CN118406118B - 一种靶向il-7r的小蛋白sbp003501及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向IL‑7R的小蛋白SBP003501及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明先通过计算机模拟设计出小蛋白SBP003501，然后利用大肠杆菌表达系统实现小蛋白SBP003501的高效表达，并通过SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。本发明制备的小蛋白SBP003501与IL‑7R之间展现了纳摩尔级别的亲和力，这种高亲和力结合使得小蛋白SBP003501即使在低浓度下也能有效地与靶点结合。本发明为开发出高效、低副作用的药物提供了可能，同时本发明小蛋白SBP003501的制备方法不仅成本低廉，而且易于大规模生产，展现了在小蛋白生产中的优越性和实用性。

Description

一种靶向IL-7R的小蛋白SBP003501及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向IL-7R的小蛋白SBP003501及其制备方法和应用。

背景技术

白介素-7受体(Interleukin-7Receptor，IL-7R)是一种细胞表面受体，用于结合白介素-7(Interleukin-7，IL-7)并传递信号。IL-7R涉及多条信号通路，其中包括JAK-STAT信号通路、PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路。其信号传导通路的异常可能导致免疫系统失衡，进而引发各种疾病。例如，IL-7Rα的过度表达或异常激活可能导致淋巴细胞的异常增殖和存活，从而引起自身免疫性疾病，比如类风湿性关节炎和炎症性肠病等。而IL-7R信号传导通路的缺陷又可能导致免疫功能低下，使机体容易受到感染或肿瘤的侵袭。

小蛋白是一类分子量较小(1-10kDa)、具有高度特异性和亲和力的生物分子，其长度通常小于100个氨基酸。它们的结构通常由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲等原始的主要结构单元组成。小蛋白主要来源于自然界或者人工合成，并在生物体内扮演着重要的角色，如催化作用、信号传导、结构支持等。作为一种新兴的药物开发模式，小蛋白在处理目前难以治疗的疾病方面展现出巨大潜力。相较于传统的大蛋白，小蛋白更易于合成和设计，同时能够在组织和细胞中发挥作用，具有类似蛋白质的功能性，如靶标结合、蛋白-蛋白相互作用的干扰等。此外，小蛋白具有类似小分子化合物的药理学特性，如较短的血清半衰期、更容易进行药物结合物的设计等，使其在药物研发中具有独特的优势。通过充分利用这些优势，小蛋白可以为药物研发领域带来新的可能性和机遇，为处理难治性疾病提供新的解决方案。

在药物研发中，传统的单克隆抗体和重组人白介素有时可能引发严重的免疫反应或全身性毒性；在生产方面，单克隆抗体的制备过程繁琐，需要依赖复杂的细胞培养技术和纯化步骤，成本较高。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种靶向IL-7R的小蛋白SBP003501及其制备方法和应用，以开发出一种新的具有高亲和力、高特异性且制备过程简单的IL-7R小蛋白配体。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：本发明提供了一种靶向IL-7R的小蛋白SBP003501，小蛋白SBP003501的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步，编码小蛋白SBP003501的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

具体地，本发明提供了一种表达载体，表达载体包含编码小蛋白SBP003501的核苷酸序列。

进一步，表达载体为PET28a(+)质粒。

具体地，本发明还提供了一种重组细胞，重组细胞包含含有编码小蛋白SBP003501的核苷酸序列的表达载体。

进一步，重组细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了一种靶向IL-7R的小蛋白SBP003501在制备以IL-7R为靶点的药物中的应用。

进一步，以IL-7R为靶点的药物为抗过敏药物、抗炎药物、抗癌药物或自身免疫性药物。

本发明具有以下有益效果：

(1)通过RIFDOCK方法精确设计的小蛋白配体与IL-7R之间展现了纳摩尔级别的亲和力，这种高亲和力结合使得小蛋白SBP003501即使在低浓度下也能有效地与靶点结合。

(2)通过大肠杆菌表达系统表达小蛋白SBP003501，不仅成本低廉，而且易于大规模生产。同时，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化技术，可以获得高纯度的小蛋白SBP003501，为后续的药物研发和临床应用提供了便利。

(3)IL-7R在免疫调节、淋巴细胞增殖和分化等多个生理过程中发挥重要作用，本发明提供的小蛋白SBP003501可以用于治疗与IL-7R相关的疾病，如自身免疫性疾病、癌症等，为这些疾病的治疗提供了新的策略。

