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CN118401667A - 用于治疗cdkl5缺乏症(cdd)的组合物 - Google Patents

用于治疗cdkl5缺乏症(cdd)的组合物 Download PDF

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CN118401667A CN202280083857.7A CN202280083857A CN118401667A CN 118401667 A CN118401667 A CN 118401667A CN 202280083857 A CN202280083857 A CN 202280083857A CN 118401667 A CN118401667 A CN 118401667A
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University of Pennsylvania Penn
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Abstract

本发明提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)，其具有AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含编码功能性CDKL5(hCDKLK5)的核酸序列。本发明还提供了一种用于生产所述rAAV的生产系统、一种包含所述rAAV的药物组合物、以及一种经由向有此需要的受试者施用有效量的所述rAAV来治疗患有CDD的受试者、或改善CDD的症状、或延迟CDD的进展的方法。

Description

用于治疗CDKL5缺乏症(CDD)的组合物
背景技术
CDKL5缺乏症(CDD)是一种影响幼儿的严重神经发育障碍。根本原因是由于X连锁细胞周期蛋白依赖性激酶样5基因CDKL5发生突变，导致CDKL5蛋白表达缺失(MendelianInheritance in Man,MIM:300203；以前称为STK9)，从而产生一系列表型，包括：EIEE2(MIM:300672)，一种形式的早期婴儿癫痫性脑病[Bahi-Buisson,N.等人Key clinicalfeatures to identify girls with CDKL5 mutations.Brain 131,2647-2661,doi:10.1093/brain/awn197(2008)]和婴儿痉挛症[Fehr,S.等人Eur J Hum Genet 21,266-273,doi:10.1038/ejhg.2012.156(2013)；Kalscheuer,V.M.等人，American Journal ofHuman Genetics,72,1401-1411,doi:10.1086/375538(2003)；Tao,J.等人AmericanJournal of Human Genetics 75,1149-1154,doi:10.1086/426460(2004).Weaving,L.S.等人American Journal of Human Genetics 75,1079-1093,doi:10.1086/426462(2004)]。除了特征性的早发性癫痫发作外，表型还可包括许多其他特征，诸如刻板的手部动作、严重的精神运动性迟缓和全身肌张力减退。产后早期发作的症状表明CDKL5在大脑发育中起着至关重要的作用。CDKL5也在成熟的成人神经系统内表达。CDKL5在整个细胞(包括细胞核以及细胞体和树突的细胞质)中表达。
CDKL5基因突变是大多数CDD病例的原因，CDD是一种进行性神经发育障碍，也是女性认知障碍的最常见原因之一。具有引起CDD的基因突变的男性会以毁灭性的方式受到影响。他们中的大多数在出生前或婴儿期早期就死亡了。参见，例如，ninds.nih.gov/Disorders/Patient-Caregiver-Education/Fact-Sheets/Rett-Syndrome-Fact-Sheet和omim.org/entry/312750。
目前，CDD尚无治愈方法，并且治疗重点是缓解疾病症状。在许多情况下，癫痫发作控制不佳，因此医学上迫切需要寻找新的治疗方法。
发明内容
本文提供了重组腺相关病毒(rAAV)，其可用于治疗有此需要的受试者的CDKL5缺乏症(CDD)。rAAV携带包含反向末端重复序列(ITR)和新核酸序列的载体基因组，该核酸序列在指导靶细胞中hCDKL5表达的调控序列的控制下编码功能性人CDKL5蛋白。
在某些实施例中，提供了可用于治疗CDD的重组腺相关病毒(rAAV)。rAAV包含：(a)AAVhu68或AAVrh91衣壳；以及(b)(a)的AAV衣壳中的载体基因组，其中该载体基因组包含：5'AAV反向末端重复序列(ITR)；包含SEQ ID NO:22的核苷酸1至2883的人CDKL5序列的表达盒，该人CDKL5序列可操作地连接至指导其表达并且进一步包含四个串联miR183靶向序列的调控序列；以及3'AAV ITR。在某些实施例中，调控序列进一步包含UbC启动子或hSyn启动子。在某些实施例中，UbC启动子具有SEQ ID NO:52的序列。在某些实施例中，表达盒包含SEQ ID NO:49(或SEQ ID NO:50)的核苷酸220至4609的核酸序列、SEQ ID NO:29(或SEQ IDNO:59)的核苷酸226至4608的核酸序列、或SEQ ID NO:31(或SEQ ID NO:60)的nt 224至4191的核酸序列。在某些实施例中，AAV衣壳是AAVhu68衣壳。在某些实施例中，载体基因组包含AAV 5'ITR、UbC启动子、Kozak序列、hCDKL5编码序列、hCDKL5编码序列的3'UTR中的四个miR183靶向序列、兔球蛋白polyA信号和AAV 3'ITR。在某些实施例中，至少一种miR183靶向序列具有AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(miR183，SEQ ID NO:11)的序列。在某些实施例中，miR183靶向序列中的两者、三者或四者具有SEQ ID NO:11。在某些实施例中，四个miR183靶向序列串联位于3'UTR中并由间隔序列隔开。
在某些实施例中，提供了包含如本文所述的rAAV载体原液和水性悬浮介质的组合物。
在某些实施例中，提供了治疗CDD的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的rAAV。
在某些实施例中，提供了可用于生产如本文所述的载体的rAAV生产系统。
在再一方面，本文提供了包含如本文所述的rAAV或载体以及水性悬浮介质的组合物。
在另一方面，提供了治疗患有CDD的受试者、或改善CDD的症状、或延迟CDD的进展的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的rAAV或载体。在某些实施例中，载体或rAAV可经由小脑延髓池内注射(ICM)施用于患者。
通过以下对本发明的详细描述，本发明的这些和其它方面是显而易见的。
附图说明
图1A示出了针对AAV CDKL5载体基因组的AAV载体设计，该载体基因组包含：5'AAV反向末端重复序列(ITR)；表达盒，其包含人突触蛋白神经元启动子、工程化的人CDKL5 DNA编码序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和poly A；以及AAV 3'ITR。图1B示出了针对AAV CDKL5载体基因组的AAV载体设计，该载体基因组包含：5'AAV ITR；和表达盒，其包含人泛素C(UbC)启动子、工程化的人CDKL5 DNA编码序列、用来降低drg表达的drg-miRNA，polyA；以及AAV 3'ITR。图1C示出了针对AAV CDKL5载体基因组的AAV载体设计，该载体基因组包含：5'AAV ITR；和表达盒，其包含鸡β-肌动蛋白杂合启动子(CBh)、工程化的人CDKL5DNA编码序列、miRNA序列、polyA；以及AAV 3'ITR。
图2A和2B示出了小鼠海马体的分析，如用抗CDKL5抗体(S957D，University ofDundee，UK)评估的。经由新生儿脑室内注射，用5×1010GC AAV-hSyn-CDKL5-1co.WPRE治疗小鼠。图2A示出了通过蛋白质印迹的CDKL5表达，绘制了用PBS注射的野生型小鼠、用PBS注射的KO小鼠和经治疗的KO小鼠中的CDKL5/微管蛋白水平。图2B示出了在用PBS注射的野生型小鼠、用PBS注射的KO小鼠和经治疗的KO小鼠中如使用pS222EB2(Baltussen等人，2018Chemical genetic identification of CDKL5substrates reveals its role inneuronal microtubuledynamics,EMBO J,37:e99763)水平所测定的CDKL5活性。
图3提供了在CDD小鼠模型中注射AAV-hSyn-hCDKL5-1co.WPRE后小鼠成熟和存活的图。所有接受注射的小鼠均在治疗后存活下来，体重增加。这些小鼠没有表现出任何明显的不良后果征象。
图4提供了来自接受AAV-hSyn-CDKL5-1co.WPRE的CDD小鼠中的行为评估的结果。该图绘制了来自高架零迷宫的结果，该高架零迷宫评估了冒险、好奇心和焦虑之间的平衡。第一个条代表接受PBS的wt小鼠。Wt小鼠好奇但谨慎，并且在开放区花费的时间有限。中间条显示仅接受PBS的Cdkl5-ko小鼠，该小鼠表现出焦虑减少并且在开放区花费更多时间，它们更频繁地进入开放区域。AAV-CDKL5处理后，Cdkl5-ko小鼠的行为恢复到wt行为(针对开放区域中的时间和针对从封闭区域进入开放区域)。
图5A和5B提供了来自接受AAV-hSyn-CDKL5-1co.WPRE的CDD小鼠中的行为评估的结果。图5A示出了小鼠在旷场中的探索活动，绘制为光束中断/箱与时间(分钟)的关系。虚线显示wt小鼠，它们很好奇，但在10分钟内探索了场地并平静下来。带长破折号的线显示Cdkl5-ko花费了更长的时间探索，但最终平静下来。带破折号和点的线显示，AAV-CDKL5处理后，Cdkl5-ko小鼠的活动性降低，并且其总体活动性水平与wt小鼠相似。图5B示出了小鼠进行的总光束中断的累积活动数据，这确认了图5A中的结果。
图6示出了历经连续三天的小鼠的运动活动和敏捷性评估(转棒疲劳实验，rotarod)中测得的跌倒潜伏期(秒)的图。据观察，随着时间的推移，野生型小鼠在学习的同时表现也有所提高。与wt小鼠相比，Cdkl5-ko小鼠表现出改进的表现，这可能是由于先前观察到的初始多动性。AAV-hSyn-CDKL5-1co.WPRE处理后，Cdkl5-ko小鼠的行为接近WT小鼠，并且在学习2天后与WT小鼠的表现相匹配。
图7A和7B示出了海马体学习和记忆(Y迷宫)的结果。图7A示出了针对测试组和两个对照组的自发交替的百分比。图7B示出了针对测试组和两个对照组的移动的距离(m)。wt小鼠表现出强烈的趋势去探索它们最近没有访问过的迷宫臂(自发交替行为)，而Cdkl5-ko小鼠具有较低的对这种依赖记忆的行为的倾向。基因疗法后，表现表明有改进的趋势。
图8A至8D展示了用于表达同种型1、同种型2、同种型3或同种型4的AAV.CDLK5载体构建体的CDKL5表达水平或活性水平。图8A示出了与注射媒介物的野生型小鼠以及注射媒介物的敲除小鼠相比，在注射AAV载体(5×1010GC，新生儿ICV)的敲除小鼠中CDKL5同种型1、2、3和4的定量表达水平。图8B示出了如根据pS222EB2的定量信号测定的CDKL5活性，该信号来自对来自经处理的野生型小鼠(注射媒介物(PBS))、敲除小鼠(注射媒介物或AAV.CDKL5-1co)的组织的蛋白质印迹分析。图8C示出了如根据pS222EB2的定量信号测定的CDKL5活性，该信号来自对来自经处理的野生型小鼠(注射媒介物(PBS))、敲除小鼠(注射媒介物或AAV.CDKL5-同种型1、2、3或4(来自图8A))的组织的蛋白质印迹分析。图8D示出了KO小鼠中同种型1(来自图8B)的定量的CDKL5表达水平。
图9A至9F示出了在比较敲除型和野生型小鼠的不同载体剂量(5×1010GC、2.5×1010GC、1×1010GC和6×109GC)的小鼠研究中AAV.CDKL5基因疗法的治疗功效。图9A示出了用5×1010GC的剂量的AAV.CDKL5或PBS处理的小鼠历经10周的时期的体重增加(g)。图9B示出了用2.5×1010GC的剂量的AAV.CDKL5或PBS处理的小鼠历经10周的时期的体重增加(g)。图9C示出了与未处理的Cdkl5-ko小鼠相比，针对5×1010GC的剂量的AAV.CDKL5处理组的后肢扣紧测试的剂量依赖性结果。图9D示出了与未处理的Cdkl5-ko小鼠相比，针对2.5×1010GC的剂量的AAV.CDKL5处理组的后肢扣紧测试的剂量依赖性结果。图9E示出了与未处理的Cdkl5-ko小鼠相比，针对1×1010GC的剂量的AAV.CDKL5处理组的后肢扣紧测试的剂量依赖性结果。图9F示出了与未处理的Cdkl5-ko小鼠相比，针对6×109GC的剂量的AAV.CDKL5处理组的后肢扣紧测试的剂量依赖性结果。WT小鼠没有表现出扣紧，而KO小鼠表现出明显的扣紧。治疗后，KO小鼠表现出显著减少的扣紧行为。经注射的WT小鼠没有受到影响。
图10A至10E示出了AAV.CDL5基因疗法在CDD ko小鼠研究中的治疗功效。图10A示出了与未处理的Cdkl5-ko小鼠相比，以5×1010GC的剂量针对AAV.CDKL5处理组的筑巢的结果(巢质量/评分)。图10B示出了与WT和Cdkl5-ko小鼠相比，以5×1010GC的剂量在AAV.CDLK5处理组中来自具有归一化趋势的大理石埋藏任务的结果。图10C示出了与未处理的Cdkl5-ko小鼠相比，针对2.5×1010GC的剂量的AAV.CDKL5处理组的筑巢的结果(巢质量/评分)。图10D示出了与WT和Cdkl5-ko小鼠相比，在2.5×1010GC的剂量的AAV.CDLK5处理组中来自具有归一化趋势的大理石埋藏任务的结果。图10E示出了与未处理的Cdkl5-ko小鼠相比，针对1×1010GC的剂量的AAV.CDKL5处理组的筑巢的结果(巢质量/评分)。图10F示出了ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中筑巢测试的结果，绘制为完整的原始巢重量的百分比重量。
图11A至11F示出了在接受AAV.CDKL5处理的ko小鼠中对多动性的校正，如在旷场活动测试中评估的。图11A示出了以5×1010GC的剂量的AAV.CDKL5处理的ko小鼠中的走动活动/箱与时间(5分钟间隔至30分钟)的关系。图11B示出了以5×1010GC的剂量的AAV.CDKL5处理的ko小鼠中的总活动。图11C示出了以2.5×1010GC的剂量的AAV.CDKL5处理的ko小鼠中的走动活动/箱与时间(5分钟间隔至30分钟)的关系。图11D示出了以2.5×1010GC的剂量的AAV.CDKL5处理的ko小鼠中的总活动。图11E示出了以6×109GC的剂量的AAV.CDKL5处理的ko小鼠中的走动活动/箱与时间(5分钟间隔至30分钟)的关系。图11F示出了以6×109GC的剂量的AAV.CDKL5处理的ko小鼠中的总活动。在AAV.CDKL5处理的ko小鼠中，在高架零迷宫中观察到冒险行为增加的归一化，并且在Y迷宫中观察到海马体学习缺陷的归一化。
图12展示了当在ko小鼠中以5×1010GC的剂量进行评估时，CDKL5同种型2至4的表达提供了后肢扣紧表型的显著校正。
图13A至13D展示了用AAV.CDKL5-同种型1处理的KO小鼠中校正的强烈趋势。图13A示出了用AAV.CDKL5-同种型1以5×1010GC的剂量处理的KO小鼠中的活性升高。图13B出了用AAV.CDKL5-同种型1以2.5×1010GC的剂量处理的KO小鼠中的活性升高。图13C示出了用AAV.CDKL5-同种型1以5×1010GC的剂量处理的KO小鼠中Y迷宫中的活性。图13D示出了用AAV.CDKL5-同种型1以2.5×1010GC的剂量处理的KO小鼠中Y迷宫中的活性。
图14A至14C示出了用AAV.CDKL5-同种型1处理敲除小鼠后的后肢扣紧的性别特异性结果。图14A示出了用AAV.CDKL5-同种型1处理雄性敲除小鼠后的后肢扣紧。图14B示出了用AAV.CDKL5-同种型1处理雌性敲除小鼠后的后肢扣紧。Cdkl5-ko小鼠中，半合子雄性和杂合子雌性小鼠两者均表现出后肢扣紧，处理后后肢扣紧显著减少。WT组均未表现出扣紧。图14C示出了高剂量(5×1010GC，新生儿ICV)对雌性杂合小鼠的走动活动显著改善。
图15A至15F示出了在ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后，雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中的旷场测试的结果。图15A示出了雄性的水平活动旷场测试的结果，绘制为X/Y轴光束中断。图15B示出了雌性的水平活动旷场测试的结果，绘制为X/Y轴光束中断。图15C示出了雄性的后立旷场测试的结果，绘制为Z轴光束中断。图15D示出了雌性的后立旷场测试的结果，绘制为Z轴光束中断。图15E示出了雄性的中心活动旷场测试的结果，绘制为中心光束中断百分比。图15F示出了雌性的中心活动旷场测试的结果，绘制为中心光束中断百分比。
图16A和16B示出了用AAV.CDKL5-同种型1载体处理的ko小鼠中的性别差异。图16A示出了用AAV.CDKL5-同种型1处理的雄性(KO)小鼠在高架零迷宫评估中的旷场-走动活动的结果，绘制为在开放区域中花费的时间。图16B示出了用AAV.CDKL5-同种型1处理的雌性(ht)小鼠的高架零迷宫评估中的旷场-走动活动的结果，绘制为在开放区域中花费的时间。风险倾向行为得到校正，体型效应在雄性中更为明显。
图17提供了来自NHP研究的各种组织样品中的载体分布(代表1×1014GC剂量)。该图提供了各种非神经元组织、脊髓轨道和脑组织的gc/二倍体基因组中的rAAV.CDKL5。观察到背根神经节(DRG)的强转导。观察到脑组织的中度至低度转导，其中一些渗漏到非神经元组织中。
图18提供了NHP研究中在小脑、额叶皮层、枕叶皮层、顶叶皮层和颞叶皮层中所示的hCDKL5表达的定量结果(通过RT-qPCR测量)。
图19A和19B示出了测量对WT小鼠施用CDKL5基因疗法后行为变化的剂量递增研究的结果。图19A示出了与用PBS处理的对照小鼠相比，在注射7.5×1010GC和1×1011GC的AAV的WT小鼠中没有显著的后肢扣紧严重程度评分变化。图19B示出了与用PBS处理的对照小鼠相比，在注射7.5×1010GC和1×1011GC的AAV的WT小鼠中没有显著的走动活动变化。
图20示出了在经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183后14天时，如通过蛋白质印迹定性测量的CDKL5表达。
图21A示出了在4月龄时如通过蛋白质印迹定性测量的CDKL5表达，其中小鼠经由新生儿ICV以3×1010、6×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183。
图21B示出了在4月龄时如通过蛋白质印迹定性测量的CDKL5表达，其中小鼠经由新生儿ICV以3×1010、1×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183。
图21C示出了从蛋白质印迹分析定量的CDKL5表达，绘制为野生型和敲除小鼠中的CDKL5/微管蛋白水平，该小鼠经由新生儿ICV以3×1010、6×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183，并以5×1010GC的剂量与AAVhu68.hSyn-CDKL5进行比较。
图22A示出了在经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183之后的来自CDKL5表达的免疫荧光显微镜分析的代表性图像。
图22B示出了在经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183之后的来自CDKL5表达的免疫荧光显微镜分析的代表性图像。
图23A示出了在经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183之后的来自CDKL5表达的免疫荧光显微镜分析的代表性图像(放大视图)(还探测了样品的NeuN，神经元标志物)。
图23B示出了在经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183之后的来自CDKL5表达的免疫荧光显微镜分析的代表性图像(放大视图)(还探测了样品的NeuN，神经元标志物)。
图24示出了与之前施用AAVhu68.hSyn.CDKL5后的结果相比，表达CDKL5的神经元的定量(高于背景水平；绘制为阳性识别的神经元中的CDKL5百分比)。
图25A至25C示出了经由新生儿ICV以1×1010、3×1010、6×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183的小鼠在出生后第16天(PND16)的统计存活的存活研究的结果。图25A示出了经由新生儿ICV以1×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183的小鼠在出生后第16天(PND16)的统计存活的存活研究的结果。图25B示出了经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183的小鼠在出生后第16天(PND16)的统计存活的存活研究的结果。图25C示出了经由新生儿ICV以6×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183的小鼠在出生后第16天(PND16)的统计存活的存活研究的结果。
图26A示出了在来自用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183载体经由ICM途径以3×1010GC的剂量处理的NHP的颈椎、胸椎和腰椎收集的组织的DRG神经元中观察到的严重程度评分。评分0表示没有毒性征象，而评分5表示严重毒性，如由委员会认证的兽医病理学家所评分的。基于对初始组织的类似评价，0.5或更低的评分被视为背景。
图26B示出了在来自用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183载体经由ICM途径以3×1010GC的剂量处理的NHP的颈椎、胸椎和腰椎收集的组织的脊髓神经元中观察到的严重程度评分。
图26C示出了在来自用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183载体经由ICM途径以3×1010GC的剂量处理的NHP的近端和远端收集的组织的腓肠神经中观察到的严重程度评分。
图27示出了施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183载体后，在各种组织或NHP中以GC/二倍体基因组绘制的载体拷贝数的结果。
图28示出了与在小鼠大脑中观察到的结果相比，在NHP的各种CNS组织(运动皮层、体感(som.Sens).皮层、顶叶皮层、海马体、丘脑)中的以每100ng的cDNA绘制的CDKL5的相对表达。
图29A示出了与用PBS处理的WT和敲除小鼠(对照组)相比，从蛋白质印迹分析定量的CDKL5表达，在以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183的敲除小鼠中绘制为CDKL5/微管蛋白水平。
图29B示出了与用PBS处理的WT和敲除小鼠(对照组)相比，从蛋白质印迹分析定量的激酶活性，在以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183的敲除小鼠中绘制为pEB2pS222/总EB2水平。
图30示出了与用PBS处理的WT和基因敲除小鼠(对照组)相比，如通过蛋白质印迹(使用pEB-S222抗体；Baltussen等人，Chemical genetic identification of CDKL5substrates reveals its role in neuronal microtubuledynamics,2018,EMBO J,37:e99763)，在以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183的敲除小鼠中定性测量的激酶活性。
图31A示出了与用PBS处理的WT小鼠相比，在以1×1010、3×1010、6×1010GC的剂量新生儿ICV施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183后，小鼠皮层和海马体组织中具有CDKL5蛋白表达的神经元百分比的结果。
图31B示出了在以3×1010GC的剂量新生儿ICV施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183之后，来自用DAPI(细胞核)、CDKL5和NeuN(神经元标志物)染色的皮层切片组织的免疫荧光分析的代表性显微图像。
图32示出了当以1×1010、3×1010、6×1010GC的剂量施用PBS或AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183时，野生型和CDKL5-ko的测量体重的分析。
图33A示出了与Cdkl5-ko小鼠和WT小鼠中未处理组相比，以3×1010GC的剂量针对AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183处理组的后肢扣紧测试的结果。表明ko具有统计学上的显著改善(*p<0.05，**p<0.01)。
图33B示出了在以1×1010、3×1010、6×1010GC的剂量施用AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183后，在Cdkl5-ko小鼠和WT小鼠中如在旷场活动测试中测量的对多动性的剂量依赖性效应，并绘制为走动活动(光束中断)。表明ko具有统计学上的显著改善(*p<0.05，**p<0.01)
图34A示出了以1×1010GC的低剂量施用AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183的WT和Cdkl5-ko小鼠的组的分箱走动活动的结果。表明ko具有统计学上的显著改善(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
图34B示出了以3×1010GC的中等剂量施用AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183的WT和Cdkl5-ko小鼠的组的分箱走动活动的结果。
图34C示出了以6×1010GC的高剂量施用AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183的WT和Cdkl5-ko小鼠的组的分箱走动活动的结果。
图35示出了以1×1010、3×1010、6×1010GC的剂量经AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183处理的WT和Cdkl5-ko小鼠的筑巢结果(巢质量/评分)。
图36A示出了小脑延髓池内(ICM)施用程序的示意性概述。
图36B示出了作为荧光镜引导程序的ICM施用的更详细概述。
图37A示出了在施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183之后，如经由从NHP的不同脑区域提取的DNA/RNA的qPCR通过载体基因组拷贝测量的对脑转导的分析。
图37B示出了在施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183后，如经由从不同NHP脑区域提取的RNA的qPCR测量的相对CDKL5转基因表达(mRNA)(相对于当以3×1010GC的剂量施用时在小鼠脑中的表达)。
图38A示出基于单神经元的CDKL5基因疗法结果的分子分析的结果，绘制为通过载体基因组拷贝测量的转导神经元的百分比。
图38B示出如从单个神经元中可检测的CDKL5转基因mRNA测量的CDKL5转基因表达水平，绘制为转基因表达神经元的百分比。
图39A示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为开放区域中的时间(秒)。图39B示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雌性Cdkl5KO/X小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为开放区域中的时间(秒)。
图40A示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为开放区域进入。图40B示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雌性Cdkl5KO /X小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为开放区域进入。
图41A示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为总移动距离。图41B示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雌性Cdkl5KO/X小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为总移动距离。
图42A示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠中Y迷宫测试的结果，绘制为自发交替百分比。图42B示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雌性Cdkl5KO/X小鼠中Y迷宫测试的结果，绘制为自发交替百分比。
图43A示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠中情境恐惧调节测试的结果，绘制为冻结百分比。图43B示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雌性Cdkl5KO /X小鼠中情境恐惧调节测试的结果，绘制为冻结百分比。
图44A示出ICV施用表达人CDKL5(CDKL5/微管蛋白)的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中转基因产物表达的结果。图44B示出ICV施用表达人CDKL5(pS222/总EB2)的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中活性的结果。
图45A示出以低剂量ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。图45B示出以低剂量ICM施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。图45C示出以中剂量ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。图45D示出以中剂量ICM施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。图45E示出以高剂量ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。图45F示出以高剂量ICM施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。
图46示出了在ICM施用表达人CDKL5的AAV载体后成年恒河猴脑中转基因产物表达的结果–成年(3-10岁)雄性和雌性恒河猴以低剂量(3.0×1012GC)、中剂量(1.0×1013GC)或高剂量(3.0×1013GC)接受单次ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40或AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40(N＝每个载体每个剂量1只动物)。
图47A示出了原料药的上游制造过程流程图。图47B示出了原料药的下游制造过程流程图。
图48示出了原料药的制造过程流程图的概述。
具体实施方式
本文提供了用于治疗CDD的组合物和方法。将有效量的重组腺相关病毒(rAAV)递送至有需要的受试者，该重组腺相关病毒具有AAV衣壳(例如，AAVhu68)并且在其中包装有编码功能性人细胞周期蛋白依赖性激酶样5(hCDKL5)的载体基因组。
I.人CDKL5
细胞周期蛋白依赖性激酶样5(CDKL5，也称为CFAP247、丝氨酸/苏氨酸激酶9、STK9；Uniprot#076039)基因天然位于X染色体短(p)臂上的22.13位。CDLK5蛋白的N末端充当激酶，这是一种改变其他蛋白的活性的酶。已鉴定出CDKL5的几种直接底物(Baltussen等人，2018；Munoz等人，2018)。CDKL5的C末端具有未知的功能。
如本文所用，功能性hCDKL5蛋白是指与CDD不相关的CKDL5蛋白的同种型、天然变体、变体、多晶型物或截短物，并且/或者在动物模型或患者中该CKDL5蛋白的递送或表达可以改善CDD的症状或延迟其进展。参见，OMIM#300203，该网页中的每一者均通过引用整体并入本文。在某些实施例中，功能性hCDKL5具有SEQ ID NO:2(同种型1)的氨基酸序列或与其至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hCDKL5蛋白具有SEQ ID NO:19(同种型2)的氨基酸序列或与其至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hCDKL5蛋白具有SEQ ID NO:20(同种型3)的氨基酸序列或与其至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hCDKL5蛋白具有SEQ ID NO:21(同种型4)的氨基酸序列或与其至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hCDKL5是截短的hCDKL5，其包含具有该序列的甲基-CpG结合结构域(MBD)和NCoR/SMRT相互作用结构域(NID)。参见，WO2018172795A1，其通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，功能性hCDKL5蛋白在动物模型中改善CDD的症状或延迟其进展。一种示例性动物模型是CDKL5-ko小鼠。本文描述了其他合适的模型。
