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CN118526601A - 用于提高核酸药物递送效率的含n-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物及其纳米颗粒 - Google Patents

用于提高核酸药物递送效率的含n-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物及其纳米颗粒 Download PDF

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CN118526601A
CN118526601A CN202410567826.XA CN202410567826A CN118526601A CN 118526601 A CN118526601 A CN 118526601A CN 202410567826 A CN202410567826 A CN 202410567826A CN 118526601 A CN118526601 A CN 118526601A
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CN
China
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nucleic acid
tertiary amine
polymer
sirna
conjugate
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Application number
CN202410567826.XA
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申有青
张润楠
韦秋雨
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Hangzhou Titou Biotechnology Partnership Enterprise LP
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种用于提高核酸药物递送效率的含N‑氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物及其纳米颗粒，将含N‑氧化三级胺基团的聚合物偶联到核酸药物链上，制备了它们的偶联物。该偶联物优点是可以入胞直接应用，也可以与阳离子的脂质或聚合物组装，形成由核酸药物/阳离子的脂质或聚合物复合形成的致密内核、外面由含N‑氧化三级胺基团的聚合物形成的电中性聚合物外壳的复合物纳米颗粒。本发明能够应用于体内外高效递送核酸药物，显著降低阳离子脂质带来的毒副作用。

Description

用于提高核酸药物递送效率的含N-氧化三级胺聚合物与核酸 药物的偶联物及其纳米颗粒
技术领域
本发明涉及核酸药物递送技术领域，特别涉及一种用于提高核酸药物递送效率的含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物及其纳米颗粒。
背景技术
核酸药物例如小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和mRNA是新兴的基因类药物。例如，siRNA在细胞质中通过碱基互补配对原则结合基因转录后产物mRNA，形成沉默复合体并诱导其降解，从而实现靶基因的特异性沉默，目前已经广泛应用于肿瘤、代谢性疾病、皮肤病、肌营养不良等多种疾病的治疗(Setten,R.L.；Rossi,J.J.；Han,S.-p.Thecurrent state and future directions of RNAi-based therapeutics.Nature ReviewsDrug Discovery，2019，18：421-446.)。mRNA应用于胞内表达所需蛋白，如目前已经应用的mRNA疫苗。但是由于核酸药物的分子量大，呈负电性、高度亲水且极易被核酸酶降解，为此需要利用载体将核酸药物复合来保护并递送至靶细胞中发挥作用。所用的载体通包括：聚合物、脂质分子、无机纳米颗粒等材料(Kanasty,R.；Dorkin,J.R.；Vegas,A.；Anderson,D.Delivery materials for siRNA therapeutics.Nature Materials，2013，12：967-977)。
由于siRNA分子量大，呈负电性、高度亲水且极易被核酸酶降解，为有效地将siRNA递送至靶细胞中发挥作用，通常采用包括：聚合物、脂质分子、无机纳米颗粒等材料包载siRNA。N-半乳糖酰胺(GalNAc)修饰的siRNA(GalNAc-siRNA)，通过靶向肝实质细胞表面高表达的脱唾液酸糖蛋白(ASGPR)，实现siRNA向肝脏的特异性递送，并通过ASGPR介导的细胞内吞作用使siRNA进入细胞和发挥基因沉默功能，用于降低血脂和治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性(Sahin,U.；Kariko,K.；Tureci,O.mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs.Nat Rev Drug Discov，2014，13：759-780.)。WO2016/197264A1公布了一种结合异核苷修饰、末端肽缀合及阳离子脂质的小干扰RNA修饰方法及制剂，用于降低载体毒性及提高siRNA药效。CN112707943 B公布了siRNA的5’-末端缀合物，与中性/阳离子混合物脂质材料形成脂质复合物。
