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CN118401520A - 自噬诱导化合物及其用途，特别是用于疾病和病症的系统治疗 - Google Patents

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CN118401520A
CN118401520A CN202280076779.8A CN202280076779A CN118401520A CN 118401520 A CN118401520 A CN 118401520A CN 202280076779 A CN202280076779 A CN 202280076779A CN 118401520 A CN118401520 A CN 118401520A
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CN
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disease
autophagy
compounds
compound
infection
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Application number
CN202280076779.8A
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彼得·哈姆雷
沃伦·加洛维
奥利弗·凯普
吉多·克罗默
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
French National Institute Of Health And Medicine
Reincarnation Therapy Co
University Hospital Of Paris Saint Germain
Western Dais Paris, University of
Sorbonne Universite
Original Assignee
French National Institute Of Health And Medicine
Western Dais Paris, University of
Sorbonne Universite
Reincarnation Therapy Co
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Abstract

本发明涉及治疗自噬相关疾病和病症，特别是全身治疗。本发明涉及式(I)化合物或其盐、溶剂化物和/或水合物，其中所述化合物诱导和/或刺激自噬过程，以及所述化合物在治疗和预防自噬相关疾病和病症中的用途。实例为癌症、年龄相关疾病和病毒感染，当全身给药时，可以采用这些化合物有效地治疗该病毒感染。

Description

自噬诱导化合物及其用途，特别是用于疾病和病症的系统 治疗
本发明涉及治疗自噬相关疾病和病症，特别是用于其系统治疗。本发明涉及根据式(I)的化合物或其盐、溶剂化物和/或水合物，其中所述化合物诱导和/或刺激自噬过程，以及所述化合物在治疗和预防自噬相关疾病和病症中的用途。例子是癌症、年龄相关疾病和病毒感染，这些疾病可以用系统提供的有效化合物有效治疗。
背景技术
自噬是从失去或失去功能的细胞中去除不必要的细胞器和蛋白质的过程，它有助于维持细胞稳态，是一种细胞生存机制。
自噬的细胞自主抗菌防御功能，最初在链球菌(streptococci)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的案例中得到证明，已经扩展到各种各样的微生物，但需要注意的是，大多数高度适应的病原体已经进化出了对抗微生物自噬消除的特定保护机制。其他研究揭示了自噬与先天免疫和适应性免疫、T细胞发育、分化和稳态以及炎症反应之间的有序交叉。因此，自噬在各种疾病中起着重要作用，所述疾病如癌症、炎症性疾病、退行性神经疾病和免疫性疾病。
自噬是一种在应激细胞中诱导的细胞生存机制。
Towers和Thorburn(见Therapeutic Targeting ofAutophagy.EBioMedicine.2016；14:15-23.doi:10.1016/j.ebiom.2016.10.034)公开了自噬被广泛接受为对神经退行性疾病的细胞保护，并且各种临床干预措施正在向前发展，以增加自噬作为一种治疗干预措施。自噬在癌症中既有积极作用，也有消极作用，这引发了关于是否或如何在癌症治疗中尝试自噬操作的争议。尽管如此，癌症是目前试图操纵自噬进行治疗的最活跃的疾病，数十项临床试验正在使用氯喹或羟氯喹联合抑制自噬与其他药物一起治疗多种肿瘤。他们回顾了最近关于神经退行性疾病和癌症中自噬的文献，并强调了治疗靶向自噬的一些机会、争议和潜在陷阱。
Mulcahy Levy和Thorburn(in：Autophagy in cancer:moving fromunderstanding mechanism to improving therapy responses in patients.Cell DeathDiffer 27、843-857(2020).https://doi.org/10.1038/s41418-019-0474-7)揭示了自噬允许将细胞材料递送到溶酶体进行降解，从而导致提供能量和大分子前体的细胞成分的基础的或应激诱导的周转。这些活性被认为在癌症中特别重要，其中已经描述了自噬的肿瘤促进和肿瘤抑制功能。自噬也与细胞凋亡和程序性细胞死亡密切相关，了解这些相互作用在改善癌症治疗和患者预后方面变得越来越重要。在这篇综述中，他们考虑了最近关于自噬操作如何对癌症细胞行为产生影响的发现如何被用来改善治疗反应。
Grainger等人(1995，Nature Medicine 1:1067-1073)和Reckless等人(1997，Circulation 95:1542-1548)已经证明，他莫昔芬，一种有效的自噬诱导剂，通过降低低密度脂蛋白(LDL)胆固醇来抑制饮食诱导的主动脉脂质损伤的形成，从而抑制小鼠模型中的动脉粥样硬化。
CN 102516239A公开了具有式(I)表示的结构式的芳香族噻唑微分子有机化合物或其水合物或其药学上可接受的盐。该发明的化合物或含有这些化合物的组合物可作为化妆品添加剂用于防晒、抗紫外线和皮肤损伤保护，并用于抑制由过量紫外线照射引起的细胞凋亡和环氧合酶COX2的表达。
US2004-0116425A1公开了可用于治疗与蛋白质的异戊二烯化相关的疾病的相关化合物及其药学上可接受的盐、包含所述化合物的药物组合物以及使用所述化合物抑制生物体中的蛋白质异戊二烯化的方法。
WO 2009-103432A2极其广泛地涉及如本文所定义的式(I)L1-R1-L-A-X的分子探针，其允许在体外测定、细胞或多细胞生物中观察所选择的胱天蛋白酶、组织蛋白酶、MMP和羧肽酶的催化活性
在WO 2010-147653A1中，极为广泛地公开了用于治疗与视蛋白蛋白的错误定位、突变视蛋白的错误折叠以及积聚在眼睛中的毒性视觉周期产物的产生有关的眼科病症的化合物。
WO 2017-216579A1涉及杂环化合物1,1'-(((丙烷-2,2-二基双(4,1-亚苯基))双(氧基)双(乙烷-2,1-二基))二吡咯烷及其医学用途，例如作为自噬诱导剂。
如果要在治疗和/或预防自噬发挥作用的疾病，则需要开发更具选择性的自噬诱导剂。本发明的目的是提供可用于预防和治疗可通过诱导和/或刺激自噬来治疗/预防的病症和疾病的有效药剂，特别是在癌症、年龄相关疾病和感染中。当研究本发明的本说明书时，其他目的和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。
本发明的第一方面通过式(I)的化合物、其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物解决了上述目的，
其中X独立地选自C、N、O和S的化学上可能的组合，并且任选地被CH3、-CH2-CH3或COOH取代，
R1选自环状C5或C6烷基，任选地包括化学上可能的N、O和/或S，且任选地被-CH3、-NH2、-COOH、C1-C4烷氧基、卤素、三氟甲基、三氟甲氧基单取代或双取代；
R2选自H、CH3、直链或支链的C2至C6烷基，任选地包括化学上可能的N、O和/或S，并且任选地被-CH3、-NH2、-OH、-COOH、环戊基、环己基、双环[2.2.1]庚烷、双环[3.1.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷取代，任选地包括化学上可能的N、O和/或S，并且任选地被-CH3、-CH2-CH3、-OH、-异丙基、-COOH、-COOCH3、-CH2-环己基、-NH2取代，
R3选自H、直链或支链的C1至C6烷基，任选地被-CH3、-OH、-CH2-CH3、-NH2、-CH2-NH2、-CH2-NH-CH3、-COOH取代，任选地包括化学上可能的一个或多个N、O和/或S；
C1至C4烷氧基，任选地包括化学上可能的一个或多个N、O和/或S，并且任选地被-NH2、-OH、-COOH单取代或双取代；
环丙基、环丁基，任选地包括化学上可能的一个或多个N、O和/或S，并且任选地被-CH3、-CH2-CH3、-NH2、-CH2-NH2、-CH2-NH-CH3、-OH和-COOH单取代或双取代；
条件是R2和R3不都是H或CH3；
R2和R3可以连接形成4元、5元、6元、7元环、稠合环戊基和/或环己基的双环[3.1.1]庚烷的双环结构，任选地包括化学上可能的一个或多个N、O和/或S，并且任选地被直链或支链C1至C6烷基单取代或双取代，任选地被-CH3、-OH、-CH2-CH3、-NH2、-NH-CH3、-CH2-NH2、-CH2-NH-CH3、-OH、-COOH、-COOCH3、＝O、异丙基、磺酰胺取代，并且任选包括化学上可能的一个或多个N、O和/或S；
条件是R2、R3或其组合包括NH或NH2的至少一种。
令人惊讶地显示，本文所述的化合物是高效的自噬诱导物/刺激物。因此，本发明人发明了用于诱导和/或刺激患者或受试者的疾病和不期望的条件相关细胞中的自噬的化合物。在本发明通式表示的化合物的情况下，自噬被有效地诱导和/或刺激。此外，与CNS或大脑相比，化合物在给药后表现出更高的全身(外周)浓度，优选至少为2:1的外周/大脑比率，这使它们成为诱导和/或刺激可通过全身给药治疗的患者或受试者的疾病和不期望的病症相关细胞中的自噬的理想候选。
令人惊讶地发现，式I化合物作为自噬诱导剂是有效的，并且与其他自噬相关的治疗方案相比显示出许多优点。与测试的现有技术化合物(包括未显示的数据)相比，本发明的改进在于出乎意料地观察到本文所述的化合物是高效的自噬诱导剂(参见下面的实施例)。
基于这些结果，这是这些化合物在本文公开的自噬相关疾病中具有活性的证据，优选可通过全身给药治疗的自噬相关疾病和病症。此外，这种活性的实例显示在下面的实施例中，其也涉及病毒感染和涉及蛋白质错误折叠的疾病模型中的特异性活性。作为示例性的医学应用，根据式170/171的化合物
令人惊讶地显示有效(参见下面的实施例)。
优选的是根据本发明的根据下式II的化合物、其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物：
其中R1、R2和R3如上所述。
优选的是根据下式的本发明的化合物III、其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物：
其中R1、R2和R3如上所述。
优选的是根据本发明的化合物、其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物，其中R1选自
优选的是根据本发明的化合物、其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物，其中R1和X如上所述，R2选自H、-CH3、-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH2、环己基、-CH2(CH3)-CH2-NH2、
R3选自H、-CH3、-CH2-CH3、丙基、异丙基、-CH2-CH2-OH、-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-CH2-NH2、-CH(NH2)-CH3、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)2、-CH2-CH(NH2)-CH3、-CH(-CH3)-CH2-NH2、-CH2-CH2-N(CH3)2，、R2和R3可以连接以形成选自以下的环：
优选的是根据本发明的根据下式IV的化合物、其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物，
其中R2选自
R3选自H、CH3、-CH2-CH2-CH3和异丙基，或
R2和R3形成选自的环。
优选的是选自以下的根据本发明的化合物：
5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-[(3S)-吡咯烷-3-基]-1H-吡咯-2-甲酰胺(式93)；
5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-[(3R)-吡咯烷-3-基]-1H-吡咯-2-甲酰胺(式94)；
2-(5-苯基噻吩-2-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)-1,3-噻唑-4-甲酰胺(式122)；4-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)-1H-吡咯-2-甲酰胺(式123)；
2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-(哌啶-4-基)-N-(丙烷-2-基)-1,3-噻唑-4-甲酰胺(式163)；
2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-[(3S)-吡咯烷-3-基]-1,3-噻唑-4-甲酰胺(式170)；
2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-[(3R)-吡咯烷-3-基]-1,3-噻唑-4-甲酰胺(式171)；和
其生理上可接受的盐、溶剂合物、水合物、对映异构体或其多晶型物。
下面的表2、2a和2b中公开了本发明的进一步优选的化合物。
术语“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的本发明化合物的有机或无机盐。这可以包括无机酸的加成盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘化物、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐和硝酸盐，或有机酸的加成盐，如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、棕榈酸盐和硬脂酸盐。示例性盐还包括草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸氢盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸盐、抗坏血酸盐、龙胆酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、葡糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、乙磺酸盐和苯磺酸盐。关于药学上可接受的盐的其他实例，可参考Gould(1986，Int J Pharm 33:201-217)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种生产本发明化合物的方法，包括根据本文公开的一般实验步骤中的任何一个，优选方法1-4。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含药学上有效量的本发明化合物和药学上或治疗上可接受的赋形剂或载体。
