CN118406624A - 一种生产2-苯乙醇的重组盐单胞菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生产2‑苯乙醇的重组盐单胞菌及其构建方法和应用，所述重组盐单胞菌表达来自酿酒酵母的aro10基因。本发明的重组盐单胞菌能够高产2‑苯乙醇，通过引入苯乙烯衍生途径还可同时生产苯乙烯，提高了工业生产过程中原料的利用率，生产周期短，生产工艺简单无污染，无需额外添加抗生素和诱导剂，利于工业化大规模生产。

Description

一种生产2-苯乙醇的重组盐单胞菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种生产2-苯乙醇的重组盐单胞菌及其构建方法和应用。

背景技术

2-苯乙醇(简称2-PE)，又称为β-苯乙醇，是一种重要的有机合成原料，主要用于生产香精香料。作为食用香料，2-PE被广泛用于调制各种香料，用于饮料、糖果等产品的生产中。而在日化用品领域，2-PE可以调制多种花香型香精，用于香皂、沐浴露、化妆品等产品的生产中。其中，日化香精是2-PE的主要应用市场，需求占比达到97％以上。

苯乙烯是一种无色、透明、易燃的液体，具有浓郁的香味，广泛用于合成高分子材料、树脂、橡胶、农药、医药、染料等领域。此外，苯乙烯可以用于合成多种药物，如抗炎药、抗肿瘤药、抗病毒药、抗生素、维生素等，其衍生物也能用于制备生物材料，如人工关节和牙科填充物。这些材料具有良好的生物相容性和耐久性，能够提高患者的生活质量。

在传统工业领域中，2-PE和苯乙烯主要通过以化石燃料为原料的化学合成法制取，然而传统化学合成方法的工艺流程较为繁琐，有些步骤需要高压、高温等极端条件，这会增加生产成本和能源消耗，生产成本高，而且合成过程中部分合成物质可能对人体健康及环境产生负面影响。近年来，利用生物合成途径从可再生原料中生产2-PE和苯乙烯的方法受到了广泛关注。这种方法不仅具有环境友好性，还能有效利用生物质资源，促进可持续发展，然而目前的方法生产的2-PE的时间周期较长，为72～160h，生产强度不高，且微生物依赖于质粒诱导表达系统，生产过程需要添加昂贵的抗生素和诱导剂，极大地提高生产成本。

因此，目前亟需一种能够降低生产周期，提高生产效率、降低生产成本、环境友好的且高产2-PE的方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种生产2-苯乙醇的重组盐单胞菌及其构建方法和应用。

本发明提供了一种生产2-苯乙醇(2-PE)的重组盐单胞菌，所述重组盐单胞菌表达酿酒酵母来源的aro10基因。

进一步的，所述重组盐单胞菌还表达拟南芥来源的pal2、酿酒酵母来源的fdc1以及恶臭假单胞菌来源的styA基因、styB基因和styC基因。

进一步的，所述基因的表达使用了基因编辑系统，所述基因编辑系统为CRISPR-Cas9。

进一步的，所述盐单胞菌包括Halomonas sp.，优选为Halomonas sp.TD01。

进一步的，所述重组盐单胞菌中表达的aro10基因通过G43位点插入到重组盐单胞菌的基因组中。

进一步的，所述aro10基因的表达使用pSEVA341载体。

进一步的，所述pSEVA341载体包含启动子，所述启动子为porin58。

本发明还提供所述重组盐单胞菌在生产2-苯乙醇中的应用。

本发明还提供了所述重组盐单胞菌的构建方法，所述构建方法包括将下列组中的任一种导入重组盐单胞菌：

(1)aro10核苷酸序列；或

(2)aro10核苷酸序列、pal2核苷酸序列、fdc1核苷酸序列和styA-styB-styC核苷酸序列；

其中，aro10核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；pal2的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；fdc1的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示；styA-styB-styC的核苷酸序列如SEQ IDNo.36所示。

本发明还提供使用重组盐单胞菌生产2-苯乙醇的方法，包括如下步骤：将所述重组盐单胞菌活化，进行摇瓶种子培养后在发酵培养基进行发酵培养。

优选地，所述发酵培养基包含苯丙氨酸；

优选地，所述苯丙氨酸的添加量为5～10g/L。

优选地，所述发酵的温度为33～37℃、pH 8.5～9.5、时间为36～48h。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