CDD症状或进展可以使用各种测定/方法来评价，该测定/方法包括但不限于存活图(例如，Kaplan-Meier存活图)、监测体重和观察行为变化(例如，通过后肢扣紧、旷场测定(运动功能)、高架区域迷宫(焦虑/风险与探索)、Y迷宫(学习和记忆/海马体)、大理石埋藏测定(先天行为和运动)、筑巢(先天社交行为)和转棒疲劳测定(运动功能、协调性))。在某些实施例中，在动物模型中功能性hCDKL5蛋白的施用或表达导致CDD症状的改善或CDD进展的延迟，由在对应的野生型动物中获得的测定结果的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或多于100％的测定结果所示。在某些实施例中，在CDD动物模型中功能性hCDKL5蛋白的施用或表达导致CDD症状的改善或CDD进展的延迟，由获自对应的未治疗的CDD动物的测定结果的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或多于100％的改进的测定结果所示。
本文提供了编码功能性hCDKL5蛋白的核酸序列，称为hCDKL5编码序列或CDKL5编码序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列选自SEQ ID NO:2(称为CDKL5或CDKL5co或CDKL5-1或CDKL5-1co)、或编码氨基酸序列NP_001032420.1(SEQ ID NO:19)的NCBI参考序列NM_001037343.1(称为CDKL5或CDKL5e1；SEQ ID NO:16)、编码氨基酸序列NP_001310218.1(SEQ ID NO:20)的NM_001323289.2(SEQ ID NO:17)以及编码氨基酸序列NP_003150.1(SEQ ID NO:21)的NM_003159.2(SEQ ID NO:18)，或与其至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的核酸序列。NCBI参考序列中的每一者均通过引用整体并入本文。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是经修饰的或工程化的(hCDKL5或hCDKL5co或CDKL5-1或CDKL5-1co)。经修饰的或工程化的序列与NCBI参考序列共有小于约70％(例如，约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性。
在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:22或与其至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9)相同的核酸序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:24或与其至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9)相同的核酸序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:25或与其至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9)相同的核酸序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:26或与其至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9)相同的核酸序列。
在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:37的工程化序列或与SEQ ID NO:37至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:38的工程化序列或与SEQ ID NO:38至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ IDNO:39的工程化序列或与SEQ ID NO:39至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:40的工程化序列或与SEQ ID NO:40至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:41的工程化序列或与SEQ ID NO:41至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:42的工程化序列或与SEQ ID NO:42至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:43的工程化序列或与SEQ ID NO:43至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ IDNO:44的工程化序列或与SEQ ID NO:44至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:45的工程化序列或与SEQ ID NO:45至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:46的工程化序列或与SEQ ID NO:46至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:47的工程化序列或与SEQ ID NO:47至少约95％相同的序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:48的工程化序列或与SEQ ID NO:48至少约95％相同的序列。
如本文所述，“核酸”可以是RNA、DNA或其修饰，并且可以是单链或双链的，并且可以选自例如包括以下项的组：编码目标蛋白质的核酸，寡核苷酸，核酸类似物，例如肽-核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)等。此类核酸序列包括，例如但不限于，编码蛋白质的核酸序列，例如充当转录阻遏物、反义分子、核酶、小抑制性核酸序列，例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微RNAi(mRNAi)、反义寡核苷酸等。
在核酸序列的情况下，术语“百分比(％)一致性”、“序列一致性”、“百分比序列一致性”或“百分比一致”是指当比对对应关系时相同的两个序列中的残基。期望序列同一性比较的长度可以超过基因组的全长、基因编码序列的全长或至少约500至5000个核苷酸的片段。然而，也可能期望较小片段(例如，至少约九个核苷酸，通常至少约20至24个核苷酸、至少约28至32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸)之间的同一性。
可以容易地确定蛋白质、多肽、约32个氨基酸、约330个氨基酸或其肽片段或对应核酸序列编码序列的全长上的氨基酸序列的百分比一致性。合适的氨基酸片段的长度可以是至少约8个氨基酸并且可以是至多约700个氨基酸。通常，当提及两种不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“类似性”时，参考“比对”序列来确定“同一性”、“同源性”或“类似性”。“比对”序列或“比对”是指与参考序列相比，通常含有对丢失的或另外的碱基或氨基酸的校正的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列。
使用多种公开或可商购获得的多序列比对程序中的任一种进行比对。序列比对程序可用于氨基酸序列，该程序例如“Clustal X”、“Clustal Omega”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。通常，以默认设置使用这些程序中的任何程序，尽管本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。可替代地，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，所述算法或计算机程序提供至少与参考算法和程序所提供的同一性或比对水平相同的同一性或比对。参见，例如，J.D.Thomson等人，Nucl.Acids.Res.,“Acomprehensive comparison of multiple sequence alignments”,27(13):2682-2690(1999)。
多个序列比对程序也可用于核酸序列。此类程序的实例包括“Clustal W”、“Clustal Omega”、“CAP Sequence Assembly”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”，该程序可通过因特网上的Web服务器进行访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。可替代地，也使用了载体NTI实用程序。本领域已知的许多算法可以用于测量核苷酸序列同一性，包含上述程序中所含有的算法。作为另一个实例，可以使用GCG 6.1版本的程序FastaTM比较多核苷酸序列。FastaTM提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可以是使用如GCG 6.1版本中所提供的采用其默认参数(字号6和评分矩阵的NOPAM系数)的FastaTM所确定的，所述程序通过引用并入本文。
II.表达盒
本文提供了包含在调控序列控制下的hCDKL5编码序列的核酸序列，也称为表达盒，该调控序列指导靶细胞中的hCDKL5表达。如本文所用，“表达盒”是指包含编码序列(例如，CDKL5编码序列)和与其可操作地连接的调控序列的核酸分子。在某些实施例中，载体基因组含有两个或更多个表达盒。术语“转基因”是指来自插入到靶细胞中的外源来源的DNA序列；通常，转基因编码产物(例如，CDKL5)。通常，待包装到病毒载体的此类表达盒含有本文所描述的基因产物的编码序列，该编码序列侧接病毒基因。组的包装信号和其它表达控制序列，诸如本文描述的序列。必要的调控序列以允许其在靶细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接至hCDKL5编码序列。如本文所用，“可操作地连接的”序列包括与hCDKL5编码序列邻接的调节转录、翻译和/或表达的序列以及以反式或在远处起作用以控制该hCDKL5编码序列的调控序列。表达盒可以含有基因序列上游(5'处)的调控序列，例如启动子、增强子、内含子等中的一者或多者以及增强子，或基因序列下游(3'处)的调控序列中的一者或多者，例如包括聚腺苷酸化位点的3'非翻译区(3'UTR)，以及其它元件。此类调控序列通常包含，例如启动子、增强子、内含子、Kozak序列、聚腺苷酸化序列和TATA信号中的一者或多者。在某些实施例中，启动子是组织特异性启动子，例如CNS特异性或神经元特异性启动子。在某些实施例中，启动子是人突触蛋白启动子(SEQ ID NO:23)。在某些实施例中，另外的或可替代的神经元特异性启动子序列可以选自神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等人，(1993)Cell.Mol.Neurobiol.,13:503 15)、神经丝轻链基因启动子(Piccioli等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611 5)、神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等人，(1995)Neuron,15:373 84)和/或其他。
在某些实施例中，人突触蛋白启动子具有序列(例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9或SEQID NO:23的nt 213至nt 678，在本文中也称为hSyn或Syn。
在其他实施例中，启动子是组成型启动子，例如具有巨细胞病毒增强子(CB7)启动子的鸡β肌动蛋白启动子、人延伸起始因子1α启动子(EF1a)启动子、人泛素C(UbC)启动子。在某些实施例中，调控序列指导中枢神经系统(CNS)细胞中的hCDKL5表达。在某些实施例中，UbC启动子包含SEQ ID NO:52的核酸序列。
在某些实施例中，靶细胞可以是中枢神经系统细胞。在某些实施例中，靶细胞是兴奋性神经元、抑制性神经元、神经胶质细胞、皮层细胞、额叶皮层细胞、大脑皮层细胞、脊髓细胞中的一者或多者。在某些实施例中，靶细胞是周围神经系统(PNS)细胞，例如视网膜细胞。也可以选择神经系统以外的其他细胞作为靶细胞，诸如单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、骨髓间充质细胞、干细胞、骨髓干细胞、心脏细胞、上皮细胞、食道细胞、胃细胞、胎儿切片细胞、结肠细胞、直肠细胞、肝细胞、肾细胞、肺细胞、唾液腺细胞、甲状腺细胞、肾上腺细胞、乳腺细胞、胰腺细胞、胰岛细胞、胆囊细胞、前列腺细胞、膀胱细胞、皮肤细胞、子宫细胞、子宫颈细胞、睾丸细胞或在没有CDD的受试者中表达功能性CDKL5蛋白的任何其他细胞。
在某些实施例中，可以包括另外的或可替代的启动子序列作为表达控制序列(调控序列)的一部分，例如位于所选择的5'ITR序列与编码序列之间。可以在本文所描述的载体中使用组成型启动子、可调控启动子[参见，例如WO 2011/126808和WO 2013/04943]、组织特异性启动子或对生理学线索有应答的启动子。一种或多种启动子可以选自不同的来源，例如人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子、SV40早期增强子/启动子、JC多瘤病毒启动子、髓鞘碱性蛋白(MBP)或神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、单纯疱疹病毒(HSV-1)潜伏期相关启动子(LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子、神经元特异性启动子(NSE)、血小板源性生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑色素浓缩激素(MCH)启动子、CBA、基质金属蛋白启动子(MPP)和鸡β-肌动蛋白启动子。
除启动子之外，载体还可以含有一种或多种其他合适的转录起始序列、转录终止序列、增强子序列、有效的RNA加工信号诸如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列，例如WPRE；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强所编码产物的分泌的序列。合适的增强子的实例是CMV增强子。其它合适的增强子包含适合于所期望的靶组织适应症的增强子。在一个实施例中，调控序列包含一个或多个表达增强子。在一个实施例中，调控序列含有两个或更多个表达增强子。这些增强子可以相同或彼此不同。例如，增强子可以包含CMV立即早期增强子。这种增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。可替代地，增强子的双拷贝可以被一个或多个序列分离。在仍另一个实施例中，表达盒进一步含有内含子，例如，鸡β-肌动蛋白内含子。在某些实施例中，内含子是嵌合内含子(CI)–由人β-球蛋白剪接供体和免疫球蛋白G(IgG)剪接受体元件组成的杂合内含子。其它合适的内含子包括本领域已知的内含子，例如，诸如WO 2011/126808中所述的内含子。合适的polyA序列的实例包括例如，兔球蛋白poly A、SV40、SV50、牛生长激素(bGH)、人生长激素和合成polyA。在某些实施例中，polyA序列是SV40 polyA序列。在某些实施例中，polyA序列是兔β球蛋白(RBG或rbg或rBG)polyA序列。在某些实施例中，polyA是包含SEQ ID NO:53的核酸序列的兔β球蛋白polyA。任选地，可以选择一个或多个序列来稳定mRNA。所提供的表达盒可以包括一个或多个表达增强子，诸如来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件(WPRE)、来自人肝炎病毒的转录后调控元件(HPRE)、来自地松鼠肝炎病毒的转录后调控元件(GPRE)或来自北极地松鼠肝炎病毒的转录后调控元件(AGSPRE)；或合成的转录后调控元件。当放置在3'UTR中时，这些表达增强元件特别有利，并且可以显著增加mRNA稳定性和/或蛋白质产量。在某些实施例中，所提供的表达盒包括调控序列，该调控序列是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)或其变体。合适的WPRE序列在本文描述的载体基因组中提供并且是本领域已知的(例如，诸如在美国专利第6,136,597号、第6,287,814号和第7,419,829号中描述的那些，其通过引用并入)。在某些实施例中，WPRE是已经突变以消除土拨鼠乙型肝炎病毒X(WHX)蛋白的表达的变体，包括例如WHX基因的起始密码子中的突变(参见，Zanta-Boussif等人，Gene Ther.2009年5月；16(5):605-19，其通过引用并入)。在其他实施例中，增强子选自非病毒来源。在某些实施例中，不存在WPRE序列。
在某些实施例中，表达盒是指具有SEQ ID NO:1的nt 213至4439的序列的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型1；SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。在某些实施例中，表达盒是指具有SEQ ID NO:5的nt 213至4562的序列的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型2或2GS SEQ IDNO:6)的氨基酸序列。在某些实施例中，表达盒是指具有SEQ ID NO:7的nt 213至4388的序列的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型3或3GS；SEQ ID NO:8)的氨基酸序列。在某些实施例中，表达盒是指具有SEQ ID NO:9的nt 213至4511的序列的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型4或4GS；SEQ ID NO:10)。在某些实施例中，表达盒包含选自SEQ ID NO:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48并且编码hCDKL5(同种型1；SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的工程化的核酸序列。在某些实施例中，表达盒是指具有SEQ ID NO:3的nt 213至4555的序列的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型1；SEQ ID NO:4)的氨基酸序列并且包含miRNA183(SEQ ID NO:11)。在某些实施例中，这些表达盒进一步包含用于减少drg表达的一个、两个、三个、四个或更多个miRNA序列。在某些实施例中，表达盒是指具有SEQ ID NO:29(或SEQ ID NO:59)的nt226至4608的序列的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型1；SEQ ID NO:30)的氨基酸序列并且包含miRNA183(SEQ ID NO:11)的4个串联重复序列。在某些实施例中，表达盒是指具有SEQID NO:49(或SEQ ID NO:50)的nt 220至4609的序列的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型1)的氨基酸序列并且包含miRNA183(SEQ ID NO:11)的4个串联重复序列。在某些实施例中，表达盒是指具有SEQ ID NO:31(或SEQ ID NO:60)的nt 224至4191的序列的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型1；SEQ ID NO:32)的氨基酸序列并且包含miRNA183(SEQ ID NO:11)的4个串联重复序列。参见，例如，2019年12月20日提交的PCT/US19/67872，并且现已公布为WO2020/132455。
在某些实施例中，表达盒包含miR183表达盒的四个拷贝。在某些实施例中，表达盒含有miR-183靶序列，其包括AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(SEQ ID NO:11)，其中与miR-183种子序列互补的序列加下划线。在某些实施例中，表达盒含有与miR-183种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，miR-183靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包括与miR-183种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，miR-183靶序列含有与SEQ ID NO:11部分互补的序列，并且因此，当与SEQ ID NO:11比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与SEQ ID NO:11比对时，miR-183靶序列包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配的序列，其中错配可以是非连续性的。在某些实施例中，miR-183靶序列包括具有100％互补性的区，所述区还包含miR-183靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区包括与miR-183种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，miR-183靶序列的其余部分与miR-183具有至少约80％至约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒包含miR-183靶序列，该靶序列包含截短的SEQ ID NO:11，即在SEQ ID NO:11的5'端或3'端中的任一端或两端处缺少至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒包含转基因和一个miR-183靶序列。在又其它实施例中，表达盒包含至少两个、三个或四个miR-183靶序列。在某些实施例中，表达盒中包含至少两个、三个或四个miR-183靶序列导致靶组织诸如心脏中转基因表达的水平增加。
在一个实施例中，表达盒包含UbC启动子、hCDKL5-1编码序列、miR183靶序列的4个拷贝以及polyA序列。在另一个实施例中，表达盒包含hSyn启动子、hCDKL5-1编码序列、miR183靶序列的4个拷贝以及polyA序列。在另一个实施例中，表达盒包含CBh启动子、hCDKL5-1编码序列、miR183靶序列的4个拷贝以及polyA序列。在某些实施例中，表达盒进一步包含至少一个内含子和/或至少一个增强子序列。在某些实施例中，增强子是缺乏表达土拨鼠乙型肝炎病毒X(WHX)蛋白的能力的突变WPRE元件。
在某些实施例中，载体基因组包含5'-AAV ITR序列、间隔序列、如本文所述的表达盒、间隔序列和3'-AAV ITR。适当地，在5'ITR序列与表达盒的5'端之间可以存在非编码间隔序列，并且在ITR序列的3'端与3'ITR之间可以存在非编码间隔序列。
在某些实施例中，表达盒包含SEQ ID NO:49(或SEQ ID NO:50)的nt 220至4609的核酸序列。在某些实施例中，表达盒包含SEQ ID NO:29(或SEQ ID NO:59)的nt226至4608的核酸序列。在某些实施例中，表达盒包含SEQ ID NO:31(或SEQ ID NO:60)的nt 224至4191的核酸序列。
III.rAAV
本文提供了可用于治疗CDD的重组腺相关病毒(rAAV)。rAAV包含(a)AAV衣壳；以及(b)包装在(a)的AAV衣壳中的载体基因组。适当地，所选择的AAV衣壳靶向待治疗的细胞。在某些实施例中，衣壳来自进化枝F。然而，在某些实施例中，可以选择另一种AAV衣壳来源。载体基因组包含反向末端重复序列(ITR)以及在指导hCDKL5表达的调控序列的控制下编码功能性人细胞周期蛋白依赖性激酶样5(hCDKL5)的核酸序列。在某些实施例中，CDKL5可以指的是CDKL5或hCDKL5、CDKL5-2GS或hCDKL5-2GS、CDKL5-3GS或hCDKL5-3GS、以及CDKL5-4GS或hCDKL5-4GS。在某些实施例中，hCDKL5编码序列与SEQ ID NO:22(编码CDKL5-1或hCDKL5-1的氨基酸序列；SEQ ID NO:2)至少约95％相同。在某些实施例中，hCDKL5编码序列与SEQ IDNO:24(编码CDKL5-2GS或hCDKL5-2GS的氨基酸序列；SEQ ID NO:6)至少约95％相同。在某些实施例中，hCDKL5编码序列与SEQ ID NO:25(编码CDKL5-3GS或hCDKL5-3GS的氨基酸序列；SEQ ID NO:8)至少约95％相同。在某些实施例中，hCDKL5编码序列与SEQ ID NO:26(编码CDKL5-4GS或hCDKL5-4GS的氨基酸序列；SEQ ID NO:10)至少约95％相同。在某些实施例中，hCDKL5编码序列与hCDKL5转录变体1至3(具有SEQ ID NO:16并且编码具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列NP_001032420.1的NM_001037343.1；具有SEQ ID NO:17并且编码具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列NP_001310218.1的NM_001323289.2；具有SEQ ID NO:18并且编码具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列NP_003150.1的NM_003159.2)中的任一者小于80％相同。在某些实施例中，hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46和47或者与其至少约95％相同(编码CDKL5-1或hCDKL5-1的氨基酸序列；SEQ ID NO:2)。在某些实施例中，功能性hCDKL5具有SEQ ID NO:2(CDKL5-1或hCDKL5-1)的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hCDKL5具有SEQ ID NO:6(CDKL5-2GS或hCDKL5-2GS)的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hCDKL5具有SEQ ID NO:8(CDKL5-3GS或hCDKL5-3GS)的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hCDKL5具有SEQ ID NO:10(CDKL5-4GS或hCDKL5-4GS)的氨基酸序列。在某些实施例中，调控序列指导中枢神经系统细胞中的hCDKL5表达。在某些实施例中，调控序列包含人突触蛋白启动子(hSyn)或CB7启动子。在某些实施例中，调控序列包含人泛素C(hUbC或UbC)启动子。在某些实施例中，调控元件包含Kozak序列、聚腺苷酸化序列、内含子、增强子和TATA信号中的一者或多者。在某些实施例中，载体基因组进一步包含背根神经节(drg)特异性miRNA靶序列中的至少两个串联重复序列，其中该至少两个串联重复序列包括可以相同或不同的至少一个第一miRNA靶序列和至少一个第二miRNA靶序列。在某些实施例中，载体基因组是SEQ ID NO:1的nt 1至nt 4634，或SEQ ID NO:3的nt 1至nt 4750，或SEQ IDNO:5的nt 1至nt 4757，或SEQ ID NO:7的nt 1至nt4583、或SEQ ID NO:9的nt 1至nt 4706，或与其至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的核酸序列。
在某些实施例中，载体基因组是指包含SEQ ID NO:1的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型1；SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。在某些实施例中，载体基因组是指包含SEQ ID NO:5的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型2或2GS SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。在某些实施例中，载体基因组是指包含SEQ ID NO:7的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型3或3GS；SEQ IDNO:8)的氨基酸序列。在某些实施例中，载体基因组是指包含SEQ ID NO:9的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型4或4GS；SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。在某些实施例中，载体基因组是指包含SEQ ID NO:3的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型1；SEQ ID NO:4)的氨基酸序列并且包含miRNA183(SEQ ID NO:11)。在某些实施例中，载体基因组是指包含SEQ ID NO:29的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型1；SEQ ID NO:30)的氨基酸序列并且包含miRNA183(SEQ IDNO:11)的串联重复序列。在某些实施例中，载体基因组是指包含SEQ ID NO:31的核酸分子，其编码hCDKL5(同种型1；SEQ ID NO:32)的氨基酸序列并且包含miRNA183(SEQ ID NO:11)的串联重复序列。
在某些实施例中，除hCDKL5编码序列之外，另一种非AAV编码序列可以包括在内，例如，肽、多肽、蛋白质、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制剂)或其它目的基因产物。有用的基因产物可以包含miRNA。miRNA和其它小干扰核酸通过靶信使RNA(mRNA)的靶RNA转录物裂解/降解或转译抑制来调节基因表达。miRNA是天然表达的，通常作为最终的19-25种非转译的RNA产物。miRNA通过与靶mRNA的3'非转译区(UTR)的序列特异性相互作用展现出其活性。这些内源表达的miRNA形成发夹前体，所述发夹前体随后被加工成miRNA双链体，并且被进一步加工成“成熟的”单链miRNA分子。这种成熟的miRNA引导多蛋白复合物miRISC，该多蛋白复合物基于其与成熟的miRNA的互补性来鉴定靶mRNA的靶位点，例如在3'UTR区中。
如本文所用，“miRNA靶序列”是定位在DNA正链(5'至3')上的序列，并且至少部分地与miRNA序列(包括miRNA种子序列)互补。miRNA靶序列对于经编码的转基因产物的非翻译区是外源性的，并且被设计成在期望抑制转基因表达的细胞中被miRNA特异性地靶向。术语“miR183簇靶序列”是指响应miR183簇(可替代地称为家族)的一个或多个成员的靶序列，包括miR-183、miR-96和miR-182(如通过Dambal,S.等人Nucleic Acids Res 43:7173-7188,2015所述，其通过引用并入本文)。
通常，miRNA靶序列的长度为至少7个核苷酸至约28个核苷酸、长度为至少8个核苷酸至约28个核苷酸、7个核苷酸至28个核苷酸、8个核苷酸至18个核苷酸、长度为12个核苷酸至28个核苷酸、约20至约26个核苷酸、约22个核苷酸、约24个核苷酸或约26个核苷酸，并且含有至少一个与miRNA种子序列互补的连续区(例如，7或8个核苷酸)。在某些实施例中，靶序列包括与miRNA种子序列具有精确互补性(100％)或部分互补性且具有一些错配的序列。在某些实施例中，靶序列包括与miRNA种子序列100％互补的至少7至8个核苷酸。在某些实施例中，靶序列由与miRNA种子序列100％互补的序列组成。在某些实施例中，靶序列含有与种子序列100％互补的序列的多个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，100％互补性区包括靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，靶序列的剩余部分与miRNA具有至少约80％至约99％的互补性。在某些实施例中，在含有DNA正链的表达盒中，miRNA靶序列是miRNA的反向补体。
如本文所用，“miRNA靶序列”是定位在DNA正链(5'至3')上的序列，并且至少部分地与miRNA序列(包括miRNA种子序列)互补。miRNA靶序列对于经编码的转基因产物的非翻译区是外源性的，并且被设计成在期望抑制转基因表达的细胞中被miRNA特异性地靶向。术语“miR183簇靶序列”是指响应miR183簇(可替代地称为家族)的一个或多个成员的靶序列，包括miR-183、miR-96和miR-182(如通过Dambal,S.等人Nucleic Acids Res 43:7173-7188,2015所述，其通过引用并入本文)。不希望受理论的束缚，转基因的信使RNA(mRNA)(编码基因产物)存在于含有miRNA的表达盒被递送的细胞类型中，使得miRNA与3'UTR miRNA靶序列的特异性结合导致mRNA沉默和切割，从而仅在表达miRNA的细胞中减少或消除转基因表达。