术语“药学或治疗上可接受的赋形剂或载体”是指不干扰活性成分的有效性或生物活性并且对宿主(可能是人类或动物)无毒的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。根据具体的给药途径，可以使用各种药学上可接受的载体，例如本领域公知的载体。非限制性实例包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石粉、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和无热原水。药学上可接受的载体或赋形剂还包括稀释剂(填料、填充剂，如乳糖、微晶纤维素)、崩解剂(如淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠)、粘合剂(如PVP、HPMC)、润滑剂(如硬脂酸镁)、增粘剂(如胶体二氧化硅)、溶剂/共溶剂(如水性载体、丙二醇、甘油)、缓冲剂(如柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐)、防腐剂(如苯甲酸钠、对羟基苯甲酸酯(甲酯、丙酯和丁酯)、BKC)、抗氧化剂(如BHT、BHA、抗坏血酸)、润湿剂(如聚山梨醇酯、山梨醇酯)、增稠剂(如甲基纤维素或羟乙基纤维素)、甜味剂(例如山梨醇、糖精、阿斯巴甜、安赛蜜)、调味剂(如薄荷、柠檬油、咸味奶油硬糖(butterscotch)等)、保湿剂(如丙烯、乙二醇、甘油、山梨醇)。其他合适的药学上可接受的赋形剂特别描述在Remington’s Pharmaceutical Sciences，15Ed.，Mack Publishing Co.，New Jersey(1991)和Bauer等人，Pharmazeutische Technologic，5Ed.，Govi Verlag Frankfurt(1997)中。本领域技术人员知道本发明化合物的合适的制剂，并且将能够容易地选择合适的药学上可接受的载体或赋形剂，这取决于例如药物组合物的制剂和给药途径。
根据本发明，所有合适的给药模式都是可考虑的。例如，药物的给药可以通过口服、皮下、直接静脉内、缓慢静脉内输注、连续静脉内输输注、静脉内或硬膜外患者控制的镇痛法(PCA和PCEA)、肌内、鞘内、硬膜外、峡部内、腹膜内、透皮、局部、口腔、舌下、透粘膜、吸入、心房内、鼻内、直肠或眼部途径、防滥用和抗滥用制剂、用于肠外使用的无菌溶液悬浮液和贮存液等，以立即释放、持续释放、延迟释放、控制释放、延长释放等方式给药。药物可以以离散的剂量单位配制，并且可以通过药学领域中公知的任何方法制备。本发明的药物组合物可以使用本领域已知的方法配制，以在给予哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。通常，将至少一种本发明化合物与至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂混合。
除了上述本发明的化合物之外，药物组合物还可以含有两种或多种本发明化合物以及其他治疗活性物质。
根据本发明的药物组合物的剂量可以根据给药途径、待给药的受试者、目标疾病及其严重程度、年龄、性别体重、个体差异和疾病状态适当选择。剂量可以一天重复几次。
根据本发明，哺乳动物受试者可以优选地选自小鼠、大鼠、猫、狗、兔、山羊、绵羊、马、骆驼、羊驼、奶牛、猴子、农场动物、竞技动物和宠物以及人。
进一步提供如本文所定义的本发明化合物，其用于预防和/或治疗哺乳动物受试者(例如人)的病症和/或疾病。适合根据本发明的相关方面进行治疗的病症和/或疾病是以有缺陷或不充分的自噬为特征的病症或疾病，或者其将受益于诸如自噬诱导的调节。与中枢神经系统或大脑相比，化合物在给药后表现出更高的全身(外周)浓度，优选至少为2:1的外周/大脑比例，这使它们成为可通过全身给药治疗的患者或受试者的疾病和不期望的病症相关细胞中诱导和/或刺激自噬的理想候选。
本发明还包括本发明化合物作为自噬诱导剂的用途。该用途可以是化妆品用途和/或在体外，例如在体外测定中。
例如，US 9,138,400涉及一种用于皮肤解毒和/或对抗皮肤老化的美容方法，包括在皮肤上局部施用组合物，所述组合物包括皮肤细胞自噬的至少一种激活剂。Eckhart L，Tschachler E和Gruber F(见Autophagic Control of Skin Aging.Front Cell DevBiol.2019；7:143.Published 2019Jul 30.doi:10.3389/fcell.2019.00143)综述了细胞类型特异性自噬在皮肤中的作用及其对衰老的不同贡献的证据。
自噬抑制在遗传性自噬空泡肌病(包括Danon病、自噬过多的X连锁肌病和婴儿自噬空泡性肌病)的发病机制中起着关键作用，所有这些疾病的特征都是溶酶体缺陷和自噬空泡的积聚。自噬空泡性肌病和心肌病也可继发于自噬抑制药物(氯喹、羟氯喹和秋水仙碱)的治疗，这些药物在实验上用于获取自噬通量，在临床上用于治疗疟疾、风湿病和痛风。
自噬损伤也与包涵体肌炎的发病机制有关，肌炎是一种与年龄相关的炎症性肌病，目前对任何形式的治疗都难以治愈，伴有其他肌肉营养不良，如胫骨肌营养不良。
基础自噬水平的改变见于类风湿性关节炎和骨关节炎。与功能失调的自噬相关的免疫反应的其他方面见于家族性地中海热患者的中性粒细胞和TNF受体相关周期性综合征患者的单核细胞，这两种疾病都是自身炎症性疾病。此外，自噬调节一种重要的中性粒细胞功能，即中性粒细胞外陷阱(NET)的产生。自噬在诱导NET形成中的重要作用已在几种中性粒细胞相关疾病中得到研究，所述疾病如痛风、败血症和肺纤维化。此外，自噬与哺乳动物巨噬细胞释放IL1B的分泌途径之间存在关系，这表明自噬在蛋白质运输中可能具有替代作用。在败血症和抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎中，酸化的LC3阳性液泡暴露于NET上的蛋白质表位，从而在中性粒细胞中也暗示了这种作用。慢性肾脏疾病患者的白细胞自噬激活也受损，这与他们的心脏异常密切相关。还有证据表明，2型糖尿病患者的胰腺β细胞和脂肪细胞的自噬发生了改变。
最近，癌症细胞中治疗诱导自噬在调节癌症细胞与免疫系统的界面方面发挥了关键作用；主要是通过影响与免疫原性细胞死亡(ICD)相关的危险信号的性质(即，促进危险信号暴露和/或释放的信号级联)。
因此，本发明的化合物用于预防和/或治疗哺乳动物受试者(如人)的自噬相关疾病或病症。
“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指对哺乳动物疾病或病症的任何治疗，包括：预防或预防疾病或病症，即导致疾病的临床症状不发展；抑制疾病，即阻止或抑制临床症状的发展；和/或缓解疾病，即引起临床症状的消退。“改善”是指对一种状态的预防、减少或缓和，或对一个受试者状态的改善；应激反应的改善是对应激反应的负面影响的抵消。改善包括但不需要完全恢复或完全预防应激反应。
优选根据本发明使用的化合物，其中所述自噬相关疾病或病症选自系统性红斑狼疮、癌症、肝脏疾病、a1抗胰蛋白酶缺乏症、Charcot-Marie-Tooth综合征、Rett综合征、镰状细胞病、Wilson病、淀粉样变性、Gaucher病、溶酶体和糖原储存障碍、囊性纤维化；病毒感染和疾病、人类巨细胞病毒(HCMV)感染、乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒感染、寨卡病毒感染、冠状病毒感染、HCoV-229E、HCoV-NL63、如HCoV-OC43、SARS-CoV-1、HCoV-HKU1、MERS-CoV或SARS-CoV-2的β冠状病毒感染、、细菌感染、代谢紊乱、糖尿病、纤维化、伤口愈合障碍、尼曼-匹克C型(NPC)病、纤维蛋白原储存病(FSB)、包涵体病(IBD)、肌营养不良、杜氏肌营养不良症、肢带肌营养不良病、肌病、肌原纤维肌病、遗传性肌病、糖尿病心肌病、抗炎症、自身免疫性疾病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、肠易激综合征、克罗恩病、血管疾病、冠状动脉疾病、心肌梗死、不稳定型心绞痛、动脉粥样硬化或血管炎、白塞综合征、巨细胞动脉炎、风湿性多肌痛、韦格纳肉芽肿病、丘格-斯特劳斯综合征、血管炎、过敏性紫癜、川崎病、病毒感染或复制、痘病毒感染、疱疹病毒感染、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨质疏松症、器官移植排斥反应、牛皮癣、增生性瘢痕形成(瘢痕疙瘩形成)、普通或妇科手术后的粘连形成、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、细胞内寄生虫引起的疾病、疟疾、结核病、神经性疼痛、术后幻肢疼痛或带状疱疹后神经痛、过敏、抗原诱导的回忆反应、免疫反应抑制、肌肉退化和萎缩、衰老中的虚弱、脊髓损伤以及涉及错误折叠和/或非折叠蛋白质的疾病和病症(这些疾病和病症可以采用全身给药时有效的化合物进行治疗)以及与年龄相关的疾病和病症(例如癌症和代谢综合征)。特别优选的是Charcot-Marie Tooth综合征。
Cheon SY，Kim H，Rubinstein DC和Lee JE.(见Autophagy,Cellular Aging andAge-related Human Diseases.Exp Neurobiol 2019；28:643-657.https://doi.org/10.5607/en.2019.28.6.643)据报道，在衰老过程中，被认为是衰老原因的细胞因子与逐渐受损的自噬有关。功能失调的自噬可能导致老年疾病，如神经退行性疾病、癌症和代谢综合征。因此，将受损的自噬恢复正常可能有助于预防与年龄相关的疾病，延长寿元(lifespan)和寿命(longevity)。它们概述了细胞衰老和随之而来的疾病背后的自噬机制。
同样，Leidal，A.M.、Levine，B.和Debnath，J.(见Autophagy and the cellbiology of age-related disease.Nat Cell Biol 20,1338-1348(2018).https://doi.org/10.1038/s41556-018-0235-8)综述了自噬随着年龄的增长而下降以及自噬受损使个体易感，而刺激自噬的干预措施往往能延长寿命。
此外，Vaccaro Maria Ines，De Tata Vincenzo和Gonzalez Claudio Daniel(见Editorial:Autophagy in Endocrine-Metabolic Diseases Associated With Aging；Frontiers in Endocrinology,11,2020,pp 572,doi＝10.3389/fendo.2020.00572)推出了一期特刊，其中包含12篇文章，涵盖了不同类型的自噬改变与衰老、内分泌代谢和退行性疾病相互作用的广泛关键主题。
进一步优选的是根据本发明使用的化合物，其中所述预防和/或治疗包括至少两种用于本发明的化合物的组合，和/或与至少一种用于所述自噬相关疾病或病症的另外的药物活性物质的组合。
进一步优选的是根据本发明使用的化合物，其中所述预防和/或治疗包括全身治疗，与CNS或大脑相比表现出更高的全身(外周)浓度。
应当理解，本发明化合物和/或包含本发明化合物的药物组合物用于给药于人类患者。术语“给药”是指单独给药或与另一种治疗剂联合给药。因此可以设想，本发明的药物组合物用于共同治疗方法，即与其他药品(medicament)或药物(drug)和/或在本发明的方法中可能有益的任何其他治疗剂共同给药。然而，如果需要，其他药物或药物和/或任何其他治疗剂可以与该化合物分开给药以供使用，只要它们与本发明化合物(供使用)组合(即直接和/或间接，优选协同)作用即可。
在根据本发明使用的化合物的另一个方面中，预防和/或治疗还包括在所述受试者中检测和/或监测至少一种自噬生物标志物的反应。生物标志物优选选自BECN1、ATG8/LC3家族(包括LC3A、LC3B、LC3C)、LC3-II、ULK1、p62、NBR1、ATG5和ATG7。
这种监测通常对取自哺乳动物受试者的生物样本进行，并包括众所周知的测试，例如基于抗体的、基于PCR的测试等。随着时间的推移重复测试，并可与对照样品和/或更早从哺乳动物受试者身上采集的样品进行比较。该结果有助于主治医师维持或修正治疗过程，通常基于所治疗的自噬相关疾病和/或病症的临床症状的严重程度。
在其另一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗哺乳动物受试者(例如人)中的自噬相关疾病和/或病症的方法，包括给所述哺乳动物施用有效量的根据本发明的化合物或药物组合物。优选地，所述预防和/或治疗包括与CNS或大脑相比表现出更高的全身(外周)浓度的全身治疗。
优选根据本发明的方法，其中所述自噬相关疾病或病症选自系统性红斑狼疮、癌症、肝脏疾病、a1抗胰蛋白酶缺乏症、Charcot-Marie-Tooth综合征、Rett综合征、镰状细胞病、Wilson病、淀粉样变性、Gaucher病、溶酶体和糖原储存障碍、囊性纤维化；病毒感染和疾病、人类巨细胞病毒(HCMV)感染、乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒感染、寨卡病毒感染、冠状病毒感染、HCoV-229E、HCoV-NL63、如HCoV-OC43、SARS-CoV-1、HCoV HKU1、MERS-CoV或SARS-CoV-2的β冠状病毒感染、细菌感染、代谢紊乱、糖尿病、纤维化、伤口愈合障碍、尼曼-匹克C型(NPC)病、纤维蛋白原储存病(FSB)、包涵体病(IBD)、肌营养不良、杜氏肌营养不良症、肢带肌营养不良病、肌病、肌原纤维肌病、遗传性肌病、糖尿病心肌病、抗炎症、自身免疫性疾病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、肠易激综合征、克罗恩病、血管疾病、冠状动脉疾病、心肌梗死、不稳定型心绞痛、动脉粥样硬化或血管炎、白塞综合征、巨细胞动脉炎、风湿性多肌痛、韦格纳肉芽肿病、丘格-斯特劳斯综合征、血管炎、过敏性紫癜、川崎病、病毒感染或复制、痘病毒感染、疱疹病毒感染、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、骨质疏松症、器官移植排斥反应、牛皮癣、增生性瘢痕形成(瘢痕疙瘩形成)、普通或妇科手术后的粘连形成、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、细胞内寄生虫引起的疾病、疟疾、结核病、神经性疼痛、术后幻肢疼痛或带状疱疹后神经痛、过敏、抗原诱导的回忆反应、免疫反应抑制、肌肉退化和萎缩、衰老中的虚弱、脊髓损伤、以及涉及错误折叠和/或非折叠蛋白质的疾病和病症，这些疾病和病症可以采用全身给药时有效的化合物有效地进行治疗。特别优选的是Charcot-MarieTooth综合征。
可以根据给药途径、给药对象、目标疾病及其严重程度、年龄、性别体重、个体差异和疾病状态来适当选择根据本发明给药的药物组合物的剂量。剂量可以一天重复几次。
根据本发明，哺乳动物受试者可以优选地选自小鼠、大鼠、猫、狗、兔、山羊、绵羊、马、骆驼、羊驼(lama)、牛、猴子、农场动物、竞技动物和宠物以及人。
除了上述本发明的化合物之外，所给药的药物组合物还可以含有两种或多种本发明化合物以及其他治疗活性物质。在所述方法中，如上所述，可以提供和/或以合适的药物组合物的形式给药所用的化合物。这些化合物可以单独给药，也可以与其他活性化合物联合给药-例如用已知的用于治疗上述病症和/或疾病的药物，由此在后一种情况下注意到有利的增加，增强或优选协同作用。
在根据本发明的方法的另一个方面中，预防和/或治疗还包括检测和/或监测所述受试者中至少一种自噬生物标志物的反应。生物标志物优选选自BECN1和ATG8/LC3家族(包括LC3A、LC3B、LC3C)、LC3-II、ULK1、p62、NBR1、ATG5和ATG7。