附图说明

图1为小蛋白SDS-PAGE结果图；

图2为小蛋白和IL-7R BLI实验的结合解离图；

图3为小蛋白和IL-7R分子对接的能量漏斗图；

图4为模拟设计的小蛋白和IL-7R的三维结构图；

图5为小蛋白和IL-7R界面上的相互作用图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例进行说明。以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1设计靶向IL-7R的小蛋白SBP003501

(1)首先，从PDB数据库获取IL-7R的三维结构，并将其作为对接的靶点，进一步的对靶点蛋白进行疏水性预测，根据疏水性分布选择对接的具体表面区域，准备进行后续的小蛋白配体设计；

(2)在本发明中，用于与靶点对接的小蛋白配体来源于深度学习模型的生成。深度学习模型经过大量的数据训练和优化，能够学习到小蛋白与靶点之间相互作用的复杂模式，并据此生成具有潜在高亲和力的小蛋白序列；通过深度学习模型，生成了一组候选的小蛋白序列，并通过Alphafold2预测出其三维结构，用于对接；

(3)使用RIFDOCK方法对这些候选的小蛋白进行对接，通过蒙特卡罗模拟和能量评分搜索蛋白质-配体结合模式，并不断尝试不同的配体构象和方向。对接完成后，随即展开了对相互作用界面的序列设计，通过优化蛋白质在界面区域的氨基酸序列，以最大化与目标的相互作用，增强与目标蛋白的结合亲和力；

(4)设计完成后，通过RIFDOCK方法的评分系统挑选出优秀的设计，并结合Rosetta软件分子对接的结果，进一步挑选出了小蛋白SBP003501的氨基酸序列，并将其转换成核苷酸序列。

实施例2构建pET-28a-SBP003501(+)表达质粒

(1)对小蛋白SBP003501的核苷酸序列进行详细分析，以确定其编码区及潜在的限制性酶切位点。随后，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术，使用特定的引物扩增出包含完整开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)的SBP003501基因片段，并在其两端引入与pET-28a质粒相匹配的限制性酶切位点及保护碱基，其中，小蛋白SBP003501的PCR引物如下：

Primer1：ggacagcaaatgggtcgcggatccGACATCCGTCGTCTGCAG(SEQ IDNo.3)；

Primer2：gtggtggtggtggtggtgctcgagCAGCTCGCGGGCTTCTTC(SEQ IDNo.4)。

(2)将pET-28a质粒用相应的限制性内切酶进行双酶切处理，以确保载体线性化。酶切后的产物经纯化后和PCR产物按摩尔比1：4进行混合，根据Gibson连接原理，利用T5核酸外切酶混合物进行连接反应，将SBP003501基因片段定向克隆至pET-28a质粒的多克隆位点中，形成重组质粒pET-28a-SBP003501(+)。

实施例3表达纯化小蛋白SBP003501

(1)将pET-28a-SBP003501(+)表达质粒转入到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，并在冰上静置30min，以确保表达质粒在低温下充分进入感受态细胞；

(2)将步骤(1)所得感受态细胞在42℃下水浴热激90s，然后迅速转移至冰上并静置5min。这一步骤利用短暂的高温刺激，促进表达质粒进入大肠杆菌细胞内部，随后冰上静置帮助细胞恢复稳定；

(3)将步骤(2)所得菌液均匀涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，并在37℃条件下过夜培养。卡那霉素用于筛选出成功转化了表达质粒的大肠杆菌细胞；

(4)次日，从步骤(3)所得LB固体培养基上挑取单个菌落，接种至5mL LB液体培养基中培养过夜，以扩大菌量；

(5)取1mL步骤(4)所得产物接种至100mL的LB或2×YT液体培养基中(含有卡那霉素)，然后将液体培养基放入水平摇床中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600值为0.5。随后加入浓度为0.1M的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导蛋白表达，并在30℃下继续培养过夜；