(1)本发明的工程菌能够高产2-PE，通过苯乙烯衍生途径还可生产苯乙烯，提高了工业生产过程中原料的利用率。

(2)本发明的工程菌生产2-PE产量可达3.22g/L，苯乙烯的产量可达0.67g/L，提高了工业生产的效率，降低生产成本。

(3)本发明生产2-PE、苯乙烯的时间周期短，生产工艺简单无污染，无需额外添加抗生素和诱导剂，利于工业化大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明的2-PE和苯乙烯合成途径通路图；

图2本发明实施例使用的pSEVA321_Cas9质粒图；

图3为本发明实施例1使用的pSEVA341_{G43Ldonor-porin58-aro10-G43Rdonor}质粒图；

图4为本发明实施例1中aro10目的片段电泳图；

图5为本发明实施例2使用的pSEVA341_{G49Ldonor-porin58-pal2-fdc1-styA-styB-styC-G49Rdonor}质粒图；

图6为本发明实施例2中TD01-P0菌株基因组中插入pal2-fdc1-styA-styB-styC目的片段验证电泳图；

图7为本发明实施例2中Halomonas sp.TD01菌株基因组中插入pal2-fdc1-styA-styB-styC目的片段验证电泳图；

图8为本发明实施例3中Halomonas sp.TD01菌株基因组中插入pal2-fdc1目的片段验证电泳图。

图9为本发明实施例6使用的pSEVA321porin58_{aro10-pal2-fdc1-styABC}质粒图；

图10为本发明实施例6使用的pSEVA321porin58_pal2-fdc1质粒图；

图11为本发明实施例6中aro10-pal2-fdc1-styA-styB-styC片段电泳图；

图12为本发明实施例6中pal2-fdc1片段电泳图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

盐单胞菌Halomonas sp.TD01本身不具有合成2-PE和苯乙烯的能力，为实现Halomonas sp.TD01合成2-PE和苯乙烯，需要额外引入外源合成途径。本发明引入了两种异源途径，表达来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的aro10基因来引入艾氏途径合成2-苯乙醇。通过引入拟南芥来源的pal2、酿酒酵母来源的fdc1、恶臭假单胞菌来源的styA、styB和styC和引入第二条合成2-苯乙醇的途径，称为苯乙烯衍生途径。其中通过引入拟南芥来源的pal2、酿酒酵母来源的fdc1引入苯乙烯生物合成途径。异源引入的途径基因整合至基因组上，使盐单胞菌不依赖抗生素和诱导剂高产2-苯乙醇和苯乙烯。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。Halomonas sp.TD01从清华大学获得。

实施例1艾氏代谢途径的构建

利用CRISPR-Cas9方法将aro10插入Halomonas sp.TD01基因组中。PCR扩增aro10、G43Ldonor，G43Rdonor和质粒pSEVA341porin58骨架，其中porin58为组成型启动子。

在Gibson连接酶的作用下，aro10、G43Ldonor，G43Rdonor片段和pSEVA341骨架重组形成新的质粒，命名为pSEVA341_{G43Ldonor porin58-aro10-G43Rdonor}，质粒信息如图3所示。通过CRISPR-Cas9基因编辑系统在Halomonas sp.TD01基因组上G43位点插入基因，将pSEVA341_{G43Ldonor porin58aro10-G43Rdonor}和pSEVA321_Cas9导入Halomonas sp.TD01。

(1)利用PCR扩增aro10、G43Ldonor，G43Rdonor和质粒pSEVA341 porin58骨架的引物序列(5’-3’)如下：

aro10-F：见SEQ ID No.1；

aro10-R：见SEQ ID No.2；

G43Ldonor-F：见SEQ ID No.3；

G43Ldonor-R：见SEQ ID No.4；

G43Rdonor-F：见SEQ ID No.5；

G43Rdonor-R：见SEQ ID No.6；

pSEVA341porin58-F：见SEQ ID No.7；

pSEVA341porin58-R：见SEQ ID No.8。

其扩增体系和扩增程序见表1和表2：

表1扩增体系表

表2扩增程序表

PCR反应完成后，配制相应浓度的琼脂糖凝胶，进行电泳以便观察DNA条带的大小，将凝胶置于紫外灯下，迅速的切下目的DNA片段的凝胶，尽可能的将多余的凝胶切掉。

(2)Gibson Assembly法连接

将回收的DNA检测其浓度，再根据目的片段和pSEVA341骨架的长度、浓度计算DNA的添加比例，并利用Gibson混合酶进行连接，其Gibson Assembly连接体系和程序如表3和表4所示：