这种监测通常对取自哺乳动物受试者的生物样本进行，并且包括通常已知的测试，例如基于抗体的测试、基于PCR的测试等。随着时间的推移重复测试，并可与对照样品和/或更早从哺乳动物受试者身上采集的样品进行比较。该结果有助于主治医师维持或修改治疗过程，通常基于所治疗的自噬相关疾病和/或病症的临床症状的严重程度。
令人惊讶地发现，根据式I的化合物作为自噬诱导剂，与其他自噬相关的治疗方案相比，特别是作为联合治疗，是有效的并且表现出许多优点。与测试的现有技术化合物(包括未显示的数据)相比，本发明的改进在于出乎意料地观察到本文所述的化合物是高效的自噬诱导剂(参见下面的实施例)。作为示例性的医学应用，根据式170/171的化合物
显示出令人惊讶的有效性(参见下面的实施例)。
然而，现在将在以下实施例中进一步描述本发明，而不限于此。为了本发明的目的，本文所引用的所有参考文献全部通过引用并入本文。
实施例
以下实施例部分使用所公开的优选化合物进行。然而，应当理解的是，本发明并不以任何方式局限于此，并且本领域技术人员能够容易地将所述条件调节至根据本发明的其他化合物。
本发明的化合物由市售的起始材料合成，优选地通过如下给出的相关一般实验步骤(一般实验步骤1-4)。
使用的缩写：
Boc 叔丁氧羰基
tBu 叔丁基
DCM 二氯甲烷
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
dppf 1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁
eq 当量
ESI 喷雾电离质谱
Hz 赫兹
H 小时
HATU 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯
HPLC高效液相色谱
J耦合常数(Hz)
LCMS液相色谱-质谱法
min分钟
NMR核磁共振
N 当量浓度(每升eq)
Ph 苯基
RT 保留时间
rt 室温
SFC 超临界流体色谱
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱
vol 体积
X-Phos 2-二环己基膦-2′,4′,6′-三异丙基联苯
X-Phos Pd G2第二代XPhos预催化剂(X-Phos氨基联苯氯化钯预催化剂)；氯(2-二环己基膦-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1’-联苯)]钯(II)
一般实验步骤1
合成示意图概述：
典型的一般条件
步骤1-将Boc-保护的中间体合成
室温下向2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸(CAS.No.137576-900，1.0eq)在DMF(10体积)中的溶液中，加入HATU(1.5eq)和DIPEA(3.0eq)。将反应混合物搅拌15-20分钟，然后在室温下将Boc保护的胺衍生物(1.0eq)加入到反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2小时至16小时(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，将反应混合物倒入冷水(10体积)中，并用乙酸乙酯(3×5体积)萃取。合并的有机级分用冷水洗涤3-4次，用硫酸钠干燥并在减压下浓缩。粗物质通过快速柱色谱法纯化(system)以提供Boc保护的中间体。
步骤2-脱保护
在0℃或室温下，向Boc保护的中间体(1.0eq)在DCM(10体积)中的搅拌溶液中加入溶于二恶烷的4N HCl。将所得反应混合物在rt下搅拌15分钟至1小时(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物并打浆(通常用乙醚或DCM)以提供目标化合物。
一般实验步骤2
合成示意图概述(X＝未指定的杂原子；R1＝芳基或杂芳基[未取代的和取代的])：)
典型的一般条件
步骤1-交叉偶联
向硼酸酯衍生物(1.0eq)和溴酯衍生物(1.2eq)在合适的溶剂(DMF或1,4-二恶烷：水(9:1，10体积)中的、室温下的搅拌溶液中加入合适的碱(磷酸钾或碳酸钾或碳酸钠；2.0至3.0eq)。反应混合物用氮气脱气10分钟。合适的钯催化剂(Pd(PPh3)4或PdCl2(dppf)。DCM或X-Phos Pd G2或(t-Bu3P2Pd；0.1eq)。将反应混合物再次用氮气脱气10分钟，然后在80C-100℃下加热3小时至16小时(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。
反应结束后，用水(10体积)稀释反应混合物并用乙酸乙酯(3×5体积)萃取。将合并的有机级分用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(系统)纯化粗物质以提供中间体1。
步骤2-酯水解
在室温下向中间体1(1.0eq)在合适的溶剂(通常为THF(10体积)或MeOH(10体积或EtOH(10容量))中的搅拌溶液中加入合适的碱(通常为LiOH(8.0eq)在水(10体积的)中或NaOH(5.0eq)在水中(10容量的))。将反应混合物在rt下搅拌2小时至16小时(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，蒸馏出反应混合物，并用乙酸乙酯(2X5体积)萃取。将水层酸化(通常用1N HCl或饱和柠檬酸溶液)，并用乙酸乙酯(3×10体积)萃取。将合并的有机级分用硫酸钠干燥并在减压下浓缩以提供酸性中间体2。
步骤3-形成Boc保护的酰胺
在室温下向搅拌的中间体2在DMF(10体积)中的溶液中加入HATU(1.5当量)和DIPEA(3.0当量)。将反应混合物在rt下搅拌15-30分钟，然后将Boc保护的胺(1.0当量)加入到反应混合物中。在rt下搅拌反应混合物(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后(通常约4h)，将反应混合物倒入冷水(10体积)中，并用乙酸乙酯(3x 10体积)萃取。合并的有机级分用冷水洗涤3-4次，用硫酸钠干燥并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(系统)纯化粗物质以提供中间体3。
第4步-脱保护
向0℃下搅拌的中间体3(1.0eq)在DCM(10体积)中的溶液中，加入在二恶烷(5体积)中的4N HCl。将反应混合物在rt下搅拌1小时至4小时(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物以提供粗品，用乙醚将粗品打浆以提供目标化合物。
一般实验步骤3
合成概述(R1＝芳基或杂芳基[未取代和取代]或烷基)：
典型的一般条件
步骤1：5-氨基-1H-吡唑-4-碳腈中间体的合成
在室温下，向适当的盐酸肼(20.69mol)在乙醇(50mL)中的搅拌溶液中加入乙酸钠(3.39g，41.39mmol)和2-(乙氧基亚甲基)丙二腈(2.52g，20.69mmol)。将反应混合物在80℃回流2小时(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物。残余物质用冷水(50mL)洗涤，并用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。合并的有机级分用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩以提供粗5-氨基-1-芳基-1H-吡唑-4-碳腈。
步骤2：1H-吡唑-4-碳腈中间体的合成：
在室温下向搅拌的粗5-氨基-1-芳基-1H-吡唑-4-碳腈(18.24mmol)在THF(50mL)中的溶液中加入亚硝酸叔丁酯(90％)(4.13g，36.49mmol)。将反应混合物在80℃回流16h(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，将反应混合物在减压下浓缩。残余物质通过快速柱色谱法纯化以提供1H-吡唑-4-碳腈。
步骤3：1H-吡唑-4-甲硫酰胺中间体的合成
向室温下搅拌的1H-吡嗪-4-碳腈(15.5mmol)在乙醇(37mL)中的溶液中加入五硫化二磷(6.93克，31.1mmol)。将反应混合物在60℃下回流2小时(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在真空下蒸馏反应混合物。粗反应混合物用碳酸氢钠溶液(100mL)洗涤直至pH中和，并用乙酸乙酯(3×150mL)萃取。将合并的有机级分用硫酸钠干燥，减压浓缩，并用乙醚打浆，得到粗1H-吡唑-4-甲硫酰胺。
步骤4：2-芳基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成：
在室温下向搅拌的1H-吡唑-4-甲硫酰胺(14.70mmol)在乙醇(50mL)中的溶液中加入3-溴-2-氧代丙酸乙酯(3.14g，16.17mmol)。将反应混合物在60℃下回流30分钟(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在真空下蒸馏反应混合物以提供2-芳基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯。
步骤5：2-芳基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸的合成：
在室温下向搅拌的2-芳基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯(14.4mmol)在乙醇(60mL)中的溶液中加入2N NaOH溶液(21.62mL)。将反应混合物在60℃下加热30分钟(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，将反应混合物倒入水(50mL)中，并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。分离出水层并用2M HCl溶液酸化以产生沉淀物，通过过滤分离沉淀物并在减压下干燥以提供2-芳基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸。
步骤6：最终的噻唑-4-甲酰胺化合物或N-Boc保护的噻唑-4-乙酰胺中间体的合成
在室温下向2-芳基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸(0.58mmol)在DMF(4mL)中的搅拌溶液中加入HATU(0.33g，0.87mmol)和DIPEA(0.21g，1.7mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，然后在室温下加入所需的胺(0.58mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4h(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，将反应混合物倒入冷水(15mL)中，并用乙酸乙酯(3x50mL)萃取。合并的有机级分用冷水洗涤3-4次，用硫酸钠干燥并在减压下浓缩。粗物质通过快速柱色谱法纯化以提供固体形式的产物。
步骤7：噻唑-4-甲酰胺的脱保护以获得最终产物
向0℃下搅拌的来自上述步骤6的N-Boc保护的中间体(0.35mmol)在DCM(2mL，10V)中的溶液中加入在二恶烷(1mL，5V)中的4M HCl。将反应混合物在室温下搅拌1h(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，并用乙醚将粗物质打浆以提供固体形式的目标噻唑-4-甲酰胺盐酸盐。
一般实验步骤4
合成概述
一般实验步骤5
合成概述(R1＝芳基或杂芳基[未取代的和取代的])
一般实验程序6
合成概述(R1＝烷基)：
化合物337合成路线概述
化合物342的合成路线概述
化合物343的合成路线概述
一组具有代表性的化合物的完整合成细节
1.N-异丙基-2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-(哌啶-4-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物163)的合成：
总体合成方案
合成程序-根据一般实验程序2制备。
在步骤1中，使用2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸(1.5g，5.52mmol)和4-(异丙基氨基)哌啶-1-甲酸酯(1.6g，6.63mmol)。2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸(1.5g，5.52mmol)、HATU(3.1g，8.29mmol)和DIPEA(2.1g，16.58mmol)在DMF(15mL)中的溶液在室温下搅拌15分钟，然后加入4-(异丙基氨基)哌啶-1-甲酸酯(1.6g，6.63mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4h。粗物质通过快速柱色谱法(系统；40-45％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到灰白色固体的4-(N-异丙基-2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-甲酰氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.3g，84％收率)。LCMS[ESI,M+1]:440.1[M-56](RT:2.400min,纯度:95.09％),1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ9.18(s,1H),8.25(s,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,2H),7.84(d,J＝9.3Hz,1H),7.55(t,J＝7.9Hz,2H),7.38(t,J＝7.4Hz,1H),4.08-3.95(m,1H),3.87(s,2H),2.78(d,J＝25.5Hz,2H),2.72-2.64(m,2H),1.89-1.58(m,2H),1.48(d,J＝14.9Hz,1H),1.39(d,J＝13.9Hz,9H),1.30-1.10(m,6H)。
在步骤2中，在DCM(23mL)中使用4-(N-异丙基-2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-甲酰氨基)哌啶-1-甲酸酯(2.3g，4.64mmol)。在加入4M HCl的二恶烷溶液(11.5mL，5V)之前，将溶液冷却至0℃。将反应混合物搅拌2小时。用乙醚将粗物质打浆，得到白色固体的N-异丙基-2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-(哌啶-4-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物163：2.0g，100％收率)。
LCMS[ESI,M+1]:396.2(RT:1.399min,纯度:95.09％),
HPLC Purity:RT:4.799min,纯度:95.39％,
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.55(s,1H),8.09(s,1H),7.58(d,J＝7.1Hz,3H),7.45(t,J＝7.7Hz,2H),7.34(t,J＝7.5Hz,1H),3.97(m,1H),3.57(m,1H),3.47(d,J＝11.5Hz,2H),3.05(d,J＝11.9Hz,1H),2.87(d,J＝10.9Hz,2H),1.92(d,J＝12.5Hz,2H),1.41(s,1H),1.16(d,J＝6.2Hz,6H).