然而静脉注射后，阳离子脂质材料依赖正负电荷作用结合带负电的siRNA在体循环中带正电，毒性较强，且在生理条件下易于带负电的血清蛋白结合导致其降解清除，体内循环时间短。有研究通过加入辅助脂质或聚合物屏蔽阳离子脂质分子的正电性以增强颗粒稳定性及体内循环时间，但所形成阳离子脂质体成分复杂，且免疫原性较强，易引起人体过敏反应。另外，目前上市的药物递送系统难以实现siRNA在肝外器官的蓄积和转染，这也限制了阳离子脂质材料在递送siRNA的应用(Kanasty,R.；Dorkin,J.R.；Vegas,A.；Anderson,D.Delivery materials for siRNA therapeutics.Nature Materials，2013，12：967-977.)。
发明内容
本发明的目的在于解决核酸药物递送中存在的问题，提供一种用于提高核酸药物递送效率的含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物及其纳米颗粒，能够应用于体内外高效递送核酸药物，显著降低阳离子脂质带来的毒副作用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于提高核酸药物递送效率的含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物，含N-氧化三级胺聚合物的链端或其侧链连接核酸链，其结构如I和II所示：
其中，A为含N-氧化三级胺的聚合物，B为偶联官能团，C为核酸链，核酸链为双链或单链；所述含N-氧化三级胺聚合物A中，X为聚合单元，Y为连接N-三级胺氧化物基团的连接基团，R1和R2分别为C1-C6的烷基，含N-氧化三级胺聚合物的分子量为2k-50kDa；
偶联官能团B为化学键，化学键包括但不限于二硫键、酰胺键、酯键或酶响应断裂键；
核酸链C为RNA或DNA片段，包括但不限于siRNA、mRNA、核酸适体、ASO、ShRNA、microRNA；
侧链核苷酸链的摩尔分数m的范围在0.01-0.4。
含N-氧化三级胺基团的聚合物为离子对型，呈电中性，具有良好的水溶性与生物相容性和血液隐蔽性，又能诱导很强的细胞内吞。本发明将含N-氧化三级胺基团的聚合物偶联到核酸药物链上，制备了它们的偶联物。该偶联物优点是可以入胞直接应用，也可以与阳离子的脂质或聚合物组装，形成由核酸药物/阳离子的脂质或聚合物复合形成的致密内核、外面由含N-氧化三级胺基团的聚合物形成的电中性聚合物外壳的复合物纳米颗粒。含N-氧化三级胺基团的聚合物外壳既遮蔽纳米颗粒内核所带的正电荷以降低正电荷带来的毒性和免疫原性及体内的非特异性吸附，又稳定整个复合物纳米颗粒；同时该聚合物特有的快速细胞内吞能力将核酸药物或复合物纳米颗粒能有效进入细胞。因此，该偶联物及其复合物纳米颗粒可有效应用于体内的核酸药物递送和应用。
作为优选，所述X为聚合单元，包括烯烃类、氨基酸类、二亚甲基胺基类；Y为连接基团，包括酯基、酰胺基、醚健；Z为聚合单元，包括烯烃类、氨基酸类、二亚甲基胺基类。X和Z中：烯烃类具体可以选择甲基丙烯酸酯类、 甲基丙烯酰胺类、乙烯基醚、乙烯基醚与马来酸酐的共聚单元等；氨基酸类具体可以选择赖氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等；二亚甲基胺基类具体可以选择乙烯基亚胺等。
作为优选的实施方案，含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物为含N-氧化三级胺聚合物与siRNA的偶联物，具体结构为如下之一：
其中，m的范围在0.01-0.4，x的范围在0.01-0.4。
作为优选的实施方案，siRNA核苷酸长度为19-23bp，所述含N-氧化三级胺聚合物的分子量为5000-30000Da。
制备方法为：首先合成端基或主链含有偶联基团的含N-氧化三级胺聚合物，然后与核酸链的3’或5’端的基团通过偶连反应制备。
含OP(含N-氧化三级胺基团的聚合物)-NAD(核酸链)偶联物制备方法包括：
聚合物合成步骤：制备端基或主链含有偶联基团的OP；
核酸药物NAD链功能化：在核酸链上3’或5’端引入可与聚合物进行偶联反应的基团，例如巯基，胺基，羧基，羟基；
共价键连接步骤：所述的聚合物上的反应基团与NAD链端基基团反应，形成二硫键、酰胺、酯键等而成偶联物。
含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物的给药途径为静脉注射、腹腔注射、肺部吸入、肌肉注射、瘤内注射、透皮给药、经皮给药、皮内注射、皮下注射中的任意一种。
一种用于提高核酸药物递送效率的纳米颗粒，采用含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物与阳离子脂质分子或阳离子聚合物组装形成；
或采用含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物与阳离子脂质分子或阳离子聚合物，以及辅助脂质组装形成。纳米颗粒的粒径在30-500纳米之间。辅助脂质用量为阳离子脂质分子或阳离子聚合物的5-20％(摩尔)，辅助脂质为二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)