(6)将步骤(5)所得产物放入离心机中，在4℃、6,000rpm条件下离心5min，收集菌体。随后加入50mL裂解缓冲液，涡旋震荡混匀，并在冰上放置30min；

(7)将步骤(6)所得产物使用超声波破碎仪以35％的功率进行超声处理，每次超声5s，间歇3s，总超声时间为10min。这一步的目的是裂解大肠杆菌细胞，释放细胞内的目标蛋白。随后放入离心机中，在4℃、10,000rpm条件下离心30min，收集上清液。将上清液与1mLNi-NTA树脂混合，并在4℃下结合2h。Ni-NTA树脂能够特异性地结合带有组氨酸(His)标签的蛋白，达到初步纯化目标蛋白的目的；

(8)使用含有25mM咪唑的洗脱缓冲液对步骤(7)所得产物进行洗脱，每次10mL过柱，重复5次，通过逐渐洗脱与树脂结合较弱的杂质，进一步纯化目标蛋白；

(9)往步骤(8)所得产物中加入1mL含有500mM咪唑的洗脱缓冲液，洗脱30min后收集洗脱液，获得纯化的小蛋白SBP003501溶液，可用于后续的分析和应用。该步骤中使用了高浓度的咪唑，能够有效竞争性地与Ni-NTA树脂结合，从而将目标蛋白从树脂上洗脱下来。

实施例4小蛋白SBP003501的纯化效果和分子量分析

(1)样品制备：取50μL的小蛋白SBP003501样品，加入4×SDS上样缓冲液(loadingbuffer)，100℃水浴加热10min，使小蛋白SBP003501变性并充分与SDS结合，以便在凝胶电泳中有效分离；

(2)配制蛋白胶：按照表1所示比例，分别配制浓度为12％的分离胶和5％的浓缩胶。分离胶用于将不同分子量的蛋白分离，浓缩胶在SDS-PAGE中主要起到样品预浓缩的作用，为后续的分离过程做好准备；

(3)电泳：将步骤(2)所得蛋白胶置于垂直电泳仪中，倒入电泳液，并将步骤(1)所得小蛋白SBP003501样品加入对应的泳道。电泳过程先以恒压80V进行30min，使样品在浓缩胶中压缩成一条窄带，然后将电压提高到120V继续电泳1h，使不同分子量的蛋白在分离胶中分离；

(4)染色：电泳结束后，取出小蛋白SBP003501胶体，加入考马斯亮蓝染液进行染色。考马斯亮蓝能与小蛋白SBP003501结合，使其呈现出蓝色，便于观察，染色过程在摇床上室温进行2h，确保小蛋白SBP003501充分显色；

(5)脱色与分析：小蛋白SBP003501染色完成后，使用脱色液进行脱色，去除背景色，使蛋白条带更加清晰，最后对脱色后的小蛋白SBP003501胶体进行分析，观察小蛋白SBP003501条带的位置和纯度。

表1分离胶和浓缩胶的配比

SDS-PAGE电泳结果见图1，由图1可知，经过脱色处理后，可以清晰地观察到在8kDa位置处存在一条明显的条带，这证实小蛋白SBP003501的成功分离。此外，通过分析得出小蛋白SBP003501的纯度高于90％，浓度为0.8mg/mL，这结果符合后续亲和力测定分析的要求，为后续研究提供了可靠的物质基础。

实施例5：小蛋白SBP003501亲和力测定和分析

(1)分析样品准备：使用透析的方法将小蛋白SBP003501和IL-7R的溶解体系置换成1xPBS缓冲液透析的主要目的是去除可能干扰后续实验的杂质，同时确保小蛋白SBP003501和IL-7R处于适当的溶液中。期间更换PBS溶液3次，以确保充分置换；

(2)传感器预湿：将蛋白质A生物传感器(ProA Biosensors)放置在盛有250μLPBST(0.02％吐温-20)的预湿板上，预湿10min，使传感器表面湿润，为后续的分子相互作用提供稳定的环境；

(3)样品稀释：使用PBST(0.02％吐温-20)将步骤(1)所得小蛋白SBP003501溶液稀释为300nM、250nM、150nM三个浓度梯度，以测定不同浓度下小蛋白SBP003501与IL-7R的结合能力，从而得出完整的结合动力学曲线；

(4)软件设置与程序编辑：打开Octet BLIDiscovery 12.2程序软件，按照表2编辑程序，设置相关实验参数，以确保实验按照预定的步骤进行；

(5)样品加载与实验运行：将步骤(3)所得的不同浓度的小蛋白SBP003501溶液加入对应的样品板位置，运行程序。此时，Octet仪器会自动按照预设的程序进行样品加载、混合、检测等操作；