2.(R)-5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)-1H-吡咯-2-甲酰胺盐酸盐的合成(化合物94)：
总体合成方案
合成程序-通过一般实验程序3制备。
在步骤1中，将1-苯基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑(3.1g，11.81mmol)和K2CO3(3.39g，24.5mmol)在水(20mL)中的溶液在室温下加入到搅拌的5-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯(2.0g，9.80mmol)在二恶烷(15mL)的溶液中。使用PdCl2(dppf)DCM络合物(0.8g，0.98mmol)作为钯催化剂。将反应混合物在90℃下搅拌2小时。通过快速柱色谱法(系统；20-30％乙酸乙酯/己烷)纯化粗物质，以提供米色固体的5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯(2.0g，77％)。
LCMS[ESI,M+1]:267.9(RT:1.896min,纯度:83.25％),
在步骤2中，在室温下，将2M NaOH(20mL)加入到搅拌的5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯(2.0g，7.48mmol)的EtOH(20mL)溶液中。将反应混合物在100℃下加热2小时。使用以下纯化程序：反应完成后，在减压下浓缩反应混合物。将残留物溶于水(50mL)中，并用乙醚(3×100mL)萃取。用饱和柠檬酸溶液将水层缓慢酸化至pH～4-5。沉淀出固体，通过过滤将其分离并在减压下干燥以提供灰白色固体的5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡咯-2-羧酸(1.5g，80％)。
LCMS[ESI,M-18]:254.2(RT:1.641min,纯度:88.07％),
HPLC Purity:RT:6.453min,纯度:88.13％
1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ12.25(s,1H),11.93(d,J＝8.0Hz,1H),8.95(s,1H),8.25(s,1H),7.80(d,J＝7.7Hz,2H),7.54(t,J＝8.0Hz,2H),7.34(t,J＝7.4Hz,1H),6.79(dd,J＝3.6,2.4Hz,1H),6.46(dd,J＝3.6,2.5Hz,1H).
在步骤3中，将5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡咯-2-羧酸(1.0g，3.95mmol)、HATU(2.25g，5.92mmol)和DIPEA(1.55g，11.85mmol)在DMF(15mL)中的混合物在rt下搅拌30分钟。在加入(R)-3-(丙基氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.90g，3.95mgmol)后，将反应混合物在rt上搅拌2小时。通过快速柱色谱法(系统；0-10％乙酸乙酯/己烷)纯化粗物质，得到(R)-3-(5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-1H-吡咯-2-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0g，55％)，浅黄色油状物。
LCMS[ESI，M-56]:408.1(RT：2.369min，纯度：94.70％)。
在步骤4中，使用(R)-3-(5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-1H-吡咯-2-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.0g，2.15mmol)。反应混合物在室温下搅拌3h。用乙醚将粗物质打浆，以提供浅绿色固体的(R)-5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)-1H-吡咯-2-甲酰胺盐酸盐(化合物94:0.650g，83％)。
LCMS[ESI,M+1]:364.4(RT:1.460min,纯度:98.31％),
HPLC纯度:RT:5.085min,纯度:97.74％
手性HPLC纯度:RT:11.97min,纯度:98.79％
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.17(s,1H),7.88(s,1H),7.54-7.41(m,4H),7.32(t,J＝7.3Hz,1H),6.45(d,J＝3.6Hz,1H),6.27(d,J＝3.6Hz,1H),4.35(m,1H),3.70(t,J＝9.0Hz,1H),3.44(dt,J＝22.0,13.3Hz,4H),3.19(dd,J＝20.6,10.3Hz,1H),2.46(d,J＝8.8Hz,1H),2.19(m,1H),1.71-1.47(m,2H),0.84(t,J＝7.3Hz,3H).
3.(R)-2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物171)和(S)-2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物170)的合成
总体合成方案
步骤1-合成3-(2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基噻唑-4-甲酰胺)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在室温下向搅拌的2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸(4.0g，14.74mmol)在DMF(4mL，10体积)中的溶液中，加入HATU(8.4g，22.11mmol)和DIPEA(5.7g，44.23mmol)。将反应混合物搅拌5分钟。然后在室温下向反应混合物中加入3-(丙基氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(3.36g，14.74mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时(通过TLC和LCMS分析监测反应进展)。反应完成后，将反应混合物倒入冷水(80ml)中，并用乙酸乙酯(3x 40ml)萃取。合并的有机级分用冷水洗涤3-4次，用硫酸钠干燥并在减压下浓缩。粗物质通过柱色谱法(0-20％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到灰白色固体的3-(2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基噻唑-4-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(6.2g，87％收率)。
LCMS[ESI,M+1]:426.1[M-56](RT:2.349min,纯度:96.95％),手性HPLC:R-异构体-RT:6.91min,纯度:49.30％,
S异构体-RT:8.70min,纯度:49.21％,
1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ9.19(s,1H),8.25(d,J＝4.5Hz,1H),8.03(s,1H),7.94(d,J＝7.7Hz,2H),7.54(t,J＝7.8Hz,2H),7.38(t,J＝7.4Hz,1H),4.57(s,1H),3.64(s,1H),3.26(d,J＝11.8Hz,3H),2.07(s,2H),1.56(s,3H),1.39(s,9H),0.88(s,2H),0.78(d,J＝7.5Hz,2H).
步骤2–合成(R)-3-(2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基噻唑-4-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯和(S)-3-(-2-(1-苯基-1-吡唑-4-酰基)-N-丙烯基噻唑-4-羧胺基)吡咯烷基-1-甲酸叔丁基酯
外消旋3-(2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基噻唑-4-甲酰氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯通过手性SFC纯化进行纯化，分离出(R)-3-(2-(2-(-1-苯基-1H-吡喃-4-基)-N丙基噻唑-4-乙酰胺基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(2.4g)和(S)-3-(-2-(1-苯基-1-吡唑-4-酰基)-N-丙酯噻唑-4-甲酰氨基)吡咯烷-2-甲酸叔丁酯。
(R)-3-(2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基噻唑-4-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的数据：
LCMS[ESI,M+1]:382.1[M-100](RT:2.402min,纯度:100％),
HPLC纯度:R异构体RT:8.97min,纯度:100％,
手性HPLC纯度:R异构体-RT:6.87min,100％,
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.86(s,1H),8.21(s,1H),7.92(s,1H),7.86(d,J＝7.1Hz,2H),7.54(t,J＝7.9Hz,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,1H),4.74(s,1H),3.56(dd,J＝97.5,62.6Hz,6H),2.22(s,2H),1.86-1.66(m,2H),1.48(s,9H),0.96(s,3H).
(S)-3-(2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基噻唑-4-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的数据：
LCMS[ESI,M+1]:425.1[M-56](RT:2.402min,纯度:100％),
HPLC纯度:S-异构体-RT:8.974min,纯度:98.02％,
手性HPLC纯度:S异构体-RT:8.69min,97.46％,
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.86(s,1H),8.21(s,1H),7.91(d,J＝7.5Hz,1H),7.86(d,J＝7.2Hz,2H),7.54(t,J＝7.9Hz,2H),7.40(t,J＝7.3Hz,1H),4.74(s,1H),3.57(dd,J＝88.5,57.6Hz,6H),2.22(s,2H),1.74(d,J＝7.1Hz,2H),1.48(s,9H),0.95(s,3H).
步骤3a——(R)-2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐的合成(化合物171)
在0℃下，向(R)-3-(2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基噻唑-4-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(2.4g，4.98mmol)在DCM(24ml，10体积)中的搅拌溶液中，向反应混合物中加入在二恶烷(4.8ml，2体积)中的4NHCl。将反应混合物在rt下搅拌3h(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物以提供粗物质，该粗物质通过用乙醚打浆而纯化以提供灰白色固体的(R)-2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物171:1.8g，94％收率)。
LCMS[ESI,M+1]:382.1(RT:1.417min,纯度:99.86％),
HPLC:RT:4.726min,纯度:99.77％,
手性HPLC:RT:6.00min,纯度:100％,
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.88(s,1H),8.20(s,1H),8.02(s,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,2H),7.55(t,J＝7.9Hz,2H),7.41(t,J＝7.4Hz,1H),4.36(s,1H),3.77(d,J＝25.4Hz,1H),3.67(s,4H),3.57-3.44(m,1H),3.29-3.19(m,1H),2.49(d,J＝57.8Hz,2H),1.82(dd,J＝14.8,7.3Hz,2H),0.93(t,J＝6.4Hz,3H).
步骤3b—(S)-2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物170)的合成
在0℃下，向搅拌的(R)-3-(2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基噻唑-4-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(2.3g，4.77mmol)DCM(23ml，10vol)溶液中加入二恶烷中的4N HCl(4.6ml，2vol)。将反应混合物在rt下搅拌3h(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物以提供粗物质，该粗物质通过用乙醚打浆纯化以提供灰白色固体的(S)-2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物170:1.8g，99％收率)。
LCMS[ESI,M+1]:382.1(RT:1.421min,纯度:98.92％),
HPLC:RT:4.720min,纯度:98.21％,
手性HPLC:RT:6.80min,纯度:99.45％,
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.87(s,1H),8.20(s,1H),8.02(s,1H),7.86(d,J＝7.8Hz,2H),7.55(t,J＝7.9Hz,2H),7.41(t,J＝7.4Hz,1H),4.36(s,1H),3.77(d,J＝24.0Hz,1H),3.67(s,3H),3.59-3.46(m,1H),3.28-3.19(m,1H),2.56(s,1H),2.42(s,1H),1.82(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.93(s,3H).