作为优选，核酸药物：阳离子脂质分子或阳离子聚合物的摩尔比＝1:1-25。
作为优选的实施方案，所述阳离子脂质分子为带正电的阳离子脂质分子，包括但不限于商用DOTAP、DOTMA、DLin-MC3-DMA、SM-102、L319；
所述阳离子聚合物为带正电的阳离子聚合物，包括但不限于聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖。
作为优选的实施方案，采用含N-氧化三级胺聚合物偶联siRNA与阳离子脂质分子DOTAP的最优组合用于提高siRNA的体内体外递送效率。siRNA与阳离子脂质分子DOTAP的摩尔比例优选1：5-25。
本发明还意外发现了含N-氧化三级胺聚合物偶联siRNA与阳离子脂质分子DOTAP的组合物所产生的siRNA递送效果超过了它们各自单独使用所应用的效应之和，产生了明显的协同增效作用，区别于商用转染试剂。
纳米颗粒的给药途径为静脉注射、腹腔注射、肺部吸入、肌肉注射、瘤内注射、透皮给药、经皮给药、皮内注射、皮下注射中的任意一种。
本发明的OP-NAD及其与阳离子脂质或聚合物组装的纳米颗粒，适用于体内核酸药物的递送，给药方式包括但不限于静脉、皮下、腹腔、肌肉、透皮、鼻腔、滴眼、吸入等给药方式，且递送效果超过了核酸药物本身与阳离子脂质或聚合物形成的复合物纳米颗粒的递送效果。
本发明的有益效果是：本发明公开的含N-氧化三级胺聚合物-核酸药物偶联物，及其与阳离子脂质分子自组装为具有电中性外壳的核酸药物复合物纳米颗粒，适用于各种给药方式，能够应用于体内外高效递送核酸药物，显著降低阳离子脂质带来的毒副作用，且含N-氧化三级胺基团的聚合物的高入胞效率，与阳离子脂质分子DOTAP间存在协同作用提高胞内转染效率。
附图说明
图1为siRNA-SS-NH-OPDEA合成步骤图；
图2为OPDEAx-co-(MMA-siRNA)y合成步骤图；
图3为实施例1-5中不同链长的含N-氧化三级胺聚合物与siRNA偶联物的凝胶阻滞图；
图4为实施例1-5中不同链长的含N-氧化三级胺聚合物与siRNA偶联的效率；
图5为实施例26中链长为8k的含N-氧化三级胺聚合物与siRNA偶联物(OP8K-siRNA)与DOTAP以不同N/P形成的复合物纳米颗粒粒径；
图6为实施例26中链长为8k的含N-氧化三级胺基团的聚合物与siRNA偶联物(OP8K-siRNA)与DOTAP以不同N/P比形成的复合物纳米颗粒的Zeta电势；
图7为实施例27中OP8K-siRNA与PEI以不同N/P比形成的复合物纳米颗粒的粒径；
图8为实施例27中OP8K-siRNA与PEI以不同N/P比形成的颗粒的电势；
图9为实施例30中OP8K-siRNA与DOTAP形成的复合物纳米颗粒沉默Hacat-EGFP细胞效率图；
图10为实施例30中OP8K-siRNA与DOTAP形成的复合物纳米颗粒沉默Hela-EGFP细胞效率图；
图11为实施例30中OP8K-siRNA与DOTAP形成的复合物纳米颗粒沉默MCF7-EGFP细胞效率图；
图12为实施例31中OP8K质量与细胞荧光抑制百分比的量效曲线；
图13为实施例31中DOTAP质量与细胞荧光抑制百分比的量效曲线；
图14为实施例31中DOTAP与OP8K-siRNA联用时，siRNA质量与细胞荧光抑制百分比的量效曲线；
图15为实施例32中PEI质量与细胞荧光抑制百分比的量效曲线；
图16为实施例32中PEI质量与OP8K-siRNA联用时，siRNA质量与细胞荧光抑制百分比的量效曲线；
图17为应用例33中不同siRNA浓度下，不同链长的含N-氧化三级胺聚合物-siRNA偶联物与DOTAP形成的复合物物纳米颗粒沉默TM4细胞的雄性激素受体的蛋白印记图；
图18为应用例33中蛋白印记条带Image J分析后柱状图；
图19为应用例34中透皮施用不同链长的含N-氧化三级胺聚合物-siRNA偶联物与DOTAP形成的复合物纳米颗粒后，小鼠皮肤组织内雄性激素受体降低情况；
图20为实施例34中蛋白印记条带Image J分析后统计图；
图21为实施例35中各组雄性激素脱发模型小鼠背部毛发生长记录图；
图22为实施例35中28天后各组雄性激素脱发模型小鼠的新生毛发重量；
图23为实施例35中扫描电镜拍摄的各组雄性激素脱发模型小鼠第28天新生毛发代表性图片；
图24为实施例35中各组雄性激素脱发模型小鼠第28天苏木精-伊红染色皮肤切片代表图；
图25为实施例35中各组雄性激素脱发模型小鼠第28天毛囊评分图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
定义：
术语“沉默”可以与“减小”“抑制”“下调”和其他类似术语交替使用，且包括任何水平的抑制。“抑制……基因的表达”或者类似术语包括任何水平基因的抑制表示至少约10％；给予与该基因表达相关的任何变量水平，例如mRNA水平、编码蛋白的水平等可以评估该基因的表达情况。将这些变量中的一个或者多个与对照水平相比，通过其绝对或相对水平的减少来评估抑制程度。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如给药前的基线水平或者未经处理的、经对照(缓冲液或者惰性对照)处理的对象、细胞、或样品确定的水平。