表3Gibson Assembly连接体系表

表4Gibson Assembly连接程序

(3)S17-1大肠杆菌转化

步骤1：将提前制备好的S17-1大肠杆菌感受态细胞从-80℃拿出，在冰上解冻，5min后待菌块融化；

步骤2：往感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻的弹管壁将反应液混匀(请勿振荡混匀)。注：连接产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10；

步骤3：冰上冰浴30min，42℃水浴热激2min后，立即置于冰上冷却2min，注：晃动会降低转化效率；

步骤4：向离心管中加入400μL LB培养基(不含抗生素)，混匀后放入37℃摇床中200rpm复苏60min；

步骤5：5000rpm离心5min收菌，弃掉350μL上清留取100μL轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上；

步骤6：将培养基倒置到37℃培养箱中培养12～16h。

(4)单克隆菌落阳性验证

在相对应的抗性LB板上挑出菌落，并进行菌落PCR验证，将条带大小正确的PCR产物送至生物公司进行测序。

(5)选择序列正确的单菌落进行扩培，12～16h后与Halomonas sp.TD01在20LB平板中进行接合，8h后挑取少量接合后的菌体涂布于具有相应抗性的60LB板上，36～48h后再进行一次单克隆菌落验证。

(6)产物鉴定

结果表明Halomonas sp.TD01菌株基因组中成功插入了aro10基因，如图4所示，目的片段为2100bp，符合预期结果，将菌株命名为TD01-P0。

实施例2利用代谢途径协同提升菌株发酵效率

利用CRISPR-Cas9方法将pal2、fdc1、styA-styB-styC插入Halomonas sp.TD01基因组和TD01-P0基因组中。体外PCR扩增pal2、fdc1、styA-styB-styC、G49Rdonor、G49Ldonor目的基因序列和pSEVA341_porin58载体骨架序列，将扩增得到的序列插入pSEVA341_porin58载体，成功构建pSEVA341_{G49Ldonor-porin58-pal2-fdc1-styA-styB-styC-G49Rdonor}质粒。将质粒pSEVA341_{G49Ldonor-porin58-pal2-fdc1-styA-styB-styC-G49Rdonor}和pSEVA321_Cas9共同导入Halomonassp.TD01与TD01-P0菌株中，具体步骤参考实施例1，质粒信息如图5所示。

利用PCR扩增pal2、fdc1、styA-styB-styC、G49Ldonor、G49Rdonor和质粒pSEVA341porin58骨架的引物序列(5’-3’)如下：

pal2-F：见SEQ ID No.9；

pal2-R：见SEQ ID No.10；

fdc1-F：见SEQ ID No.11；

fdc1-R：见SEQ ID No.12；

styA-styB-styC-F：见SEQ ID No.13；

styA-styB-styC-R：见SEQ ID No.14；

G49Rdonor-F：见SEQ ID No.15；

G49Rdonor-R：见SEQ ID No.16；

G49Ldonor-F：见SEQ ID No.17；

G49Ldonor-R：见SEQ ID No.18；

pSEVA341porin58-F₁：见SEQ ID No.19；

pSEVA341porin58-R₁：见SEQ ID No.20。

通过目的产物的大小进行验证，结果表明在TD01-P0菌株G49位点中成功插入了pal2-fdc1-styA-styB-styC基因序列，如图6所示，目的片段为6000bp，符合预期结果。在Halomonassp.TD01菌株G49位点中成功插入了pal2-fdc1-styA-styB-styC基因，如图7所示，目的片段为6000bp，符合预期结果。将导入苯乙烯衍生途径的TD01-P0与Halomonassp.TD01菌株分别命名为TD01-P2与TD01-P1。

