CN118516400B - gma-miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物育种技术领域，尤其涉及gma‑miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用。所述gma‑miR169c基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述脂肪酸包括油酸、山嵛酸、亚麻酸和二十碳一烯酸。通过过表达所述gma‑miR169c基因，抑制植物中油酸、山嵛酸的合成，促进亚麻酸和二十碳一烯酸的合成。所述植物包括拟南芥和大豆。本发明通过探究gma‑miR169c基因对脂肪酸合成代谢相关通路的影响，扩展大豆脂肪酸合成相关miRNA的报道，为植物分子育种改良、提高脂肪酸含量提供了新的思路。

Description

gma-miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用

技术领域

本发明涉及植物育种技术领域，尤其涉及gma-miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用。

背景技术

大豆，拉丁学名为Glycine max(Linn.) Merr，其为一年生草本植物，是世界上第二大植物油脂原料来源。大豆油脂是维持生命体生命活动重要物质，是细胞的组成成分和能量储藏的主要形式，在生命活动过程中其代谢产物脂肪酸对于心血管疾病患病概率的降低、血液中低密度胆固醇含量的降低具有重要作用。

MicroRNA是一种长度约为20nt~40 nt的内源性单链非编码RNA，目前已有研究表明miRNA在植物的生长、发育、激素信号转导和胁迫反应中起着至关重要的调控作用。然而，目前有关于植物油脂合成的相关研究主要集中在关键酶基因上，特别关于miRNA在脂质代谢的调控作用和与油脂相关性状之间的遗传关系知之甚少。

发明内容

本发明以大豆品种吉农18号开花后30d、40d和50d幼荚为实验材料，进行了转录组和miRNA测序，筛选出与大豆脂肪酸生物合成相关的gma-miR169c基因。

因此，本发明的目的在于提供gma-miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用，所述gma-miR169c基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述脂肪酸包括油酸、山嵛酸、亚麻酸和二十碳一烯酸。

在本发明的一具体实施方式中，通过表达所述gma-miR169c基因，抑制植物中油酸、山嵛酸的合成，促进亚麻酸和二十碳一烯酸的合成。

在本发明的一具体实施方式中，所述植物为双子叶植物。

在本发明的一具体实施方式中，所述双子叶植物包括拟南芥和大豆。

在本发明的一具体实施方式中，过表达所述gma-miR169c基因的方法包括：将包含所述gma-miR169c基因的重组菌转化到植物中。

在本发明的一具体实施方式中，所述转化的方法包括花序侵染法。

在本发明的一具体实施方式中，包含所述gma-miR169c基因的重组菌是将包含所述gma-miR169c基因的重组载体转入大肠杆菌DH5α中获得。

在本发明的一具体实施方式中，转入的方法包括热激法。

在本发明的一具体实施方式中，包含所述gma-miR169c基因的重组载体是将所述gma-miR169c基因插入pCAMBIA3301载体NcoI和BstE II位点之间获得。

本发明具有如下有益效果：

本发明通过外源基因表达载体将编码序列如SEQ ID NO.1所示的gma-miR169c基因序列导入到植物中，过表达gma-miR169c基因拟南芥植株表现为油酸、山嵛酸含量显著低于对照，同时亚麻酸、二十碳一烯酸的含量明显升高。本发明通过调控gma-miR169c基因在植物中的表达进而用于培育脂肪酸含量可调控的植物新品种，为培育新的作物品种提供了新思路，在分子育种上具有极大的应用价值。

附图说明

图1：gma-miR169c基因扩增产物电泳图，M：DL2000bp DNA marker；1~3：扩增产物。

图2：pCAMBIA3301-miR169c双酶切产物电泳图，M：DL10000bp DNA marker；1：单酶切结果；2：双酶切结果。

图3：gma-miR169c对脂肪调控关键基因相关的调节因子表达的影响，A：脂酰基-ACP硫酯酶B 的相对表达水平，B：脂肪酸脱氢酶的相对表达水平，C：长链酰基-CoA合成酶的相对表达水平，D：溶血磷脂酸酰基转移酶2的相对表达水平，WT表示野生型拟南芥，miR169c表示过表达gma-miR169c拟南芥，*表示p<0.05的统计学差异。