通常，miRNA靶序列的长度为至少7个核苷酸至约28个核苷酸、长度为至少8个核苷酸至约28个核苷酸、7个核苷酸至28个核苷酸、8个核苷酸至18个核苷酸、长度为12个核苷酸至28个核苷酸、约20至约26个核苷酸、约22个核苷酸、约24个核苷酸或约26个核苷酸，并且含有至少一个与miRNA种子序列互补的连续区(例如，7或8个核苷酸)。在某些实施例中，靶序列包括与miRNA种子序列具有精确互补性(100％)或部分互补性且具有一些错配的序列。在某些实施例中，靶序列包括与miRNA种子序列100％互补的至少7至8个核苷酸。在某些实施例中，靶序列由与miRNA种子序列100％互补的序列组成。在某些实施例中，靶序列含有与种子序列100％互补的序列的多个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，100％互补性区包括靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，靶序列的剩余部分与miRNA具有至少约80％至约99％的互补性。在某些实施例中，在含有DNA正链的表达盒中，miRNA靶序列是miRNA的反向补体。
在某些实施例中，表达盒mRNA或DNA正链的至少第一和/或至少第二miRNA靶序列的miRNA靶序列选自：(i)AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(miR183，SEQ ID NO:11)；或(ii)AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(miR182，SEQ ID NO:13)。在其他实施例中，选择AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC(SEQ ID NO:14)。
在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有作为miR-183靶序列的至少一个miRNA靶序列。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有miR-183靶序列，该靶序列包括AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(SEQ ID NO:11)，其中与miR-183种子序列互补的序列是GTGCCAT。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有与miR-183种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，miR-183靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包括与miR-183种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，miR-183靶序列含有与SEQ ID NO:11部分互补的序列，并且因此，当与SEQ IDNO:11比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与SEQ ID NO:11比对时，miR-183靶序列包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配的序列，其中错配可以是非连续性的。在某些实施例中，miR-183靶序列包括具有100％互补性的区，所述区还包含miR-183靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区包括与miR-183种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，miR-183靶序列的其余部分与miR-183具有至少约80％至约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含miR-183靶序列，该靶序列包含截短的SEQ ID NO:11，即在SEQ ID NO:11的5'端或3'端中的任一端或两端处缺少至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含转基因和一个miR-183靶序列。在其它实施例中，表达盒或载体基因组包含至少两个、三个或四个miR-183靶序列。(i)AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(miR183，SEQ ID NO:11)；
在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有作为miR-182靶序列的至少一个miRNA靶序列。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有miR-182靶序列，该靶序列包括AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO:13)。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有与miR-182种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，miR-182靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包括与miR-182种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，miR-182靶序列含有与SEQ ID NO:13部分互补的序列，并且因此，当与SEQ ID NO:13比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与SEQ ID NO:13比对时，miR-183靶序列包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配的序列，其中错配可以是非连续性的。在某些实施例中，miR-182靶序列包括具有100％互补性的区，所述区还包含miR-182靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区包括与miR-182种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，miR-182靶序列的其余部分与miR-182具有至少约80％至约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含miR-182靶序列，该靶序列包含截短的SEQ ID NO:13，即在SEQ ID NO:13的5'端或3'端中的任一端或两端处缺少至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含转基因和一个miR-182靶序列。在其它实施例中，表达盒或载体基因组包含至少两个、三个或四个miR-182靶序列。
本文所使用的术语“串联重复序列”是指存在两个或更多个连续miRNA靶序列。这些miRNA靶序列可以是连续的，即一个接一个地直接定位，使得一个靶序列的3'端直接位于下一个靶序列的5'端的上游，没有中间序列，或者反之亦然。在另一个实施例中，miRNA靶序列中的两个或更多个由短间隔序列隔开。
如本文所用，“间隔子”是任何所选核酸序列，例如，长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的定位在两个或更多个连续miRNA靶序列之间的核酸序列。在某些实施例中，间隔子的长度为1个到8个核苷酸、长度为2个到7个核苷酸、长度为3个到6个核苷酸、长度为四个核苷酸、4个到9个核苷酸、3个到7个核苷酸或更大的值。合适地，间隔子是非编码序列。在某些实施例中，间隔子可以具有四(4)个核苷酸。在某些实施例中，间隔子是GGAT。在某些实施例中，间隔子是六(6)个核苷酸。在某些实施例中，间隔子是CACGTG或GCATGC。
在某些实施例中，串联重复序列含有相同miRNA靶序列中的两个、三个、四个或更多个。在某些实施例中，串联重复序列含有至少两个不同的miRNA靶序列、至少三个不同的miRNA靶序列、或至少四个不同的miRNA靶序列等。在某些实施例中，串联重复序列可以含有两个或三个相同的miRNA靶序列以及不同的第四miRNA靶序列。
在某些实施例中，表达盒中可存在至少两组不同的串联重复序列。例如，3'UTR可含有紧接在转基因下游的串联重复序列、UTR序列和两个或更多个更接近UTR的3'端的串联重复序列。在另一实例中，5'UTR可含有一个、两个或更多个miRNA靶序列。在另一实例中，3'可含有串联重复序列，并且5'UTR可含有至少一个miRNA靶序列。
在某些实施例中，表达盒含有两个、三个、四个或更多个串联重复序列，所述串联重复序列在转基因的终止密码子的约0个至20个核苷酸内开始。在其它实施例中，表达盒含有距转基因的终止密码子至少100个至约4000个核苷酸的miRNA串联重复序列。
在某些实施例中，所述miRNA靶序列之间的所述间隔子是相同的。如本文所用，CDKL5或hCDKL5是指同种型1，除非另有说明。同种型2至4可以指定为：CDKL5-2GS或hCDKL5-2GS、CDKL5-3GS或hCDKL5-3GS、以及CDKL5-4GS或hCDKL5-4GS。具有这些同种型的表达盒和载体基因组可以如针对同种型1所述进行构建。
参见，2019年12月20日提交的PCT/US19/67872，现为WO 2020/132455，其通过引用并入本文，以及2020年5月12日提交的美国临时专利申请第63/023,593号；2020年6月12日提交的美国临时专利申请第63/038,488号；2020年6月24日提交的美国临时专利申请第63/043,562号；以及2020年9月16日提交的美国临时专利申请第63/079,299号、2011年2月22日提交的美国临时专利申请第63/152,042号，其通过引用特此并入。
在某些实施例中，进化枝F AAV衣壳选自AAVhu68衣壳、AAV9衣壳、AAVhu31衣壳、AAVhu32衣壳或这些衣壳中的一者的工程化变体。编码AAVhu68衣壳蛋白的核酸序列在下面的实例中用于生产携带载体基因组的AAV.hCDKL5重组AAV(rAAV)。涉及AAVhu68的另外的细节于WO 2018/160582和US2015/0079038中提供，该文献中的每一者均通过引用整体并入本文。本文所述的进化枝F载体非常适合于将包含hCDKL5编码序列的载体基因组递送至中枢神经系统(包括脑、海马体、运动皮层、小脑和运动神经元)内的细胞。这些载体可用于靶向中枢神经系统(CNS)内的其他细胞以及CNS之外的某些其他组织和细胞。
在某些实施例中，基于靶细胞选择用于本文所述的组合物和方法的AAV衣壳。在某些实施例中，AAV衣壳转导CNS细胞和/或PNS细胞。在某些实施例中，AAV衣壳选自cy02衣壳、rh43衣壳、AAV8衣壳、rh01衣壳、AAV9衣壳、rh8衣壳、rh10衣壳、bb01衣壳、hu37衣壳、rh02衣壳、rh20衣壳、rh39衣壳、rh64衣壳、AAV6衣壳、AAV1衣壳、hu44衣壳、hu48衣壳、cy05衣壳、hu11衣壳、hu32衣壳、pi2衣壳或其变体。在某些实施例中，AAV衣壳是进化枝F衣壳，诸如AAV9衣壳、AAVhu68衣壳、hu31衣壳、hu32衣壳或其变体。参见，例如，WO 2005/033321(2015年4月14日公开)、WO 2018/160582和US2015/0079038，该文献中的每一者通过引用整体并入本文。在某些实施例中，AAV衣壳是非进化枝F衣壳，例如进化枝A、B、C、D或E衣壳。在某些实施例中，非进化枝F衣壳是AAV1或其变体。在某些实施例中，AAV衣壳转导除神经系统细胞之外的靶细胞。在某些实施例中，AAV衣壳是进化枝A衣壳(例如，AAV1、AAV6、AAVrh91)、进化枝B衣壳(例如，AAV 2)、进化枝C衣壳(例如，hu53)、进化枝D衣壳(例如，AAV7)或进化枝E衣壳(例如，rh10)。在某些实施例中，AAV衣壳是进化枝A衣壳，诸如AAVrh91衣壳(SEQ ID NO:33和35的核酸序列)。参见，2020年4月29日提交的PCT/US20/030266，现已公布为WO2020/223231，其通过引用并入本文，以及2019年4月29日提交的美国临时美国专利申请第63/065,616号，其通过引用特此并入。另参见，2020年8月14日提交的美国临时申请第63/065,616号、和2020年11月4日提交的美国临时专利申请第63/109,734号、以及2021年8月13日提交的国际申请第PCT/US21/45945号，其通过引用并入本文。尽管如此，也可以选择其他AAV衣壳。
在某些实施例中，AAV衣壳是AAVhu68衣壳或AAVrh91衣壳。在某些实施例中，由编码SEQ ID NO:61的氨基酸序列的核酸序列产生AAVhu68衣壳。在某些实施例中，AAVhu68衣壳包含：(i)由编码SEQ ID NO:61的核酸序列产生的AAVhu68 vp1蛋白、AAVhu68 vp2蛋白和AAVhu68 vp3蛋白；或者(ii)AAVhu68 vp1、AAVhu68 vp2和AAVhu68vp3蛋白的异源群体，其中AAVhu68 vp1、AAVhu68 vp2和AAV hu68 vp3蛋白相对于SEQ ID NO:61中的氨基酸，在天冬酰胺-甘氨酸对的位置57、329、452、512中的每一者处包含至少50％至100％的脱酰胺天冬酰胺(N)，其中脱酰胺天冬酰胺被脱酰胺为天冬氨酸、异天冬氨酸、相互转化的天冬氨酸/异天冬氨酸对、或其组合，如使用质谱所测定的。在某些实施例中，编码AAVhu68 vp1蛋白的核酸序列是SEQ ID NO:57，或与编码SEQ ID NO:61的氨基酸序列的SEQ ID NO:57至少80％至至少99％相同的序列；任选地其中该核酸序列与SEQ ID NO:57至少80％至97％相同。参见，例如，WO 2018/160582和WO2019/169004，其通过引用整体并入本文。
如本文所使用的，与AAV的组有关的术语“进化枝”是指如基于对AAV vp1氨基酸序列进行的比对，通过(至少1000个复制品的)至少75％的自举值(bootstrap value)和不大于0.05的泊松校正距离测量结果(Poisson correction distance measurement)使用邻接算法(Neighbor-Joining algorithm)确定的一组在系统发育上彼此相关的AAV。在文献中已经描述了邻接算法。参见，例如，M.Nei和S.Kumar,Molecular Evolution andPhylogenetics(Oxford University Press,New York(2000)。提供了可以用于实施此算法的可用计算机程序。例如，MEGA v2.1程序实施了经修改的Nei-Gojobori方法。使用这些技术和计算机程序以及AAV vp1衣壳蛋白的序列，本领域技术人员可以容易地确定所选AAV是含在本文所鉴定的进化枝之一中，还是在这些进化枝之外的另一个进化枝中。参见，例如，GGao,等人，J Virol,2004年6月；78(10):6381-6388，其鉴定了进化枝A、B、C、D、E和F，并提供了新AAV的核酸序列，GenBank登录号AY530553至AY530629。还参见WO 2005/033321。
rAAV由AAV衣壳和载体基因组构成。AAV衣壳是vp1的异质群体、vp2的异质群体和vp3蛋白的异质群体的组装。如本文所使用的，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异质”或其任何语法变型是指由不相同的元件组成的群体，例如具有带有不同的经修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白质)。
如本文所使用的，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异质”或其任何语法变型是指由不相同的元件组成的群体，例如具有带有不同的经修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白质)。如与vp1、vp2和vp3蛋白(可替代地被称为同种型)结合使用的术语“异质群体”是指衣壳内的vp1、vp2和vp3蛋白的氨基酸序列中的差异。AAV衣壳含有具有来自预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含某些脱酰胺化的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，某些亚群包含天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺的天冬酰胺(N)位置，并且任选地进一步包含其它脱酰胺的氨基酸，其中脱酰胺引起氨基酸变化和其它任选的修饰。
在某些实施例中，提供了AAV衣壳，其具有含有多个高度脱酰胺化的“NG”位置的AAV衣壳同种型(即，VP1、VP2、VP3)的异质群体。在某些实施例中，高度脱酰胺化的位置在下文参考预测的全长VP1氨基酸序列鉴定的位置中。在其它实施例中，衣壳基因被修饰成使得参考的“NG”被消融，并且突变体“NG”被工程化到另一个位置中。
如本文所用，术语“靶细胞”和“靶组织”可以指打算被受试者AAV载体转导的任何细胞或组织。所述术语可以指肌肉、肝脏、肺、气道上皮、中枢神经系统、神经元、眼睛(眼细胞)或心脏中的任何一种或多种。
如本文所用，术语“载体基因组”是指包装在病毒衣壳例如AAV衣壳中并且能够被递送至宿主细胞或患者的细胞中的核酸分子。在某些实施例中，载体基因组是表达盒，该表达盒具有将载体基因组包装到AAV衣壳的最末端5'和3'端所必需的反向末端重复(ITR)序列，并且其间含有如本文所述的、可操作地连接至指导其表达的序列的CDLK5基因。在某些实施例中，载体基因组可至少包含从5'至3'的AAV 5'ITR、编码序列和AAV 3'ITR。在某些实施例中，ITR来自AAV2，可以选择与衣壳不同的源AAV，或其他全长ITR。在某些实施例中，ITR来自与在产生或反式补充AAV期间提供rep功能的AAV来源相同的AAV。进一步地，可以使用其它ITR。载体基因组在本文中有时被称作“迷你基因”。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”可以指rAAV由质粒产生的包装细胞系。在替代方案中，术语“宿主细胞”可以指需要转基因表达的靶细胞。
如上所述，提供了rAAV，其具有靶向所需细胞的AAV衣壳和载体基因组，该载体基因组至少包含将载体基因组包装到衣壳中所需的AAV ITR、hCDKL5编码序列和指导其表达的调控序列。在某些实施例中，载体基因组是单链AAV载体基因组。在某些实施例中，本发明中可使用rAAV载体，该载体含有自身互补(sc)AAV载体基因组。
载体的AAV序列通常包括顺式作用的5'和3'反向末端重复(ITR)序列(参见，例如，B.J.Carter,于“Handbook of Parvoviruses”,P.Tijsser编辑,CRC Press,第155 168页(1990))。ITR序列的长度为约145个碱基对(bp)。优选地，分子中使用了编码ITR的基本上整个序列，尽管允许对这些序列进行一定程度的微小修饰。修饰这些ITR序列的能力在本领域的技术范围内。(参见，例如，诸如Sambrook等人，“Molecular Cloning.ALaboratoryManual”,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；以及K.Fisher等人，J.Virol.,70:520 532(1996)的文本)。在本发明中采用的此类分子的实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选转基因序列和相关的调控元件侧接有5'和3'AAV ITR序列。在一个实施例中，ITR来自与供应衣壳的AAV不同的AAV。在一个实施例中，ITR序列来自AAV2。已经描述了被称为ΔITR的5'ITR的缩短版本，其中缺失了D序列和末端解析位点(trs)。在其它实施例中，使用了全长AAV 5'和3'ITR。在某些实施例中，载体基因组包括130个碱基对的缩短的AAV2 ITR，其中外部A元件缺失。在使用内部A元件作为模板的载体DNA扩增期间，缩短的ITR回复到145个碱基对的野生型长度。在某些实施例中，5'ITR包含SEQ ID NO:51的核酸序列。在某些实施例中，3'ITR包含SEQ ID NO:54的核酸序列。然而，可以选择来自其它AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一个AAV来源的情况下，所得载体可以被称为假型的。然而，这些元件的其它构型可以是合适的。
在某些实施例中，构建载体基因组，其包含5'AAV ITR-启动子-任选的增强子-任选的内含子-hCDKL5编码序列-polyA-3'ITR。在某些实施例中，构建载体基因组，其包含5'AAV ITR-启动子-任选的增强子-任选的内含子-hCDKL5编码序列-任选地重复miR(去)靶向序列-polyA-3'ITR。在某些实施例中，构建载体基因组，其包含5'AAV ITR-启动子-任选的内含子-hCDKL5编码序列-任选的增强子-polyA-3'ITR。在某些实施例中，构建载体基因组，其包含5'AAV ITR-启动子-任选的增强子-任选的内含子-hCDKL5编码序列-任选的增强子-任选地重复miR(去)靶向序列-polyA-3'ITR。在某些实施例中，ITR来自AAV2。在某些实施例中，存在多于一个启动子。在某些实施例中，增强子存在于载体基因组中。在某些实施例中，存在多于一个增强子。在某些实施例中，内含子存在于载体基因组中。在某些实施例中，存在增强子和内含子。在某些实施例中，polyA是SV40 poly A(即，源自猿猴病毒40(SV40)晚期基因的聚腺苷酸化(PolyA)信号)。在某些实施例中，polyA是兔β-球蛋白(RBG)poly A。在某些实施例中，载体基因组至少包含：5'AAV ITR-hSyn启动子-hCDKL5编码序列-poly A-3'ITR。在某些实施例中，载体基因组至少包含5'AAV ITR-CB7启动子-hCDKL5编码序列-RBGpoly A-3'ITR。在某些实施例中，drg脱靶序列是如本文所述的一个、两个、三个、四个或更多个miR183序列并且包含在表达盒中。在某些实施例中，hCDKL5编码序列针对CDKL5。在某些实施例中，hCDKL5编码序列针对CDKL5-2GS。在某些实施例中，hCDKL5编码序列针对CDKL5-3GS。在某些实施例中，hCDKL5编码序列针对CDKL5-4GS。任选地，这些载体基因组中的一者或多者包括WPRE元件。
如本文所用，载体基因组或包含载体基因组的rAAV在本文中举例说明为AAV.启动子(任选).Kozak(任选).内含子(任选).CDKL5编码序列(例如，hCDKL5、hCDKL5co、CDKL5、CDKL5co).miRNA(任选).polyA(任选).填充物(任选)。在某些实施例中，rAAV在本文中举例说明为AAV衣壳.启动子(任选).Kozak(任选).内含子(任选).CDKL5编码序列.miRNA(任选).polyA(任选).填充物(任选)。任选地，这些载体基因组中的一者或多者包括WPRE元件。
在某些实施例中，载体基因组至少包含5'AAV ITR-泛素C启动子-hCDKL5编码序列-RBG poly A-3'ITR。在某些实施例中，载体基因组包含SEQ ID NO:58的核酸序列。在某些实施例中，载体基因组至少包含5'AAV ITR-泛素C启动子-hCDKL5编码序列-一个、两个、三个、四个或更多个miR183序列-RBG poly A-3'ITR。在某些实施例中，载体基因组包含SEQID NO:29的核酸序列。在某些实施例中，载体基因组包含SEQ ID NO:49的核酸序列。在某些实施例中，载体基因组至少包含5'AAV ITR-鸡β肌动蛋白杂合启动子-hCDKL5编码序列-一个、两个、三个、四个或更多个miR183序列-RBG poly A-3'ITR。在某些实施例中，载体基因组包含SEQ ID NO:31的核酸序列。任选地，这些载体基因组中的一者或多者包括WPRE元件。
另外地，本文提供了可用于生产如本文所述的rAAV的rAAV生产系统。该生产系统包含细胞培养物，该细胞培养物包含(a)编码AAV衣壳蛋白的核酸序列；(b)载体基因组；以及(c)足够的AAV rep功能和辅助功能，以允许将载体基因组包装到AAV衣壳中。在某些实施例中，载体基因组是SEQ ID NO:1、3、5、7、9、29或31。在某些实施例中，细胞培养物是人胚肾293细胞培养物。在某些实施例中，AAV rep来自不同的AAV。在某些实施例中，其中AAV rep来自AAV2。在某些实施例中，AAV2 rep由SEQ ID NO:56的核酸序列编码。在某些实施例中，AAV rep编码序列和cap基因位于同一核酸分子上，其中rep序列与cap基因之间任选地存在间隔子。在某些实施例中，间隔子是atgacttaaaccaggt(SEQ ID NO:15)。
为了用于生产AAV病毒载体(例如，重组(r)AAV)，可将载体基因组载于任何合适的载体，例如质粒上，将其递送到包装宿主细胞中。可将用于本发明的质粒进行工程化，以使它们适于在原核细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等中进行体外复制和包装。合适的转染技术和包装宿主细胞是已知的和/或可以由本领域的技术人员容易地设计。
用于产生和分离适合于用作载体的AAV的方法是本领域已知的。一般参见，例如，Grieger&Samulski,2005,Adeno-associated virus as a gene therapy vector:Vectordevelopment,production and clinical applications,Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.99:119-145；Buning等人，2008,Recent developments in adeno-associatedvirus vector technology,J.Gene Med.10:717-733；以及下文引用的参考文献，这些参考文献中的每一者通过引用整体并入本文。如本文所用，基因疗法载体是指如本文所述的rAAV，其适合用于治疗患者。为了将基因包装到病毒粒子中，ITR是在与含有该基因的核酸分子相同的构建体中需要的顺式的唯一AAV组分。cap和rep基因可以反式供应。
在某些实施例中，用于rAAV的制造过程涉及如2022年8月16日提交的美国临时专利申请第63/371,597号和2022年8月16日提交的美国临时专利申请第63/371,592号中描述的方法，该专利申请通过引用整体并入本文。
在一个实施例中，所选基因元件可以通过任何合适的方法递送至AAV包装细胞，所述方法包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合。也可以制备稳定的AAV包装细胞。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见，例如，MolecularCloning:A Laboratory Manual,Green和Sambrook编辑,Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,NY(2012)。
术语“AAV中间体”或“AAV载体中间体”是指缺少包装在其中的所期望的基因组序列的组装的rAAV衣壳。这些也可以被称为“空”衣壳。此类衣壳可以不含有表达盒的可检测基因组序列，或者含有不足以实现基因产物的表达的仅部分包装的基因组序列。这些空衣壳是无功能性的以将所关注的基因转移至宿主细胞。
可以使用已知的技术产生本文所描述的重组腺相关病毒(AAV)。参见，例如，WO2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此类方法涉及培养含有编码AAV衣壳蛋白的核酸序列的宿主细胞；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重复序列(ITR)和转基因组成的表达盒；以及足够的辅助功能，以允许将表达盒包装到AAV衣壳蛋白中。已经描述了产生衣壳的方法、其编码序列以及用于产生rAAV病毒载体的方法。参见，例如，Gao,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10),6081-6086(2003)以及US2013/0045186A1。
在一个实施例中，提供了一种可用于生产重组AAVhu68或AAVrh91的生产细胞培养物。此类细胞培养物含有在宿主细胞中表达AAVhu68衣壳蛋白的核酸；适合于包装到AAVhu68衣壳中的核酸分子，例如，含有AAV ITR以及编码可操作地连接至调控序列的基因的非AAV核酸序列的载体基因组，该调控序列指导该基因在宿主细胞中的表达；以及足够的AAV rep功能和腺病毒辅助功能，以允许将载体基因组包装到重组AAVhu68或AAVrh91衣壳中。在一个实施例中，细胞培养物由哺乳动物细胞(例如，人胚肾293细胞以及其它细胞)或昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(Sf9)细胞)构成。在某些实施例中，杆状病毒提供将载体基因组包装到重组AAVhu68或AAVrh91衣壳中所必需的辅助功能。
任选地，rep功能由AAV而不是hu68提供。在某些实施例中，至少部分的rep功能来自AAVhu68或AAVrh91。在另一个实施例中，rep蛋白是除了AAVhu68rep之外的异源rep蛋白，例如但不限于AAV1 rep蛋白、AAV2 rep蛋白、AAV3 rep蛋白、AAV4 rep蛋白、AAV5 rep蛋白、AAV6 rep蛋白、AAV7 rep蛋白、AAV8 rep蛋白；或rep 78、rep68、rep 52、rep 40、rep68/78和rep40/52；或其片段；或另一种来源。这些AAVhu68或突变体AAV衣壳序列中的任一者都可以在指导其在宿主细胞中表达的外源性调控控制序列的控制下。
在一个实施例中，在合适的细胞培养物(例如，HEK 293或Sf9)或悬浮液中制造细胞。用于制造本文所描述的基因疗法载体的方法包含本领域众所周知的方法，如产生用于产生基因疗法载体的质粒DNA、产生载体以及纯化载体。在一些实施例中，基因疗法载体是AAV载体，并且所生成的质粒是编码AAV载体基因组和目的基因的AAV顺式质粒、含有AAVrep和cap基因的AAV反式质粒以及腺病毒辅助质粒。载体产生过程可以包含方法步骤，如开始细胞培养、进行细胞传代、接种细胞、用质粒DNA转染细胞、将转染后介质交换为无血清介质以及采集含载体的细胞和介质。所采集的含载体的细胞和介质在本文中被称为粗细胞采集物。在又另一个系统中，通过用基于杆状病毒的载体进行感染来将基因疗法载体引入到昆虫细胞中。关于这些生产系统的综述，一般参见，例如，Zhang等人，2009,Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associatedvirus production,Human Gene Therapy 20:922-929，该文献中的每一者的内容通过引用整体并入本文。制备和使用这些和其它AAV生产系统的方法也描述于以下美国专利中，该文献中的每一者的内容通过引用整体并入本文：美国专利第5,139,941号；第5,741,683号；第6,057,152号；第6,204,059号；第6,268,213号；第6,491,907号；第6,660,514号；第6,951,753号；第7,094,604号；第7,172,893号；第7,201,898号；第7,229,823号；和第7,439,065号。
此后，粗细胞采集物可以是本主题的方法步骤，如浓缩载体采集物、渗滤载体采集物、微流化载体采集物、核酸酶消化载体采集物、过滤经微流化的中间体、通过色谱粗纯化、通过超速离心法粗纯化、通过切向流过滤进行缓冲液交换和/或调配和过滤以制备大量载体。
在高盐浓度下进行两步亲和色谱法纯化，随后使用阴离子交换树脂色谱法来纯化载体药物产物并去除空衣壳。这些方法在于2016年12月9日提交的WO 2017/160360及其优先权文件、于2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,071号以及于2015年12月11日提交并且标题为“Scalable Purification Method for AAV9”的第62/226,357号中更详细地描述，这些专利申请通过引用并入本文。在某些实施例中，载体药物产品(例如，AAVrh91)的纯化包括在2016年12月9日提交的WO2017/100674及其优先权文件、2015年12月9日提交的美国临时专利申请第62/266,351号、以及2016年4月13日提交并且标题为“ScalablePurification Method for AAV1”的62/322,083中更详细描述的那些，这些专利申请通过引用并入本文。
为了计算空颗粒和满颗粒的含量，将所选样品(例如，在本文的实例中经过碘克沙醇梯度纯化的制剂，其中基因组拷贝(GC)数＝颗粒数)的VP3带体积相对于加载的GC颗粒进行作图。所得线性等式(y＝mx+c)用于计算测试制品峰的带状体积中的颗粒的数量。然后将加载的每20μL颗粒数量(pt)乘以50，以得到颗粒(pt)/mL。将Pt/mL除以GC/mL得到颗粒与基因组拷贝的比率(pt/GC)。Pt/mL–GC/mL得到空pt/mL。空pt/mL除以pt/mL并且×100得到空颗粒的百分比。
