载体的混合物(总混合物的80％)。
将细胞转移到550升发酵罐，重新用培养基灌注50l发酵罐后，使其余的细胞(因此，10％的存活细胞)再次布居于仍然留在发酵罐中的载体。
约70％的细胞证明具有生存力。
表2
天 50升培养物 250升培养物
细胞×100.000/ml 细胞×100.000/ml
0 8(400×108个总细胞) 1.1(275×108个存活细胞)
1 0.8
2 2.9
3 3.4
4 8.9
5 18.0
实施例6
类似于实施例5，但是将80％的结合载体的细胞的培养物从母生物反应器转移到生产生物反应器。添加病毒后，开始生产。
当物理上分离的生产生物反应器正在生产时，使母发酵罐中剩余的20％细胞和载体胰蛋白酶消化，解吸附，向母生物反应器中添加新基质后，使细胞重新布居在母生物反应器中。
实施例7
从大批冷冻细胞开始的大规模培养
使大规模冷冻细胞解冻，并接种到10升(工作容积)发酵罐中(Cytodex载体密度5g/l；培养基EpiSerf)，接种密度1×106个细胞/ml。细胞吸附后，更换培养基，以便除去残留的防冻剂。
1天后，附着于载体的活细胞量为0.45×106个细胞/ml，从该密度后细胞开始生长。当密度达到2.8×106个细胞/ml时，通过胰蛋白酶消化使细胞从其载体上解吸附，其中80％转移到50升工作体积的发酵罐(载体5g/l)中。
从表3可以推断出，在第1天，细胞大批冷冻后，活细胞量约为45％。
相对于转移细胞的总量，胰蛋白酶解吸附后，存活率为71.4％。
表3
天 细胞密度(×106/l)
10升发酵罐 50升发酵罐
0 1.0
1/2 0.45
3/4 1.3
5 2.6
6 2.8(280×108总量)
6 0.6(60×108总量) 0.28(140×108总量)
7 0.4(200×108总量)

Claims (6)

1.用于生产病毒的依赖于贴壁的动物细胞的制备方法，通过培养细胞达到所需的预生产批量的细胞容量，其后是重复的不连续过程：
a)部分预生产批量的细胞用于制备至少一个生产批量，和
b)其余部分的预生产批量的细胞用作种子，制备至少一个后续预生产批量。
2.按照权利要求1的方法，其中重复的不连续过程为：
a)转移部分预生产批量的细胞，用于制备至少一个生产批量，和
b)转移其余部分的预生产批量的细胞，用作种子制备至少一个后续预生产批量。
3.按照权利要求1或2的方法，特征在于第一预生产批量从工作种子原种通过至少一个传代步骤而制备。
4.按照权利要求1或2的方法，特征在于细胞是MDCK细胞。
5.按照权利要求3的方法，特征在于细胞是MDCK细胞。
6.按照权利要求2的方法，特征在于，细胞生长在基质上，且在每次转移步骤之前，细胞从其基质上释放。
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