术语“偶联”是指两个或多个具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，本专利中“偶联物”表示一个或多个具有含氧化三级胺结构的聚合物与siRNA共价连接或一个聚合物分子连接多个是RNA而形成的化合物。
阳离子脂质的分子的代表性示例包括但不限于商品化的DOTAP、D-Lin-MC3-DMA、ALC-0315、SM-102。
阳离子聚合物的代表性示例包括但不限于：PEI、ERP、B-PDEAEA。
根据含N-氧化三级胺基团的聚合物-siRNA偶联物与阳离子脂质分子或聚合物的组装的纳米颗粒，可按预期用途的要求改变组分比例。
实施例1：制备含N-氧化三级胺基团的聚合物共价结合一条siRNA链的偶联物siRNA序列：
siGFP(sense strand:5′-CAA GCU GAC CCU GAA GUU CTT-3′(SEQ ID No.1),antisense strand:5′-GAA CUU CAG GGU CAG CUU GTT-3′(SEQ ID No.2))，(吉玛基因，GenePharma)；
siLUC(sense strand:5′-CUU ACG CUG AGU ACU UCG ATT-3′(SEQ ID No.3),antisense strand:5′-UCG AAG UAC UCA GCG UAA GTT-3′(SEQ ID No.4))，(吉玛基因，GenePharma)
siAndrogen receptor(sense strand:5′-GGG CAA UUC AAC CAU AUC UTT-3′(SEQ IDNo.5)，
antisense strand:5′-AGA UAU GGU UGA AUU GCC CTT-3′(SEQ ID No.6)，(由NCBI基因序列库设计)。
GFP-ASO sequence：5′-TTGCCGGTGGTGCAGATAAA-3′(SEQ ID No.7)，scrambledGFP-ASO sequence:5′-GGAGTACACTATATCGGTGG-3′(SEQ ID No.8)。
GFP-shRNA top strand：
5′-CACCGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATCGAAATGAAGCAGCACGACTTCTTC-3GFP(SEQ IDNo.9)′
bottom strand:
5′-AAAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATTTCGATGAAGCAGCACGACTTCTTC-3′(SEQ IDNo.10)。
MicroRNA 155：NCBI NR_029565(NCBI基因序列库)。
Aptamer target VEGF:
5′-GGGAGCUCAGAAUAAACGCUCAA-30N-UUCGACAUGAGGCCCGGAUCCGGC-3′(SEQ IDNo.11)。N＝A、C、G或T/U。
ATRP法制备聚合物端基含有保护氨基(Boc-NH)的含N-氧化三级胺结构的聚合物(Boc-NH-PDEA)：在聚合瓶中加入甲基丙烯酸-2-(N,N-二乙胺基)乙酯单体(DEA,3.72g，20mmol)、2,2-联吡啶(62.5mg,0.4mmol)、溴化亚铜(28.7mg，0.2mmol)及2.5mL无水甲醇，随后加入N-Boc-乙醇胺-2-Br-2-甲基丙酸酯(58.8mg，0.2mmol)，氮气置换后于40℃油浴锅中加热4h。终止反应后纯化，获得的聚合物Boc-NH-PDEA20k，分子量约2万Da。
通过改变单体与引发剂的摩尔比例，采用同样的聚合方法可以聚合出不同分子量的聚合物(表1)。
表1
单体：引发剂 PDEA聚合物分子量(Da)
1:27 4300
1:54 7500
1:108 20300
1:162 29800
。
以聚合物Boc-NH-PDEA20k为例，取2g加入30％过氧化氢水溶液20mL，常温下搅拌直至白色固体完全溶解。透析除去过氧化氢并冷冻干燥得到聚合物端基含有保护氨基的聚[2-(N-氧化-N,N-二乙胺基)乙酯](Boc-NH-OPDEA)。
取2g Boc-NH-OPDEA20k溶解于16mL二氯甲烷中，滴入4mL三氟乙酸进行氨基脱保护，反应4h。旋蒸出去溶剂后得到脱保护的聚合物NH2-OPDEA20k。加入三乙胺调节pH至碱性，取1.2eq的琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯溶于二甲基甲酰胺中，与NH2-OPDEA20k过夜反应，反应结束后采用乙醚沉淀法得到PSS-NH-OPDEA20k聚合物。
利用3’端保护巯基的siRNA，与PSS-NH-OPDEA20k进行化学偶联反应。siRNA巯基脱保护步骤为：在3’端含有巯基保护基的siGFP(66μg)中加入3％三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液0.4mL，室温振荡1小时，加入0.05mL 3M乙酸钠溶液和1mL乙醇终止反应，在-80℃冷冻4小时，13000g离心20分钟，收集上清，冷冻干燥得到巯基脱保护的siGFP-SH。