通常，用于测定具有包装的基因组的空衣壳和AAV载体颗粒的方法是本领域已知的。参见，例如，Grimm等人，Gene Therapy(1999)6:1322-1330；Sommer等人，Molec.Ther.(2003)7:122-128。为了测试变性的衣壳，所述方法包含使经处理的AAV原种经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如在缓冲液中含有3-8％三乙酸盐的梯度凝胶)，然后运行凝胶直到分离出样品材料，并且将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜(优选地尼龙)上。然后，将抗AAV衣壳抗体用作与变性的衣壳蛋白结合的初级抗体，优选地抗AAV衣壳单克隆抗体，最优选地B1抗AAV-2单克隆抗体(Wobus等人，J.Virol.(2000)74:9281-9293)。然后使用次级抗体，所述次级抗体与初级抗体结合并且含有一种用于检测与初级抗体的结合的装置，更优选地是含有与其共价结合的检测分子的抗IgG抗体，最优选地是与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠IgG抗体。一种用于检测结合的方法用于半定量地确定初级抗体与次级抗体之间的结合，优选地是能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选地是化学发光检测试剂盒。例如，对于SDS-PAGE，可以从柱级分中取得样品并在含有还原剂(例如，DTT)的SDS-PAGE上样缓冲液中加热，并在预浇注的梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如，Novex)上解析衣壳蛋白。可以根据制造商的说明使用SilverXpress(Invitrogen,CA)或其它合适的染色方法(即，SYPRO红宝石色或考马斯染色)进行银染色。在一个实施例中，可以通过定量实时PCR(Q-PCR)测量柱级分中的AAV载体基因组(vg)的浓度。将样品稀释并用DNA酶I(或另一种合适的核酸酶)消化以去除外源性DNA。在核酸酶失活后，使用引物和对引物之间的DNA序列具有特异性的TaqManTM荧光探针进一步稀释和扩增样品。在Applied Biosystems Prism 7700序列检测系统上测量每种样品达到所定义的荧光水平所需的周期的数量(阈值周期，Ct)。含有与AAV载体中所含序列相同的序列的质粒DNA用于在Q-PCR反应中产生标准曲线。从样品获得的周期阈值(Ct)的值用于通过相对于质粒标准曲线的Ct值对其进行归一化来确定载体基因组效价。也可以使用基于数字PCR的端点测定。
在一方面，使用了经优化的q-PCR方法，所述方法利用了广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶K(如可从凯杰公司(Qiagen)商购获得)。更具体地，经优化的qPCR基因组效价测定与标准测定类似，不同之处在于在DNA酶I消化之后，将样品用蛋白酶K缓冲液稀释并用蛋白酶K处理，然后进行热失活。合适地，以等于样品大小的量用蛋白酶K缓冲液稀释样品。蛋白酶K缓冲液可以浓缩2倍或更多倍。通常，蛋白酶K处理为约0.2mg/mL，但是可以在0.1mg/mL至约1mg/mL之间变化。处理步骤一般在约55℃下进行持续约15分钟，但是可以在较低温度(例如，约37℃至约50℃)下进行历经较长的时间段(例如，约20分钟至约30分钟)，或者在较高的温度(例如，至多约60℃)下进行持续较短的时间段(例如，约5至10分钟)。类似地，热失活一般在约95℃下持续约15分钟，但是温度可以降低(例如，约70至约90℃)并且时间延长(例如，约20分钟至约30分钟)。然后将样品稀释(例如，1000倍)，并如标准测定中所描述的进行TaqMan分析。
另外地或可替代地，可以使用液滴数字PCR(ddPCR)。例如，已经描述了用于通过ddPCR确定单链和自互补AAV载体基因组效价的方法。参见，例如，M.Lock等人，Hu GeneTherapy Methods,Hum Gene Ther Methods.2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014年2月14日。
简而言之，用于从基因组缺陷型AAVhu68(或AAVrh91)中间体中分离具有包装的基因组序列的rAAVhu68(或AAVrh91)颗粒的方法涉及使包括重组AAVhu68(或rh91)病毒颗粒和AAVhu68(或AAVrh91)衣壳中间体的悬浮液经受高效液相色谱，其中AAVhu68(或AAVrh91)病毒颗粒和AAVhu68中间体与在约10.2(或者对于AAVrh91为约9.8)的pH下平衡的强阴离子交换树脂结合，并经受盐梯度，同时监测洗脱液在约260纳米(nm)和约280nm下的紫外线吸光度。尽管对于rAAVhu68和AAVrh91来说不太理想，但pH可在约10至10.4的范围内。在此方法中，当A260/A280的比率达到拐点时，从洗脱的级分中收集AAV完整衣壳。在一个实例中，对于亲和色谱步骤，可以将经渗滤的产物应用于有效捕获AAVhu68或AAVrh91血清型的亲和树脂(Life Technologies)。在这些离子条件下，显著百分比的残留的细胞DNA和蛋白质流过柱，而AAV颗粒则被有效捕获。
将rAAV.hCDKL5悬浮在合适的生理相容性组合物(例如，缓冲盐水)中。该组合物可以冷冻储存，随后解冻并任选地用合适的稀释剂稀释。可替代地，可以将载体制备为适合于无需进行冷冻和解冻步骤而递送至患者的组合物。
如本文所用，术语“NAb效价”是产生多少中和抗体(例如，抗AAV Nab)的量度，该中和抗体中和其靶向的表位(例如，AAV)的生理作用。抗AAV NAb效价可以如在例如Calcedo,R等人，Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-AssociatedViruses.Journal of Infectious Diseases,2009.199(3):第381-390页中所描述的那样进行测量，所述文献通过引用并入本文。
缩写“sc”是指自身互补。“自身互补AAV”是指其中由重组AAV核酸序列所携带的编码区已经被设计成形成分子内双链DNA模板的构建体。感染后，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。参见，例如，D M McCarty等人，“Self-complementary recombinant adeno-associatedvirus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNAsynthesis”,Gene Therapy,(2001年8月)，第8卷，第16期，第1248-1254页。自身互补AAV描述于例如美国专利第6,596,535号；第7,125,717号；以及第7,456,683号，该专利中的每一者通过引用整体并入本文。
“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有目的基因的表达盒被包装在病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，它们不能产生子代病毒粒子，但保留感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)”-仅含有目的基因，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。
在许多情况下，rAAV颗粒被称为DNA酶抗性的。然而，除此核酸内切酶(DNA酶)之外，其它核酸内切酶和核酸外切酶也可以用于本文所描述的纯化步骤中，以去除污染性核酸。可以选择此类核酸酶以降解单链DNA和/或双链DNA以及RNA。此类步骤可以含有单个核酸酶或针对不同靶标的核酸酶的混合物，并且可以是核酸内切酶或核酸外切酶。
术语“抗核酸酶”表示AAV衣壳已经在表达盒周围完全组装，该表达盒被设计成将基因递送到宿主细胞并保护这些包装的基因组序列在被设计成去除产生过程中可能存在的污染性核酸的核酸酶温育步骤期间免于降解(消化)。
IV.其他载体
本文提供了包含如本文所述的表达盒的载体。在某些实施例中，表达盒包含在指导hCDKL5表达的调控序列的控制下编码功能性人细胞周期蛋白依赖性激酶样5(hCDKL5)的核酸序列。在某些实施例中，hCDKL5编码序列编码包含以下的氨基酸序列的hCDKL5蛋白：[MKIPNIGNVMNKFEILGVVGEGAYGVVLKCRHKETHEIVAIKKFKDSEENEEVKETTL RELKMLRTLKQENIVELKEAFRRRGKLYLVFEYVEKNMLELLEEMPNGVPPEKVKSYIYQLIKAIHWCHKNDIVHRDIKPENLLISHNDVLKLCDFGFARNLSEGNNANYTEYVATRWYRSPELLLGAPYGKSVDMWSVGCILGELSDGQPLFPGESEIDQLFTIQKVLGPLPSEQMKLFYSNPRFHGLRFPAVNHPQSLERRYLGILNSVLLDLMKNLLKLDPADRYLTEQCLNHPTFQTQRLLDRSPSRSAKRKPYHVESSTLSNRNQAGKSTALQSHHRSNSKDIQNLSVGLPRADEGLPANESFLNGNLAGASLSPLHTKTYQASSQPGSTSKDLTNNNIPHLLSPKEAKSKTEFDFNIDPKPSEGPGTKYLKSNSRSQQNRHSFMESSQSKAGTLQPNEKQSRHSYIDTIPQSSRSPSYRTKAKSHGALSDSKSVSNLSEARAQIAEPSTSRYFPSSCLDLNSPTSPTPTRHSDTRTLLSPSGRNNRNEGTLDSRRTTTRHSKTMEELKLPEHMDSSHSHSLSAPHESFSYGLGYTSPFSSQQRPHRHSMYVTRDKVRAKGLDGSLSIGQGMAARANSLQLLSPQPGEQLPPEMTVARSSVKETSREGTSSFHTRQKSEGGVYHDPHSDDGTAPKENRHLYNDPVPRRVGSFYRVPSPRPDNSFHENNVSTRVSSLPSESSSGTNHSKRQPAFDPWKSPENISHSEQLKEKEKQGFFRSMKKKKKKSQTVPNSDSPDLLTLQKSIHSASTPSSRPKEWRPEKISDLQTQSQPLKSLRKLLHLSSASNHPASSDPRFQPLTAQQTKNSFSEIRIHPLSQASGGSSNIRQEPAPKGRPALQLPGQMDPGWHVSSVTRSATEGPSYSEQLGAKSGPNGHPYNRTNRSRMPNLNDLKETAL](SEQ ID NO:2)，其中hCDKL5编码序列是SEQ ID NO:22或与SEQ ID NO:22至少约95％相同的核酸序列，并编码SEQ ID NO:2的蛋白质。在某些实施例中，hCDKL5编码序列编码包含以下的氨基酸序列的hCDKL5-2GS蛋白：[MKIPNIGNVMNKFEILGVVGEGAYGVVLKCRHKETHEIVAIKKFKDSEENEEVKETTL RELKMLRTLKQENIVELKEAFRRRGKLYLVFEYVEKNMLELLEEMPNGVPPEKVKSYIYQLIKAIHWCHKNDIVHRDIKPENLLISHNDVLKLCDFGFARNLSEGNNANYTEYVATRWYRSPELLLGAPYGKSVDMWSVGCILGELSDGQPLFPGESEIDQLFTIQKVLGPLPSEQMKLFYSNPRFHGLRFPAVNHPQSLERRYLGILNSVLLDLMKNLLKLDPADRYLTEQCLNHPTFQTQRLLDRSPSRSAKRKPYHVESSTLSNRNQAGKSTALQSHHRSNSKDIQNLSVGLPRADEGLPANESFLNGNLAGASLSPLHTKTYQASSQPGSTSKDLTNNNIPHLLSPKEAKSKTEFDFNIDPKPSEGPGTKYLKSNSRSQQNRHSFMESSQSKAGTLQPNEKQSRHSYIDTIPQSSRSPSYRTKAKSHGALSDSKSVSNLSEARAQIAEPSTSRYFPSSCLDLNSPTSPTPTRHSDTRTLLSPSGRNNRNEGTLDSRRTTTRHSKTMEELKLPEHMDSSHSHSLSAPHESFSYGLGYTSPFSSQQRPHRHSMYVTRDKVRAKGLDGSLSIGQGMAARANSLQLLSPQPGEQLPPEMTVARSSVKETSREGTSSFHTRQKSEGGVYHDPHSDDGTAPKENRHLYNDPVPRRVGSFYRVPSPRPDNSFHENNVSTRVSSLPSESSSGTNHSKRQPAFDPWKSPENISHSEQLKEKEKQGFFRSMKKKKKKSQTTDSTNGENPSIKKSLFPLFNSKNHLKHSSSLKKLPVVTPPMVPNSDSPDLLTLQKSIHSASTPSSRPKEWRPEKISDLQTQSQPLKSLRKLLHLSSASNHPASSDPRFQPLTAQQTKNSFSEIRIHPLSQASGGSSNIRQEPAPKGRPALQLPGQMDPGWHVSSVTRSATEGPSYSEQLGAKSGPNGHPYNRTNRSRMPNLNDLKETAL](SEQ ID NO:6)，其中hCDKL5编码序列包含SEQ ID NO:24的核酸序列或与SEQ ID NO:24至少约95％相同的序列，并编码SEQ ID NO:6的蛋白质。在某些实施例中，hCDKL5编码序列编码包含以下的氨基酸序列的hCDKL5-3GS蛋白：[MKIPNIGNVMNKFEILGVVGEGAYGVVLKCRHKETHEIVAIKKFKDSEENEEVKETTL RELKMLRTLKQENIVELKEAFRRRGKLYLVFEYVEKNMLELLEEMPNGVPPEKVKSYIYQLIKAIHWCHKNDIVHRDIKPENLLISHNDVLKLCDFGFARNLSEGNNANYTEYVATRWYRSPELLLGAPYGKSVDMWSVGCILGELSDGQPLFPGESEIDQLFTIQKVLGPLPSEQMKLFYSNPRFHGLRFPAVNHPQSLERRYLGILNSVLLDLMKNLLKLDPADRYLTEQCLNHPTFQTQRLLDRSPSRNQAGKSTALQSHHRSNSKDIQNLSVGLPRADEGLPANESFLNGNLAGASLSPLHTKTYQASSQPGSTSKDLTNNNIPHLLSPKEAKSKTEFDFNIDPKPSEGPGTKYLKSNSRSQQNRHSFMESSQSKAGTLQPNEKQSRHSYIDTIPQSSRSPSYRTKAKSHGALSDSKSVSNLSEARAQIAEPSTSRYFPSSCLDLNSPTSPTPTRHSDTRTLLSPSGRNNRNEGTLDSRRTTTRHSKTMEELKLPEHMDSSHSHSLSAPHESFSYGLGYTSPFSSQQRPHRHSMYVTRDKVRAKGLDGSLSIGQGMAARANSLQLLSPQPGEQLPPEMTVARSSVKETSREGTSSFHTRQKSEGGVYHDPHSDDGTAPKENRHLYNDPVPRRVGSFYRVPSPRPDNSFHENNVSTRVSSLPSESSSGTNHSKRQPAFDPWKSPENISHSEQLKEKEKQGFFRSMKKKKKKSQTVPNSDSPDLLTLQKSIHSASTPSSRPKEWRPEKISDLQTQSQPLKSLRKLLHLSSASNHPASSDPRFQPLTAQQTKNSFSEIRIHPLSQASGGSSNIRQEPAPKGRPALQLPGQMDPGWHVSSVTRSATEGPSYSEQLGAKSGPNGHPYNRTNRSRMPNLNDLKETAL](SEQ ID NO:8)，其中hCDKL5编码序列包含SEQ ID NO:25或与SEQ IDNO:25至少约95％相同的核酸序列，并编码SEQ ID NO:8的蛋白质。在某些实施例中，hCDKL5编码序列编码包含以下的氨基酸序列的hCDKL5-4GS蛋白：[MKIPNIGNVMNKFEILGVVGEGAYGVVLKCRHKETHEIVAIKKFKDSEENEEVKETTL RELKMLRTLKQENIVELKEAFRRRGKLYLVFEYVEKNMLELLEEMPNGVPPEKVKSYIYQLIKAIHWCHKNDIVHRDIKPENLLISHNDVLKLCDFGFARNLSEGNNANYTEYVATRWYRSPELLLGAPYGKSVDMWSVGCILGELSDGQPLFPGESEIDQLFTIQKVLGPLPSEQMKLFYSNPRFHGLRFPAVNHPQSLERRYLGILNSVLLDLMKNLLKLDPADRYLTEQCLNHPTFQTQRLLDRSPSRNQAGKSTALQSHHRSNSKDIQNLSVGLPRADEGLPANESFLNGNLAGASLSPLHTKTYQASSQPGSTSKDLTNNNIPHLLSPKEAKSKTEFDFNIDPKPSEGPGTKYLKSNSRSQQNRHSFMESSQSKAGTLQPNEKQSRHSYIDTIPQSSRSPSYRTKAKSHGALSDSKSVSNLSEARAQIAEPSTSRYFPSSCLDLNSPTSPTPTRHSDTRTLLSPSGRNNRNEGTLDSRRTTTRHSKTMEELKLPEHMDSSHSHSLSAPHESFSYGLGYTSPFSSQQRPHRHSMYVTRDKVRAKGLDGSLSIGQGMAARANSLQLLSPQPGEQLPPEMTVARSSVKETSREGTSSFHTRQKSEGGVYHDPHSDDGTAPKENRHLYNDPVPRRVGSFYRVPSPRPDNSFHENNVSTRVSSLPSESSSGTNHSKRQPAFDPWKSPENISHSEQLKEKEKQGFFRSMKKKKKKSQTTDSTNGENPSIKKSLFPLFNSKNHLKHSSSLKKLPVVTPPMVPNSDSPDLLTLQKSIHSASTPSSRPKEWRPEKISDLQTQSQPLKSLRKLLHLSSASNHPASSDPRFQPLTAQQTKNSFSEIRIHPLSQASGGSSNIRQEPAPKGRPALQLPGQMDPGWHVSSVTRSATEGPSYSEQLGAKSGPNGHPYNRTNRSRMPNLNDLKETAL](SEQ ID NO:10)，其中hCDKL5编码序列包含SEQ ID NO:26或与SEQ ID NO:26至少约95％相同的核酸序列，并编码SEQ ID NO:10的蛋白质。
在某些实施例中，载体是选自重组细小病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺病毒的病毒载体；或选自裸露DNA、裸露RNA、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体或基于壳聚糖的调配物的非病毒载体。所选载体可以通过任何合适的方法，包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合递送。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor,NY。
“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有目的基因的表达盒被包装在病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，它们不能产生子代病毒粒子，但保留感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)”-仅含有目的转基因，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。此类复制缺陷型病毒可以是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒(整合或非整合)或另外合适的病毒来源。
V.组合物
本文提供了包含如本文所述的rAAV或载体以及水性悬浮介质的组合物。在某些实施例中，悬浮液被配制用于静脉内递送、鞘内施用或脑室内施用。
本文提供了组合物，该组合物含有至少一种rAAV原液以及任选的载剂、赋形剂和/或防腐剂。如本文所使用的，rAAV的“原液”是指rAAV的群体。尽管由于脱酰胺作用，其衣壳蛋白具有异质性，但是原液中的rAAV被期望共用相同的载体基因组。原液可以包含具有衣壳的rAAV，所述衣壳具有例如所选AAV衣壳蛋白和所选生产系统的特有的异质脱酰胺模式。原种可以由单一生产系统生产或由生产系统的多次运行汇集。可以选择各种生产系统，包含但不限于本文所描述的生产系统。
如本文所用，“载剂”包含任何和所有溶剂、分散培养基、媒剂、涂层、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收缓释剂、缓冲液、载剂溶液、悬浮液、胶体等。此类培养基和药剂用于药物活性物质的用途在本领域是众所周知的。补充性活性成分也可以掺入到组合物中。短语“药学上可接受的”是指当向宿主施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。如脂质体、纳米胶囊、微颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等递送媒剂可以用于将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞中。具体地，rAAV载体递送的载体基因组可以被调配成用于递送或包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。
在一个实施例中，组合物包含适合于递送至受试者的最终调配物，该组合物是例如缓冲到生理上相容的pH和盐浓度的水性液体悬浮液。任选地，调配物中存在一种或多种表面活性剂。在另一个实施例中，可以将组合物作为稀释以向受试者施用的浓缩物运输。在其它实施例中，可以在施用时将组合物冻干并重构。
可以从无毒的非离子型表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如，诸如F68[BASF]，也被称为泊洛沙姆188，其具有中性pH，具有8400的平均分子量。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，该非离子型三嵌段共聚物由侧接聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、SOLUTOL HS15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“P”(对于泊洛沙姆)命名，后跟三个数字：前两位数字x100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字x 10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。在一个实施例中，表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％至约0.001％(基于重量比，w/w％)的量存在。在另一个实施例中，表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％至约0.001％(基于体积比，v/v％)的量存在。在又另一个实施例中，表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％至约0.001％的量存在，其中n％表示n克/100mL悬浮液。
在另一个实施例中，组合物包含载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。鉴于转移病毒所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的载剂。例如，一种合适的载剂包括盐水，其可以用多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)配制。其它示例性载剂包含无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。缓冲液/载剂应包含防止rAAV粘附到输液管道上但不干扰rAAV体内结合活性的组分。可以从无毒的非离子型表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如，诸如泊洛沙姆188(也被称为商业名称F68[BASF]、F68、F68、P188)，其具有中性pH，具有8400的平均分子量。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，该非离子型三嵌段共聚物由侧接聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、SOLUTOL HS15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧-油醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“P”(对于泊洛沙姆)命名，后跟三个数字：前两位数字x100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字x 10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％至约0.001％的量存在。
在某些实施例中，含有rAAV.hCDKL5的组合物在6.8至8、或7.2至7.8、或7.5至8的范围内的pH下递送。对于鞘内递送，可能需要高于7.5的pH，例如7.5至8，或7.8。
在某些实施例中，调配物可以含有不包括碳酸氢钠的缓冲盐水溶液。此类调配物可以含有缓冲盐水溶液，该缓冲盐水溶液包括含磷酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁及其混合物中的一者或多者的水溶液，诸如Harvard缓冲液。水溶液可以进一步含有P188，即可从BASF商购获得的泊洛沙姆，其先前以商品名F68出售。水性溶液的pH可以为7.2。
在另一个实施例中，调配物可以含有缓冲盐水溶液，该缓冲盐水溶液包含1mM磷酸钠(Na3PO4)、150mM氯化钠(NaCl)、3mM氯化钾(KCl)、1.4mM氯化钙(CaCl2)、0.8mM氯化镁(MgCl2)和0.001％泊洛沙姆(例如，)188，pH 7.2。参见例如harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html。在某些实施例中，Harvard缓冲液是优选的，因为用Harvard缓冲液观察到更好的pH稳定性。
在某些实施例中，调配缓冲液是具有Pluronic F68的人工CSF。在其它实施例中，调配物可以含有一种或多种渗透增强剂。合适的渗透增强剂的实例可以包括，例如甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。
任选地，除了rAAV和载剂之外，本发明的组合物还可以含有其它常规的药物成分，诸如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包含氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包含明胶和白蛋白。
根据本发明的组合物可以包含药学上可接受的载剂，如上文所定义。合适地，本文所述的组合物包含有效量的一种或多种AAV，其悬浮于药学上合适的载剂中和/或与合适的赋形剂混合，其被设计用于通过注射、渗透泵、鞘内导管递送至受试者，或用于通过另一装置或途径递送。在某些实施例中，ommaya储库用于递送。在一个实例中，组合物被调配用于鞘内递送。在一个实例中，组合物被配制用于静脉内(iv)递送。
VI.用途
本文提供了治疗CDD的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的rAAV或载体。
在某些实施例中，本文的“有效量”是实现CDD症状的改善和/或延迟CDD进展的量。
以足够的量施用载体以转染细胞并提供足够水平的基因转移和表达，以便提供治疗益处，而不会产生过度的副作用或具有医学上可接受的生理作用，这可以由医学领域的技术人员确定。常规的和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至所需器官(例如，脑、CSF、肝脏(任选地经由肝动脉)、肺、心脏、眼、肾)、口服、吸入、鼻内、鞘内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、脑实质内、脑室内、鞘内、ICM、腰椎穿刺和其它非肠道施用途径。如果期望，可以组合施用途径。
病毒载体(例如，rAAV)的剂量主要取决于诸如待治疗的病状、患者的年龄、体重和健康状况等因素，并且因此在患者之间可能有所不同。例如，治疗有效的人类剂量的病毒载体一般在约25至约1000微升至约100mL的溶液的范围内，该溶液含有浓度为约1×109至1×1016的载体基因组拷贝。在某些实施例中，递送约1mL至约15mL、或约2.5mL至约10mL、或约5mL悬浮液的体积。在某些实施例中，递送约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、或约15mL悬浮液的体积。在某些实施例中，在此体积中施用约8.9×1012至2.7×1014GC总量的剂量。在某些实施例中，在此体积中施用约1.1×1010GC/g脑质量至约3.3×1011GC/g脑质量的剂量。在某些实施例中，在此体积中施用每克脑质量约3.0×109、约4.0×109、约5.0×109、约6.0×109、约7.0×109、约8.0×109、约9.0×109、约1.0×1010、约1.1×1010、约1.5×1010、约2.0×1010、约2.5×1010、约3.0×1010、约3.3×1010、约3.5×1010、约4.0×1010、约4.5×1010、约5.0×1010、约5.5×1010、约6.0×1010、约6.5×1010、约7.0×1010、约7.5×1010、约8.0×1010、约8.5×1010、约9.0×1010、约9.5×1010、约1.0×1011、约1.1×1011、约1.5×1011、约2.0×1011、约2.5×1011、约3.0×1011、约3.3×1011、约3.5×1011、约4.0×1011、约4.5×1011、约5.0×1011、约5.5×1011、约6.0×1011、约6.5×1011、约7.0×1011、约7.5×1011、约8.0×1011、约8.5×1011、约9.0×1011GC的剂量。
调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。可以监测转基因产物的表达水平以确定所得病毒载体的剂量频率，优选地含有迷你基因的AAV载体。任选地，与出于治疗目的描述的剂量方案类似的剂量方案可以用于使用本发明的组合物进行免疫。
可以以剂量单位调配复制缺陷型病毒组合物，以使含有的复制缺陷型病毒的量在约1.0×109GC至约1.0×1016GC的范围内(以治疗受试者)，包括该范围内的所有整数或分数量，并且对于人类患者而言，优选为1.0×1012GC至1.0×1014GC。在一个实施例中，组合物被配制成每剂量包含至少1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109或9×109GC，包括在该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010GC，包含范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011或9×1011GC，包含范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，组合物被配制成每剂量含有至少1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012或9×1012GC，包括在该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，组合物被配制成每剂量含有至少1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013或9×1013GC，包括在该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，组合物被配制成每剂量含有至少1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×1014、7×1014、8×1014或9×1014GC，包括在该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，组合物被配制成每剂量含有至少1×1015、2×1015、3×1015、4×1015、5×1015、6×1015、7×1015、8×1015或9×1015GC，包括在该范围内的所有整数或分数量。
在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为每kg体重1×1010至约1×1015GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，载体的有效量是每kg体重约1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109或9×109GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每kg体重约1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每kg体重约1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011或9×1011GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每kg体重约1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012或9×1012GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每kg体重约1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013或9×1013GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每kg体重约1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×1014、7×1014、8×1014或9×1014GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每kg体重约1×1015、2×1015、3×1015、4×1015、5×1015、6×1015、7×1015、8×1015或9×1015GC，包括该范围内的所有整数或分数量。
在某些实施例中，通过脑质量来缩放剂量，该脑质量提供了CSF隔室的大小的近似值。不希望受理论束缚，剂量换算基于新生小鼠的0.15g的脑质量(Gu等人，2012)、幼年NHP的90g的脑质量(Herndon等人，1998)、6-8个月婴儿小鼠的610g、8-12个月婴儿小鼠的780g、以及>12个月婴儿小鼠的960g(Dekaban，1978)。针对人类婴儿的每个年龄范围的估计脑重量是在(Dekaban，1978)中提出的男性和女性脑重量得出的，通过假设新生儿(370g)和4-8个月婴儿的脑重量之间近似线性增加，得出≥1-<4个月大婴儿的平均估计脑重量为488g。610g的值对应于4-8个月大的男性和女性的平均脑重量(Dekaban，1978)。紧接着下表列出了新生小鼠、幼年NHP和等效人类剂量的剂量缩放的实例。施用体积也可以基于脑CSF(Matsumae等人，1996)和脊髓CSF(Rochette等人，2016)的估计体积从NHP缩放到人类。