实施例3生产苯乙烯的TD01菌株构建

通过实施例2构建好的环形pSEVA341_{G49Ldonor-porin58-pal2-fdc1-styA-styB-styC-G49Rdonor}质粒进行扩增，去除styA-styB-styC基因，将得到的单线性片段进行连接，得到构建完成的pSEVA341_{G49Ldonor-porin58-pal2-fdc1-G49Rdonor}质粒，质粒的构建方法参照实施例1。之后将pSEVA341_{G49Ldonor-porin58-pal2-fdc1-G49Rdonor}质粒与pSEVA321_Cas9导入Halomonas sp.TD01中，pal2-fdc1-styA-styB-styC核苷酸序列如SEQ ID No.37所示，pal2-fdc1核苷酸序列如SEQID No.38所示。

利用PCR扩增环形pSEVA341_{G49Ldonor-porin58-pal2-fdc1-styA-styB-styC-G49Rdonor}质粒的引物序列(5’-3’)如下：

pSEVA341_{G49Ldonor-porin58-pal2-fdc1-G49Rdonor}-F：见SEQ ID No.21；

pSEVA341_{G49Ldonor-porin58-pal2-fdc1-G49Rdonor}-R：见SEQ ID No.22。

结果如图8所示，目的片段为4221bp，说明成功将苯乙烯途径插入Halomonassp.TD01菌株基因组中的G49位点，成功在Halomonas sp.TD01菌株中引入苯乙烯合成途径，将其命名为TD01-S0。

实施例4利用三种重组菌摇瓶发酵产2-PE与苯乙烯

使用实施例1～3构建的三种菌株进行发酵培养。

(1)种子液制备

①菌种活化

将重组的菌株在60LB平板划线，37℃活化24h，待其长出单克隆。

②一级种子培养：

挑取单菌落接种于装有5mL种子培养基(60LB)的摇菌管中，置于摇床37℃，220rpm培养12h。

③二级种子培养：

吸取一级菌，按1％接种量接种于装有20mL种子培养基(60LB)150mL锥形瓶中，将置于摇床37℃，220rpm培养12h。

(2)摇瓶发酵生产2-苯乙醇与苯乙烯

(a)培养基准备：50MM培养基体系：

底料：NaCl 50g/L、酵母粉1g/L；

组分I：MgSO₄ 20g/L、CO(NH₂)₂ 30g/L；

组分II：KH₂PO₄ 175g/L；

组分III：将5g/L Fe(III)-NH₄-Citrate和2g/L CaCl₂·2H₂O和(12mol/L)浓盐酸41.7mL充分混合后定容1L；

组分IV：ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnCl₂·4H₂O 0.03g/L、H₃BO₃ 0.3g/L、CoCl₂·6H₂O0.2g/L、CuSO₄·5H₂O 0.01g/L、NiCl₂·6H₂O 0.02g/L和NaMoO₄·2H₂O 0.03g/L；

组分III&IV：取100mL组分III和10mL组分IV，加入90mL去离子水混合，最后用5M的NaOH调pH值到4.5～5.5；

碳源(g/L)：葡萄糖30g/L、苯丙氨酸5g/L。

(b)60LB种子液培养基

酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠60g/L；

pH为8.5；

发酵生产采用50MM培养体系，将种子液按5％接种于150mL锥形瓶(底料18mL、组分I 0.4mL、组分II 0.4mL、组分III&IV 0.4mL、500g/L葡萄糖1.2mL、200g/L尿素0.4mL；使用5M的NaOH调pH值到8.5～9.5)内，置于摇床37℃、220rpm培养48h。为了避免挥发性产物(即苯乙烯)的损失，采用了封闭系统发酵生产。发酵结束后使用等体积甲醇液体从瓶口收集苯乙烯。

(3)发酵结束后收集菌体进行检测

(a)OD₆₀₀测定：

取1mL发酵后的菌液，在12000r/min下离心10min，弃上清加入等量体积的去离子水，重悬菌体，使用分光光度计检测波长为600nm时吸光值(必要时对菌液进行稀释，确保使用分光光度计在波长为600nm时的读数位于为0.3～0.8范围之中)。