PSS-NH-OPDEA20k加入pH＝8PBS缓冲溶液中，随后加入脱保护的siGFP-SH(与聚合物摩尔比1：1)，室温搅拌4h后进行超滤除盐，冷冻干燥得到最终产物siGFP-SS-NH-OPDEA20k。siRNA在聚合物端基，即每个聚合物链上只有一个siRNA(图1)。类似地，用上述方法将端基含有化学偶联位点的聚合物与3’端带有可反应基团的核酸，可以制备每个聚合物链上含有一条核酸药物链的OPDEA-核酸药物偶联物。
实施例2-13为合成的代表性含N-氧化三级胺基团的聚合物-核酸药物偶联物(表2)表2
实施例14：制备含N-氧化三级胺基团的聚合物主链上偶联多条siRNA的偶联物
在聚合瓶中依次加入甲基丙烯酸-2-(N,N-二乙胺基)乙酯(DEA,1.76g，9.5mmol)，2-Boc-氨基甲基丙烯酸乙酯(64.5mg，0.5mmol)、2,2-联吡啶(62.5mg,0.4mmol)、溴化亚铜(28.7mg，0.2mmol)及2.5mL无水甲醇，采用α-溴代乙苯作为引发剂(37mg，0.2mmol)进行原子自由基聚合反应，于40℃油浴锅中加热4h。获得的聚合物PDEAx-co-(MMA-NH-Boc)y，分子量约1万。取其1g，加入30％过氧化氢水溶液10mL，常温下搅拌直至白色固体完全溶解。透析除去过氧化氢并冷冻干燥得到聚合物OPDEAx-co-(MMA-NH-Boc)y。
取1g OPDEAx-co-(MMA-NH-Boc)y溶解于8mL二氯甲烷中，滴入2mL三氟乙酸进行氨基脱保护，反应4h。除去溶剂后得到脱保护的聚合物OPDEAx-co-(MMA-NH2)y。
在siLUC 5’端含有叔丁基-6–己烷基保护基的siRNA进行羧基脱保护，步骤为：siLUC(约33μg)，加入乙酸钠溶液1mL和三氟乙酸0.2mL，室温振荡1小时后，加入1mL乙醇，在-80℃冷冻4小时，13000g离心20分钟，收集上清，冷冻干燥得到siLUC-COOH。
OPDEAx-co-(MMA-NH2)y加入到pH＝8PBS缓冲溶液中，随后加入siLUC-COOH(与聚合物摩尔比5：1)和10eq 4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉，加入室温搅拌4h后进行透析，冷冻干燥得到最终产物OPDEAx-co-(MMA-siLUC)y(图2)，siRNA在聚合物侧链上，根据核磁和质谱分析siRNA的偶联个数。该实施例偶联个数为5。
类似地，采用上述方法将5’端基功能化的核酸药物和主链上具有相应偶联位点的聚合物进行反应，制备聚合物链上含有多条核酸药物的OPDEA-核酸药物偶联物(表3)。
表3
聚合物分子量 核酸药物类型 主链上核酸药物数量
实施例15 5KDa siRNA(siLUC) 1
实施例16 5KDa siRNA(siLUC) 2
实施例17 8KDa siRNA(siLUC) 2
实施例18 8KDa siRNA(siLUC) 5
实施例19 10KDa siRNA(siLUC) 4
实施例20 20KDa siRNA(siLUC) 6
实施例21 8KDa ASO(GFP-ASO) 2
实施例22 8KDa ASO(GFP-ASO) 4
实施例23 10KDa ASO(GFP-ASO) 5
实施例24 30KDa ASO(GFP-ASO) 5
。
实施例25
配置含溴化乙锭的终浓度为0.5mg/mL的1％琼脂糖凝。按照每个上样孔中siRNA含量为0.5μg，取实施例1中不同链长的OP-siRNA偶联物与普通琼脂糖凝胶DNA/RNA上样缓冲液(protein biotechnologies)混合均匀后上样，以0.5μg游离siRNA溶液作为对照。在恒定电压100V的条件下，电泳30min。电泳结束后取出凝胶，置于紫外凝胶成像仪进行成像并拍摄。结果如图3所示，结果分析如图4所示：OP5k-siRNA偶联效率为34.14％，OP8k-siRNA偶联效率为44.81％，OP10k-siRNA偶联效率为48.46％，OP20k-siRNA偶联效率为38.08％，OP30k-siRNA偶联效率为30.65％。5k，8k，10k，20k，30k为OP聚合物分子量。
实施例26
将实施例1中的OP8k-siRNA与阳离子脂质分子DOTAP(MedChemExpress)制备成复合物纳米颗粒：以DOTAP与siRNA的N/P摩尔比为5-25：1分别取对应质量的DOTAP溶于乙醇得有机相，将OP-siRNA偶联物溶于MES缓冲液(pH＝5，20mM)得水相。将两者混合，涡旋震荡后在pH＝5，20mM MES缓冲液中透析，1h后得到组合物的纳米颗粒溶液。
制备过程中，加入阳离子脂质的5-20％(摩尔)的辅助脂质：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，不影响制备组合物的纳米颗粒的性质。
当siRNA质量为0.5μg，以不同N/P比制备复合物纳米颗粒时，DOTAP质量如下表所示：
表4
实施例27
将实施例1中的OP8K-siRNA与阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)(Sigma-Aldrich)制备成复合物纳米颗粒：以PEI与siRNA的N/P摩尔比为5-25：1分别取对应质量的PEI溶于pH＝7.4的HEPES缓冲液，取OP8K-siRNA偶联物溶于MES缓冲液(pH＝5，20mM)，将两者混合，涡旋震荡后于4℃静置1h后得到组合物的纳米颗粒溶液。
当siRNA质量为0.5μg，以不同N/P比制备复合物纳米颗粒时，PEI质量如下表所示：
表5
实施例28