在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为每克(g)脑质量1×1010至约1×1015GC，包含该范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，载体的有效量是每克(g)脑质量约1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109或9×109GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每克(g)脑质量约1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每克(g)脑质量约1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011或9×1011GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每克(g)脑质量约1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012或9×1012GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每克(g)脑质量约1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013或9×1013GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每克(g)脑质量约1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×1014、7×1014、8×1014或9×1014GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量是每克(g)脑质量约1×1015、2×1015、3×1015、4×1015、5×1015、6×1015、7×1015、8×1015或9×1015GC，包括该范围内的所有整数或分数量。
这些上述剂量可以以各种体积的载剂、赋形剂或缓冲剂调配物施用，范围为约25到约1000微升或更大的体积，包含所述范围内的所有数字，这取决于待治疗区域的大小、所使用的病毒效价、施用途径以及所述方法的所期望的效果。在一个实施例中，载剂、赋形剂或缓冲液的体积为至少约25μL。在一个实施例中，体积为约50μL。在另一个实施例中，体积为约75μL。在另一个实施例中，体积为约100μL。在另一个实施例中，体积为约125μL。在另一个实施例中，体积为约150μL。在另一个实施例中，体积为约175μL。在又另一个实施例中，体积为约200μL。在另一个实施例中，体积为约225μL。在又另一个实施例中，体积为约250μL。在又另一个实施例中，体积为约275μL。在又另一个实施例中，体积为约300μL。在又另一个实施例中，体积为约325μL。在另一个实施例中，体积为约350μL。在另一个实施例中，体积为约375μL。在另一个实施例中，体积为约400μL。在另一个实施例中，体积为约450μL。在另一个实施例中，体积为约500μL。在另一个实施例中，体积为约550μL。在另一个实施例中，体积为约600μL。在另一个实施例中，体积为约650μL。在另一个实施例中，体积为约700μL。在另一个实施例中，体积介于约700与约1000μL之间。
在某些实施例中，剂量可以在约1×109GC/g脑质量至约1×1012GC/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约1×1010GC/g脑质量至约3×1011GC/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约1×1010GC/g脑质量至约2.5×1011GC/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约5×1010GC/g脑质量的范围内。
在一个实施例中，病毒构建体可以以至少约1×109GC至约1×1015、或约1×1011至5×1013GC的剂量递送。可以由本领域的技术人员确定用于递送这些剂量和浓度的合适的体积。例如，可以选择约1μL到150mL的体积，其中对于成人而言，选择更大的体积。通常，对于新生婴儿，合适的体积为约0.5mL到约10mL，对于年龄较大的婴儿，可以选择约0.5mL到约15mL。对于幼儿，可以选择约0.5mL到约20mL的体积。对于儿童，可以选择至多约30mL的体积。对于青春期前的少年和青少年，可以选择最大约50mL的体积。在仍其它实施例中，患者可以接受鞘内施用的体积选择为约5mL至约15mL或约7.5mL至约10mL。可以确定其它合适的体积和剂量。可以调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。
可以根据所公开的方法将上文描述的重组载体递送到宿主细胞。可以将优选地悬浮于生理上相容的载剂中的rAAV施用于人或非人哺乳动物患者。在某些实施例中，为了施用于人类患者，将rAAV适当地悬浮于含有盐水、表面活性剂和生理上相容的盐或盐的混合物的水溶液中。合适地，将调配物调整到生理上可接受的pH，例如，在pH 6至9、或pH 6.5至7.5、pH 7.0至7.7或pH 7.2至7.8的范围内。由于脑脊液的pH为约7.28至约7.32，对于鞘内递送，可能需要该范围内的pH；而对于静脉内递送，可能需要约6.8至约7.2的pH。然而，可以选择最宽范围和这些子范围内的其它pH用于其它递送途径。
如本文所用，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指经由注射到椎管中，更具体地注射到蛛网膜下腔中使得其到达脑脊液(CSF)的药物的施用途径。鞘内递送可以包括腰椎穿刺、心室内(包含脑室内(ICV))、枕骨下/脑池内、和/或C1-2穿刺。例如，可以通过腰椎穿刺引入材料以在整个蛛网膜下腔扩散。在另一个实例中，可以向小脑延髓池中注射。在某些实施例中，如本文所述的rAAV、载体或组合物经由鞘内施用施用于有需要的受试者。在某些实施例中，鞘内施用如2019年11月29日公开的美国专利公开第2018-0339065A1号中所述的进行，该专利公开通过引用整体并入本文。
如本文所使用的，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指药物直接进入到小脑延髓池的脑脊液中，更具体地是通过枕骨下穿刺或通过直接注射到小脑延髓池中或通过永久定位的管的施用途径。
在某些实施例中，本文描述的组合物的治疗在动物和/或在人类患者中具有最小至轻度无症状的DRG感觉神经元变性，对于感觉神经毒性和亚临床感觉神经元损伤具有良好的耐受性。
VII.用于将药物组合物递送至脑脊液中的设备和方法
在一方面，本文提供的载体可以经由本节中提供的和WO 2018/160582中描述的方法和/或装置进行鞘内施用，该文献通过引用并入本文。可替代地，可以选择其他装置和方法。在某些实施例中，该方法包括经由脊柱针的CT引导的枕骨下注射到患者的小脑延髓池中的步骤。如本文中所使用的，术语计算机断层摄影(CT)是指放射线照相术，其中通过计算机由沿着轴线制成的一系列平面横截面图像构建身体结构的三维图像。在某些实施例中，如本文所述的载体和/或其组合物经由计算机断层扫描(CT)引导的枕骨下注射至小脑延髓池(小脑延髓池内[ICM])施用。在某些实施例中，Ommaya储库用于递送药物组合物。在某些实施例中，该设备在2019年11月29日公开的美国专利公开第2018-0339065 A1号中进行了描述，该专利公开通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，在第1天，将AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG作为单剂量经由CT引导的枕骨下注射到小脑延髓池而施用于入院参与者。在第1天，在适当效价下的含有AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG(最终体积≤5ml)的注射器是通过与本研究相关的研究药房制备的，并被递送到操作间。在研究药物施用之前，参与者是麻醉的、插管的，而且使用消毒技术准备好注射部位并将其覆盖。进行腰椎穿刺以去除预定体积的CSF，之后IT注射碘化造影剂，以辅助可视化小脑延髓池的相关解剖结构。可以在针插入之前或期间IV施用造影剂，以替代IT造影剂。根据执行手术的介入医师的判断决定是否使用IV或IT造影剂。在荧光镜引导下，将脊柱针(22-25G)推进到小脑延髓池中。较大的导引针可以用于协助针放置。在确认针放置之后，将扩展套件附接到脊柱针上，并用CSF填充。根据介入医师的判断，可以将含有造影剂材料的注射器连接到扩展套件上，并注入少量造影剂材料以确认针在小脑延髓池中的放置。在确认针放置之后，将含有rAAV的注射器连接到扩展套件。历经1-2分钟，缓慢注射注射器内含物，以递送≤5.0ml的体积。
VIII.CDD
如本文所用，“患者”或“受试者”可互换地指雄性或雌性哺乳动物，包括人、兽医或农场动物、家畜或宠物以及通常用于研究的动物。在一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是人患者。在一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是男性或女性人。在某些实施例中，这些方法和组合物的受试者被诊断患有CDD和/或具有CDD的症状。
该方法和组合物可用于治疗CDD的任何阶段。在某些实施例中，患者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月大，或者约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18岁。在某些实施例中，患者是幼儿，例如年龄为18个月至3岁。在某些实施例中，患者年龄为3岁至6岁、年龄为3岁至12岁、年龄为3岁至18岁、年龄为3岁至30岁。在某些实施例中，患者年龄大于18岁。
CDD的症状包括癫痫发作，通常在出生后3个月内开始，并且最早可能在出生后第一周出现。癫痫发作的类型随着年龄的增长而变化，并且可能遵循可预测的模式。最常见的类型是全身性强直阵挛性癫痫发作，其包括意识丧失、肌肉强直和抽搐；强直性癫痫发作，其特征是肌肉收缩异常；和癫痫痉挛，其涉及短暂的肌肉抽搐。大多数患有CDKL5缺乏症的人每天都会发生癫痫发作，尽管他们也可能有一段时间没有癫痫发作。CDKL5缺乏症的癫痫发作通常对治疗有抵抗力。
患有CDKL5缺乏症的儿童发育会受到损害。大多数有严重的智力障碍，并且很少或不会说话。粗大运动技能(诸如坐、站立和行走)的发展被延迟或无法实现。大约三分之一的受影响者能够独立行走。精细运动技能，诸如用手指拾取小物体，也会受到损害；大约一半的受影响者有目的地使用双手。大多数患有这种疾病的人都有视力问题(皮层视力损害)。
CDKL5缺乏症的其他常见特征包括重复的手部动作(刻板症)，诸如拍手、舔手和吸手；磨牙(磨牙症)；睡眠中断；喂养困难；以及胃肠道问题，包括便秘和酸性胃内容物回流到食道(胃食管反流)。一些受影响者会出现呼吸不规则的情况。一些患有CDKL5缺乏症的人的独特面部特征包括高而宽的前额、大而深的眼睛、鼻子和上唇(人中)之间界限分明的空间、丰满的嘴唇、宽阔的牙齿和高上颚(上颚)。还可能出现其他身体差异，诸如头部尺寸异常小(小头畸形)、脊柱左右弯曲(脊柱侧弯)和锥形手指。
如上所述，术语“增加”、“降低”、“减少”、“改善”、“改进”、“延迟”或其任何语法变体，或指示变化的任何类似术语，意指与对应的参考(例如，未经治疗的对照或正常状况下无CDD的受试者)相比，约5倍、约2倍、约1倍、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％的变体，除非另有说明。
在某些实施例中，患者接受控制与CDD相关的一些体征和症状(诸如癫痫发作、肌肉僵硬或呼吸、睡眠、胃肠道或心脏的问题)的药物。
在某些实施例中，利尿剂可以用于有此需要的受试者的共同疗法中。所使用的利尿剂可以是乙酰唑胺(Diamox)或其他合适的利尿剂。在一些实施例中，利尿剂在基因疗法施用时施用。在一些实施例中，利尿剂在基因疗法施用之前施用。在一些实施例中，施用利尿剂，其中注射体积为3mL。
在某些实施例中，可以利用共同疗法，其包括共同施用Cdkl5-同种型1、同种型2、同种型3和/或同种型4表达载体或其各种两路或三路组合。任选地，共同疗法可以进一步包括施用另一种活性剂。在某些实施例中，共同疗法可以包括酶替代疗法。
任选地，免疫抑制共同疗法可以用于有需要的受试者中。用于此类共同疗法的免疫抑制剂包括但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢物、T细胞抑制剂、大环内酯(例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物)和细胞抑制剂，包括烷化剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、抗体或对亲免素有活性的药剂。免疫抑制剂可以包含氮芥、亚硝基脲、铂化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤、氟尿嘧啶、更生霉素、蒽环霉素、丝裂霉素C、博来霉素、光神霉素、IL-2受体(CD25)或CD3定向抗体、抗IL-2抗体、环孢素、他克莫司、西罗莫司、IFN-β、IFN-γ、阿片类或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在某些实施例中，可以在施用基因疗法之前或之后的第0、1、2、3、4、5、6、7或更多天开始免疫抑制疗法。此类免疫抑制疗法可涉及施用一种、两种或更多种药物(例如，糖皮质激素、泼尼松、霉酚酸酯(MMF)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))。此类免疫抑制药物可以以相同剂量或调整后的剂量向有需要的受试者施用一次、两次或更多次。此类疗法可以涉及在同一天共同施用两种或更多种药物(例如，泼尼松、霉酚酸酯(MMF)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))。可以在基因疗法施用之后以相同的剂量或经过调整的剂量继续使用这些药物中的一种或多种药物。根据需要，此类疗法可以持续约1周(7天)、约60天或更长时间。在某些实施例中，选择无他克莫司的方案。
词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应解释为包括性的而非排他性的。词语“组成(consist)”、“组成(consisting)”及其变体应解释为排他性的而非包括性的。虽然说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的，但是在其它情况下，也意图使用“由…组成”或“基本上由…组成”的语言来解释和描述相关的实施例。
术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并且包括RNA或RNA和蛋白质的产生。关于RNA，术语“表达”或“翻译”尤其涉及肽或蛋白质的产生。表达可以是暂时的或可以是稳定的。
应当注意，术语“一个或一种(a或an)”是指一个或多个/一种或多种，例如，“增强子”应被理解为表示一个或多个增强子。如此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/种”在本文中可互换地使用。
在整个说明书中，使用术语“e”后跟数值(n)来指代指数。应当理解，这是指“×10n)。例如，“3e9”与3×109相同，并且“1e13”与1×1013相同。
如上所述，除非另外说明，否则术语“约”在用于修饰数值时意指±10％的变化。
除非在本说明书中另有定义，否则本文所使用的技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员和参照公开文本所通常理解的相同含义，这为本领域的技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。
IX.实例
以下实例仅是说明性的，并且不旨在限制本发明。下表提供了以下实例中使用的某些缩写的列表。其他缩写或含义对于本领域技术人员来说可以是显而易见的。
实例1.小鼠模型和初步研究
CDD是由CDKL5基因的剪接位点突变引起的，该基因编码在大脑中高度表达的磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。这种突变导致CDKL5激酶活性破坏，造成AKT-mTOR和其他相关途径的信号转导减少，以及神经回路通讯缺陷。
已经开发了几种CDD的模型，并且可以选择用于评价治疗效果。以下这些模型对于CDKL5表达无效：例如，具有外显子6缺失的Cdkl5-ko小鼠(Δ外显子6)，Wang等人，Proceedings of the National Academy of Sciences 2012年12月,109(52)21516-21521；DOI:10.1073/pnas.1216988110；具有外显子4缺失的Cdkl5-ko小鼠(Δ外显子4)(参见，Amendola等人(2014)Mapping Pathological Phenotypes in a Mouse Model ofCDKL5Disorder.PLoS ONE 9(5):e91613.doi.org/10.1371/journal.pone.0091613(2014)；Cdkl5(R59X敲入)模型(可从Jackson实验室获得；参见，Tang等人(2019)、Tang S等人Altered NMDAR signaling underlies autistic-like features in mouse models ofCDKL5deficiency disorder.Nat Commun.2019；10(1):2655.发表于2019年6月14日.doi:10.1038/s41467-019-10689-w，以及Cdkl5(D471fs)模型(Rodney Samaco，Baylor Collegeof Medicine，Houston，TX)。
CDD小鼠，携带缺乏外显子6(与人CDKL5的外显子7相对应)的截短的CDKL5基因，在10至11周内表现出表型，并在患有CDD的人类中观察到临床相关症状，包括运动协调受损、认知功能差和社会行为以及AKT和mTOR信号传导。值得注意的是，在CDD小鼠中观察到后肢扣紧以及类似自闭症和非社交行为，表明小鼠在2或2.5个月内发生了神经退行性病变。
然而，当前的CDD小鼠模型并未表现出任何形式的自发性或难治性癫痫症，这与归因于人类的CDKL5致病变异的疾病表型相反。CDD小鼠中缺乏这种表型可能归因于动物年龄、研究持续时间以及C57BL/6小鼠的遗传背景赋予的癫痫抵抗力增加(Wang等人，2012以及Amendola等人，2014)。基于这一观察，不可能观察到新生CDD小鼠的癫痫表型。另外，虽然CDD主要影响杂合雌性个体，并且因此，所提出的临床试验患者群体包括杂合雌性，但CDD发展的征象在杂合雄性Cdkl5KO/Y小鼠中明显，但在杂合雌性Cdkl5KO/+小鼠中不明显。因此，杂合雄性Cdkl5KO/Y小鼠被用于当前的非临床计划，因为它们最能代表人类的CDD的疾病表型，男性患者中CDD的疾病表型也往往更严重。如本文所述，已经报道了几种其他CDKL5缺陷的小鼠模型。这些小鼠均缺乏CDKL5蛋白表达，表现出正常的寿命并表现出广泛的轻度行为异常。CDKL5表达在小鼠大脑中受到发育调控。因此，发现CDKL5在整个小鼠大脑包括皮层和海马体中高度表达，这表明这些区域的Cdkl5缺陷可能与在Cdkl5缺陷小鼠中观察到的表型有关。在雄性Cdkl5-ko小鼠中已经观察到最明显的表型，在约11周龄时表现出来，并且大多数涉及神经行为表型的研究是用雄性Cdkl5-ko小鼠进行的。
在这项研究中，我们展示了在三种CDD小鼠模型(Cdkl5-ko(外显子6)、Cdkl5(R59X)、Cdkl5(D471fs))的CNS中的恢复CDKL5表达显著改善疾病症状。我们开发了一种AAV基因疗法载体，它由AAVhu68衣壳、和带有人突触蛋白启动子的表达盒以及工程化人CDKL5转基因组成。当经由新生小鼠侧脑室注射将AAV-CDKL5载体施用至Cdkl5敲除小鼠时，我们在整个大脑中高达50％的神经元中检测到了强劲的表达。AAV施用和人CDKL5表达的耐受性良好。人CDKL5主要定位至细胞质；蛋白质表达和激酶活性持续超过4个月。我们对经治疗的Cdkl5-ko小鼠的队列进行了一系列神经行为测试，并且发现与未经治疗的Cdkl5-ko表型相比，在野生型小鼠中观察到的行为结果有显著改善。然后，我们在携带患者来源的移码突变(Cdkl5(R59X)和CDKL5(D471fs)模型)而不是基因敲除的2种不同的CDD小鼠模型中重复了相同的研究。我们获得了非常相似的结果，从而重申了我们的CDKL5基因疗法载体的治愈益处。
CDKL5在人脑中表达为至少四种不同的同种型。我们为三种选择性剪接的同种型生成了类似的AAV基因疗法载体，这些同种型均被发现在转导的小鼠大脑中表达并表现出激酶活性。
为了测试我们的AAV-CDKL5基因疗法载体在较大动物中的表达，我们对恒河猴进行了研究。通过经由小脑延髓池注入脑脊液，我们已经能够在整个大脑中以每个二倍体基因组0.1至1个载体拷贝实现载体分布。在背根神经节(DRG)中观察到更高的载体转导。因此，用对人CDKL5序列特异的探针进行原位杂交显示在DRG神经元中表达丰富，但在皮层灰质神经元中表达稀疏得多。CDKL5的施用和表达在所有六只恒河猴中持续60天普遍耐受性良好，然而，我们注意到脊髓白质束的轻度轴突病变。
总之，我们表现出有希望的证据，CDKL5基因疗法为模型小鼠提供了持久的治愈益处，并且在非人灵长类动物中耐受性良好。这种方法的进一步优化最终可能为受CDD影响的儿童提供临床干预的选择。
材料和方法。
质粒。将人脑中表达的四种CDKL5(细胞周期蛋白依赖性激酶样5，Uniprot IDO76039)的氨基酸序列1反向翻译为DNA序列。编码序列被进一步工程化，例如，通过考虑人类基因组中发现的密码子频率、神秘的RNA剪接位点和可替代的阅读框。在人突触蛋白启动子的控制下将工程化序列克隆到AAV表达质粒中2。编码序列前面是Kozak序列，后面是WPRE增强子盒(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)、SV40 poly A序列，并由AAV2反向末端重复序列(ITR)构成框架。为了抑制背根神经节(DRG)中的表达，在一些实验中，将上述质粒修饰为直接在CDKL5编码序列之后和WPRE序列之前含有miR183结合位点(agtgaattctaccagtgccata)(SEQ ID NO:11)的四个重复序列。AAV CDKL5载体是使用作为衣壳PHP.B(用于小鼠研究)或AAVhu684或AAVrh91(用于小鼠和非人灵长类动物研究)而产生的。
小鼠研究。所有涉及小鼠的研究均得到了宾夕法尼亚大学IACUC的批准。我们从Jackson实验室获得了Cdkl5-ko小鼠(B6.129(FVB)-Cdkl5tm1.1Joez/J，品系#021967)，并将杂合雌性ko小鼠与wt C57Bl6雄性杂交，以获得同窝小鼠的以下基因型：雄性半合子Cdkl5-ko(也称为KO小鼠或小鼠)、雄性wt、雌性杂合Cdkl5-ko和雌性wt。小鼠在18-21天龄时通过眼眶后注射接受AAV Cdkl5载体(剂量范围1×1011GC至5×1011GC)或媒介物对照(无菌磷酸缓冲盐水)，总体积为100μl。可替代地，小鼠在出生当天脑室内注射1×1010GC至5×1010GC的剂量，总体积为2μl。考虑到基因型和注射产品将小鼠混合饲养，每周至少称重和观察两次，并在雄性小鼠11周或雌性14周时进行行为测试。我们没有观察到与治疗相关的发病率。
蛋白质印迹和组织染色。安乐死后，快速冷冻一侧皮层半球，并且随后使用RIPA缓冲液生成蛋白质裂解物。使用抗人Cdkl5(S957D，邓迪大学，UK)、EB2(ab45767，Abcam)或EB2phospo222(pab01032-P，Covalab，UK)的抗体进行蛋白质印迹。将另一半大脑在福尔马林中固定过夜，包埋在石蜡中，并用相同的CDKL5抗体处理薄切片以进行免疫荧光染色。
行为测试。小鼠每天接受一次测试。一天中的测试时间、操作员和环境保持相同(60dB白噪声背景和1000流明白炽间接照明)。每次测试前，让小鼠在自己的笼子里适应30分钟。对于旷场测定，将具有最少量垫料的新笼放入红外光束阵列(MedAssociates，Inc.)中。在笼子中间添加一只小鼠，并且自动记录历经接下来30分钟的光束制动次数，光束制动分为靠近地面的光束制动(一般活动)和离地3英寸的光束制动(后立活动)。对于高架零迷宫(EZM，Stoelting Co.)，使用了具有两个相对的封闭象限和两个开放象限的高架圆形平台，以允许不间断的探索。将一只小鼠放置在开放象限的中间，并对其运动进行15分钟的视频记录。对于Y迷宫(Stoelting Co.)，使用了含有三个相同的Y形臂的封闭平台。将一只小鼠放置在最靠近操作者的臂上，并对其动作进行5分钟的视频记录。对于大理石埋藏测定，新笼子里装满了3英寸的AlphaDri垫料(Shepherd Specialty Papers)并轻轻压实。将12个纯蓝色弹珠均匀分布到垫料上，并且一只小鼠放在笼子中间。30分钟后记录至少一半被垫料覆盖的弹珠数量。
数据分析。使用GraphPad Prims软件对数据进行绘图和分析。视频文件以20fps的mp4格式录制，并使用EthoVision XT软件(版本14，Noldus Information Technology)进行分析。对于筑巢测定，小鼠在新笼子中单独饲养过夜，并供应标准化的2×2英寸巢方块(基于棉花)。24小时后，按照1-5的等级对巢的质量进行评分，并对任何剩余的未触及的巢材料进行称重。
非人灵长类动物实验。所有涉及非人灵长类动物的研究均得到宾夕法尼亚大学IACUC的批准，并根据USDA规定进行。物种普通猕猴(Macaca mulatta)(恒河猴)的非人灵长类动物(NHP)获自Covance Research Products,Inc.。根据基因疗法计划SOP进行检疫和畜牧业。在AAV载体施用前一个月和整个研究过程中，定期监测体重、体温、呼吸频率和心率，并获取血液和CSF样品。全血用于细胞计数和分类，以及临床血液化学检测。CSF样品用于血细胞计数和分类，以及总蛋白定量。为了经由小脑延髓池穿刺将AAV载体递送至CSF，将麻醉的猕猴以侧卧位放置在手术台上，头部向前弯曲。使用无菌技术，将21-27号、1-1.5英寸Quincke脊柱针(Becton Dickinson)推进到枕骨下空间中，直到观察到CSF的流动。针将指向小脑延髓池的更宽的上间隙，以避免血液污染和潜在的脑干损伤。将使用荧光镜经由脊髓造影来验证针穿刺的正确放置。在给药前收集1mL的CSF用于基线分析。收集CSF后，将leur通路延伸导管连接至脊柱针，以方便给予1ml碘海醇(商品名：Omnipaque 180mg/mL，General Electric Healthcare)造影剂。在验证针放置后，将装有测试品的注射器(体积等于1mL加上注射器体积和接头死区)连接到柔性接头并注射历经30±5秒。取下针，且直接对穿刺部位施加压力。AAVhu68.hSyn.Cdkl5-1co和AAVhu68.hSyn.Cdkl5-1co载体已经以高达3×1013GC/NHP的剂量注射。在研究第0、14、18、41天和最后一个研究日，对所有猕猴进行神经学评估，以详细评价神经功能。简而言之，评价包括姿势和步态评估、颅神经评估、本体感觉评估和脊髓/神经反射。在研究第56天，对猕猴实施安乐死，并进行大体验尸检查和尸检。从每只猕猴采集25个主要组织，一式两份用于速冻或福尔马林固定。从速冻组织中纯化DNA或RNA，并且分别用于载体生物分布或转基因表达分析。对于载体生物分布，使用TaqManqPCR测定法确定每总DNA重量的基因组拷贝(GC)，探针再次指向转基因盒的polyA区域和内标。为了定量转基因表达，使用总RNA经由与polyT寡核苷酸的第一链合成生成cDNA，然后使用不与内源恒河猴CDKL5序列交叉反应的转基因特异性探针进行TaqMan qPCR。为了进行组织病理学分析，将猕猴组织包埋到石蜡中，并分别用H&E溶液或CDKL5抗体对这些切片进行染色。将相同的脊髓切片与Luxol Fast Blue温育以对髓磷脂进行染色。所有染色的组织切片均由委员会认证的兽医病理学家进行审查，并通过同行评审验证异常结果。
参考文献：
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4.Hinderer,C.等人Severe Toxicity in Nonhuman Primates and PigletsFollowing High-Dose Intravenous Administration of an Adeno-Associated VirusVector Expressing Human SMN.Human Gene Therapy 29,285-298,(2018)。
实例2：基因疗法AAV载体
ITR之间的表达构建体由人突触蛋白启动子(SEQ ID NO:23)、人CDKL5同种型1的工程化编码序列(SEQ ID NO:22)、WPRE表达增强子(SEQ ID NO:27)和SV40 poly A序列(SEQ ID NO:28)组成(图1A)。类似地，可替代的表达构建体分别含有人CDKL5同种型2(CDKL5-2GS或hCDKL5-2GS；SEQ ID NO:24)、3(CDKL5-3GS或hCDKL5-3GS；SEQ ID NO:25)或4(CDKL5-4GS或hCDKL5-4GS；SEQ ID NO:26)的工程化编码序列，代替同种型1。所有测试的质粒在小鼠大脑中均表达良好，磷酸化EB2的能力(CDKL5激酶活性的测量)显示出微小差异。我们发现，需要WPRE增强子才能在小鼠大脑中获得类似于野生型小鼠Cdkl5表达的人CDKL5表达水平(图2)。CDKL5具有完全活性，如通过其磷酸化其内源靶标EB2蛋白的能力来确定(图2)。CDKL5的表达和定位经由IHC得到确认。
我们还通过将人突触蛋白与人泛素C启动子(Ubc)(图1B)或与鸡β肌动蛋白杂合启动子(图1C)交换来生成可替代的表达构建体。将AAVrh91衣壳中的AAV载体AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183和AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用于Cdkl5-ko小鼠，并在P14进行尸检。小鼠脑组织的蛋白质印迹分析确认了用包含UbC或CBh启动子的AAV载体基因组转导后的CDKL5的表达(图20)。图20示出了在施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183后14天时，如通过蛋白质印迹定性测量的CDKL5表达。总体而言，当以3×1010GC的剂量用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183处理时，我们观察到CDKL5-ko小鼠大脑(分析的皮层组织)中CDKL5表达和激酶功能的强劲恢复(图29A、29B和30)。图29A示出了与用PBS处理的WT和敲除小鼠(对照组)相比，从蛋白质印迹分析定量的CDKL5表达，在以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183的敲除小鼠中绘制为CDKL5/微管蛋白水平。图29B示出了与用PBS处理的WT和敲除小鼠(对照组)相比，从蛋白质印迹分析定量的激酶活性，在以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183的敲除小鼠中绘制为pEB2pS222/总EB2水平。图30示出了与用PBS处理的WT和基因敲除小鼠(对照组)相比，如通过蛋白质印迹(使用pEB-S222抗体；Baltussen等人，(2018))，在以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183的敲除小鼠中定性测量的激酶活性。
接下来，我们检查了以不同剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183和AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183后的CDKL5表达水平。在这项研究中，小鼠经由新生儿ICV以1×1010、3×1010、6×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183。从4个月大的小鼠采集皮层的组织样品，并经由蛋白质印迹检查CDKL5表达(图21A、21B和21C)。图21A示出了在4月龄时如通过蛋白质印迹定性测量的CDKL5表达，其中小鼠经由新生儿ICV以3×1010或6×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183。图21C示出了从蛋白质印迹分析定量的CDKL5表达，绘制为野生型和敲除小鼠中的CDKL5/微管蛋白水平，该小鼠经由新生儿ICV以3×1010或6×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183，并与以5×1010GC的剂量的AAVhu68.hSyn-CDKL5进行比较。皮层的蛋白质印迹分析显示强劲的hCDKL5转基因表达。从这些结果中，我们观察到剂量依赖性表达，在6×1010GC的剂量下的饱和度。当与从hSyn启动子驱动的CDKL5表达观察到的结果进行比较时，UbC启动子允许CDKL5表达达到更接近健康受试者中野生型(WT)CDKL5表达水平的水平。以不同剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183后的蛋白质印迹分析CDKL5表达示出不太强劲的hCDKL5转基因表达(图21B)。图21B示出了在4月龄时如通过蛋白质印迹定性测量的CDKL5表达，其中小鼠经由新生儿ICV以3×1010或1×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183。