(b)2-PE与苯乙烯含量的检测

取1mL发酵液在12000r/min转速下离心2min，上清使用80％甲醇稀释适当倍数后过0.22μm的有机系膜待测，苯乙烯经甲醇收集后使用80％甲醇稀释适当倍数后过0.22μm的有机系膜待测，采用HPLC法检测2-PE与苯乙烯，采用高效液相检测系统，UV检测器，C18柱(Agilent ZORBAX Eclipse Plus，250mm×4.6mm，5μm)。流速：1mL/min，流动相为水(A)、甲醇(B)，0-8min，由95％A、5％B线性变化20％A、80％B，8-10min为20％A、80％B，10-14min，由20％A、80％B线性变化至95％A、5％B。紫外吸收：260nm，进样体积：10μL，检测时长：14min。

(4)发酵结果如表5所示。

表5重组菌株发酵结果

由上述内容可知，TD01-P2菌株中同时构建艾氏途径和苯乙烯途径的2-PE产量都显著高于单独引入途径的情况，而苯乙烯产量略低于单独引入苯乙烯合成途径菌株。说明在Halomonas sp.TD01菌株中联合构建途径的发酵效果最佳，2-PE产量可达1.77g/L。

实施例5苯丙氨酸添加量优化强化2-PE与苯乙烯合成产量

为了进一步提高提高2-PE与苯乙烯的产量，通过优化苯丙氨酸的添加量来实现改目的，将苯丙氨酸添加浓度设置为1、2、5、7、10g/L梯度。使用菌株为TD01-P2。除苯丙氨酸添加浓度改变外，发酵培养基其余组分以及摇瓶发酵具体实施方法同实施例4，发酵结果如表6所示。

表6重组菌株发酵结果

由上述发酵结果显示，在发酵培养基中添加7g/L苯丙氨酸时，2-PE与苯乙烯产量均有较大提升，2-PE产量可达3.22g/L，苯乙烯产量可达0.67g/L。

本发明利用合成生物学技术对2-PE合成的两条途径进行发酵对比，以提高Halomonas sp.TD01菌株合成2-PE的产量，发现TD01-P2途径对2-PE产量的提高效果最佳，为了再次突破改造菌生产2-PE的产量，对该菌株的培养基添加苯丙氨酸的量进行优化以提高2-PE的生产。此外，TD01-P2在产苯乙醇的同时，还能够生产苯乙烯。因此，TD01-P2菌株可以作为2-PE与苯乙烯的工业生产菌株。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生产2-苯乙醇的重组盐单胞菌，其特征在于，所述重组盐单胞菌表达酿酒酵母来源的aro10基因。

2.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述重组盐单胞菌还表达拟南芥来源的pal2基因、酿酒酵母来源的fdc1基因以及恶臭假单胞菌来源的styA基因、styB基因和styC基因。

3.根据权利要求1～2任一项所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述基因的表达使用了基因编辑系统，所述基因编辑系统为CRISPR-Cas9。

4.根据权利要求1～2任一项所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述盐单胞菌包括Halomonas sp.。

5.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述重组盐单胞菌中表达的aro10基因通过G43位点插入到重组盐单胞菌的基因组中。

6.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述aro10基因的表达使用pSEVA341载体。

7.根据权利要求6所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述pSEVA341载体包含启动子，所述启动子为porin58。

8.权利要求1～2任一项所述的重组盐单胞菌在生产2-苯乙醇中的应用。

9.一种权利要求1～2任一项所述的重组盐单胞菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将下列组中的任一种导入重组盐单胞菌：

(1)aro10核苷酸序列；或

(2)aro10核苷酸序列、pal2核苷酸序列、fdc1核苷酸序列和styA-styB-styC核苷酸序列；

其中，aro10核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；pal2的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；fdc1的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示；styA-styB-styC的核苷酸序列如SEQ IDNo.36所示。

10.一种使用权利要求1～2任一项所述的重组盐单胞菌生产2-苯乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述重组盐单胞菌活化，进行摇瓶种子培养后在发酵培养基进行发酵培养；

优选地，所述发酵培养基包含苯丙氨酸；

优选地，所述苯丙氨酸的添加量为5～10g/L；

优选地，所述发酵的温度为33～37℃、pH 8.5～9.5、时间为36～48h。