实施例4中的OP8k-siRNA与DOTAP形成的纳米颗粒的粒径电势的测量：取制备好的OP8K-siRNA/DOTAP纳米颗粒溶液利用动态光散射仪在25℃条件下对其尺寸，Zeta电位进行测定，所得结果经DTS软件计算得出。每组重复三次并取平均值。如图5和图6，纳米颗粒粒径在100nm-400nm，PDI在0.4以下，电势随DOTAP与siRNA的N/P摩尔比增大呈现由负变正的趋势。当N/P比为10时，粒径为100nm左右，且电势呈现略微正电性，表明siRNA的有效包载且形成的纳米颗粒粒径适中，N/P比为10为最佳N/P比。加入阳离子脂质的5-20％(摩尔)的辅助脂质：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，不影响制备组合物的纳米颗粒的粒径和电性。
实施例29
实施例5中的OP8k-siRNA与PEI形成的复合物纳米颗粒粒径电势的测量：取制备好的OP8k-siRNA/PEI纳米颗粒溶液利用动态光散射仪在25℃条件下对其尺寸，Zeta点位进行测定，所得结果经DTS软件计算得出。每组重复三次并取平均值。如图7和图8，纳米颗粒粒径在250nm-600nm，PDI在1以下，电势为负。在不同N/P时，PEI与OP8k-siRNA形成的纳米颗粒粒径电势无规律。
实施例30
OP8k-siRNA与DOTAP的复合物的细胞转染实验：将表达EGFP荧光的Hacat、Hela、MCF-7细胞(ATCC，American Type Culture Collection)培养于12孔板中，细胞密度为105个/孔，每孔有1mL含10％FBS的DMEM或1640培养基，并将细胞置于5％ CO2浓度和95％湿度的37℃恒温培养箱中培养24h。之后将每孔中的培养基替换为1mL无血清的DMEM或者1640培养基，并且分别加入制备好的复合物纳米颗粒溶液(含siEGFP 1.33μg)，培养6h后更换培养基为1mL含10％ FBS的DMEM或者1640培养基继续培养48h后消化细胞。流式细胞仪检测各组细胞的EGFP表达量。商用脂质体Lipo2000、DOTAP与siEGFP(吉玛基因，GenePharma)形成的复合物、OP8k-siEGFP作为对照组。如图9、图10、图11所示，OP8k-siRNA与DOTAP形成的复合物纳米颗粒在表达EGFP的Hacat细胞、Hela细胞、MCF-7细胞上均能实现大于60％的荧光沉默效率。OP8k-siRNA与DOTAP的形成的复合物纳米颗粒的沉默效率大于DOTAP与siRNA形成复合物或单独使用OP8k-siRNA的沉默效率，且优于商用脂质体Lipo2000。
实施例31
OP8k-siRNA与DOTAP的复合物的联合指数(协同指数)的计算：将表达EGFP荧光的Hacat细胞培养于12孔板中，细胞密度为105个/孔，每孔含有1mL含10％FBS的DMEM培养基，并将细胞置于5％ CO2浓度和95％湿度的37℃恒温培养箱中培养24h。之后将每孔中的培养基替换为1mL无血清的DMEM培养基。以siRNA质量梯度为0.25，0.5，1，1.33，2.66μg分别配置DOTAP与siRNA复合物、OP8k-siRNA与DOTAP复合物以及纯OP8k-siRNA的溶液。其中DOTAP与siRNA的N/P摩尔比为10。OP8k质量以实施例25中的OPDEA-siRNA连接效率计算得到。具体配置方案如下表所示。
表6
将制备好的组合物溶液加入培养基培养6h后更换培养基为含10％ FBS的DMEM培养基1mL，继续培养48h后收集细胞。流式细胞仪检测各组细胞的EGFP表达量。商用脂质体Lipo2000作为对照组。以EGFP荧光mean值计算得到的抑制百分数为纵坐标，以OP8k质量，DOTAP质量及siRNA的质量为横坐标，分别做OP8k，DOTAP,OP8k及DOTAP联合使用的量效曲线如图12-14所示。根据Chou-Talalay法，联合指数CI的计算公式为
其中，(DX)1和(DX)2分别表示单用OP8k和单用DOTAP负载siRNA所产生50％细胞荧光抑制率的剂量(μg)，D1和D2分别表示联合用药时产生50％细胞荧光抑制率的OPDEA和DOTAP的用量(μg)
根据拟合量效曲线计算得当产生50％细胞荧光抑制率时，到(DX)1＝28.93μg，(DX)2＝139.53μg，D1＝4.45μg，D2＝26.41μg。CI＝0.343098。
CI值小于1，表明OPDEA与DOTAP在siRNA递送上存在协同效应。
基于实施例30-31的过程，以5k，10k，20k，30k OP聚合物分子量替代8k形成OP5k、10k 20k 30k-siRNA与DOTAP的复合物，经计算，CI值小于1均存在协同效应。
实施例32
OP8k-siRNA与PEI的复合物的联合指数的计算：将表达EGFP荧光的Hacat细胞培养于12孔板中，细胞密度为100000个/孔，每孔含有1mL含10％ FBS的DMEM培养基，并将细胞置于5％ CO2浓度和95％湿度的37℃恒温培养箱中培养24h。之后将每孔中的培养基替换为1mL无血清的DMEM培养基。以siRNA质量梯度为0.25，0.5，1，1.33，2.66μg分别配置PEI与siRNA复合物、OP8k-siRNA与PEI复合物及纯OP8k-siRNA的溶液。其中PEI与siRNA的N/P摩尔比10。OP8k质量以实施例3中的OP8k-siRNA连接效率计算得到。具体配置方案如下表所示。
表7