图4：T₃代拟南芥转基因籽粒中脂肪酸检测图谱，图中A为野生型拟南芥检测图谱，B为过表达gma-miR169c拟南芥检测图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

其中，大肠杆菌DH5α感受态细胞购于全式金生物公司；农杆菌GV3101感受态细胞购于北京庄萌国际生物公司；用于表达载体构建中的pCAMBIA3301载体由申请人实验室保存，该载体的详细信息，包括序列和图谱，可以在HonorGene生物资源库中找到；各种药品试剂，如无特殊说明均购自康为试剂生物科技股份有限公司。

实施例1

（1）构建过表达gma-miR169c载体质粒

本实施例以大豆品种吉农18号开花后30天的幼荚为材料，大豆品种吉农18号审定编号：吉申豆2006009，由吉林农业大学从国外杂交组合的后代材料中经多年系统远育而成，保存于申请人实验室。提取幼荚RNA并将RNA反转录cDNA为模板，利用带有同源臂的引物F和带有同源臂的引物R进行PCR的扩增，得到194bp大小的带有同源臂的gma-miR169c基因序列；gma-miR169c基因原始序列如SEQ ID NO.1所示，带有同源臂的gma-miR169c基因序列如SEQ ID NO.2所示，带有同源臂的引物F序列如SEQ ID NO.3所示，带有同源臂的引物R序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.1：atcgctcaatggaTAAAAGTTACTCTAGGGAtaacagactgatcttccctaagatctcacatggatgggaaggtttggcacctcgatgtcggctcttcgccacctgaggctgtagtatgttccaagggtttggttgttcgcccattaaagc。

SEQ ID NO.2：ACGGGGGACTCTTGACCATGGatcgctcaatggaTAAAAGTTACTCTAGGGAtaacagactgatcttccctaagatctcacatggatgggaaggtttggcacctcgatgtcggctcttcgccacctgaggctgtagtatgttccaagggtttggttgttcgcccattaaagcGGTGACCAGCTCGAATTTCCCC。

SEQ ID NO.3：acgggggactcttgaccatggATCGCTCAATGGATAAAAGTTACTCTA。

SEQ ID NO.4：ggggaaattcgagctggtcaccGCTTTAATGGGCGAACAACCA。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，然后胶回收。鉴定结果如图1所示。

把回收产物和pCAMBIA3301载体分别用NcoI和BstE II双酶切，结果如图2所示，然后经胶回收；利用重组酶2×Super Pfx MasterMix和同源重组的原理，具体反应体系如下表1。

表1 PCR反应体系

PCR仪中50℃反应5分钟~15分钟，反应结束后，将连接产物置于冰上冷却数秒；通过热激的方法转到大肠杆菌，在卡那霉素的LB培养基上筛选阳性克隆。进行质粒提取，测序后成功获得gma-miR169c过表达载体质粒pCAMBIA3301-miR169c。

（2）获得gma-miR169c转基因拟南芥植株

本实施例获得了转基因拟南芥植株，获得的方法包括如下步骤：

取0.01 μg~1 μg质粒加入100μL农杆菌GV3101中，用手轻轻拨打管底混匀，依次于冰上静置10min，液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min后加入900μL无抗生素的YEP液体培养基，28℃、200rpm培养2h；均匀涂在50μg/mL卡那霉素LB培养基上，28℃倒置培养2天；

接种单个菌落于5mL LB培养基，28℃、200rpm培养过夜，所述LB培养基中含50μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素；

取500μL菌液扩大培养于500mL含50μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，28℃、200rpm培养过夜，室温，5000g，离心10min，收集菌体；

配制侵染液：MS粉4.4g、蔗糖 100g、1000× B5 维生素 2mL、 1mg/ml 的 20μL、Silweet L-77 400μL、1M NaOH 180μL、ddH₂O 1950mL；