如通过蛋白质印迹分析观察到，施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183后的CDKL5的表达发生变化，并通过荧光显微镜进一步确认。代表性免疫荧光显微镜图像示出，在施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183后，CDKL5在整个大脑中显著表达，并且在施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183后观察到暗淡的表达，而大部分在皮层中可见(图22A和22B)。图22A示出了在经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183之后的来自CDKL5表达的免疫荧光显微镜分析的代表性图像。图22B示出了在经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183之后的来自CDKL5表达的免疫荧光显微镜分析的代表性图像。经过进一步分析，我们观察到UbC启动子比CBh启动子(主要定位于神经元中)在更多细胞中驱动CDKL5表达(图23A和23B)。图23A示出了在经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183之后的来自CDKL5表达的免疫荧光显微镜分析的代表性图像(放大视图)(还探测了样品的NeuN，神经元标志物)。图23B示出了在经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183之后的来自CDKL5表达的免疫荧光显微镜分析的代表性图像(放大视图)(还探测了样品的NeuN，神经元标志物)。
总之，我们观察到用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183和AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183转导后，小鼠脑中CDKL5转基因的表达。经过进一步分析，在用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183转导后，在小鼠大脑的海马体中观察到每个细胞的CDKL5表达较高。同时，在用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183转导后，在小鼠大脑的海马体中观察到每个细胞的CDKL5表达较低，其中。用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183转导后，在小鼠大脑的皮层中观察到每个细胞的CDKL5的表达较高。用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183转导后，在小鼠大脑的皮层中观察到每个细胞的CDKL5的表达较低。此外，我们比较了施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183(3×1010GC，新生儿ICV)和AAVhu68.hSyn.CDKL5-1co.miR183(2.5×1010GC)后，Cdkl5-ko小鼠大脑中的CDKL5表达。按照规定施用AAV后，在小鼠大脑中观察到非常相似的表达模式。在用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183(AAVrh91衣壳；泛素C启动子)或用AAVhu68.hSyn.CDKL5-1co.miR183(AAVhu68衣壳；突触蛋白启动子)转导后，在小鼠大脑中观察到CDKL5表达。
实例3：CDKL5基因疗法在CDD小鼠模型中的临床前治疗益处
为了测试CDKL5基因疗法对Cdkl5缺陷小鼠的治疗益处，我们用5×1011GC(5e11gc)的AAV9-PHP.B-hSyn-hCDKL5-1co.WPRE载体通过眼眶后IV注射治疗了幼年Cdkl5-ko(也称为KO小鼠或小鼠)的队列和野生型(wt)同窝小鼠。所有治疗组继续以相同的速率生长，并且没有观察到与治疗相关的死亡。小鼠在10周龄时接受了一系列的行为测试。我们在高架零迷宫和旷场活动测试中观察到治疗组的稳健且具有统计显著性的归一化。同一组在转棒疲劳测试和Y迷宫测试中略有改善，但热敏感性没有改善。
鉴于Cdkl5对神经发育很重要，我们想知道早期施用基因疗法是否可以改善小鼠的治疗结果。接下来，我们通过心室内(ICV)注射用每只小鼠6×109GC至5×1010GC的剂量范围的AAVhu68-hSyn-hCDKL5-1co.WPRE载体来治疗新生儿Cdkl5-ko的队列或wt同窝小鼠。行为测试在10周龄或在11至14周龄时进行(如有说明)。跨所有组的总体观察结果是治疗耐受性良好，没有治疗相关的死亡，并且观察到正常的体重增加(图9A和9B)和总体发育。在5×1010GC的剂量、2.5×1010GC的剂量和1×1010GC的剂量下，观察到CDKL5转基因在Cdkl5-ko小鼠脑中的剂量依赖性表达。10周龄时，KO小鼠表现出特征性的后肢扣紧表型，该表型在经治疗的ko小鼠中得到了显著改善。通过后肢扣紧测试测量了CDKL5基因疗法的治疗功效。在经治疗的CDKL5-ko小鼠中观察到严重程度评分的剂量依赖性改善(图9C至9F)。同样，在ko小鼠中发现的持续多动性和后立表型也针对野生型活性进行了归一化。在Y迷宫测试(自发交替指数)中，经治疗的ko小鼠的海马体学习和记忆得到了显著改善。CDKL5基因疗法的治疗效果通过旷场活动测试进一步测量，该测试测量KO和经AAV处理的小鼠的多动性的校正。在经治疗的Cdkl5-ko小鼠中观察到多动性的剂量依赖性消退(图11A至11F)。当KO小鼠单独饲养在新笼子中过夜时，筑巢能力很差，并且不会撕毁所有筑巢材料。经治疗的KO小鼠以剂量依赖性方式显著提高了它们的筑巢能力(图10A、10C、10E)。另外的两种其他神经行为测定(大理石埋藏和Y迷宫)示出在经治疗的Cdkl5-ko小鼠中表型改善的强烈趋势(图10B和10D)。EEG表型在一项初步合作研究中得到挽救，并且作为转化生物标志物可能变得有用。另外地，还通过独立的实验队列对关键测定(后肢扣紧、走动活动)的结果进行验证。较大的队列规模(N＝18/组)导致更稳健的统计显著性。还使用可替代的CDD小鼠模型(R59X、D471fs)对关键测定(后肢扣紧、走动活动)的结果进行验证。总之，CDKL5基因疗法将功能性CDKL5蛋白递送至小鼠大脑，并对CDD雄性小鼠模型中的多种神经行为结果具有剂量依赖性治疗效果。
完成行为测试后，在小鼠约3个月大时采集大脑。蛋白质印迹显示，即使在AAV施用后3个月，Cdkl5-ko大脑中仍存在人CDKL5的强劲表达。最后，在印迹磷酸化EB2蛋白时，人CDKL5显示出强大的激酶活性。
我们还用可替代的CDD小鼠模型检查了CDKL5基因疗法的结果。Cdkl5(D471fs)携带造成提前终止密码子的患者点突变。与患者一样，这些小鼠的大脑中没有发现CDKL5蛋白，且EB磷酸化水平高度降低。因此，Cdkl5(D471fs)与之前使用的Cdkl5-ko小鼠一样缺乏Cdkl5蛋白，然而，由于小鼠模型的生成方法，遗传背景略有不同。新生幼犬以与之前相同的浓度注射(5×1010GC，neoICV)，并在3个月后显示出强劲的hCDKL5蛋白表达和EB2磷酸化。一小规模的试点队列进行了行为测试。AAV处理耐受性良好，并且未观察到发病率。在经治疗的突变小鼠中，后肢扣紧得到了显著校正；同样，高架零迷宫测试中的突变表型被校正为经治疗的突变小鼠中的野生型行为(在开放区域中，开放区域进入，图14、15、16)。突变小鼠与新笼子中呈网格状排列的玻璃弹珠表现出较差的互动和埋葬行为，而野生型小鼠通常会埋葬几乎所有的玻璃弹珠。经治疗的突变小鼠表现出与野生型小鼠强烈的校正行为。另参见，下文描述的实例8和9。在以5×1010GC/小鼠的较高剂量的治疗组中，在Cdkl5-ko小鼠中观察到显著改善。
我们还用可替代的CDD小鼠模型检查了CDKL5基因疗法的结果。Cdkl5(R59X)携带引入提前终止密码子的患者点突变。与患者一样，这些小鼠的大脑中没有发现CDKL5蛋白，且EB磷酸化水平高度降低。因此，Cdkl5(R59X)与之前使用的Cdkl5-ko小鼠一样缺乏Cdkl5蛋白，然而，由于小鼠模型的生成方法，遗传背景略有不同。新生幼犬以与之前相同的浓度注射(5×1010GC，neoICV)，并在3个月后显示出强劲的hCDKL5蛋白表达和EB2磷酸化。一小规模的试点队列进行了行为测试。AAV处理耐受性良好，并且未观察到发病率。在经治疗的突变小鼠中，后肢扣紧得到了显著校正。
我们还在杂合雌性Cdkl5-ko小鼠中用可替代的CDD小鼠模型检查了CDKL5基因疗法的结果。此类模型反映了大多数CDD患者(CDD雌性)。总体评估表明，杂合雌性Cdkl5-ko小鼠神经行为表型要温和得多，发病较晚，并且因此使治疗结果的稳健评估更加困难。然而，高剂量(5×1010GC，新生儿ICV)下的后肢扣紧和走动活动的代表性数据示出显著改善(图14B和14C)。另参见，实例8和9。
另外地，我们还检查了WT小鼠中CDKL5基因疗法的剂量递增。经由新生儿ICV以7.5×1010GC和1×1011GC(即先前最高使用剂量的1.5倍或2倍)注射WT(C57Bl6/J)小鼠。没有观察到对体重、发育和存活的明显影响。小鼠表现正常，并且没有表现出后肢扣紧或活动变化。在CNS组织的病理学家审查中没有观察到效果(图19A和19B)。实例4.CDKL5基因疗法(AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183)在CDD小鼠模型中的临床前治疗益处
另外地，在Cdkl5-ko和野生型小鼠中检查了以1×1010GC、3×1010GC或6×1010GC的不同剂量的AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183和AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183的行为效果(即，治疗效果)。在这项研究中，Cdkl5-ko(也称为KO小鼠或小鼠)和野生型(WT)小鼠经由新生儿ICV以3×1010GC的剂量施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183。图24示出与施用AAVhu68.hSyn.CDKL5后的先前结果相比，表达CDKL5的神经元的定量(高于背景水平)。比较时，观察到AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183施用以在正常受试者中实现了WT表达的范围内的表达。而观察到AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183施用以在3×1010GC的剂量下在小鼠脑中达到次最优表达水平。正如预期的那样，WT大脑中神经元的数量和强度有所增加。
我们进一步确认，经由新生儿ICV以1×1010、3×1010或6×1010GC的剂量在施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183的小鼠中的CDKL5的表达。图31A示出了与用PBS处理的WT小鼠相比，在以1×1010、3×1010、或6×1010GC的剂量新生儿ICV施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183后，小鼠皮层和海马体组织中作为具有CDKL5蛋白表达的神经元百分比的结果。图31B示出了在以3×1010GC的剂量新生儿ICV施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183之后，来自用DAPI(细胞核)、CDKL5和NeuN(神经元标志物)染色的皮层切片组织的免疫荧光分析的代表性显微图像。我们在皮层和海马体中观察到丰富的、剂量依赖性的CDKL5表达。
存活和活力研究结果示出新生儿ICV注射后的剂量限制活力的趋势(图25)。图25示出了经由新生儿ICV以1×1010、3×1010或6×1010GC的剂量施用AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183的小鼠在出生后第16天(PND16)的统计存活的存活研究的结果。
在施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183的小鼠中，在所有剂量(即1×1010、3×1010、6×1010GC)下均观察到正常发育。所有队列均观察到正常体重增加。另外地，还观察到与治疗相关的发病率。对照组的WT小鼠对CDKL5表达的耐受性良好。图32示出了当以1×1010、3×1010、6×1010GC的剂量施用PBS或AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183时，野生型和CDKL5-ko的测量体重的分析。此外，观察到后肢扣紧的改善(图33A)。图33A示出了与Cdkl5-ko小鼠和WT小鼠中未处理组相比，以3×1010GC的剂量针对AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183处理组的后肢扣紧测试的结果。
图33B示出了在以1×1010、3×1010或6×1010GC的剂量施用AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183后，在Cdkl5-ko小鼠和WT小鼠中如在旷场活动测试中测量的对多动性的剂量依赖性效应，并绘制为走动活动(光束中断)。图34A示出了以1×1010GC的低剂量施用AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183的WT和Cdkl5-ko小鼠的组的分箱走动活动的结果。图34B示出了以3×1010GC的中等剂量施用AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183的WT和Cdkl5-ko小鼠的组的分箱走动活动的结果。图34C示出了以6×1010GC的高剂量施用AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183的WT和Cdkl5-ko小鼠的组的分箱走动活动的结果。这些结果显示在施用AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183的Cdkl5-ko小鼠中的多动性的剂量依赖性改善。
此外，我们观察到在小鼠中施用最低剂量的AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183时筑巢评分的改善(图35)。图35示出了以1×1010、3×1010或6×1010GC的剂量经AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183处理的WT和Cdkl5-ko小鼠的筑巢结果(巢质量/评分)。
总之，与用PBS处理的Cdkl5-ko小鼠相比，我们观察到当用AAV.CDKL5(在hSyn、UbC下)启动子处理时，Cdkl5-ko小鼠有显著改善。
AAV.UbC.CDKL5-1co.miR183载体在小鼠中显示出与当由hSyn驱动CDKL5表达时相似的治疗效用。具有AAVrh91衣壳的rAAV.CDLK5载体与包含工程化核酸序列的AAV载体基因组一起使用，实现了与rAAVhu68.CDKL5相似的CDKL5表达水平。与hSyn启动子相比，Ubc启动子在小鼠脑中的CDKL5蛋白水平更高。
实例5：效用人CDKL5同种型2至4
已表明在人和小鼠大脑中发现了有至少4种可检测的Cdkl5 mRNA剪接变体，但尚未确定同种型2至4作为稳定蛋白质存在。同种型1占大脑CDKL5的>85％。
我们对人CDKL4同种型2至4进行了密码子工程化编码序列，并将其克隆到与之前相同的AAV载体中。将编码同种型1至4的AAV9-PHP.B载体尾部IV注射到成年Cdkl5-ko小鼠中，并在2周后采集大脑用于蛋白质印迹分析。我们发现所有四种同种型都能稳健地表达和显示预期的凝胶迁移模式。选择产生与同种型1的表达量非常相似的同种型2至4表达的工程化序列进行随访。与同种型1相比，同种型2产生的EB2磷酸化水平略高，并且同种型3或4产生的EB2磷酸化水平略低。
三种可替代的CDKL5同种型已被注射到新生Cdkl5-ko小鼠中，以测试与同种型1相比的潜在治疗益处如何。图12示出用可替代的CDKL5同种型(2、3和4)治疗对扣紧表型的显著校正。图8A至8D提供了用于表达同种型1、同种型2、同种型3或同种型4的AAV.CDLK5载体构建体的CDKL5表达水平或活性。图8A示出了与注射媒介物的野生型小鼠以及注射媒介物的敲除小鼠相比，在注射表达这些同种型中的每一者的AAV载体(5×1010GC，新生儿ICV)的敲除小鼠中的表达水平。图8B示出了在注射媒介物(PBS)的野生型小鼠、注射媒介物或AAV.CDKL5-1co的敲除小鼠中使用pS222EB2确定的CDKL5活性。图8C示出了对于图8A中的组使用pS222EB2确定的CDKL5活性。图8D示出了对于图8B中的组的CDKL5表达水平。
总之，所有同种型都表达为蛋白质并具有相当的催化活性。当进行头对头测试(5×1010GC，新生儿ICV)时，CDD小鼠模型中的同种型2、3或4的治疗结果与同种型1相当。总体而言，使用CDKL5同种型1进行的CDKL5基因疗法对于雄性CDD模型小鼠来说是一种有前途且安全的方法，具有显著的治疗益处。
实例6：用于hCDKL5基因疗法的毒性和安全性测试的试点NHP研究
我们想要研究包装在NHP中的AAVhu68衣壳中的AAV-hSyn-CDKL5-1co.WPRE构建体的表达模式和安全性特性。使用本文描述的载体基因组和之前已经描述的生产方法来产生载体。参见，例如，WO 2018/160582，其通过引用并入本文。一组六只恒河猴(4-6岁)经由小脑延髓池(ICM)进行注射。我们测试了不同的条件：
A.剂量1×1014GC，注射到1ml缓冲液中
B.剂量1×1014GC，注射到3或5ml缓冲液中
C.剂量3×1014GC，注射到3ml缓冲液中
D.剂量1×1014GC，注射到1ml缓冲液中，使用利尿剂乙酰唑胺预处理2天后，以减少CSF产生。
图36A示出了小脑延髓池内(ICM)施用程序的示意性概述。图36B示出了作为荧光镜引导程序的ICM施用的更详细概述。经由小脑延髓池(ICM)注射到CSF提供进入大脑的最佳途径。
简而言之，对于非人灵长类动物(NHP)研究，使用AAVhu68-hSyn-Cdkl5-1co-WPRE载体进行hCDKL5基因疗法的毒性和安全性测试。在一项初步研究中，评估了三种不同的剂量：3×1012GC/动物、1×1013GC/动物和3×1013GC/动物。对于试点研究，选择了1×1014GC/动物的剂量，并评估了两个不同的体积(3mL和5mL)以经由小脑延髓池将AAV载体递送至脑脊液(CSF)。其他研究组使用1×1014GC/动物和利尿剂(例如Diamox品牌乙酰唑胺)或3×1014GC/动物(受试者)。
另外地，我们测试了2×1012、1×1013和3×1013GC/受试者的剂量。用CDKL5载体的治疗耐受性良好，没有观察到临床血液化学变化的征象。笼侧神经学检查的观察发现与基线相比没有变化。
注射后28天进行尸检，随后进行分子分析、组织学和病理学审查。总体而言，CNS以外的主要器官中没有发现重大转导差异(例如，肝脏的转导可能已经达到最大值)。没有观察到脊髓和DRG中的主要转导差异(仍然保持非常高的转导率)，然而根据注射参数，脑组织的显著变化变得明显。在皮层中观察到转导的最高转导增加。Diamox造成整个大脑中转导效率略有增加。
图17示出了每种NHP跨非神经元组织、脊髓束组织和脑组织的载体生物分布。在图18中，仅示出了大脑的载体生物分布数据。结果表明，观察到背根神经节组织(DRG)存在强转导，脑组织存在中度至低度转导，并且存在神经元组织中的转导渗漏。病理结果表明背侧白质束有轻度轴突病变。观察到hCDKL5 mRNA水平略有差异。当使用3ml注射体积时，mRNA表达有较高的趋势。我们还通过原位杂交(ISH)可视化hCDKL5 mRNA分布。背根神经节(DRG)跨所有六种NHP都显示出非常强的mRNA表达。在运动皮层中观察到少量的转导神经元(<10％)。偶尔，会发现小簇的转导神经元。在本研究中，跨NHP的运动皮层中的hCDKL5 mRNA阳性神经元没有显著差异。
病理学审查未发现跨组织和NHP的任何肉眼病变。接受最高剂量的NHP在肝脏中显示出轻微的炎症细胞浸润的征象。另外地，所有NHP均存在轻度至中度脊髓轴突病变和DRG卫星病。
另外地，我们还检查了AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183和AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183载体的NHP中的载体表达和安全性测试。经由ICM途径以3×1010GC的剂量向猕猴施用载体。进行病理学分析和神经检查以评价AAV载体施用后的CDKL5表达的效果。
经由ICM途径以3×1010GC的剂量向NHP施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183和AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183载体后，评价毒性和安全性。在检查临床血液化学时，整个研究中结果显示正常，未观察到ALT或AST升高。我们没有观察到任何安全或毒性问题的征象。在脑脊液(CSF)分析中，我们观察到2例NHP具有持续轻度的脑脊液细胞增多，但尸检期间ICM注射部位没有炎症证据。在笼侧神经学检查中，没有观察到明显的变化或缺陷。在病理组织切片审查中，我们检查了DRG/SpC、周围神经和其他器官。图26A示出了在来自用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183载体经由ICM途径以3×1010GC的施用剂量处理的NHP的颈椎、胸椎和腰椎收集的组织的DRG神经元中观察到的严重程度评分。图26B示出了在来自用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183载体经由ICM途径以3×1010GC的剂量处理的NHP的颈椎、胸椎和腰椎收集的组织的脊髓神经元中观察到的严重程度评分。图26C示出了在来自用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183载体经由ICM途径以3×1010GC的剂量处理的NHP的近端和远端收集的组织的腓肠神经中观察到的严重程度评分。
接下来，我们检查了不同组织中的载体拷贝数(图27和37)。图27示出了施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183或AAVrh91.CBh.CDKL5-1co.miR183载体后，在各种组织或NHP中以GC/二倍体基因组绘制的载体拷贝数的结果。图37A示出了在施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183之后，如经由从NHP的不同脑区域提取的DNA/RNA的qPCR通过载体基因组拷贝测量的对脑转导的分析。我们观察到皮层中良好的转导(约10GC/细胞)，以及DRG神经元和肝细胞中的高转导(约100gc/细胞)。此外，我们分析了不同组织中的转基因表达(图28和37B)。图28示出了与在小鼠大脑中观察到的结果相比，在NHP的各种CNS组织(运动皮层、som.sens.皮层、顶叶皮层、海马体、丘脑)中的以每100ng的cDNA绘制的CDKL5的相对表达。图37B示出了在施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183后，如经由从不同NHP脑区域提取的RNA的qPCR测量的相对CDKL5转基因表达(mRNA)(相对于当以3×1010GC的剂量施用时在小鼠脑中的表达)。
接下来，我们进行原位杂交(ISH)显微镜检查以检查DRG组织中的转基因表达。我们观察到整个NHP大脑中很少检测到CDKL5转基因mRNA。尽管我们观察到零星的转基因表达，但应该注意的是，一些DRG神经元在分析期间过度暴露(数据未显示)。而且，检测技术的灵敏度可能会低估表达CDKL5转基因的神经元数量。
另外地，我们在施用AAVrh91.UbC.CDKL5-1co.miR183后，经由2步PCR检测载体基因组的存在和CDKl5表达的存在，对脑组织进行了单神经元分析，并通过载体基因组拷贝的PCR检测或来自大量组织的CDKL5 mRNA进行确认(图38A和38B)。图38A示出基于单神经元的CDKL5基因疗法结果的分子分析的结果，绘制为通过载体基因组拷贝测量的转导神经元的百分比。图38B确认了从单神经元分析获得的结果。图38B示出从大量mRNA测量的CDKL5转基因表达水平，绘制为转基因表达神经元的百分比。从这些结果中，我们观察到许多神经元表达CDKL5转基因，但水平适中。
总之，我们研究中检查的AAV-CDKL5载体(SEQ ID NO:1)可用于在神经元中实现稳定的CDKL5蛋白表达。AAV-CDKL5基因疗法显著改善了CDD小鼠模型的表型。另外地，AAV-CDKL5载体可以经由小脑延髓池有效递送至非人灵长类动物并在整个CNS中表达。
实例7：hCDKL5基因疗法
AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG
AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG是一种表达人CDKL5同种型1基因的突变体编码序列的AAV血清型hu68(AAVhu68)载体。AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG通过在CNS中提供功能性CDKL5蛋白来解决显著的未满足需求，并从而校正疾病的根本原因，如下所述。所述的首次人体(FIH)试验是一项经由小脑延髓池内(ICM)注射施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的开放标签、多中心、剂量递增研究，以评价患有CDKL5缺乏症(CDD)的儿科(≥30天)和成人受试者的安全性、耐受性和探索性疗效终点。
施用途径
许多单基因中枢神经系统(CNS)疾病的动物模型已成功使用AAV介导的基因转移进行治疗，并且使用第一代AAV载体进行的几项早期人类研究证明了载体递送至大脑的安全性(Janson等人，2002；Mandel和Burger，2004；Kaplitt等人，2007；Mittermeyer等人，2012；Bartus等人，2014)。然而，这些载体的低效率阻碍了将动物模型中的功效转化为临床益处。随着第二代AAV载体的出现，基因转移至大脑的可能性已大大增强。特别是，一些进化枝F分离株，诸如AAV9，已证明具有极其有效的脑转导(Gray等人，2013；Haurigot等人，2013；Hinderer等人，2014b；Hinderer等人，2015)。使用这些更有效的载体，基因疗法已显示出极大增强的治疗多种神经系统疾病的可能性，并且利用第二代载体的几个项目已进入临床(Haurigot等人，2013；Hinderer等人，2014b；Hinderer等人，2015；Gurda等人，2016)。
CNS基因转移的早期研究不仅受到第一代AAV载体的基因转移效率低的挑战，而且还受到可用递送方法的限制。大多数早期的非临床和临床研究利用将载体直接注射到大脑或脊髓的实质中(Vite等人，2005；Worgall等人，2008；Colle等人，2010；Ellinwood等人，2011；Tardieu等人，2014)。虽然这种方法在注射位点附近产生了强大的转导，但将这种方法转化为影响整个CNS的细胞的疾病是困难的，因为需要大量的载体注射才能实现广泛的转基因递送。CNS基因转移的另一个障碍是发现实质内载体注射可能引发注射部位的炎症，这可能促进针对转基因产物的适应性免疫应答(Worgall等人，2008；Colle等人，2010；Ellinwood等人，2011；Ciesielska等人，2013)。已经开发出两种可替代的载体递送方法，以更安全且更有效地靶向CNS的大部分区域。
第一个是基于以下发现：一些AAV载体(包括AAV9)可以在IV递送后转导CNS内的细胞(Foust等人，2009)。然而，IV载体递送有两个关键限制。首先，载体渗透到CNS的效率低，需要极大的载体剂量才能达到转基因表达的治疗水平，增加了全身毒性的风险，并且可能需要大量的载体，而这对于许多患者群体来说可能不可行(Gray等人，2011；Hinderer等人，2014b；Gurda等人，2016)。其次，IV载体递送后向CNS的基因转移受到载体衣壳中预先存在的NAb的极大限制(Gray等人，2011)。鉴于AAV NAb在人类中的流行率很高，这使得大量患者群体将不是接受IV AAV处理的候选人。为了规避IV AAV针对CNS的局限性，鞘内(IT)载体递送已被开发为可替代的方法。IT ROA使用脑脊液(CSF)作为载体分散的媒介物，有可能通过单次微创注射实现整个CNS和周围神经系统(PNS)的转基因递送。动物研究已证明，通过避免穿越血脑屏障的可能性，IT递送可实现CNS基因转移的效率显著提高，且载体剂量比IV方法所需的载体剂量低得多(Gray等人，2011；Hinderer等人，2014b)。由于CSF中存在的抗体水平非常低，IT载体递送不会受到AAV衣壳中预先存在的NAb的影响，从而使该方法适用于更广泛的患者群体(Haurigot等人，2013)。IT AAV递送可以使用多种CSF进入途径来进行。腰椎穿刺(LP)是用于进入CSF的最常见方法，并且因此被评价为NHP中AAV施用的一种途径。研究发现，与在小脑延髓池的水平注射载体更优越相比，经由LP将AAV9载体递送至CSF在脑和脊髓的细胞转导效率至少低10倍(Hinderer等人，2014b)。
通过在NHP中进行的单次ICM注射实现的优越的脑转导使得选择此ROA用于AAVhu68.CB7.CI.hARmiR3610.WPRE.rBG的临床研究。ICM注射(也称为枕骨下穿刺)曾经是一种常见的手术，但由于脑干或附近血管损伤的情况很少见，最终在成像前时代被LP取代(Saunders和Riordan，1929)。如今，该手术可以在实时计算机断层扫描(CT)引导下进行，允许在针插入过程中对关键结构(诸如髓质、椎动脉和小脑后下动脉)进行可视化(Pomerantz等人，2005；Hinderer等人，2014b)。
AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG填充药物产品(FDP)由非复制重组腺相关病毒(rAAV)载体活性成分和调配缓冲液组成。rAAV载体由合同制造组织(CMO)生产。AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG是使用确保产品的安全性、同一性、质量、纯度和强度的程序来生产的，其实践符合“美国食品和药物管理局(FDA)的1期研究药物的行业cGMP指南”(2008年7月)和“FDA行业指南：人类基因疗法研究新药申请(IND)的化学、制造和控制(CMC)信息”(2020年1月)两者。
用于AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的制造过程涉及用质粒DNA瞬时转染人胚肾293(HEK293)细胞。为了支持临床开发，通过聚乙烯亚胺(PEI)介导的生物反应器中的HEK293细胞的三重转染来生产单批次或多批次的散装原料药(BDS)。在可能的情况下，在一次性的、封闭的生物处理系统中通过澄清、切向流动过滤(TFF)、亲和色谱法和阴离子交换色谱法对所采集的AAV材料依次进行纯化。原料药(DS)和药物产品(DP)在鞘内最终调配缓冲液(ITFFB；含有0.001％泊洛沙姆188的人工CSF)中配制。一个或多个BDS批次被冻结，随后被解冻，在需要时被合并，被调整到目标浓度，通过0.2μm过滤器无菌过滤，并且装入小瓶。填充数据作为批次文档包的一部分提供。
使用液滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)效价测定来监测与规模无关的制造过程，该效价测定也用于确定临床剂量。通过评估线性、准确度和精密度，开发了该测定并使其合格使用。在整个程序开发中使用相同的测定。
生物制品的描述
该生物制品包括hCDKL5-1co、人细胞周期蛋白依赖性激酶样5同种型1(工程化突变体)；ITR，反向末端重复序列；miR183，微小RNA-183；PolyA，聚腺苷酸化；rBG，兔β-球蛋白；UbC、泛素C)及其序列元件详述如下(另参见，SEQ ID NO:49(载体基因组)和SEQ ID NO:50(表达盒))。
制造：组分和材料
AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG通过用AAV顺式质粒(pAAV.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG.KanR(SEQ ID NO:49的载体基因组))、编码AAV2rep和AAVhu68 cap基因的AAV反式质粒(pAAV2/hu68n.KanR(包含SEQ ID NO:55))，以及辅助腺病毒质粒(pAdΔF6.KanR)进行三重质粒转染HEK293细胞来产生。AAVhu8.UbC.hCDKL5-1co.mirR183.RBG包装的载体基因组的大小为4857个碱基(包括野生型长度ITR)。质粒中的载体基因组，如SEQID NO:49所述，包括130个碱基对的缩短的AAV2 ITR，其中外部A元件缺失。在使用内部A元件作为模板的载体DNA扩增期间，缩短的ITR回复到145个碱基对的野生型长度。
顺式质粒含有以下载体基因组序列元件：
·反向末端重复序列(ITR)：ITR是源自AAV2(130个碱基对[bp](SEQ ID NO:51)，GenBank：NC_001401)的相同的反向互补序列，侧接载体基因组的所有组分。当以反式方式提供AAV和腺病毒辅助功能时，ITR功能既充当载体DNA复制的起点，又充当载体基因组的包装信号。如此，ITR序列表示载体基因组复制和包装所需的唯一顺式序列。
·人泛素C(UbC)启动子：选择该普遍存在的启动子(1229bp，GenBank：D63791.1)来驱动CNS细胞类型(SEQ ID NO:52)中的转基因产物表达。
·编码序列：编码序列是人CDKL5同种型1基因(2883bp，GenBank：NP_001310218.1(SEQ ID NO:20))的工程化版本。该同种型包含>85％的脑CDKL5总表达，并且被认为是CDKL5的主要脑同种型。(注：CDKL5的主要脑同种型的原始名称是同种型2。然而，Hector等人2016中最近将CDKL5同种型2重新命名为CDKL5同种型1。虽然上面列出的GenBank序列尚未更新以反映这一命名变化，并且仍命名为CDKL5同种型2，但我们将AAVhu68.UbC.hCDKL5-1CO.miR183.RBG中的编码序列称为CDKL5同种型1，以反映当前本领域中用于CDKL5的主要脑同种型所用的命名法)(SEQ ID NO:22)。