将制备好的组合物溶液加入培养基培养6h后更换培养基为含10％FBS的DMEM培养基1mL，继续培养48h后收集细胞。流式细胞仪检测各组细胞的EGFP表达量。商用脂质体Lipo2000作为对照组。以EGFP荧光mean值计算得到的抑制百分数为纵坐标，以OP8k、质量，PEI质量及siRNA的质量为横坐标，分别做OP8k，PEI，OP8k及PEI联合使用的量效曲线如图12、15、16所示。单独使用PEI负载siRNA进行细胞转染或将PEI及OP8k进行联用时，均无法达到50％的抑制百分比，PEI及OP8k联用时的最大抑制效率低于单独使用PEI时的抑制百分比，PEI与OP8k不具有协同作用。
实施例33
含N-氧化三级胺基团聚合物-siRNA偶联物与DOTAP的复合物的TM4细胞雄性激素受体沉默实验：将TM4培养于12孔板中，细胞密度为100000个/孔，每孔含有1mL含10％ FBS的DMEM培养基，并将细胞置于5％ CO2浓度和95％湿度的37℃恒温培养箱中培养24h。之后将每孔中的培养基替换为1mL无血清培养基，并且分别加入制备好的组合物纳米颗粒溶液(含siAndrogen receptor 1或0.5μg)，培养6h后更换培养基为1mL完全培养基继续培养48h。弃去培养基，PBS(PH＝7.4,10mM)清洗两次后每孔加入200μL细胞裂解液(碧云天)于摇床冰上裂解20min。采用改良型BCA蛋白检测试剂盒(生工，Sangon Biotech)测定总蛋白浓度，用蛋白裂解液稀释至5μg/μL蛋白浓度。用SDS-PAGE凝胶电泳蛋白上样稀释液(5X)(碧云天)稀释，95℃蛋白变性后，上样SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白条带。蛋白通过电转移至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶粉室温下摇床摇动封闭1h。加入雄性激素受体兔抗鼠一抗孵育(1:1000，proteintech,Cat No.22089-1-AP)4℃过夜。用TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗(1:1000，碧云天)，室温下孵育1h，TBST洗膜3次，进行化学发光显色，用化学发光成像仪拍照。如图17、图18所示，不同链长的含N-氧化三级胺基团聚合物-siRNA偶联物与DOTAP形成的复合物，涂抹后均有沉默TM4细胞雄性激素受体的效果，且随siRNA质量增加，沉默效果增加。
实施例34
含N-氧化三级胺基团聚合物-siRNA偶联物/DOTAP复合物透皮下调小鼠皮肤内雄性激素受体表达水平：按照实施例1合成的不同链长含N-氧化三级胺基团聚合物与沉默雄性激素受体的siRNA(siAndrogen receptor)的偶联物，按照实施例26方法配置OP-siRNA偶联物/DOTAP纳米颗粒。将形成的纳米颗粒于小鼠背部透皮给药，以DOTAP与游离siRNA形成的复合物溶液为对照，剂量均为5μg siRNA。透皮给药4h后，撤去复合物溶液，24h后处死小鼠，取给药区域皮肤，置于浓度为1mM的PMSF增强型细胞裂解液(碧云天)中研磨。充分研磨30min后，于4℃以1.5×104g离心15min，取上清溶液。采用改良型BCA蛋白定量法测定总蛋白浓度后，用细胞裂解液将样品蛋白浓度调整为5μg/uL。按样品/Loading buffer的体积比为4/1加入loading buffer，涡旋混匀后于95℃蛋白变性，上样SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白条带。蛋白通过电转移至硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶粉室温下摇床摇动封闭1h。TBST清洗三次，每次7min。加入一抗(兔抗鼠Androgen Receptor抗体1：1000，鼠抗鼠Tubulin抗体1：1000)，4℃过夜摇床孵育。用TBST洗膜3次后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(1：1000)，室温下孵育1h，TBST洗膜3次，进行化学发光显色，用化学发光成像仪拍照。如图19和20所示，透皮施用不同链长的含N-氧化三级胺基团聚合物-siAndrogen Receptor偶联物与DOTAP形成的复合物，均有沉默皮肤组织内雄性激素受体的效果，其中OP8k-siAndrogen receptor/DOTAP、OP30k-siAndrogen receptor/DOTAP复合物后沉默雄性激素受体效果优于其余组。
实施例35
OP8k-siAndrogen receptor/DOTAP复合物透皮治疗雄性激素脱发小鼠：将6周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为模型组、氟他胺组及OP8k-siAndrogen receptor/DOTAP治疗组共3组(n＝4)。在第0天对各组小鼠背部脱毛，空白组在后续28天不做任何处理，其余三组连续28天每日在背部涂抹200μL睾酮乙醇溶液(0.5％w/v)进行雄性激素脱发模型建模。治疗组在第1天、8天、15天共接受三次治疗。其中氟他胺组每次涂抹100μL 10mg/mL溶液于小鼠背部，氟他胺溶液配置如下：将氟他胺(Sigma-Aldrich)溶于DMSO中配置100mg/mL的DMSO溶液，随后取100μL 100mg/mL的DMSO溶液加入到900μL的20％ SBE-β-CD生理盐水溶液中得到浓度为10mg/mL的氟他胺溶液。