4.N-异丙基-N-(哌啶-4-基)-2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物47)的合成
总体合成方案
步骤1：5-氨基-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-碳腈的合成：
在室温下，向搅拌的(2-(三氟甲基)苯基)肼盐酸盐(4.4克，20.69毫摩尔)在乙醇(50mL)中的溶液中加入乙酸钠(3.39g，41.39mmol)和2-(乙氧基亚甲基)丙二腈(2.52克，20.6毫摩尔)。将反应混合物在80℃下回流2小时(通过TLC和LCMS分析监测反应进展)。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物。残余物质用冷水(50mL)洗涤，并用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。将合并的有机级分用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩以提供黄色固体的5-氨基-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-碳腈(5.4g，88％收率)。
LCMS[ESI,M+1]:253.30(RT:1.454min,纯度:73.75％)
1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.85(d,J＝7.7Hz,1H),7.81-7.72(m,1H),7.72-7.64(m,2H),7.46(d,J＝7.7Hz,1H),6.59(s,2H).
步骤2：1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-碳腈的合成：
在室温下向搅拌的5-氨基-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-碳腈(4.6g，18.24mmol)在THF(50mL)中的溶液中加入亚硝酸叔丁酯(90％)(4.13g，36.49mmol)。将反应混合物在80℃下回流16小时(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，将反应混合物在减压下浓缩。残余物质通过快速柱色谱法(系统；0-5％乙酸乙酯在己烷中)纯化，得到黄色固体1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-碳腈(3.7g，86％收率)。
LCMS[ESI,M-1]:236.2(RT:1.826min,纯度:89.90％)
1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ8.93(s,1H),8.30(s,1H),7.92(d,J＝7.8Hz,1H),7.83(t,J＝7.4Hz,1H),7.74(t,J＝7.7Hz,1H),7.65(d,J＝7.8Hz,1H).
步骤3：1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-甲硫酰胺的合成
在室温下，向搅拌的(1-(2-(三氟甲基苯基)-1H吡唑-4-碳腈(3.7g，15.5mmol)在乙醇(37毫升)中的溶液中加入五硫化磷(6.93g，31.1mmol)。将反应混合物在60℃下回流2小时(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在真空下蒸馏反应混合物。粗反应混合物用碳酸氢钠溶液(100mL)洗涤直至pH中和，并用乙酸乙酯(3x 150mL)萃取。将合并的有机级分用硫酸钠干燥，减压浓缩，并用乙醚打浆，得到黄色固体的1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-甲硫酰胺(4.0g，收率95％)。LCMS[ESI,M+1]:272.29(RT:1.606min,纯度:80.03％)
1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ9.45(s,1H),9.21(s,1H),8.41(s,1H),8.10(s,1H),7.90(t,J＝8.3Hz,1H),7.79(t,J＝7.7Hz,1H),7.69(t,J＝7.8Hz,1H),7.65-7.57(m,1H).
步骤4：2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成：
在室温下向搅拌的1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-甲硫酰胺(4.0g，14.70mmol)在乙醇(50mL)中的溶液中加入3-溴-2-氧代丙酸乙酯(3.14g，16.17mmol)。将反应混合物在60℃下回流30分钟(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在真空下蒸馏反应混合物，并用乙醚打浆，得到黄色固体的2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯(5.3g，98％收率)。
LCMS[ESI,M+1]:367.9(RT:2.015min,纯度:72.00％)
1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ8.75(s,1H),8.39(d,J＝13.9Hz,1H),8.23(s,1H),7.91(d,J＝7.8Hz,1H),7.85-7.75(m,1H),7.72(d,J＝7.3Hz,1H),7.67(d,J＝7.8Hz,1H),4.24(dd,J＝14.2,7.1Hz,2H),1.28-1.19(t,J＝7.2Hz,3H).
步骤5：2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸的合成：
在室温下向搅拌的2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯(5.3g，14.4mmol)在乙醇(60mL)中的溶液中加入2N NaOH溶液(21.62mL)。将反应混合物在60℃下加热30分钟(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，将反应混合物倒入水(50mL)中，并用乙酸乙酯(3x 50mL)萃取。分离出水层并用2M HCl溶液酸化以产生沉淀物，通过过滤分离沉淀物并在减压下干燥以提供棕色固体的2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸(2.3g，47％收率)。LCMS[ESI,M+1]:339.85(RT:1.613min,纯度:99.13％)
HPLC:6.280min,99.63％
1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ13.01(s,1H),8.69(d,J＝21.4Hz,1H),8.44-8.28(m,1H),8.18(d,J＝21.6Hz,1H),7.91(d,J＝7.7Hz,1H),7.81(t,J＝7.5Hz,1H),7.67(dt,J＝30.1,15.0Hz,2H).
步骤6：合成4-(N-异丙基-2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-甲酰氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：
在室温下向搅拌的2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-羧酸在DMF(4mL)中的溶液中加入HATU(0.33g，0.87mmol)和DIPEA(0.21g，1.7mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，然后在室温下加入4-(异丙基氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.142g，0.58mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4h(通过TLC和LCMS分析监测反应进展)。反应完成后，将反应混合物倒入冷水(15mL)中，并用乙酸乙酯(3x 50mL)萃取。合并的有机级分用冷水洗涤3-4次，用硫酸钠干燥并在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(系统18-22％乙酸乙酯在己烷中的溶液)以提供白色固体的4-(N-异丙基-2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-甲酰氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.2g，60％收率)。
LCMS[ESI,M-56]:507.98(RT:2.388min,纯度:97.26％)
步骤7：N-异丙基-N-(哌啶-4-基)-2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物47)的合成
(化合物47)在0℃下，将4M HCl在二恶烷(1mL，5V)中的4-(N-异丙基-2-(2-(二氟甲基)苯)-1H-吡啶-4-基)哌啶-1-甲酸酯(0.20g，0.35mmol)在DCM(2mL，10V)中的搅拌溶液加入。将反应混合物在室温下搅拌1h(通过TLC和LCMS分析监测反应的进展)。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，并用乙醚将粗物质打浆，以提供(N-异丙基-N-(哌啶-4-基)-2-(1-(2-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-4-基)噻唑-4-甲酰胺盐酸盐(化合物47:0.150g，收率91％)，为灰白色粘性固体。
LCMS[ESI,M+1]:464.07(RT:1.411min,纯度:98.37％)
HPLC:RT:4.758min,纯度:97.90％
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.53(s,1H),8.25(s,1H),7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.91-7.73(m,3H),7.68(d,J＝7.8Hz,1H),4.26(s,1H),3.66(d,J＝17.7Hz,1H),3.51(d,J＝10.5Hz,2H),3.24-2.99(m,3H),1.96(s,2H),1.55(s,1H),1.25(d,J＝74.4Hz,6H).
表1：化合物5-210，化学名称、LCMS数据和实验步骤
表2.根据本发明的化合物、化学结构和名称
生物测定和数据
如上所述，本发明的化合物诱导和/或刺激自噬，并可用于治疗自噬相关疾病。本发明化合物的生物活性可以通过任何适当的测试来确定，以确定诱导和/或刺激自噬的能力。
自噬刺激的评估
使用下述一种或多种测定法评估本发明化合物刺激自噬的能力
测定溶酶体和自溶体形成
溶酶体通过与自噬体融合并产生“自溶体”来消化其内容物，从而在自噬途径中发挥基本作用。化合物对溶酶体和自溶体形成的刺激指示自噬的刺激。使用各种荧光染色标记和追踪酸性细胞器(包括溶酶体和自溶体)，如：LysoViewTM 650(70059和70059-T，Biotium)、LysoViewTM633(70058和70058-T，Biotim)和LysoTrackerTM深红(L12492，ThermoFisher Scientific)，通过荧光显微镜评估化合物刺激活细胞中溶酶体和自溶解体形成，从而自噬的能力。定量评估细胞表型以诱导酸性囊泡形成，并将其与未处理的对照进行比较，从而提供对所研究化合物刺激自噬能力的测定。
使用LysoViewTM633染料或LysoTrackerTM深红染料的代表性步骤：将人骨肉瘤U2OS细胞(40000个细胞/孔)接种在24孔玻璃底平板(Sensoplate，Greiner Bio-One)中，并在37℃和5％CO2的湿润气氛中孵育过夜。细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)和100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen)的DMEM(Gibco)中生长。附着期后，在细胞培养基中用不同的目标化合物(在DMSO中的不同浓度)或DMSO(未处理的对照)处理细胞，并孵育24小时。移除含有化合物的培养基，并将细胞与含有1x LysoViewTM 633(70058和70058-T，Biotium)或50nM LysoTrackerTM深红(L12492，ThermoFisher Scientific)的预热细胞培养基在37℃下孵育45分钟。最后，使用Hoechst 33342(1μg/mL)对细胞核染色10分钟，然后用新鲜培养基代替培养基。然后将24孔板放入显微镜上的加热台中，并将细胞维持在37℃。使用EVOS M7000显微镜(ThermoFisher Scientific)使用用于Cy5和DAPI检测的适当滤波器组捕获图像。相对于未处理的对照，目视评估细胞表型诱导酸性囊泡形成；使用ImageJ或Cell Profiler采集并分析多个图像。
相对于浓度为10μM的DMSO处理的对照(未处理的对照)，本发明的所有化合物以及化合物170和171的优选外消旋混合物在人骨肉瘤U2OS细胞中显示出明显增加的酸性囊泡形成，除了化合物317、322和332，它们仅显示出轻微增加。在该测定中，所有化合物(包括化合物170和171的外消旋混合物)的酸性囊泡形成增加了至少25％，但化合物310、317、320、321、322、323、329、332和334除外，它们仅显示出轻微的增加。这是这些化合物在所测试条件下显著刺激自噬的证据。