(6)数据分析：最后，使用Octet Alanysis 12.2对实验数据进行处理和分析。包括对实验数据进行处理、拟合和解释，以得出小蛋白SBP003501与IL-7R的结合动力学参数，如结合常数、解离常数等。

表2Octet BLIDiscovery程序参数设定

结合解离图如图2所示，由图2可知小蛋白SBP003501与IL-7R的结合过程表现为慢结合和慢解离的特性，且存在着较高亲力。分析结果见表3，由表3可知，小蛋白SBP003501的平衡解离常数(KD)值为8.2nM，这一数值反映了小蛋白SBP003501和IL-7R能紧密结合。此外，结合常数(Ka)为28650(1/Ms)，解离常数(Kdis)为23510(1/s)，这些参数表明小蛋白SBP003501和IL-7R具有显著的特异性结合能力，为后续的生物学研究和应用提供了重要的参考依据。

表3Octet BLIDiscovery分析结果

实施例6小蛋白SBP003501亲和力分析

我们利用RosettaDock软件对小蛋白SBP003501与IL-7R复合体以及IL-7与IL-7R复合体进行了进一步的亲和力分析。结果见图3，由图3可知小蛋白SBP003501能与IL-7R对接，并生成理想的对接漏斗图。对靶点的对接能量漏斗图及对应结构清晰展示了对接构象的优化程度，不仅非常接近预期的理想模型，而且在能量层面也达到了优化状态，显示出极高的结构稳定性。通过与IL-7R的天然配体IL-7进行比较，发现小蛋白SBP003501的最低界面打分为-45.93Kcal/mol，而IL-7为-45.63Kcal/mol，这表明小蛋白SBP003501和IL-7对IL-7R在计算模拟中表现出相似的结合亲和力。

实施例7小蛋白SBP003501与IL-7R的相互作用模式

本发明采用了PyMOL这一分子可视化软件进行分析。首先分析了两个蛋白质的结构及其结合模式，发现它们的结合构象与天然配体的结合位置非常相近，而且符合最初选择的靶点区域，小蛋白SBP003501和IL-7R的三维结构图如图4所示，其中，蓝色部分为小蛋白SBP003501，绿色部分为IL-7R。接着利用PyMOL，进一步分析了蛋白质相互作用界面，该软件不仅能准确识别蛋白间的相互作用，还可以清晰、直观的方式将其突出显示。结果见图5，图5以不同形式和颜色展示了这些相互作用。图中紫色虚线代表疏水相互作用，可以看出小蛋白SBP003501与IL-7R之间存在大量的疏水作用力，这一发现充分证明了本发明小蛋白SBP003501设计的合理性和有效性。此外，界面中还观察到其他极性相互作用，如氢键等，这些相互作用对于维持小蛋白SBP003501与IL-7R复合体的稳定性至关重要。因此，小蛋白SBP003501与IL-7R之间的相互作用不仅增强了蛋白质之间的结合力，还影响了小蛋白SBP003501与IL-7R复合体的整体结构和功能。

本发明中小蛋白SBP003501的核苷酸序列和氨基酸序列分别如下：

(1)小蛋白SBP003501的氨基酸序列：

DIRRLQKLFEAASQFEDPELARKVLEALREAFEKGIPPEVKEEIERLIR EIKTLPPEEAREL(SEQID No.1)。

(2)小蛋白SBP003501的核苷酸序列：

GATATTCGCCGCCTGCAGAAACTGTTTGAAGCGGCGAGCCAGTTTGAAGATCCGGAACTGGCGCGCAAAGTGCTGGAAGCGCTGCGCGAAGCGTTTGAAAAAGGCATTCCGCCGGAAGTGAAAGAAGAAATTGAACGCCTGATTCGCGAAATTAAAACCCTGCCGCCGGAAGAAGCGCGCGAACTG(SEQ ID No.2)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种靶向IL-7R的小蛋白SBP003501，其特征在于，所述小蛋白SBP003501的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的靶向IL-7R的小蛋白SBP003501，其特征在于，编码所述小蛋白SBP003501的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述的编码小蛋白SBP003501的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET-28a(+)质粒。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含权利要求3-4任一项所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。