使用侵染液重悬菌体使农杆菌菌液的OD值处于OD=0.8~1.0之间；

将含有农杆菌的侵染夜倒入烧杯中，将刚刚开花的拟南芥倒置其上，使得整个花序浸入侵染夜5 min ~7min；

取出拟南芥，将其侧卧放在干净的塑料托盘上，并用薄膜覆盖避光保湿24h；

将拟南芥扶起，正常光下培养，约3周~4周后长角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子；

使用浓度为1.5g/L的Basta溶液喷洒四叶期幼苗，每2日喷洒一次，待部分拟南芥幼苗枯黄后，把正常生长状态的拟南芥移栽到新的小盆中，后期提取莲座叶基因组进行PCR鉴定，即得过表达gma-miR169c拟南芥。

（3）过表达gma-miR169c基因影响脂肪酸相关关键酶基因的表达量

本实施例通过qRT-PCR检测与脂肪酸合成相关的油脂合成关键酶基因在转基因拟南芥和野生型拟南芥中相对表达情况。

与脂肪酸合成相关的油脂合成关键酶基因包括：脂酰基-ACP硫酯酶B，英文缩写为FATB；脂肪酸脱氢酶，英文缩写为FAD2；溶血磷脂酸酰基转移酶2，英文缩写为LPAT2；长链酰基-CoA合成酶，英文缩写为LACS8。

通过qRT-PCR检测在T3代过表达gma-miR169c拟南芥植株和野生型拟南芥植株中关键酶基因的表达量。结果见图3，在过表达gma-miR169c拟南芥植株中，FATB、LACS8的表达量低于野生型，FAD2、LPAT2表达量高于野生型。

这说明gma-miR169c基因可能直接或间接影响脂肪酸相关关键酶基因的表达量，继而证实了gma-miR169c基因可能参与拟南芥脂肪酸合成代谢。

（4）过表达gma-miR169c基因影响脂肪酸含量

通过GB 5009.168—2016S食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定检测了T₃代过表达gma-miR169c拟南芥植株的种子和野生型拟南芥植株种子中的脂肪酸含量，脂肪酸包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳一烯酸、二十碳二烯酸、山嵛酸、芥酸。

结果见图4，对T₃代过表达gma-miR169c拟南芥种子中主要脂肪酸含量进行测定，其中过表达gma-miR169c拟南芥中的油酸、山嵛酸含量显著低于野生型拟南芥，同时亚麻酸、二十碳一烯酸的含量明显升高。过表达gma-miR169c拟南芥籽粒中油酸、山嵛酸、亚麻酸和二十碳一烯酸含量分别为 13.6315g/100g、0.5095g/100g、21.0275g/100g和20.269g/100g，同野生型相比，油酸和山嵛酸分别下降了15.3%和38%，亚麻酸和二十碳一烯酸分别提高了6.2%和9%。

结果表明，gma-miR169c基因参与对拟南芥脂肪酸的调控。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形在内。

Claims (6)

1.gma-miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用，其特征在于，所述gma-miR169c基因序列如SEQ ID NO.1所示；通过过表达所述gma-miR169c基因，抑制植物中油酸、山嵛酸的合成，促进亚麻酸和二十碳一烯酸的合成；所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述gma-miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用，其特征在于，过表达所述gma-miR169c基因的方法包括：将包含所述gma-miR169c基因的重组菌转化到拟南芥中。

3.根据权利要求2所述gma-miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用，其特征在于，所述转化的方法为花序侵染法。

4.根据权利要求2所述gma-miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用，其特征在于，包含所述gma-miR169c基因的重组菌是将包含所述gma-miR169c基因的重组载体转入大肠杆菌DH5α中获得。

5.根据权利要求4所述gma-miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用，其特征在于，转入的方法为热激法。

6.根据权利要求4所述gma-miR169c基因在调控植物脂肪酸合成中的应用，其特征在于，包含所述gma-miR169c基因的重组载体是将所述gma-miR169c基因插入pCAMBIA3301载体Nco I和BstE II位点之间获得。