还测试了本发明的选定化合物，并显示相对于浓度为0.8μM的DMSO处理的对照(未处理的对照)，人骨肉瘤U2OS细胞中酸性囊泡形成增加。这是本发明化合物，特别是这些化合物在测试条件下显著刺激自噬的证据。表2显示了所选化合物的这一数据。与DMSO处理的对照相比，具有指定为“+”的活性的化合物提供了10％至30％的酸性囊泡形成的百分比增加。与DMSO处理的对照相比，具有指定为“++”的活性的化合物提供了30％至50％的酸性囊泡形成的百分比增加。与DMSO处理的对照相比，具有指定为“+++”的活性的化合物提供了50％至100％的酸性囊泡形成的百分比增加。与DMSO处理的对照相比，具有指定为“++++”的活性的化合物在酸性囊泡中提供了大于100％的百分比增加。优选的化合物如表2a所示，更优选的化合物如表2b所示。
表2
表2(续)
表2a优选化合物
化合物编号 活性
110 +++
116 +++
120 +++
122 ++++
123 ++++
124 +++
141 +++
48 +++
50 +++
92 +++
93 ++++
94 ++++
95 +++
98 +++
99 +++
表2b更优选的化合物
化合物编号 活性
122 ++++
123 ++++
93 ++++
94 ++++
相对于DMSO处理的对照(未处理的对照)，本发明的某些化合物还显示出在其他细胞类型的酸性囊泡形成增加。例如，与浓度为10μM的DMSO处理的对照相比，化合物170和171的外消旋混合物在成人真皮成纤维细胞(HDFa细胞)中显示出显著更大的酸性囊泡形成。这是该化合物在这些条件下显著刺激自噬的证据。
在另一例子中，发现本发明的某些化合物在SH-SY5Y细胞中显示出相对于DMSO处理的对照(未处理的对照)增加的酸性囊泡形成(表3)。这是该化合物在这些条件下显著刺激自噬的证据。
此处概述了步骤的简要说明：
第1天：将细胞接种在6x 96孔Cellvis成像板的中间60孔中的15K细胞/孔中。
第2天：用90μl含有NucBlue Live的DMEM/F12(+10％FBS/1％P/S)替换培养基，并用10μl化合物(10x浓缩)处理细胞，一式三份，持续24小时。
第3天：去除处理，并将细胞与LysoTrackerTM深红染料孵育30分钟。用培养基洗涤细胞两次，并立即在x20下在EVOS M7000上成像(每孔6个图像，30分钟成像时间/板)。使用Celleste图像分析软件对图像进行分析。
表3：SH-SY5Y细胞中酸性囊泡形成相对于DMSO处理的对照(未处理的对照)的倍数变化
串联报告基因测定法(评估自噬通量的测定法)
还使用了稳定表达RFP-eGFP-hLC3b的U2OS细胞系(串联报告细胞系)评估本发明的所选化合物刺激自噬的能力。
在自噬过程中，要降解的运载物首先被称为自噬体的细胞器包裹。然后，这些自噬体与溶酶体融合，使其酸化，并激活其消化酶。“自噬通量”一词用于表示自噬的动态过程：自噬通量是指自噬的整个过程，包括自噬体的形成、成熟、与溶酶体的融合、随后的分解和大分子释放回胞质溶胶(Zhang XJ,Chen S,Huang KX,Le WD.Why should autophagicflux be assessed？Acta Pharmacol Sin.2013May；34(5):595-9.doi:10.1038/aps.2012.184.Epub 2013Mar 11)。刺激自噬通量的化合物刺激自噬的动态过程(自噬的整个过程)。
LC3b是一种在自噬体膜中发现的蛋白质，已被用于在细胞中产生自噬的遗传报告因子。在这些系统中，LC3b的串联融合是用两种不同波长的荧光蛋白设计的：一种是酸敏感的(例如发出绿色荧光的eGFP)，另一种是对酸不敏感的(如发出红色荧光的RFP)。表达RFP-eGFP-hLC3b的细胞可以使用荧光显微镜进行检查：存在的自噬体将在两个通道中发出荧光(两个通道重叠处的黄色或单个红色和绿色通道中都存在的点状)，但存在的自溶体仅在RFP(红色)通道中发荧光。使用荧光显微镜，可以计数自噬体和自溶体的数量，从而监测自噬的诱导(总点状计数)和自噬通量的速率(仅红色与红色和绿色点状的比率)。与未处理的对照相比，可以使用该系统来评估小分子对自噬诱导和通量的影响。
代表性步骤：将稳定表达RFP-eGFP-hLC3b的人骨肉瘤U2OS细胞(10000个细胞/孔)接种到96孔玻璃底平板(Cell Carrier Ultra，Perkin Elmer)中的DMEM Glutamax培养基(Gibco)中，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和抗生素(100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，Invitrogen)，然后在37℃和5％CO2的加湿气氛中孵育过夜。然后用溶解在DMSO中的目标化合物以重复的5点或10点剂量反应处理细胞。8个孔用等体积的DMSO处理，4个孔用0.3μM torin-1作为阳性对照(MCE)，4个孔用0.4μM torin-1加0.2μM巴佛洛霉素(MCE，作为通量抑制的对照)。将细胞返回到培养箱中，并继续处理24小时。处理后，吸出培养基，用4％甲醛+1％戊二醛(Sigma)在dPBS(加镁和钙，Gibco)中的溶液固定细胞。使固定在室温下进行15分钟，然后丢弃固定剂溶液，用PBS(Gibco)加Hoescht 33342(1μg/ml，Sigma)代替。30分钟后，使用40x水物镜在Opera Phenix共焦显微镜(Perkin Elmer)上对板进行成像，使用DAPI、mCherry和GFP通道进行收集。使用Harmony图像分析软件(Perkin-Elmer)基于DAPI对其细胞核的染色来检测细胞，并且使用软件内的斑点拾取功能来计数每个细胞的自噬体(GFP和RFP点)和自溶体(仅RFP点)的数量。
本发明的所选化合物在不同浓度下相对于DMSO处理的对照(未处理的对照)显示出仅RFP的点(自溶体)的数量增加(表4)。这是本发明的化合物，特别是这些化合物在所测试的条件下显著刺激自噬通量(从而刺激自噬的整个过程)的证据。
表4：在建立表达RFP-eGFP-hLC3b的U2OS细胞系(串联报告细胞系)中，相对于DMSO处理的对照(未处理的对照)，仅含RFP的点(自溶体)的数量的变化“自溶体％DMSO活性”是化合物的活性(基于仅含RFP点((自溶小体))的数量)占DMSO处理对照(未治疗的对照)的活性的百分比。
基于这些结果，这是这些化合物诱导自噬的证据。以下实施例中公开了这种活性在各种自噬相关疾病中具有治疗作用的其他证据。
评估各种疾病和条件模型中的活性
实施例1
在源自人类患者细胞的1A型糖原储存障碍(GSD1A)的诱导多能干细胞(iPSC)模型 中的活性证明。
选择化合物170和171的外消旋混合物作为本发明的实例化合物，在该模型中进行评价。
用化合物处理细胞的时间表：
第1天。分化的肝细胞GSD1A疾病模型细胞(DefineGEN Ltd)在胶原I包被的48孔板中培养。用PBS填充空孔。
第9天。将化合物170和171的外消旋混合物(以DMSO溶液形式)加入疾病模型细胞中
第11天。用含有化合物的新鲜培养基代替用于疾病模型细胞的培养基。
第12天。在PBS和HBSS中洗涤细胞一次，并向每个孔中加入30μL提供有磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物的NP40裂解缓冲液。板立即放在干冰上。
裂解物制备：将细胞裂解物解冻，并向每个裂解物中加入30μL提供有磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液。
蛋白质定量：使用BCA将裂解物的等分试样用于蛋白质定量。
糖原定量：将等分的裂解物在96℃下煮沸5分钟。然后将煮沸的裂解物以1000xg离心5分钟以除去沉淀物。按照制造商的说明，使用MAK016试剂盒(Merck)将上清液用于糖原定量。简言之，在2等分试样中，将2μL的每种上清液转移到半面积96孔板中。将试剂盒中的8μL水解缓冲液添加到每个样品的一份等分试样中(-HE；用于量化裂解物的游离葡萄糖含量)。向另一个样品提供8μL水解缓冲液，其中提供水解酶(+HE；用于定量裂解物的游离葡萄糖+糖原含量)。在室温下孵育30分钟后，向每个孔中加入10μL探针混合物，并在室温下培养30分钟后测量570nm处的吸光度。首先根据空白读数调整A570读数。通过从+HE读数中减去-HE读数来估计细胞的糖原含量，并将这些值归一化为仅DMSO的对照。进行两次定量实验。
甘油三酯定量：根据制造商的说明，使用MAK266试剂盒(Merck)也使用先前实验的煮沸上清液进行甘油三酯定量。简言之，将2μL的每种上清液转移到一半面积的96孔板中。每个样品加入8μl试剂盒中的脂肪酶反应混合物。在室温下孵育20分钟后，向每个孔中加入10μL探针混合物，并在室温下培养30分钟后测量570nm处的吸光度。首先基于空白读数调整A570读数，并将值归一化为仅DMSO对照。注意，量化实验进行了两次。
结果：与仅DMSO的对照相比，化合物170和171的外消旋混合物在10μM的浓度下成功地减少了从GSD1A患者来源的iPSC分化的肝细胞中的细胞糖原和甘油三酯(分别减少了75％和20％以上)。
结论：在患者来源的分化肝细胞中糖原的分解有力地支持了本发明化合物治疗GSD1A的疗效。糖原的分解是一种特殊类型的自噬，称为糖原吞噬。
实施例2
对人巨细胞病毒(HCMV)和寨卡病毒(ZIKV)的抗病毒活性的证明
选择化合物170和171的外消旋混合物作为本发明的示例化合物，在该模型中进行评估。
感染性测定：
将细胞接种在96孔板中，第二天在100μL的测定培养基中用从20μM开始的3倍系列稀释的化合物预处理。24小时后，用ZIKV或HCMV以与多轮病毒复制兼容的感染复数(MOI)感染细胞(不去除培养基)。DMSO处理的感染细胞和未感染细胞被包括为阳性和阴性对照。表5总结了每种病毒的实验条件。
表5.传染性测定中使用的实验条件。FBS：胎牛血清，E：包膜，gB：糖蛋白B。MOI：感染复数(每个细胞感染病毒的数量)。在指定的时间点，选择允许一轮以上的病毒复制，固定细胞并对病毒特异性抗原进行免疫染色。在Perkin-Elmer Opera LTX上采集图像，并使用Columbus软件计算感染细胞的百分比。
细胞毒性测定
在感染性测定的同时，为了测定化合物的细胞毒性，将细胞接种在96孔板中，并在第二天用100μl测定培养基中的相同系列稀释的化合物预处理。在感染性测定的持续时间内将化合物留在细胞上，之后使用代谢测定(MTT测定)来测定与DMSO处理的对照相比的细胞活力。
结果：表6总结了化合物170/171对ZIKV和HCMV的IC50和TC50值。
表6.式170/171化合物对HCMV和ZIKV的IC50和TC50值。IC50和TC50以微摩尔形式报道。“-”符号表示无抑制。
结论：化合物170和171的外消旋混合物在小于20μM的浓度范围内(IC50分别<10μM和<15μM)对HCMV和ZIKV均表现出抗病毒活性，毒性有限。这是本发明化合物在治疗某些自噬相关病毒感染方面有效的证据
实施例3
选择化合物170和171的外消旋混合物作为本发明的实例化合物，在该模型中进行评价。
NAFLD细胞模型中的活性：表达突变PNPLA3的HepG2细胞的凝胶分析
方法：使用Lipofectamine LTX在含有1％油酸BSA的DMEM培养基中用GFP-PNLA3(I148>M)过表达质粒转染HepG2细胞，并放置过夜。第二天，对细胞进行胰蛋白酶消化，并将其接种在含有1％油酸BSA的DMEM培养基中的96孔板中。7小时后，将培养基改为含有目的化合物的标准DMEM。24小时后，用PBS洗涤细胞一次，并在RIPA缓冲液中裂解。收集裂解物，离心，并将上清液与莱姆利缓冲液(无DTT或沸腾)混合，并负载在4-20％SDS-PAGE凝胶上。电泳后，凝胶在FITC通道中直接成像，以可视化GFP信号。
结果：化合物170和171的外消旋混合物显示，与非活性对照相比，GFP分解巴氟洛霉素敏感产物信号增加了3.7倍。因此，在该模型中，化合物170和171的外消旋混合物负责突变的PNPLA3的溶酶体分解。
PNPLA3的I148>M突变形式与非酒精性脂肪肝的风险增加有关。因此，该模型起到NAFLD体外模型的作用，并且它是与错误折叠蛋白质降解相关的条件和疾病的一个例子。该模型中的活性也是本发明化合物对涉及错误折叠蛋白质的各种疾病具有活性的证据。
实施例4
帕金森病细胞模型中的活性
选择化合物156和171作为本发明的示例化合物，在该模型中进行评价。
该模型(由法国Neuro Sys SAS运行)基于多巴胺能神经元特异性毒素(DA毒素)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP，MPP+的前药)损伤的多巴胺能酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的原代培养(Dauer和Przedborski，2003)。任何减少DA毒素神经毒性的物质都可以作为治疗或预防PD的新治疗剂。
方法
中脑神经元的原代培养：如Visanji等人，2008和Callizot等人，2019所述培养大鼠多巴胺能神经元。简言之，妊娠15天的怀孕雌性大鼠(Wistar)使用CO2室深度麻醉和颈椎脱位处死。在显微镜下解剖从15天大鼠胚胎(Janvier，法国)获得的中脑。将胚胎中脑取出并放置在含有2％青霉素-链霉素(PS)和1％牛血清白蛋白(BSA)的Leibovitz(L15)的冰冷培养基中。中脑弯曲的腹侧部分是发育中大脑中富含多巴胺能神经元的区域，用于细胞制备。
通过在37℃下进行20分钟的胰蛋白酶解将中脑解离(最终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的溶液)。通过加入含有DNAase I II级(0.5mg/mL)和10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)来终止反应。然后通过10ml移液管通过3次传代将细胞机械解离。然后在+4℃下，在L15培养基中的BSA层(3.5％)上将细胞以180x g离心10分钟。弃去上清液，将细胞颗粒重新悬浮在由补充有B27(2％)、L-谷氨酰胺(2mM)和2％PS溶液和10ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF)和1ng/mL胶质源性神经生长因子(GDNF)的Neurobasal组成的确定培养基中。使用台盼蓝排除试验在Neubauer细胞仪中计数活细胞。将细胞以40000个细胞/孔的密度接种在96孔板(预包被有聚-L-赖氨酸)中，并在37℃、5％CO2/95％空气气氛中的加湿培养箱中保持。每2天用新鲜培养基更换一半培养基。使用第一和最后的行和列的孔(以避免任何边缘效应)，并用无菌水填充。