·微小RNA-183(miR183)：miR183的四个22bp靶序列(GenBank：NR_029615.1)包含在人CDKL5序列的3'非翻译区中。微小RNA通过影响mRNA稳定性和翻译两者，在转录后下调多细胞生物中靶信使核糖核酸(mRNA)的表达。由于miR183表达很大程度上受限于DRG，因此miR183靶序列能够实现人CDKL5转基因产物的DRG特异性下调。(SEQ ID NO:11)。
·兔β-球蛋白聚腺苷酸化信号(rBG PolyA)：rBG PolyA信号(127bp，GenBank：V00882.1)促进顺式转基因mRNA的有效聚腺苷酸化。此元件充当转录终止的信号、新生转录物的3'端处的特异性切割事件以及添加长聚腺苷酸尾(SEQ ID NO:53)的信号。
使用AAV2/hu68反式质粒pAAV2/hu68(包含SEQ ID NO:55)。AAVhu68反式质粒编码来自AAVhu68的四种WT AAV血清型2(AAV2)Rep蛋白和三种WT AAV VP衣壳蛋白。使用的腺病毒辅助质粒含有对AAV复制重要的腺病毒基因组的区域；即，E2A、E4和VA RNA(腺病毒E1功能由HEK293细胞提供)。然而，质粒不含其它腺病毒复制或结构基因。质粒不含对于复制至关重要的顺式元件，诸如腺病毒ITR。保留在此质粒中的E2、E4和VA腺病毒基因以及存在于HEK293细胞中的E1，对于AAV载体产生都是必需的。
制造过程的概述
用于FIH临床试验的AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG是通过使用质粒DNA瞬时转染HEK293细胞，随后进行下游纯化而制造的。制造过程流程图如图47A、47B所示。图46A示出了原料药的上游制造过程流程图。图46B示出了原料药的下游制造过程流程图。所拟议的过程中测试如图的右侧所示。还提供了每个生产和纯化步骤的描述。
ITFFB制造
鞘内最终调配缓冲液(ITFFB)溶液在临床现场用于在按照研究方案施用之前稀释药物产品。ITFFB稀释剂是一种无菌水溶液，含有与药物产品相同的赋形剂，但不含活性物质。ITFFB溶液将在≤–60℃下冷冻保存。
实例8–AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的药理学、安全性和毒理学的进一步评价：
编码人细胞周期蛋白依赖性激酶样5(CDKL5)同种型1基因的工程化、突变体版本的AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG(一种AAV血清型hu68(AAVhu68)载体)的药理学、安全性和毒理学，已在与其他候选者的各种研究中进行了评估。如本文所述，
治疗后14周，行为表型的改善与疾病相关靶组织(大脑)中转基因产物表达(CDKL5蛋白)和活性(EB2底物磷酸化)增加至野生型水平相关。由于发现旷场测试、筑巢测试和后肢扣紧测试是评价CDD小鼠模型中AAV施用功效的最敏感测定法，因此选择这些测定法作为未来后续鼠类药理学研究的读出器。
一项药理学研究评价了AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG在新生(PND 0-1)雄性Cdkl5KO/Y小鼠中的功效并确定了MED。MED是基于转基因产物表达(人CDKL5)以及对类似于CDD患者中观察到的临床特征的神经和行为表型的影响来确定的。癫痫发作是人类CDD的临床特征，在MED研究中并未进行评估。最后，毒理学研究评估了对幼年雄性和雌性恒河猴施用ICM后AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的安全性、耐受性、药理学(转基因产物表达)、生物分布和排泄。
方法：药理学研究
在C57BL/6J(野生型)小鼠、CDD小鼠模型(雄性Cdkl5 KO小鼠和雌性Cdkl5 HET小鼠)和两个物种的NHP(恒河猴和非洲绿猴)中进行体内药理学研究。
A.CDD的小鼠模型
本文描述的非临床药理学研究利用CDD的敲除小鼠模型，在该模型中X连锁鼠Cdkl5的外显子6已缺失，导致Cdkl5 mRNA显著减少并且没有可检测到的CDKL5蛋白(Wang等人2012)。CDD小鼠模型中的这种敲除突变重现了与CDKL5患者相关的剪接位点突变，该突变引起人外显子7(与鼠外显子6同源)的跳跃并导致人外显子8中提前终止密码子，从而造成在具有这种突变的人类中残留CDKL5蛋白表达的缺失。研究CDD小鼠表型的小组通常使用雄性小鼠，因为雄性Cdkl5KO/Y小鼠(其为X连锁Cdkl5敲除等位基因的半合子)通常表现出比雌性Cdkl5KO/X小鼠(其为X连锁Cdkl5敲除等位基因的杂合子并且还证明由于随机X染色体失活而导致野生型Cdkl5基因表达的可变组织嵌合性)更严重和一致的表型。在雄性Cdkl5KO/Y小鼠中观察到的许多表型也类似于在CDD患者中所见的表型，包括社会行为表型、运动协调异常/多动性、认知功能受损、神经元回路通讯缺陷以及由CDKL5激酶活性受损导致的生化缺陷。下面讨论在雄性Cdkl5KO/Y小鼠中观察到的表型。
社会行为表型：
在大约8周龄的雄性Cdkl5KO/Y小鼠中观察到了类似于CDD患者中观察到的非社交和自闭症样行为。在三室社交方法测试中，雄性Cdkl5KO/Y小鼠与新刺激的小鼠在社交室中花费的时间相比，在非社交室中占据和嗅探新物体花费的时间更多，以及在暴露于无障碍室时，雄性Cdkl5KO/Y小鼠与社交室中其他小鼠的互动时间与野生型小鼠相比显著减少，表明社交偏好降低。到了这个年龄，Cdkl5KO/Y小鼠的筑巢行为在笼子环境中也受到损害，这表明社会行为存在缺陷，并且不能归因于嗅觉系统缺陷(Wang等人，2012)。
运动协调/焦虑样表型：
雄性Cdkl5KO/Y小鼠表现出各种运动表型，类似于CDD患者的症状，这些症状在大约10-11周龄时表现出来。例如，到了这个年龄的雄性Cdkl5KO/Y小鼠中观察到转棒疲劳测定的下降潜伏期减少和后肢扣紧异常，这表明运动协调丧失。在高架零迷宫测试和旷场测试中，也在雄性Cdkl5KO/Y小鼠中观察到焦虑样运动行为(例如，强迫性、多动性和/或风险倾向行为)(Wang等人，2012)。
认知表型和神经回路缺陷：
雄性Cdkl5KO/Y小鼠表现出认知功能受损，这类似于患有CDD的患者中观察到的认知症状。认知表型包括运动活动缺陷以及学习和记忆受损。例如，基于情境恐惧调节测定，到9-12周龄时观察到雄性Cdkl5KO/Y小鼠的情境和线索依赖性行为应答存在显著缺陷。此外，雄性Cdkl5KO/Y小鼠还表现出听觉诱发事件相关的电位(ERP)缺陷，这表明神经回路活动受损，类似于患有CDD的患者中所见。ERP是对特定感觉、认知或运动刺激的刻板的电生理应答。作为感觉信息处理的测量，ERP已被用作神经回路通讯的读出器，并且已被证明在认知障碍(诸如精神分裂症和自闭症)中会发生改变。神经元回路网络内的干扰可能导致在Cdkl5 KO小鼠中观察到的行为应答的延迟。电路通讯取决于低频或高频振荡，并且低频与长距离神经元电路通讯相关。与自闭症谱系障碍患者中报告的神经元缺陷类似，Cdkl5 KO小鼠中低δ、θ和α频率的振荡强度减弱(Wang等人，2012)。
生化缺陷：
与患有CDD的患者相比，Cdkl5 KO小鼠不表现出自发性或难治性癫痫症。CDD小鼠中缺乏这种表型可能归因于动物年龄、研究持续时间以及Cdkl5 KO小鼠模型(C57BL/6)的遗传背景赋予的癫痫抵抗力增加(Wang等人，2012以及Amendola等人，2014)。在12周龄之前的Cdkl5 KO小鼠中没有观察到异常的EEG模式。已经通过小鼠品系的杂合突变产生了CDD的几种小鼠模型。最近，在42周龄的老年雌性Cdkl5 KO小鼠中观察到癫痫事件发生频率较高(Mulcahey等人，2020)。在特定品系的Cdkl5 KO小鼠(Cdkl5RS9X/+雌性)中也注意到对癫痫样事件的年龄依赖性效应，该小鼠证明在16周龄时较早出现癫痫发作，在32周龄时出现肌阵挛性癫痫样事件(Racine 3至5期)，以及在57周龄时出现严重的癫痫样事件(Racine 3至5期)(Terzic等人2021)。癫痫表型与年龄相关，并且需要在老年小鼠中进行评估。基于该观察，不可能在已完成的和计划的利用新生Cdkl5 KO小鼠的鼠科药理学研究中观察癫痫表型。
鉴于与人类CDD的相似性，在疾病的症状前阶段接受治疗的新生雄性Cdkl5KO/Y小鼠代表了预期患者群体的最相关的动物模型，用于评估AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG在MED研究的潜在疗效。
B.非人灵长类动物
NHP已被选用于POC大型动物药理学研究。这些研究包括恒河猴和非洲绿猴两者。NHP被选择用于试点药理学研究，因为NHP的毒理学和免疫应答与人类的毒理学和免疫应答非常相似。此外，恒河猴和非洲绿猴两者的NHP中枢神经系统(CNS)的尺寸充当目标临床群体的代表性模型，并允许经由预期的临床途径施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG(ICM施用)。
基因型
由于Cdkl5是X连锁基因，最初的POC药理学研究利用雌性Cdkl5KO/X小鼠(Cdkl5KO等位基因的杂合子)和雄性Cdkl5KO/Y小鼠(Cdkl5 KO等位基因的半合子)来模拟人类的CDD。由于MED研究是在雄性小鼠中进行，因此评价雄性Cdkl5KO/Y小鼠。然而，由于确定新生小鼠(PND 0-1)的基因型和性别具有挑战性，因此在MED研究中对整窝的新生小鼠(包括雌性Cdkl5KO/X)进行给药；然而，仅招募雄性Cdkl5KO/Y小鼠并进行分析以确定MED。野生型C57BL/6小鼠也被选择用于初始POC和MED研究，因为它们与Cdkl5 KO小鼠模型具有相似的遗传背景，并且因此可用作健康对照组。
性别
雄性Cdkl5KO/Y小鼠、雌性Cdkl5KO/X小鼠和性别匹配的C57BL/6J野生型对照已被包括在初始POC研究中，以表征CDD表型的严重程度和进展。由于本文获得和描述的数据证明，关于对于确定MED(例如，旷场测试)至关重要的某些评估中，雄性Cdkl5KO/Y小鼠比雌性Cdkl5KO/X小鼠具有更严重的表型，因此雄性Cdkl5KO/Y小鼠已被选择进行MED研究。雄性Cdkl5KO/Y小鼠也是计划中的MED研究的首选，因为随机X染色体失活造成雌性中嵌合Cdkl5表达，因为Cdkl5是X连锁基因。由于表达野生型Cdkl5等位基因与Cdkl5敲低等位基因的细胞的总百分比的动物间差异，Cdkl5表达的嵌合现象可引起表型变异，使得雌性小鼠次优用于MED研究。
雄性和雌性恒河猴和非洲绿猴已被用于POC药理学研究。选择两种性别来模拟计划的临床试验中的预期患者群体(男性和女性CDD患者)。
年龄
所有小鼠药理学研究均评价了在PND 0-1上施用载体的新生小鼠。选择这个年龄是因为它是最早可行的治疗时间点，并且代表明显临床症状出现之前的疾病的症状前阶段，取决于所采用的测定，该症状通常在雄性Cdkl5KO/Y小鼠中约8-10周龄开始表现。因此，新生(PND 0-1)小鼠模型在最大可行范围内反映了最年轻的预期患者群体的疾病阶段。
在NHP中进行的POC研究评价了成年(3-10岁)动物。该年龄范围被认为足以对主要候选载体的表达谱和安全性/毒性进行初步比较，并在最大可行范围内对最年轻的预期患者群体的小脑延髓池的大小和解剖结构进行建模。
剂量选择
已完成的POC小鼠药理学研究以5.0×1010GC的剂量评价了测试品，因为基于预期的载体效价和体积限制，这接近小鼠ICV施用的最高可行剂量。另一项POC小鼠药理学研究以2倍低剂量(2.5×1010GC)评价AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG，因为用表达人CDKL5的其他候选AAV载体进行的研究已证明该剂量的功效与最高可行剂量的功效相当(数据未显示)。MED研究随后包括一个高剂量、两个中剂量和一个低剂量，并基于上述POC研究的结果进行选择。所选剂量允许评估剂量依赖性功效，同时确保MED研究中评价的剂量水平是不同的。
在恒河猴中进行的NHP POC药理学研究利用了3.0×1013GC的高剂量，这接近基于预期载体效价和体积限制的NHP中ICM施用的最高可行剂量。中剂量和低剂量分别比最大可行剂量低大约3倍和10倍。选择该范围是为了确保剂量不同，并且包含与可在小鼠MED药理学研究和符合GLP的NHP毒理学研究中评价的剂量范围相似的剂量范围。在非洲绿猴中进行的NHP POC药理学研究利用了5.0×1013GC的剂量，因为该剂量接近基于预期载体效价和体积限制的NHP中ICM施用的最高可行剂量。
研究持续时间
在新生小鼠中进行的所有药理学研究的长度均为13-14周，这是足够的持续时间来评价到8-11周龄时开始显现的行为缺陷以及与Cdkl5激酶活性丧失相关的任何生化表型。
在NHP中进行的两项POC药理学研究的长度均为56天，这是足够的持续时间来在转基因产物表达的预期起始、峰值和平台期间评价动物，并且来评估可能的急性安全性信号。
施用途径
ICV途径(即，将载体直接施用到脑室)已被选择用于小鼠的药理学研究，因为它能够将AAV载体有效递送到疾病相关的靶组织(大脑)。使用预期的临床途径(ICM施用至小脑延髓池)，即利用CSF作为载体分散的媒介物，有可能经由单次微创注射在整个CNS中实现转基因产物表达，但在小鼠中是不可行的，因为动物体型较小。然而，ICM途径已被选择用于NHP POC药理学研究，以反映预期的临床途径，并能够使用与计划的临床试验中利用的临床施用系统相当的临床施用系统。
C.药理学终点
旷场测试(多动行为测试)
旷场测试测量运动活动，并且可用于测量啮齿类动物的焦虑样行为。它由一个圆形或方形外壳组成，设备中心有一个开放、无障碍的区域。旷场将红外光束从外壳的一侧发射到另一侧。当光束被穿过光束的动物破坏时，这被视为“光束中断”。测试期间，将小鼠放入外壳中，并且研究人员退出房间。使用视频跟踪软件记录小鼠行为30分钟，并对光束中断进行定量。活动和焦虑是基于远离外壳内的壁发生的运动来评价的，该运动包括场地中心的整体走动活动(基于x/y轴光束中断的数量以及中心光束中断百分比的水平活动)和后立行为(z轴光束中断)。Cdkl5KO/Y小鼠已被证明在旷场测试中表现出多动性，包括在场地中心增加的走动活动(增加的x/y轴光束中断)和增加的后立(增加的z轴光束中断)。场地中心内的运动(确定为发生在迷宫中心的光束中断的百分比[即，与发生在靠近壁的迷宫外围的光束中断的百分比相反])表示焦虑样行为减少。场中心活动(x/y轴光束中断和中心光束中断百分比)的减少和/或后立行为(z轴光束中断)的减少预计表明Cdkl5 KO小鼠在AAV施用后多动性表型的改善。
大理石埋藏(多动行为测试)
大理石埋藏测定评价啮齿类动物的强迫性和多动性表型。在Cdkl5 KO小鼠中评价大理石埋藏，因为这些小鼠在其他测定(例如，旷场测试)中表现出多动性表型。为了进行大理石埋藏测定，小鼠首先在笼子里适应30分钟。然后将小鼠放入测试笼中，在测试笼预先将12个弹珠放置在干笼垫料的水平堆顶部(3个弹珠乘4个弹珠)。研究人员离开房间，并且将小鼠留在笼子里30分钟。30分钟后，将小鼠放回其笼中，并且将笼内垫料中埋藏≥50％的弹珠数量进行计数。埋藏弹珠数量的减少预计表明AAV施用后Cdkl5 KO小鼠的多动性表型有所改善。
高架零迷宫(风险倾向行为测试)
高架零迷宫基于动物平衡探索/觅食行为(好奇心)和避免潜在危险(冒险)(焦虑样行为的测试)的能力来测量啮齿动物的行为。高架零迷宫是一个圆形迷宫，具有交替的“开放”和“封闭”象限。高架零迷宫测试通过首先让小鼠在笼子中适应30分钟来进行。然后将动物放入迷宫的开放区域，该区域由设备一端的灯照亮，以创建光线明亮的开放区域和光线暗淡的封闭区域。研究人员离开房间，并对动物进行大约15分钟的视频录制。随后在EthoVisionXT视频跟踪软件中确定进入照明开放区域的次数、在开放区域中花费的时间以及行驶的总距离。Cdkl5 KO小鼠已被证明在高架零迷宫测试中更容易出现风险，与正常对照小鼠相比，它们在较亮的开放区域中花费的时间量增加，而正常对照小鼠则在设备的较暗的封闭区域中花费更多的时间量(Wang等人，2012)。Cdkl5KO小鼠在迷宫中时进入开放区域的数量、在开放区域中花费的时间和/或行进的总距离的减少预计表明AAV施用后疾病表型的改善。
筑巢(社会行为测试)
筑巢是啮齿类动物的一种家笼社会行为，对于庇护、保温和繁殖非常重要。筑巢涉及小鼠将材料撕碎，诸如放在笼子里的紧密包装的棉花或麻线，且然后将其排列成巢(Deacon 2006)。Cdkl5 KO小鼠表现出筑巢行为受损，其特征是筑巢失败(即，没有撕碎巢来制造筑巢材料)或筑巢质量差，这表明社会行为存在缺陷。通过首先让小鼠在测试室中适应大约24小时来评估筑巢情况。然后在下午晚些时候将小鼠单独饲养在预先称重的方形棉巢中。大约20小时后，根据紧接着的下表所示的5分评分系统对新创建的巢的质量进行评分。另外地，对剩余的任何未撕碎的巢进行称重并记录(即，剩余≥约0.1g的巢)。碎巢的增加(即完整巢的百分比的减少)和筑巢质量评分的增加将表明筑巢质量的提高，并且预计将表明Cdkl5 KO小鼠在AAV施用后的社会行为表型的整体改善。
资料来源：Deacon，2006。
后肢扣紧(运动控制测试)
后肢扣紧是在Cdkl5 KO小鼠中观察到的一种运动控制表型，其中动物将其后肢拉向其身体，并在倒置时将它们扣在一起(Wang，2012)。通过将小鼠的尾巴悬挂在其笼子上方20-30秒，并根据紧接着的下表中所示的评分系统观察其后肢的行为来评估后肢扣紧。累积后肢扣紧评分的降低预计表明AAV施用后Cdkl5 KO小鼠的运动表型的改善。
Y迷宫自发交替测试(空间工作记忆测试)
Y迷宫自发交替测试评估小鼠的探索活动并评价空间工作记忆。测试设备是一个不透明的Y形封闭迷宫，三个臂彼此成120°角放置。针对这个测试，动物首先被放置在迷宫的中心。研究人员退出房间，且让小鼠自由探索迷宫大约5分钟。动物的运动被记录在视频中以评估臂进入，这被定义为动物将所有四肢完全移动到迷宫的臂中。由于正常小鼠通常更喜欢研究迷宫的新臂而不是返回其先前探索过的迷宫的一部分，因此正常小鼠预计会表现出探索其最近较少访问过的迷宫臂的倾向。访问最近较少探索的迷宫臂的趋势被称为自发交替，并且自发交替百分比是通过将自发交替的数量除以条目总数减2，然后将结果乘以100而计算的。由于相对于WT，Cdkl5 KO小鼠在Y迷宫测试中表现出自发交替减少，自发交替百分比的增加预计表明AAV施用后Cdkl5 KO小鼠的探索/空间工作记忆表型的改善。
情境恐惧调节测试(学习和记忆测试)
情境恐惧调节测试评估啮齿类动物的学习和记忆能力。对于该测试，进行训练阶段，在该训练阶段将小鼠置于调节室中3分钟，在此时间结束时，小鼠的足部接受1.5mA的电击。电击后然后将小鼠留在室中1分钟。第二天，将小鼠再次放回调节室进行5分钟的测试阶段。对动物进行视频记录，并确定动物在测试阶段期间“冻结”(即除了呼吸运动之外没有检测到任何运动)所花费的时间比例。Cdkl5 KO小鼠通常在冻结的测试阶段花费的时间较短，这表明学习和记忆存在缺陷。因此，冻结测试时间花费的比例的增加表明Cdkl5 KO小鼠在AAV施用后的学习和记忆缺陷有所改善(Yennawar,2019)。转基因产物表达–CDKL5蛋白(蛋白质印迹、免疫荧光)、CDKL5 mRNA(原位杂交、qPCR、单细胞RNAseq)
对于NHP药理学研究，通过人CDKL5原位杂交、人CDKL5 qPCR和单细胞RNAseq在mRNA水平评价转基因产物在疾病相关靶组织(大脑)中的表达。对于小鼠药理学研究，通过CDKL5蛋白质印迹法在蛋白质水平评价转基因产物在疾病相关靶组织(大脑)中的表达，该蛋白质印迹法检测人CDKL5和内源性小鼠CDKL5两者，以及使用抗人CDKL5抗体检测人CDKL5免疫荧光。AAV施用预计会增加大脑中CDKL5的表达，在大脑中该蛋白是正常神经元功能所必需的。
转基因产物活性–CDKL5底物磷酸化(磷酸-EB2蛋白质印迹)
CDKL5的激酶活性可以通过测量其底物(包括微管相关蛋白EB2)的磷酸化来评估。使用识别丝氨酸222的磷酸化的抗体，通过磷酸-EB2蛋白质印迹来评估Cdkl5 KO小鼠的疾病相关靶组织(脑)中的CDKL5激酶活性。AAV施用预计会增加通常在Cdkl5KO小鼠的大脑中观察到的异常低水平的EB2磷酸化。
实例9–进一步评价AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的药理学、安全性和毒理学：
A.评价rAAV载体在CDD小鼠模型中的功效的概念验证药理学和测定开发研究
该POC药理学研究评价了对新生雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠在ICV施用后AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40的功效。AAVhu68.hSyn.hCDKL51co.WPRE.SV40利用相同的衣壳(AAVhu68)并表达相同的转基因产物(人CDKL5同种型1)。然而，AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40包括不同的启动子(hSyn与UbC)和polyA(SV40与rBG)，将WPRE序列整合到转基因序列的3'端，并且缺乏用于DRG脱靶的miR183靶序列。
新生(PND 0-1)雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠以5.0×1010GC的剂量接受单次ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40。年龄匹配的雄性和雌性野生型C57BL/6小鼠也被施用媒介物(PBS)作为对照。生活中的评估包括每天进行的活力检查、治疗后4周开始每周测量体重以及治疗后11-14周进行的行为评估(旷场测试、筑巢测试、大理石埋藏测试、后肢扣紧测试、Y迷宫测试、高架零迷宫测试和情境恐惧调节测试)。治疗后14周，对小鼠进行尸检，并进行蛋白质印迹分析，以评价CDKL5敲低以及对疾病相关靶组织(大脑)中底物磷酸化(磷酸EB2)的影响。
AAV施用耐受性良好。施用AAV或媒介物的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠在研究过程中体重增加与施用AAV或媒介物的性别匹配野生型小鼠的体重增加相当(数据未显示)，确认了已发表的文献的观察结果，出生后体重增加的缺陷(即生长迟缓)并不是Cdkl5敲除小鼠表型的特征。
在旷场测试中，分别与经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠相比，经AAV处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠表现出减少的多动性(显著减少水平活动和后立，并且中心活动呈减少趋势)，用AAV处理使所评价的所有三个参数的活性归一化至接近野生型水平。多动性表型的校正在雄性Cdkl5KO/Y小鼠中最为明显，因为当与雌性Cdkl5KO/X小鼠相比，雄性对于所评价的所有三个参数通常表现出更严重的多动性表型(图15A至15F，另参见实例3)。
图15A至15F示出了在ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后，雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中的旷场测试的结果。图15A示出了雄性的水平活动旷场测试的结果，绘制为X/Y轴光束中断。图15B示出了雌性的水平活动旷场测试的结果，绘制为X/Y轴光束中断。图15C示出了雄性的后立旷场测试的结果，绘制为Z轴光束中断。图15D示出了雌性的后立旷场测试的结果，绘制为Z轴光束中断。图15E示出了雄性的中心活动旷场测试的结果，绘制为中心光束中断百分比。图15F示出了雌性的中心活动旷场测试的结果，绘制为中心光束中断百分比。简而言之，新生(PND 0-1)雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠以5.0×1010GC的剂量接受单次ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5 1co.WPRE.SV40(N＝16只雄性，10只雌性)或媒介物(PBS；N＝16只雄性，13只雌性)。对另外的年龄匹配的C57BL/6野生型小鼠进行ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40(5.0×1010GC；N＝10只雄性，11只雌性)或作为对照的媒介物(PBS；N＝15只雄性，12只雌性)。治疗后11-14周，进行旷场测试。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001基于双向方差分析，随后是Tukey多重比较检验，将经AAV处理的Cdkl5 KO小鼠(深蓝线)与经媒介物处理的Cdkl5 KO(红线)进行比较。缩写：AAV，腺相关病毒；ANOVA，方差分析；Cdkl5，细胞周期蛋白依赖性激酶样5(基因，小鼠)；GC，基因组拷贝；ICV，脑室内；KO，敲除；N，动物数量；PBS,磷酸盐缓冲盐水；PND，产后日；WT，野生型。
虽然在大理石埋藏测定中，与经健康的媒介物处理的性别匹配的野生型对照相比，经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠倾向于埋藏更多的弹珠，但埋藏的弹珠的数量差异并不具有统计学显著性。因此，该结果排除了使用该测定来评估AAV处理功效(图10B，另参见，实例3)。
在高架零迷宫测试中，当与经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠相比时，经AAV处理的雄性Cdkl5 KO小鼠表现出风险倾向行为的趋势减少，如通过在迷宫的开放区域平均花费更少的时间所证明；然而，该减少并不具有统计学显著性。对于雌性Cdkl5KO/X小鼠，与健康性别匹配的经媒介物处理的野生型对照相比，风险倾向行为的增加较小，而观察到在雌性Cdkl5KO/X小鼠中施用AAV后，开放区时间呈减少趋势，差异不显著(图39A、39B、40A、40B、41A、41B)。
关于高架零迷宫测试中的开放区进入，当与经媒介物处理的雌性Cdkl5KO/X小鼠相比时，经AAV处理的雌性Cdkl5KO/X小鼠表现出风险倾向行为的显著减少，如通过开放区进入显著减少所证明，用AAV处理使进入开放区的情况归一化至接近野生型水平。相反，通过该参数评估的风险倾向表型在雄性Cdkl5KO/Y小鼠中并不明显，用经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠表现出与健康性别匹配的经媒介物处理的野生型对照相似的进入开放区域的数量，因此排除了在雄性中使用该参数来评价AAV处理功效(图39A、39B、40A、40B、41A、41B)。
关于在高架零迷宫中移动的距离，与健康性别匹配的经媒介物处理的野生型对照相比，经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠或雌性Cdkl5KO/X小鼠没有观察到显著差异，排除了在两性中使用该参数来评估AAV处理功效(图39A、39B、40A、40B、41A、41B)。
图39A示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为开放区域中的时间(秒)。图39B示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雌性Cdkl5KO/X小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为开放区域中的时间(秒)。图40A示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为开放区域进入。图40B示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雌性Cdkl5KO/X小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为开放区域进入。图41A示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为总移动距离。图41B示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雌性Cdkl5KO/X小鼠中高架零迷宫测试的结果，绘制为总移动距离。简而言之，新生(PND 0-1)雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠以5.0×1010GC的剂量接受单次ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5 1co.WPRE.SV40(N＝16只雄性，10只雌性)或媒介物(PBS；N＝12只雄性，10只雌性)。对另外的年龄匹配的C57BL/6野生型小鼠进行ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40(5.0×1010GC；N＝10只雄性，11只雌性)或作为对照的媒介物(PBS；N＝14只雄性，11只雌性)。治疗后11-14周，进行高架零迷宫测试。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001基于单向方差分析，随后是Sidak多重比较检验，对除了经AAV处理的野生型小鼠之外的所有组进行相互比较。缩写：AAV，腺相关病毒；ANOVA，方差分析；Cdkl5，细胞周期蛋白依赖性激酶样5(基因，小鼠)；GC，基因组拷贝；ICV，脑室内；KO，敲除；N，动物数量；PBS,磷酸盐缓冲盐水；PND，产后日；WT，野生型。
在筑巢测试中，分别与经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠相比，经AAV处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠表现出巢质量的改善，如通过筑巢质量评分显著提高所证明，并且完整巢的百分比显著下降。值得注意的是，AAV处理使筑巢质量评分和完整巢的尺寸两者归一化至野生型水平(图10A和10F)。
图10F示出了ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中筑巢测试的结果，绘制为完整的原始巢重量的百分比重量。简而言之，新生(PND 0-1)雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠以5.0×1010GC的剂量接受单次ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5 1co.WPRE.SV40(N＝15)或媒介物(PBS；N＝8)。对另外的年龄匹配的雄性和雌性C57BL/6野生型小鼠进行ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40(5.0×1010GC；N＝11)或作为对照的媒介物(PBS；N＝11)。治疗后11-14周，进行筑巢测试。进行巢质量评分，并基于重量测量原始完整巢的百分比。*p<0.5、**p<0.01、***p<0.001基于单向方差分析，随后是Sidak多重比较检验，对除了经AAV处理的野生型小鼠之外的所有组进行相互比较(针对巢质量评分)，以及单向方差分析，随后是Tukey多重比较检验，将所有组进行相互比较(针对原始巢的百分比)。缩写：AAV，腺相关病毒；ANOVA，方差分析；Cdkl5，细胞周期蛋白依赖性激酶样5(基因，小鼠)；GC，基因组拷贝；ICV，脑室内；KO，敲除；N，动物数量；PBS,磷酸盐缓冲盐水；PND，产后日；WT，野生型。
分别与经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠相比，经AAV处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠表现出显著降低的后肢扣紧评分，表明运动控制显著改善。然而，AAV处理并未完全使这种运动表型归一化，因为经AAV处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠的后肢扣紧评分仍然保持高于健康性别匹配的野生型对照(图14A和14B；另参见，实例3)。
在Y迷宫测试中，当与经媒介物处理的雌性Cdkl5KO/X小鼠相比时，经AAV处理的雌性Cdkl5KO/X小鼠表现出自发交替百分比的增加，用AAV处理将交替百分比归一化至接近野生型水平。这一结果表明，AAV处理增加了雌性Cdkl5KO/X小鼠探索最近较少访问的迷宫臂的倾向，这表明空间学习/记忆得到改善。相反，这种表型在雄性Cdkl5KO/Y小鼠中并不明显，因为经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠表现出与健康性别匹配的经媒介物处理的野生型对照相似的自发交替百分比，因此排除了在雄性中使用该参数来评价AAV处理功效(图42A和42B)。
图42A示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠中Y迷宫测试的结果，绘制为自发交替百分比。图42B示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雌性Cdkl5KO/X小鼠中Y迷宫测试的结果，绘制为自发交替百分比。简而言之，新生(PND 0-1)雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠以5.0×1010GC的剂量接受单次ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL51co.WPRE.SV40(N＝16只雄性，10只雌性)或媒介物(PBS；N＝16只雄性，13只雌性)。对另外的年龄匹配的C57BL/6野生型小鼠进行ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40(5.0×1010GC；N＝10只雄性，11只雌性)或作为对照的媒介物(PBS；N＝15只雄性，12只雌性)。治疗后11-14周，进行Y迷宫测试。*p<0.05基于单向方差分析，随后是Sidak多重比较检验，对除了经AAV处理的野生型小鼠之外的所有组进行相互比较。缩写：AAV，腺相关病毒；ANOVA，方差分析；Cdkl5，细胞周期蛋白依赖性激酶样5(基因，小鼠)；GC，基因组拷贝；ICV，脑室内；KO，敲除；N，动物数量；PBS,磷酸盐缓冲盐水；PND，产后日；WT，野生型。
在情境恐惧调节测试中，与经媒介物处理的雌性Cdkl5KO/X小鼠相比，经AAV处理的雌性Cdkl5KO/X小鼠表现出冻结行为百分比显著增加，表明AAV施用后表型显著改善。值得注意的是，雌性Cdkl5KO/X小鼠中的AAV处理将冻结百分比增加至健康性别匹配的野生型对照的水平，表明表型的归一化。相反，与经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠相比，雄性Cdkl5KO/Y小鼠的AAV处理没有显著增加冻结百分比，表明AAV施用没有改善雄性Cdkl5KO/Y小鼠的这种表型，尽管在雌性Cdkl5KO/X小鼠中具有显著功效(图43A和43B)。