OP8k-siAndrogen receptor/DOTAP复合物组按照实施例26配置，每次透皮施用5μg siRNA。拍照记录各组小鼠背部毛发生长情况。28天后，处死小鼠并集背部新生长出毛发，称重并使用扫描电镜观察毛发形态以评价毛发质量。收集小鼠背部皮肤，进行苏木精-伊红染色，对各组小鼠进行毛囊评分。如图21所示，在给药两次后，氟他胺组和OP8k-siAndrogen receptor/DOTAP组于第16天可见新生毛发生长。21天时，复合物组小鼠透皮给药治疗处大部分背部面积有可见毛发生长，28天时新生毛发覆盖程度优于氟他胺涂抹治疗组。对新生毛发进行称重，如图22，OP8k-siAndrogen receptor/DOTAP组新生毛发重量大于氟他胺组，表明复合物透皮给药组新生毛发密度较高。在扫描显微镜下，如图23，OP8k-siAndrogen receptor/DOTAP组新生毛发直径大于模型组及氟他胺组，且毛发鳞片完整，表现出良好的毛发质量。通过苏木精伊红染色切片对各组毛囊状态进行评分，如图24、25，OP8k-siAndrogen receptor/DOTAP组毛囊较多，且大部分处于生发期，毛囊评分高于氟他胺组，表明三次透皮给药后，改善了雄性激素脱发小鼠的毛囊微环境，加速毛囊由静止期和退行期进入生发期，有利于毛发再生。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于提高核酸药物递送效率的含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物，其特征在于：含N-氧化三级胺聚合物的链端或其侧链连接核酸链，其结构如I和II所示：
其中，A为含N-氧化三级胺的聚合物，B为偶联官能团，C为核酸链，核酸链为双链或单链；所述含N-氧化三级胺聚合物A中，X为聚合单元，Y为连接N-三级胺氧化物基团的连接基团，R1和R2分别为C1-C6的烷基，含N-氧化三级胺聚合物的分子量为2k-50kDa；
偶联官能团B为化学键，化学键包括但不限于二硫键、酰胺键、酯键或酶响应断裂键；
核酸链C为RNA或DNA片段，包括但不限于siRNA、mRNA、核酸适体、ASO、ShRNA、microRNA；
侧链核苷酸链的摩尔分数m的范围在0.01-0.4。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于：所述X为聚合单元，包括烯烃类、氨基酸类、二亚甲基胺基类；Y为连接基团，包括酯基、酰胺基、醚健；Z为聚合单元，包括烯烃类、氨基酸类、二亚甲基胺基类。
3.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于：含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物为含N-氧化三级胺聚合物与siRNA的偶联物，具体结构为如下之一：
4.根据权利要求3所述的偶联物，其特征在于：siRNA核苷酸长度为19-23bp，所述含N-氧化三级胺聚合物的分子量为5000-30000Da。
5.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，制备方法为：首先合成端基或主链含有偶联基团的含N-氧化三级胺聚合物，然后与核酸链的3’或5’端的基团通过偶连反应制备。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的偶联物，其特征在于，含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物的给药途径为静脉注射、腹腔注射、肺部吸入、肌肉注射、瘤内注射、透皮给药、经皮给药、皮内注射、皮下注射中的任意一种。
7.一种用于提高核酸药物递送效率的纳米颗粒，其特征在于：采用权利要求1-4任意一项所述的含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物与阳离子脂质分子或阳离子聚合物组装形成；
或采用权利要求1-4任意一项所述的含N-氧化三级胺聚合物与核酸药物的偶联物与阳离子脂质分子或阳离子聚合物，以及辅助脂质组装形成。
8.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于：核酸药物：阳离子脂质分子或阳离子聚合物的摩尔比＝1:1-25。
9.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于：所述阳离子脂质分子为带正电的阳离子脂质分子，包括但不限于商用DOTAP、DOTMA、DLin-MC3-DMA、SM-102、L319；
所述阳离子聚合物为带正电的阳离子聚合物，包括但不限于聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖。
10.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其特征在于：纳米颗粒的给药途径为静脉注射、腹腔注射、肺部吸入、肌肉注射、瘤内注射、透皮给药、经皮给药、皮内注射、皮下注射中的任意一种。
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