受试化合物和MPTP：
i)预孵育。在培养的第6天，将测试化合物溶解在PBS或DMSO中，并在MPTP暴露前孵育1小时。
ii)损伤。施用试验化合物一小时后，将MPTP添加至最终浓度4μM，在仍存在化合物/抑制剂的对照培养基中稀释48小时。在96孔板中的一个培养物上测试测试化合物(每个条件n＝6个培养孔)。
终点评估：
免疫染色：TH和α-突触核蛋白。中毒48小时后，除去细胞培养上清液，并在室温下用4％多聚甲醛的PBS溶液(pH＝7.3)固定细胞20分钟。将细胞在PBS中洗涤两次，然后使其透化。在室温下用含有0.1％皂苷和1％FCS的PBS溶液封闭非特异性位点15分钟。将培养物与：(a)在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中以1/10000的稀释度在小鼠中产生的单克隆抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体在室温下孵育2小时，以及(b)在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中将以1/200的稀释度的兔中产生的多克隆抗α-突触核蛋白(α-突触核蛋白)抗体在常温下孵育2h。在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中，用稀释度为1/800的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG和稀释度为1/400的Alexa-Fluor 568山羊抗兔IgG在室温下1小时来显示这些抗体。
计算机自动分析。对于每种情况，使用相同的采集参数用Image(分子设备)以10倍放大率自动拍摄20张照片(代表整个井区域)(20张照片，用于TH和α-突触核蛋白进入TH神经元)。通过图像，Meta(Molecular Devices)可直接自动进行分析。
测量了以下读数：
i)TH神经元总数分析(多巴胺能TH阳性神经元)
ii)多巴胺能TH阳性神经元的总轴突网络(单位：μm)
iii)α-突触核蛋白聚集(TH和α-突触染色重叠)
化合物156和171在这种基于MPP+损伤的PD体外模型中显示出积极作用。
化合物156在10μM、1μM和500nM的浓度下显著保护多巴胺能神经元(与单独的MPP+损伤相比，多巴胺能TH阳性神经元的数量增加>18％)并在10μM、1μM和500nM的浓度下保护轴突网络(与单独的MPP+损伤相比，多巴胺能TH阳性神经元的轴突网络的长度增加了>39％)。该化合物在1μM、1μM、500nM和100nM的浓度下降低了α-突触核蛋白的聚集(与单独的MPP+损伤相比，每个多巴胺能TH阳性神经元的α-syn面积减少了>13％)。
化合物171在500μM和1μM的浓度下对所有三个读数显示出显著的积极作用：(i)与单独的MPP+损伤相比，多巴胺能TH阳性神经元的数量增加了>25％，(ii)与单独MPP+损伤相比，多巴胺能够TH阳性神经元神经突网络的长度增加了>31％，以及(iii)与单独MPP+损伤相比每个多巴胺能TH正神经元的α-syn面积减少了>18％。
该测定是帕金森病的体外模型。该模型中的活性(积极作用)有力地支持本发明的化合物在治疗帕金森病和其他自噬相关的神经退行性疾病或病症中是有效的。
参考文献
Callizot N,Combes M,Henriques A,Poindron P.Necrosis,apoptosis,necroptosis,three modes of action of dopaminergic neuron neurotoxins.PLoS ONE14(4):e0215277
Dauer W.,Przedborski S.Parkinson's disease:mechanisms andmodels.Neuron2003,39(6):889-909
Visanji NP,Orsi A,Johnston TH,Howson PA,Dixon K,Callizot N,BrotchieJM and Rees DD.PYM50028,a novel,orally active,nonpeptide neurotrophic factorinducer,prevents and reverses neuronal damage induced by MPP+in mesencephalicneurons and by MPTP in a mouse model of Parkinson's disease.FASEB J.2008；22(7):2488-97
实施例5
Charcot-Marie Tooth 1A(CMT1A)小鼠模型中的活性
选择化合物163作为本发明的示例化合物，在该模型中进行评价。该模型(由Invivex SAS，法国运行)使用表达三个拷贝的野生型人外周髓磷脂蛋白22(PMP22)基因的C3-PMP22转基因小鼠(B6.Cg-Tg(PMP22)C3Fbas/J)。这些小鼠表现出年龄依赖性脱髓鞘神经病变，其特征主要是远端力量和感觉丧失。C3-PMP小鼠在3周时没有表现出明显的临床症状，并以年龄依赖的方式发展为轻度神经肌肉损伤。它们具有稳定、低的神经传导速度，类似于患有人类CMT1A的成年人。这些小鼠的髓鞘形成延迟，在3周大时，它们含有的有髓鞘纤维数量减少。
研究概述
动物特征：
性别/物种/品系：B6.Cg-Tg(PMP22)C3Fbas/J雄性
年龄：3周
供应商：Jackson Laboratory(美国)
治疗开始时的大致重量：19.0g±2.5g
动物数量：每组6只小鼠
动物鉴定：在研究开始时，用尾巴上的数字鉴定动物。每个参数都记录在实验手册中。
适应和临床症状：动物在实验前7天(一周)到达现场，以实现最佳适应。每天记录临床症状和死亡率。每周测定两次体重。
研究概述：
剂量：30mg/kg
给药：经口灌胃
读数：
i)转棒疲劳(Rotarod)(神经肌肉性能)
ii)坐骨神经电生理学(EMG)
iii)蛋白质印迹PMP22分析
iv)坐骨神经组织学
实验持续时间：在1个月和2个月大时测量读数。
-1个月大时的基线转棒疲劳和肌电图读数
-2个月大时转棒疲劳和EMG读数
-2个月大坐骨神经PMP22蛋白印迹及组织病理学研究
用于测试化合物163的载体:10％DMSO/5％Cremophor RH 40和在水中85％的10％HP-β-CD(v/v)
溶媒对照组：仅溶媒(未治疗的对照组)
统计：使用Prism软件进行统计分析。概率小于5％(p＜0.05)被认为是显著的。
研究读数的操作步骤
坐骨神经电生理学。在用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉的小鼠上进行肌电图。将一对钢针电极(AD Instruments，MLA1302)沿着坐骨神经切迹处的神经皮下放置(近端刺激)。第二对电极沿着脚踝上方的胫骨神经放置(远端刺激)。使用PowerLab 26T(ADInstruments)在1mA下持续10ms的最大方波脉冲进行递送。使用钢电极记录足部固有肌肉的复合肌肉动作电位(CMAP)。测定CMAP的振幅和潜伏期。在腿完全伸展的情况下，沿着皮肤表面测量两个刺激部位之间的距离，并使用Excel从坐骨神经潜伏期测量中自动计算神经传导速度(NCV)。
转棒疲劳。使用旋转杆装置(法国Bioseb)测量神经肌肉协调和平衡。首先对小鼠进行了预训练试验，使其熟悉旋转杆。在300秒的最长时间段内，以从4转/分到40转/分的连续增加的速度测量下降的潜伏期。每只动物每天进行3次试验。每天，对每只动物取3次试验的平均值，然后对每组取平均值。
PMP22蛋白质印迹分析
在电生理学分析和动物处死后，对所有动物的左坐骨神经取样，溶解在用蛋白酶抑制剂(Fisher Scientific，法国)完成的4℃ RIPA裂解缓冲液中，在冰上10s内超声处理三次(Microson超声细胞分裂器XL，Microsonic)，并在4℃下以10000rpm离心30分钟。取样50μL上清液，并使用牛血清白蛋白稀释液作为标准，通过NanoDrop对总蛋白进行定量。然后，使用Laemmli/β-巯基乙醇(Merck，S3401)在95℃下孵育10分钟，使10微克蛋白质样品变性，在变性的10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝化纤维膜上。用5mL Licor封闭缓冲液封闭膜60分钟。将以下一抗在4℃下在相同的封闭缓冲液中孵育过夜：兔抗PMP22(1:750，Sigma-Aldrich，SAB4502217)和小鼠抗微管蛋白(1:1000，SigmaAldrich，T9026-100UL)。第二天，将膜在TBS吐温20(0.1％V/V)中洗涤3次，持续10分钟，然后在室温下与第二荧光抗体孵育1小时：驴抗小鼠IRDye680(1∶10000，LI-COR Biosciences)和驴抗兔IRDye800(1∶10.000，LI-CORBioscience)。二抗孵育后，用TBS吐温20(0.1％V/V)洗涤膜三次，持续10分钟。随机抽取样品以避免膜变异性。使用Odyssey CLX LI-COR成像系统进行条带的可视化，并使用Image J软件(4.0版)进行条带定量。
坐骨神经甲苯胺蓝染色
动物处死后，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.3)中的4％PFA和2.5％戊二醛原位固定3只小鼠/组的右坐骨神经20分钟。然后，移除神经并在同一缓冲液中过夜后固定。在0.2MPBS缓冲液中洗涤30分钟后，使用乙醇梯度溶液将样品脱水，并包埋在环氧树脂中。切割半透明横截面，并用0.5％甲苯胺蓝+1％硼砂+100mL MilliQ水染色。轴突直径、有髓鞘轴突数量和髓鞘g比率使用Image J g比率安装插件(plugging)进行量化。
体内研究阶段总结：
第1天：上午8点至上午11点
在研究的体内部分开始前一天进行了渐进行为测试学习(旋转棒测试学习)。为了减少动物因新环境而产生的压力和焦虑，动物在行为测试室中停留2小时。
第2天：上午8点至上午11点-转棒疲劳：
使用转棒疲劳测试分析神经肌肉性能。对每只动物取3次试验的值的平均值，然后对每一动物组取平均值。
第3天：上午8点至11点-电生理学(EMG)：
使用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉动物，并进行坐骨神经电生理记录。使用钢电极记录足部固有肌肉的复合肌肉动作电位(CMAP)。然后，根据坐骨神经潜伏期测量值计算每只动物的神经传导速度(NCV)。
从第3天到第31天：上午7点和下午7点
将化合物163通过每天两次的经口灌胃给予一组小鼠(化合物处理组)的成员。仅将赋形剂通过每天两次的灌胃给药给另一组小鼠(赋形剂对照组)的成员。
第29天：从上午8点到上午11点
进行渐进性行为测试研究(转棒疲劳测试研究)。为了减少动物因新环境而产生的压力和焦虑，动物在行为测试室中停留2小时。
第30天：上午8点至上午11点-转棒疲劳：
使用转棒疲劳测试分析神经肌肉性能。对每只动物取3次试验的平均值，然后对每一动物组取平均值。
第31天：
上午8点至11点-电生理学(EMG)：
使用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉动物，并进行坐骨神经电生理记录。使用钢电极从足部固有肌肉记录CMAP。然后，如前所述，根据坐骨神经潜伏期测量值计算每只动物的NCV。
上午12点-最终程序，坐骨神经取样：
电生理记录后，通过颈椎脱位处死小鼠。对左右坐骨神经分别进行PMP22蛋白质印迹和组织学分析。
结果
死亡率和体重
研究期间未观察到死亡。
研究期间未观察到任何病理临床症状。
组之间没有观察到体重的显著差异，这表明在所分析的时间点没有化合物163的全身毒性作用。
转棒疲劳测试。在基线时(1个月大)，在溶媒和化合物163组中观察到类似的旋转棒潜伏期。在载体治疗组2个月大时观察到神经肌肉损伤，其特征是旋转杆潜伏期显著降低。在2个月大的CMT1A小鼠中，与载体组相比，化合物163处理组的转子棒潜伏期显著增加(在化合物163处理的组中观察到平均转子棒潜伏期比载体组增加133％)。这些数据表明，当在一个月内以30mg/kg每天给药两次时，化合物163对由CMT1A障碍诱导的神经肌肉损伤具有保护作用。
坐骨神经电生理学。
复合肌肉动作电位(CMAP)振幅
在基线(1个月大)时，在载体和化合物163组中观察到相似的CMAP振幅。在载体治疗组中，在2个月大时观察到坐骨神经传导障碍，其特征是CMAP振幅显著降低。在2个月大的CMT1A小鼠中，与溶媒组相比，化合物163处理组表现出CMAP幅度的显著增加(在化合物163处理的组中观察到CMAP幅度比载体组增加86％)。这些数据表明，当在一个月内以30mg/kg每天两次给药时，化合物163化合物对由CMT1A障碍诱导的CMAP损伤具有保护作用。此外，由于CMAP幅度与轴突活性直接相关，这些结果表明化合物163对轴突功能具有直接或间接的功效。
神经传导速度(NCV)
关于神经传导速度，在基线(1个月大)时，在载体组和化合物163组中观察到相似的神经传导速度。在载体治疗组中，在2个月大时观察到坐骨神经传导障碍，其特征是神经传导速度显著降低。在2个月大的CMT1A小鼠中，观察到化合物163处理组的神经传导速度增加(与载体组相比，在化合物163处理的组中观察到NCV增加94％)。
PMP22蛋白质印迹分析
与载体组相比，化合物163处理组在2个月大的CMT1a小鼠的坐骨神经中PMP22的过表达显著降低(在化合物163处理的组中观察到PMP22的水平与溶媒组相比较降低33％)，证实了化合物163对CMT1a障碍的积极疗效，并证实了行为测试和电生理学数据。
坐骨神经的组织学分析