图43A示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠中情境恐惧调节测试的结果，绘制为冻结百分比。图43B示出ICV施用表达人CDKL5的AAV载体后雌性Cdkl5KO /X小鼠中情境恐惧调节测试的结果，绘制为冻结百分比。简而言之，新生(PND 0-1)雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠以5.0×1010GC的剂量接受单次ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5 1co.WPRE.SV40(N＝16只雄性，10只雌性)或媒介物(PBS；N＝16只雄性，13只雌性)。对另外的年龄匹配的C57BL/6野生型小鼠进行ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40(5.0×1010GC；N＝10只雄性，11只雌性)或作为对照的媒介物(PBS；N＝15只雄性，12只雌性)。治疗后11-14周，进行情境恐惧调节测试。**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001基于单向方差分析，随后是Sidak多重比较检验，对除了经AAV处理的野生型小鼠之外的所有组进行相互比较。缩写：AAV，腺相关病毒；ANOVA，方差分析；Cdkl5，细胞周期蛋白依赖性激酶样5(基因，小鼠)；GC，基因组拷贝；ICV，脑室内；KO，敲除；N，动物数量；PBS,磷酸盐缓冲盐水；PND，产后日；WT，野生型。
向雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠施用AAV后，行为表型的改善与转基因产物表达和活性的归一化相关。具体地，在经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中观察到的可检测的脑CDKL5蛋白表达的缺失在AAV施用后的14周在雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中恢复至野生型水平。类似地，在经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠的大脑中观察到的CDKL5底物磷酸化的减少(如通过磷酸-EB2水平确定)在AAV施用后的14周在雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中恢复至野生型水平(图44A和44B)。
图44A示出ICV施用表达人CDKL5(CDKL5/微管蛋白)的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中转基因产物表达的结果。图44B示出ICV施用表达人CDKL5(pS222/总EB2)的AAV载体后雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠中活性的结果。简而言之，新生(PND 0-1)雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠以5.0×1010GC的剂量接受单次ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5 1co.WPRE.SV40或媒介物(PBS)。对另外的年龄匹配的C57BL/6野生型小鼠进行ICV施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40(5.0×1010GC)或作为对照的媒介物(PBS)。治疗后14周进行尸检时，收集脑组织用于通过蛋白质印迹评价转基因产物表达(CDKL5蛋白表达)和转基因产物活性(EB2的磷酸化)。**p<0.01；***p<0.001基于单向方差分析，随后是Sidak多重比较检验，对除了经AAV处理的野生型小鼠之外的所有组进行相互比较。缩写：AAV，腺相关病毒；ANOVA，方差分析；Cdkl5，细胞周期蛋白依赖性激酶样5(基因，小鼠)；GC，基因组拷贝；ICV，脑室内；KO，敲除；N，动物数量；PBS,磷酸盐缓冲盐水；PND，产后日；pS222，磷酸-丝氨酸222；WT，野生型。
总的来说，这项POC药理学和测定开发研究证明，类似于利用相同的衣壳(AAVhu68)和转基因(人CDKL5同种型1)的AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的AAV载体进行的单次ICV施用，可产生CDD的新生小鼠模型的行为表型的显著改善。该小鼠模型行为表型的改善与治疗后14周疾病相关靶组织(大脑)中转基因产物表达(CDKL5蛋白)和活性(EB2底物磷酸化)增加至野生型水平相关。
在CDD小鼠模型中评价AAV施用的功效的最敏感的测定是旷场测试、筑巢测试和后肢扣紧测试。具体地，在旷场测试中，雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠两者在AAV处理后表现出多动性的归一化，如通过水平活动显著减少和后立至野生型水平所证明。旷场测试的治疗效果在雄性Cdkl5KO/Y小鼠中最为明显，因为在该测定中，雄性表现出比雌性Cdkl5KO/X小鼠明显更严重的表型，造成雄性Cdkl5KO/Y小鼠的测试敏感性增加。在筑巢测试中，雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠两者在AAV施用后表现出筑巢缺陷的归一化，其特征是筑巢评分显著增加并且巢重量显著降低，两者均归一化至野生型水平。在后肢扣紧测试中，雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠两者在施用AAV后也表现出运动协调表型的改善，其特征是后肢扣紧评分显著降低，尽管该表型并未完全归一化至野生型水平。
一些测试(大理石埋藏测试和Y迷宫测试)被证明对于评价CDD小鼠模型表型是无效的，因为当与野生型对照相比，经媒介物处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和/或雌性Cdkl5KO/X小鼠观察到极少甚至没有表型异常，使得未来对剂量依赖性治疗效果的评价对这些评估具有挑战性。此外，一项另外的测试(情境恐惧调节)证明了在仅一种性别(雌性Cdkl5KO/X KO小鼠，但不是雄性Cdkl5KO/Y小鼠)的AAV处理效果，这排除了在未来药理学研究中使用该评估。
基于本研究的结果，发现旷场测试、筑巢测试和后肢扣紧测试是用于评价雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠两者中AAV施用的功效的最敏感的测定法，且因此被选择用于未来的药理学研究。
B.对成年恒河猴ICM施用后临床候选先导化合物的概念验证载体比较药理学研究
该POC载体比较研究旨在评估在对成年恒河猴进行ICM施用后，两种先导候选物(AAVhu68.hSyn.hCDKL5 1co.WPRE.SV40[在实例3和实例9A中评价]和AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40)的安全性、耐受性和转基因产物表达。AAVhu68.hSyn.hCDKL5 1co.WPRE.SV40和AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40利用相同的衣壳(AAVhu68)并表达相同的转基因产物(人CDKL5)。AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40还包括与AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG(UbC)相同的启动子。然而，AAVhu68.hSyn.hCDKL51co.WPRE.SV40在转基因序列的3'处包含不同的启动子(hSyn与UbC)和WPRE序列，而两个载体具有不同的polyA(SV40与rBG)并且缺乏miR183靶序列用于AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG中发现的DRG脱靶。
简而言之，成年(3-10岁)雄性和雌性恒河猴接受以低剂量(3.0×1012GC)、中剂量(1.0×1013GC)或高剂量(3.0×1013GC)进行单次ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40或AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40。生活中的评价包括每天进行的观察、体重、神经学监测以及血液的临床病理学(CBC、凝血板、血清化学)和CSF。所有NHP在第56天进行尸检。尸检时，收集疾病相关靶组织(大脑)以及另外的高灌注CNS(脊髓)、PNS(DRG、TRG和坐骨神经)和外周组织，用于评价载体生物分布。对脑、脊髓和PNS组织进行组织病理学评价，因为这些组织是通过ICM途径高度转导的组织。还评价了垂体组织的组织病理学。收集另外的脑组织以评估该疾病相关靶组织中的转基因产物表达(通过ISH和qPCR的人CDKL5mRNA表达)。收集并储存血清用于可能将来评估对载体衣壳的NAb。还收集并储存了PBMC和组织驻留淋巴细胞，以将来可能评价T细胞对载体衣壳和/或转基因产物(IFN-γELISpot)的应答。
AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG耐受性良好，并且在笼侧观察、神经学监测或血液临床病理学中未观察到与测试品相关的发现。在第28天施用中剂量(1.0×1013GC)的AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40的单个动物中观察到短暂的轻度CSF淋巴细胞增多症(≥6个白细胞[WBC]/μL)，被认为与测试品相关。到第42天的以下时间点，细胞增多症无症状且无需治疗即可消退。另一只施用中剂量(1.0×1013GC)的AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40的动物在第8天表现出明显的淋巴细胞增多症；然而，这种无症状的发现可能归因于样品(1780个RBC)中的血液稀释，并且在任何其他所评价的时间点都没有观察到。
关于第56天的组织病理学，对于任何剂量的任一载体均未观察到DRG感觉神经元变性(每只动物N＝0/3DRG节段)。然而，对于大多数动物，脊髓背侧白质束和周围神经(坐骨神经)两者中均观察到轴突病变。轴突病变的发现提示DRG感觉神经元病理学，因为来自这些DRG神经元的轴突投射到脊髓的该区域并进入周围神经。在所有病例中，脊髓和周围神经轴突病变均无症状，日常观察或神经系统检查未发现临床异常。
关于脊髓背侧白质束的轴突病变，两种载体的发生率和严重程度似乎通常呈剂量依赖性，从最低剂量下无轴突病变(两种载体的N＝0/3节段)增加到中剂量和高剂量下的最小严重程度(1级)(AAVhu68.hSyn.hCDKL5 1co.WPRE.SV40分别为N＝1/3节段和N＝3/3节段；对于两种剂量的AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40为N＝2/3节段)。跨载体进行比较，两种载体都表现出相似的脊髓轴突病变严重程度，在所有病例中观察到最小(1级)病理学(每个载体N＝2/3只动物)。此外，没有观察到这些载体之间脊髓轴突病变的发生率存在明显差异。与相同剂量下的AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40(N＝2/3节段)相比，AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40在中剂量下导致脊髓轴突病变的发生率较低(N＝1/3节段)。然而，在高剂量下观察到相反的情况，与AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40(N＝2/3节段)相比，AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40表现出更高的脊髓轴突病变发生率(N＝3/3节段)。
关于周围神经(坐骨神经)的轴突病变，AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40的严重程度和发生率似乎不存在剂量依赖性，在所有剂量下，每只动物都观察到最小(1级)的外周神经轴突病变(N＝3/3坐骨神经；N＝3/3动物)。相比之下，AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40导致周围神经轴突病变，其就严重程度和发生率两者而言均呈剂量依赖性，在低剂量或中剂量下未观察到轴突病变(N＝2/2坐骨神经；N＝2/2动物)以及在高剂量下观察到轻度轴突病变(2级)(N＝1/1坐骨神经；N＝1/1动物)。跨载体进行比较，AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40导致外周轴突病变的总体发生率较低，而AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40导致轴突病变的总体严重程度较低。
第56天对载体生物分布的评价显示，两种载体在整个大脑中都有高水平的转导。两种载体还在脊髓、DRG、周围神经(三叉神经)和脾脏中证明了相对高水平的转导。在外周组织(包括肺、肌肉、心脏、肾脏、肝脏和眼睛)中观察到两种载体的转导相对较低。任一种载体的剂量应答都不明显，可能是因为本项POC研究所评价的动物数量较少。跨载体进行比较，当考虑到预期的动物间差异时，每个组织(包括所评价的每个大脑区域)的转导水平对于每个各自的剂量通常是相似的。因此，向NHP进行ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL51co.WPRE.SV40或AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40会产生可比的生物分布特性，两种载体均能有效转导疾病相关的靶组织(大脑)。
图45A示出以低剂量ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。图45B示出以低剂量ICM施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。图45C示出以中剂量ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。图45D示出以中剂量ICM施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。图45E示出以高剂量ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。图45F示出以高剂量ICM施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40后成年恒河猴中载体生物分布的结果。简而言之，成年(3-10岁)雄性和雌性恒河猴接受以低剂量(3.0×1012GC)、中剂量(1.0×1013GC)或高剂量(3.0×1013GC)进行单次ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40或AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40(每个剂量每个载体N＝1只动物)。所有NHP在第56±4天进行尸检，并收集指定组织用于评价AAVhu68载体生物分布(TaqMan qPCR)。虚线代表检测限(50GC/μg DNA)。缩写：AAVhu68，腺相关病毒hu68；DNA，脱氧核糖核酸；GC，基因组拷贝；ICM，小脑延髓池内；N，动物数量；NHP，非人灵长类动物；qPCR，定量聚合酶链式反应。
与观察到的每个载体的生物分布特性一致，在对两种载体评价的所有剂量下，在与CDD治疗相关的脑区域中，包括小脑和整个皮层，转基因产物表达(人CDKL5同种型1mRNA)都是可检测到的(图46)。两种载体的转基因产物表达通常都是剂量依赖性的，与每种载体的中剂量和高剂量相比，在低剂量观察到大多数脑区域的表达水平较低。跨载体进行比较，当考虑到预期的动物间变异性时，每个不同剂量下每个大脑区域的表达水平通常相似。因此，向NHP进行ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5 1co.WPRE.SV40或AAVhu68.UbC.hCDKL51co.SV40会产生疾病相关靶组织(大脑)中相似水平的剂量依赖性转基因产物表达。
图46示出了在ICM施用表达人CDKL5的AAV载体后成年恒河猴脑中转基因产物表达的结果–成年(3-10岁)雄性和雌性恒河猴以低剂量(3.0×1012GC)、中剂量(1.0×1013GC)或高剂量(3.0×1013GC)接受单次ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL5-1co.WPRE.SV40或AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.SV40(N＝每个载体每个剂量1只动物)。所有NHP在第56±4天进行尸检，并收集大脑用于评价转基因产物表达(人CDKL5同种型1mRNA qPCR)。缩写：CDKL5-1，细胞周期蛋白依赖性激酶样5(同种型1)；GC，基因组拷贝；ICM，小脑延髓池内；mRNA，信使核糖核酸；N，动物数量；NHP，非人灵长类动物；qPCR，定量聚合酶链式反应。
总的来说，对成年雄性和雌性恒河猴进行ICM施用AAVhu68.hSyn.hCDKL51co.WPRE.SV40或AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40具有良好的耐受性，在笼侧观察、神经学监测或任一载体的血液临床病理学中未观察到与测试品相关的发现。在第28天施用中剂量(1.0×1013GC)的AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40的单个动物中观察到可能与测试品相关的短暂性轻度无症状CSF淋巴细胞增多症，该症状到第42天无需治疗即可消退。第56天对两种载体的组织病理学评价显示，脊髓背侧白质束和周围神经出现无症状轴突病变，该病变被认为继发于DRG感觉神经元变性。虽然对于两种载体的脊髓中轴突病变的发生率和严重程度相似，但与AAVhu68.hSyn.hCDKL5 1co.WPRE.SV40相比，对于AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40的周围神经的严重程度略低(分别为1级与2级)。两种载体还表现出类似的强大载体转导特性，并在第56天在疾病相关靶组织(大脑)中产生转基因产物(人CDKL5 mRNA)。
最终，这项研究选择了缺乏3'WPRE元件的AAVhu68衣壳、UbC启动子和hCDKL51co转基因序列进行进一步评价。这些元件的选择基于对NHP进行ICM施用AAVhu68.UbC.hCDKL51co.SV40后在疾病相关靶组织(大脑)中有利的载体生物分布和转基因产物表达谱，以及对用AAVhu68.UbC.hCDKL5 1co.SV40治疗的动物的观察与施用其他载体的那些相比，表现出较不严重的周围神经病理学。
C.CDD小鼠模型中AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的概念验证药理学和测定开发研究
这项POC药理学研究评价了对新生雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠进行ICV施用后的AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的疗效，以优化用于该计划的MED药理学研究的研究设计和测定法。
简而言之，新生(PND 0-1)雄性Cdkl5KO/Y小鼠和雌性Cdkl5KO/X小鼠以2.5×1010GC的剂量接受单次ICV施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG或媒介物(PBS)(N＝12/组)。另外的年龄匹配的雄性和雌性C57BL/6J野生型小鼠接受媒介物(PBS)作为对照(N＝12)。持续的生活中的评估包括每天进行的活力检查、每周进行的体重测量以及治疗后10-11周进行的行为评估(旷场、筑巢、后肢扣紧测试)。治疗后13-14周进行尸检。尸检时，收集血液用于CBC/差异分析和血清临床化学分析。收集组织列表用于组织病理学评价。在疾病相关的靶组织(大脑)和高度转导的外周组织中评价转基因产物表达(CDKL5蛋白质印迹、CDKL5免疫荧光)和转基因产物活性(EB2的磷酸化[磷酸-EB2蛋白质印迹])。
D.对新生雄性Cdkl5KO/Y小鼠进行ICV施用后的AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的功效以确定MED
该药理学研究评价了在新生雄性Cdkl5KO/Y小鼠中ICV施用的AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的功效并确定了MED。用于本研究的载体是为计划的符合GLP的NHP毒理学研究而制造的毒理学载体批次。
简而言之，在本研究中进行评价了N＝60个新生(PND 0–1)经AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG处理的雄性Cdkl5KO/Y小鼠和N＝12个年龄匹配的经媒介物处理的雄性C57BL/6J野生型对照。该研究包括一个尸检时间点(治疗后13-14周)。使用ICV施用评价AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的四个剂量水平。剂量水平的选择基于正在进行的POC药理学研究的结果，该研究评价了除了POC安全性以及在成年非洲绿猴中进行的AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的药理学研究(如上所述)之外的在CDD小鼠模型中的AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG施用的功效(也如上所述)。
生活中的评估包括每天进行的活力检查、体重测量和行为评估(旷场、筑巢、后肢扣紧测试)。治疗后13-14周进行尸检。尸检时，收集血液用于CBC/差异分析和血清临床化学分析。收集组织列表用于组织病理学评价。在疾病相关的靶组织(大脑)和高度转导的外周组织中评价转基因产物表达(CDKL5蛋白质印迹、CDKL5免疫荧光)和活性(EB2的磷酸化)。
E.向幼年恒河猴ICM施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的毒理学研究
一项为期180天的符合GLP的毒理学研究评估了以低剂量、中剂量或高剂量(N＝4/剂量)向幼年(1.5-2岁)雄性和雌性恒河猴单次ICM施用后的GTP-213的安全性、耐受性、药理学(CDKL5 mRNA表达)、生物分布和排泄特性。另外年龄匹配的雄性和雌性NHP施用媒介物(鞘内最终调配缓冲液[ITFFB])作为对照(N＝2)。
NHP(恒河猴)被选用于计划的毒理学研究(遗传毒性、致癌性、生殖毒性和发育毒性评估)。评价的最高剂量是基于预期载体效价和最大施用体积的最大可行剂量。中剂量和低剂量分别比最大可行剂量低大约3倍和10倍。选择该范围以确保剂量不同并涵盖小鼠MED药理学研究中评价的剂量范围。该毒理学研究的研究持续时间为180天，其中有第90天的临时尸检时间点。
使用CSF作为用于载体传播的媒介物，鞘内(IT)ROA有可能在整个CNS中实现转基因递送。对大型动物溶酶体贮积病(诸如粘多糖贮积症[MPS]I型和MPS VII型)模型的研究证明，AAV的CSF递送造成整个大脑中神经元的广泛转导，而大脑是用于治疗CDD的关键靶组织(Hinderer等人，2014a；Hinderer等人，2015；Gurda等人，2016)。最近的一项研究检查了用于CSF进入的不同途径，证明了经由ICM施用递送AAV载体，与经由腰椎穿刺而注射载体相比，在转导大脑、脊髓和脊髓运动神经元的细胞方面的效率至少高10倍(Hinderer等人，2014b)。因此，ICM施用被选用于计划的临床试验，并且ICM途径将用于计划的NHP毒理学研究，以复制预期的临床ROA。
从非临床剂量缩放到临床剂量的方法
ICM载体施用造成载体在CSF隔室内立即分布，并且预计功效和毒性两者都与CNS载体暴露有关。因此通过脑质量来缩放剂量，该脑质量提供了CSF隔室的大小的近似值。剂量换算基于新生小鼠的0.15g的脑质量(Gu等人，2012)、幼年NHP的90g的脑质量(Herndon等人，1998)、6-8个月婴儿小鼠的610g、8-12个月婴儿小鼠的780g、以及>12个月婴儿小鼠的960g(Dekaban，1978)。针对人类婴儿的每个年龄范围的估计脑重量是在(Dekaban，1978)中提出的男性和女性脑重量得出的，通过假设新生儿(370g)和4-8个月婴儿的脑重量之间近似线性增加，得出≥1-<4个月大婴儿的平均估计脑重量为488g。610g的值对应于4-8个月大的男性和女性的平均脑重量(Dekaban，1978)。
紧接着下表列出了新生小鼠、幼年NHP和等效人类剂量的剂量缩放的实例。施用体积也将基于脑CSF(Matsumae等人，1996)和脊髓CSF(Rochette等人，2016)的估计体积从NHP缩放到人类。
实例10：首次人体临床试验方案概要
首次人体试验的概述
FIH试验是一项经由小脑延髓池内(ICM)注射施用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的开放标签、多中心、剂量递增研究，以评价患有CDKL5缺乏症(CDD)的儿科(≥30天)和成人受试者的安全性、耐受性和探索性疗效终点。最多可招募36名患有CDD的受试者参加该研究。本研究最初在第一个剂量递增队列中招募年龄≥12岁的受试者。仅在独立数据安全监测委员会(DSMB)审查了来自下一个较高年龄组的可用安全性、实验室和临床数据后，才开始对较低年龄组(≥2岁且<12岁，≥30天至<2岁)进行交错入组和治疗。每个年龄组都有剂量递增，升级到下一个剂量水平需要获得DSMB的同意。
剂量递增(队列1和2)评估AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的两个剂量水平的单次ICM施用。待测试的AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG剂量水平是基于来自鼠类MED研究和GLP NHP毒理学研究的数据确定的，并且由低剂量(施用于队列1)和高剂量(施用于队列2)组成。预计两个剂量水平都赋予治疗益处，但要理解的是，如果耐受的话，将预期更高剂量是有利的和先进的。我们的标准方法是应用安全裕度，以便为人类受试者选择的高剂量为NHP中的等效MTD的30-50％。低剂量通常比所选高剂量低2-3倍，前提是该剂量超过动物研究中同等缩放的MED。
本研究的剂量递增部分遵循3+3设计。对于每个年龄组，三名受试者被纳入一个剂量队列。如果DSMB认为安全数据可以接受，则年龄队列可能会进入下一个剂量水平。另外地，下一个较年轻的年龄队列可能会开始以与较年长的年龄队列中测试的相同剂量水平入组。如果前三名受试者中的一者开发出安全审查触发(SRT)或基于DSMB指导，则最多另外三名受试者将被纳入相同年龄和剂量的队列。
尽管剂量递增阶段计划有2个剂量水平队列(最多12名受试者)，但第二个剂量水平队列的表现取决于不断变化的安全性、耐受性和可获得的有效性数据。剂量水平、队列规模、后续队列的安全性监测在入组前由DSMB确认。
由于拟议的临床试验是第一个在人类中评价AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的临床试验，因此使用AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG的受试者的研究产品(IP)给药在每名受试者之间至少错开6周，以监测肝酶升高并对表明ICM施用并发症、免疫反应或其他剂量限制性毒性的不良事件(AE)进行评价。此外，这个6周的时间窗口捕获了当基于非临床数据而预期基因表达最大的时间。可以基于新出现的非临床数据进一步细化受试者的IP给药之间的持续时间，以缩短或延长最终方案中受试者IP给药之间的间隔。
所有经治疗的受试者将被跟踪2年，以评价AAVhu68.UbC.hCDKL5-1co.miR183.rBG在1期FIH研究中的安全性特性并表征其药效学和功效特性。在随后的长期随访研究中对受试者进行另外3年(给药后总共5年)的随访，以评价长期临床结果，这符合草案“FDAGuidance for Industry:Long Term Follow-Up after Administration of Human GeneTherapy Products”(2020年1月)。
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本说明书中引用的所有文件均通过引用并入本文，如2020年4月27日提交的美国临时专利申请第63/016,036号和2020年10月13日提交的美国临时专利申请第63/091,032号、2020年11月4日提交的美国临时申请第63/109,608号、2021年4月26日提交的国际专利申请第PCT/US21/29185号以及2021年10月18日提交的美国临时专利申请第63/256,827号通过引用并入。在此提交的电子序列表名为“UPN-22-9863PCT_SequenceListing_20221018.xml”，大小为281,561字节，创建于2022年10月18日，并且电子序列表的内容(例如其中的序列和文本)通过引用整体并入本文。虽然已经参考特定实施例描述了本发明，但是应理解，在不脱离本发明的精神的情况下可以进行修改。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (19)

1.一种用于治疗CDKL5缺乏症(CDD)的重组腺相关病毒(rAAV)，其中所述rAAV包含：
(a)AAVhu68或AAVrh91衣壳；以及
(b)(a)的AAV衣壳中的载体基因组，其中所述载体基因组包含：5'AAV反向末端重复序列(ITR)；包含SEQ ID NO:22的核苷酸1至2883的人CDKL5序列的表达盒，所述人CDKL5序列可操作地连接至指导其表达并且进一步包含四个串联miR183靶向序列的调控序列；以及3'AAV ITR。
2.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述调控序列进一步包含UbC启动子或hSyn启动子。
3.根据权利要求1或2所述的rAAV，其中所述表达盒包含SEQ ID NO:49(或SEQ ID NO:50)的核苷酸220至4609的核酸序列、SEQ ID NO:29(或SEQ ID NO:59)的核苷酸226至4608的核酸序列、或者SEQ ID NO:31(或SEQ ID NO:60)的nt 224至4191的核酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的rAAV，其中所述AAV衣壳是AAVhu68衣壳。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组包含AAV 5'ITR、UbC启动子、hCDKL5编码序列、四个miR183靶向序列、兔球蛋白polyA信号和AAV 3'ITR。
6.根据权利要求5所述的rAAV，其中所述载体基因组进一步包含Kozak序列。
7.根据权利要求2至5中任一项所述的rAAV，其中所述UbC启动子具有SEQ ID NO:52的序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的rAAV，其中所述miR183靶向序列中的至少一者具有AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(miR183，SEQ ID NO:11)的序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的rAAV，其中所述四个miR183靶向序列串联定位并由间隔序列隔开。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的rAAV，其具有包含核酸分子的AAVhu68衣壳，所述核酸分子包含SEQ ID NO:49的载体基因组。
11.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的rAAV以及载剂、防腐剂、赋形剂或水性稀释剂中的一者或多者。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其包含适合于脑室内或脑池内糊剂注射的水性液体。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的rAAV或根据权利要求11或12所述的药物组合物，其适合于治疗CDKL5缺乏症。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的rAAV在制备药物中的用途。
15.根据权利要求1至10中任一项所述的rAAV用于治疗CDKL5缺乏症的用途。
16.一种用于生产rAAV载体的核酸分子，所述核酸分子包含载体基因组，所述载体基因组包含：5'AAV反向末端重复序列(ITR)；包含SEQ ID NO:22的核苷酸1至2883的人CDKL5序列的表达盒，所述人CDKL5序列可操作地连接至指导其表达并且进一步包含四个串联miR183靶向序列的调控序列；以及3'AAV ITR。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中所述载体基因组包含SEQ ID NO:49。
18.根据权利要求16或17所述的核酸分子，其是质粒。
19.一种rAAV生产宿主细胞，其包含：
(a)根据权利要求16或17所述的核酸分子；
(b)包含AAV衣壳编码序列，并且任选地进一步包含AAV rep编码序列的核酸分子；以及
(c)腺病毒辅助基因。
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