进行坐骨神经甲苯胺蓝染色以从组织学角度确定化合物163的功效。在2个月大的CMT1A小鼠中，与溶媒组相比，化合物163治疗后观察到髓鞘形成轴突的数量显著增加和g比率降低(髓鞘形成轴突数量增加64％，g比率降低22％)。在2个月大的CMT1A小鼠中，与溶媒组相比，在化合物163治疗组中也观察到轴突直径的增加(增加45％)。这些数据证实了使用行为测试和电生理分析观察到的功能功效数据，并表明化合物163靶向由CMT障碍诱导的轴突和髓鞘雪旺细胞病理。
总结和结论
在用载体处理的临床前CMT1A小鼠模型中观察到神经肌肉损伤以及神经传导幅度和速度的降低。与溶媒组相比，化合物163处理组表现出转棒潜伏期和CMAP幅度的显著增加、PMP22过表达的减少以及轴突数量和髓鞘直径的增加。此外，在化合物163处理组中也观察到神经传导速度和轴突直径的增加，但与溶媒组相比，这些增加没有统计学意义。
总之，本研究证实化合物163对靶向髓鞘和轴突的CMT1A神经病变具有显著的保护作用。当在30天内每天两次以30mg/kg给药时，该化合物增加了神经肌肉和电生理性能，并降低了分子病理机制。
该模型用作Charcot-Marie Tooth 1A(CMT1A)的体内模型。该模型中的活性(积极作用)有力地支持本发明的化合物在治疗Charcot-Marie Tooth 1A(CMT1A和其他自噬相关疾病或病症中是有效的。

Claims (21)

1.一种根据式(I)的化合物，
其中X独立地选自C、N、O和S的化学上可能的组合，并且任选地被-CH3、-CH2-CH3或COOH取代，
R1选自环状C5或C6烷基，任选地包括化学上可能的N、O和/或S，并且任选地被-CH3、-NH2、-COOH、C1-C4烷氧基、卤素、三氟甲基、三氟甲氧基单取代或双取代；
R2选自H、CH3、直链或支链的C2至C6烷基，任选地包括化学上可能的N、O和/或S，并且任选地被-CH3、-NH2、-OH、-COOH、环戊基、环己基、双环[2.2.1]庚烷、双环[3.1.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷取代，任选地包含化学上可能的N、O和/或S，且任选地被-CH3、-CH2-CH3、-OH、-异丙基、-COOH、-COOCH3、-CH2-环己基、-NH2取代，
R3选自H、直链或支链的C1至C6烷基，任选地被-CH3、-OH、-CH2-CH3、-NH2、-CH2-NH2、-CH2-NH-CH3、-COOH取代，任选地包括化学上可能的一个或多个N、O和/或S；
C1至C4烷氧基，任选地包括化学上可能的一个或多个N、O和/或S，并且任选地被-NH2、-OH、-COOH单取代或双取代；
环丙基、环丁基，任选地包括化学上可能的一个或多个N、O和/或S，并且任选地被-CH3、-CH2-CH3、-NH2、-CH2-NH2、-CH2-NH-CH3、-OH和-COOH单取代或双取代；
条件是R2和R3不都是H或CH3；
R2和R3可以连接以形成4元、5元、6元、7元环、稠合环戊基和/或环己基的双环[3.1.1]庚烷的双环结构，任选地包括化学上可能的一个或多个N、O和/或S，并且任选地被直链或支链的C1-C6烷基单取代或双取代，任选地被-CH3、-OH、-CH2-CH3、-NH2、-NH-CH3、-CH2-NH2-、-CH2-NH-CH3、-OH、-COOH、-COOCH3、＝O、异丙基、磺酰胺取代，并且任选包括化学上可能的一个或多个N、O和/或S；
条件是R2、R3或其组合包含NH或NH2的至少一种，
其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物。
2.根据权利要求1的化合物，其根据下式II，
其中
X、R1、R2和R3如上所述。
3.根据权利要求1或2的化合物，其根据下式III
其中
R1、R2和R3如上所述，
其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中R1选自
其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的化合物，其中R2选自H、-CH3、-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH2、环己基、-CH2(CH3)-CH2-NH2、
R3选自H、-CH3、-CH2-CH3、丙基、异丙基、-CH2-CH2-OH、-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-CH2-NH2、-CH(NH2)-CH3、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)2、-CH2-CH(NH2)-CH3、-CH(-CH3)-CH2-NH2、-CH2-CH2-N(CH3)2、 且
R2和R3可连接形成选自以下的环：
其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其根据下式IV，
其中，R2选自
R3选自H、CH3、-CH2-CH2-CH3和异丙基，或
R2和R3形成选自的环，
其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物。
7.一种化合物，其选自以下化合物：
5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-[(3S)-吡咯烷-3-基]-1H-吡咯-2-甲酰胺(式93)；
5-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-[(3R)-吡咯烷-3-基]-1H-吡咯-2-甲酰胺(式94)；
2-(5-苯基噻吩-2-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)-1,3-噻唑-4-甲酰胺(式122)；
4-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-(吡咯烷-3-基)-1H-吡咯-2-甲酰胺(式123)；
2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-(哌啶-4-基)-N-(丙烷-2-基)-1,3-噻唑-4-甲酰胺(式163)；
2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-[(3S)-吡咯烷-3-基]-1,3-噻唑-4-甲酰胺(式170)；
2-(1-苯基-1H-吡唑-4-基)-N-丙基-N-[(3R)-吡咯烷-3-基]-1,3-噻唑-4-甲酰胺(式171)；
其生理上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体或多晶型物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其在施用后表现出与CNS或大脑相比更高的全身(外周)浓度，优选至少2:1的外周/大脑比率。
9.一种制备根据权利要求1-8中任一项所述的化合物的方法，包括根据上述一般实验程序1-4中任一项的步骤。
10.一种药物组合物，其包含药学上有效量的根据权利要求1-8中任一项的化合物和药学上可接受的载体。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物或根据权利要求9所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗诸如人类的哺乳动物受试者的疾病。
12.根据权利要求1至8中任一项的化合物或根据权利要求9的药物组合物，其用作自噬诱导剂，其中优选用途是化妆品和/或在体外使用。
13.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物或根据权利要求9所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗诸如人类的哺乳动物受试者中自噬相关的疾病或病症。
14.根据权利要求13所述的用途化合物，其中所述自噬相关疾病或病症选自系统性红斑狼疮、癌症、肝脏疾病、a1抗胰蛋白酶缺乏症、Charcot-Marie-Tooth综合征、Rett综合征、镰状细胞病、Wilson病、淀粉样变性、Gaucher病、溶酶体和糖原储存障碍、囊性纤维化；病毒感染和疾病、人类巨细胞病毒(HCMV)感染、乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒感染、寨卡病毒感染、冠状病毒感染、HCoV-229E、HCoV-NL63、如HCoV-OC43、SARS-CoV-1、HCoV HKU1、MERS-CoV或SARS-CoV-2的β冠状病毒感染、、细菌感染、代谢紊乱、糖尿病、纤维化、伤口愈合障碍、尼曼-匹克C型(NPC)病、纤维蛋白原储存病(FSB)、包涵体病(IBD)、肌营养不良、杜氏肌营养不良症、肢带肌营养不良病、肌病、肌原纤维肌病、遗传性肌病、糖尿病心肌病、抗炎症、自身免疫性疾病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、肠易激综合征、克罗恩病、血管疾病、冠状动脉疾病、心肌梗死、不稳定型心绞痛、动脉粥样硬化或血管炎、白塞综合征、巨细胞动脉炎、风湿性多肌痛、韦格纳肉芽肿病、丘格-斯特劳斯综合征、血管炎、过敏性紫癜、川崎病、病毒感染或复制、痘病毒感染、疱疹病毒感染、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、骨质疏松症、器官移植排斥反应、银屑病、增生性瘢痕形成(瘢痕疙瘩形成)、普通或妇科手术后的粘连形成、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、细胞内寄生虫引起的疾病、疟疾、结核病、神经性疼痛、术后幻肢疼痛或带状疱疹后神经痛、过敏、抗原诱导的回忆反应、免疫反应抑制、肌肉退化和萎缩、衰老中的虚弱、脊髓损伤、以及涉及错误折叠和/或非折叠蛋白质的疾病和病症，这些疾病和病症可以采用全身给药时有效的化合物有效地进行治疗。
15.根据权利要求13或14所述用途的化合物，其中所述预防和/或治疗包括至少两种根据权利要求13或14所述用途的化合物的组合，和/或与至少一种用于所述自噬相关疾病或病症的另外的药物活性物质的组合。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的化合物，其中所述预防和/或治疗包括全身治疗，与CNS或大脑相比表现出更高的全身(外周)浓度。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的化合物，其中所述预防和/或治疗还包括在所述受试者中检测和/或监测至少一种自噬生物标志物的反应，所述自噬生物标志物优选选自BECN1和包括LC3A、LC3B、LC3C的TG8/LC3家族、LC3-II、ULK1、p62、NBR1、ATG5和ATG7。
18.一种用于预防和/或治疗诸如人的哺乳动物受试者中自噬相关疾病或病症的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的至少一种根据权利要求1-8中任一项所述的化合物或根据权利要求9所述的药物组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述自噬相关疾病或病症选自系统性红斑狼疮、癌症、肝脏疾病、a1抗胰蛋白酶缺乏症、Charcot-Marie-Tooth综合征、Rett综合征、镰状细胞病、Wilson病、淀粉样变性、Gaucher病、溶酶体和糖原储存障碍、囊性纤维化；病毒感染和疾病、人类巨细胞病毒(HCMV)感染、乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒感染、寨卡病毒感染、冠状病毒感染、HCoV-229E、HCoV-NL63、如HCoV-OC43、SARS-CoV-1、HCoV HKU1、MERS-CoV或SARS-CoV-2的β冠状病毒感染、、细菌感染、代谢紊乱、糖尿病、纤维化、伤口愈合障碍、尼曼-匹克C型(NPC)病、纤维蛋白原储存病(FSB)、包涵体病(IBD)、肌营养不良、杜氏肌营养不良症、肢带肌营养不良病、肌病、肌原纤维肌病、遗传性肌病、糖尿病心肌病、抗炎症、自身免疫性疾病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、肠易激综合征、克罗恩病、血管疾病、冠状动脉疾病、心肌梗死、不稳定型心绞痛、动脉粥样硬化或血管炎、白塞综合征、巨细胞动脉炎、风湿性多肌痛、韦格纳肉芽肿病、丘格-斯特劳斯综合征、血管炎、过敏性紫癜、川崎病、病毒感染或复制、痘病毒感染、疱疹病毒感染、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、骨病、骨质疏松症、器官移植排斥反应、银屑病、增生性瘢痕形成(瘢痕疙瘩形成)、普通或妇科手术后的粘连形成、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、细胞内寄生虫引起的疾病、疟疾、结核病、神经性疼痛、术后幻肢疼痛或带状疱疹后神经痛、过敏、抗原诱导的回忆反应、免疫反应抑制、肌肉退化和萎缩、衰老中的虚弱、脊髓损伤、以及涉及错误折叠和/或非折叠蛋白质的疾病和病症、这些疾病和病症可以采用全身给药时有效的化合物有效地进行治疗。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述预防和/或治疗包括全身治疗，与CNS或大脑相比，表现出更高的所述化合物的全身(外周)浓度。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，还包括在所述受试者中检测和/或监测至少一种自噬生物标志物的反应，所述自噬生物标志物优选选自BECN1和包括LC3A、LC3B、LC3C的ATG8/LC3家族、LC3-II、ULK1、p62、NBR1、ATG5和ATG7。
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