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CN118369111A - 单纯疱疹病毒mRNA疫苗 - Google Patents

单纯疱疹病毒mRNA疫苗 Download PDF

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CN118369111A
CN118369111A CN202280081626.2A CN202280081626A CN118369111A CN 118369111 A CN118369111 A CN 118369111A CN 202280081626 A CN202280081626 A CN 202280081626A CN 118369111 A CN118369111 A CN 118369111A
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CN
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CN202280081626.2A
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卡皮尔·巴尔
安德烈亚·卡尔菲
苏马纳·钱德拉蒙利
安东尼·迪皮亚扎
阿历克·弗雷因
吴凯
赖彦廷
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ModernaTx Inc
Original Assignee
ModernaTx Inc
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Abstract

本文提供了信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其编码参与病毒附着和进入的多种单纯疱疹病毒(HSV)抗原。还提供了使用所述疫苗的方法和包含所述疫苗的组合物。

Description

单纯疱疹病毒mRNA疫苗
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2021年12月8日提交的美国临时申请号63/287,208和于2022年1月10日提交的美国临时申请号63/298,112的权益，这些美国临时申请中的每一项全文以引用方式并入本文。
电子序列表的引用
电子序列表(M137870195WO00-SEQ-NTJ.xml；大小：214,658字节；以及创建日期：2022年12月7日)的内容全文以引用方式并入本文。
背景技术
属于两种亚型(HSV-1或HSV-2)之一的单纯疱疹病毒(HSV)是疱疹病毒科中的双链线性DNA病毒。这些神经侵入性病毒在神经节中建立潜伏性感染，其中再活化和复制的散发性发作导致被称为“爆发”的复发性症状期。在此类爆发期间，有复制能力的病毒颗粒在受影响的区域是丰富的，并且与受影响的区域的接触允许HSV传播。HSV在全球范围内影响着许多人。世界卫生组织估计，在50岁以下的人群中，有67％感染了HSV-1，而在15与49岁之间的人群中，有11％感染了HSV-2。
目前，包括阿昔洛韦泛昔洛韦和伐昔洛韦在内抗病毒药物是FDA批准的人们可以用来对抗HSV的唯一治疗方法。疱疹病毒比大多数病毒更复杂和更易躲避，因此开发疫苗具有挑战性。事实上，在过去几年中，有几家负责监督疱疹疫苗临床试验的公司已经放弃了研究。例如，2018年6月，一家公司宣布其HSV-2疫苗的II期临床试验不符合“其主要终点”。2017年9月，另一家公司宣布正在探索其疱疹疫苗的“战略替方案”，但最终停止了该疫苗方面的支出。
通过使用减毒活疫苗，诸如用于预防水痘和单带状疱疹的减毒水痘-带状疱疹病毒(VZV)，经常预防由其他疱疹病毒引起的症状性感染。尽管使用减毒HSV活疫苗的临床试验正在进行中，但仍存在活病毒在接种疫苗的受试者体内建立潜伏性感染的相关风险，从而使受试者在以后的生命中易于爆发。因此，仍然迫切需要开发安全且有效的HSV疫苗。
发明内容
本文提供的信使核糖核酸(mRNA)疫苗安全地指导身体的细胞机制以产生多种经修饰的HSV蛋白，这些HSV蛋白被设计成在细胞内部和外部具有治疗上的免疫原性活性。这些HSV mRNA疫苗包含多种mRNA多核苷酸，这些多核苷酸中的每一种编码不同的细胞内或细胞表面表达的蛋白质，该蛋白质被策略性地设计成引发针对HSV的改善的、平衡的体液和细胞免疫应答。另外，细胞内HSV抗原被设计成防止HSV蛋白表达的有害影响。对表面表达的HSV糖蛋白的修饰改善表达和抗体应答，而对HSV胞内蛋白的修饰引发改善的CD8+T细胞应答，该应答可以清除其中HSV已经从潜伏期中重新出现或正在活跃复制和表达野生型蛋白质对应物的细胞。令人惊奇的是，mRNA疫苗接种后产生的经修饰的HSV胞内蛋白抑制致病性糖蛋白特异性Th2细胞的生成，而不影响免疫保护性糖蛋白特异性Th1细胞或糖蛋白特异性抗体的生成。
在一些方面，HSV mRNA疫苗接种导致身体细胞以与当蛋白质由天然病毒表达时类似的方式表达HSV糖蛋白B(gB)、HSV糖蛋白C(gC)和/或HSV糖蛋白D(gD)，从而引发对糖蛋白具有特异性的抗体和T细胞(例如，产生促炎性IFN-γ的Th1细胞和清除受感染细胞的CD8+T细胞)的产生。由于HSV糖蛋白B、C和D中的每一者都是病毒进入所必需的，因此针对这些抗原的多价mRNA疫苗生成限制(例如，预防)和/或治疗HSV感染的有效中和抗体应答。本文示出了对这些抗原的修饰以改善抗体应答。例如，相对于野生型(未经修饰的)形式，HSV gC的胞质尾区的缺失引发更高的抗体滴度。作为另一个实例，HSV gC的残基327(例如，F327A)的突变消除人C3b的结合和螯合作用，从而暴露出对于免疫接种重要的gC表位，这些gC表位本来会被C3b掩蔽。
响应于本文提供的HSV mRNA疫苗而生成的抗体具有可用于预防或改善HSV感染的多种抗病毒活性。例如，对HSV颗粒的中和活性，从而在微量中和测定中防止细胞感染。另外，引发的抗体促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，这导致清除受病毒感染的细胞。此外，抗体防止HSV颗粒的细胞-细胞扩散，其中从一个细胞释放的HSV易位并感染邻近的细胞。因此，除了在预防未暴露的或最近暴露的受试者的HSV感染中的预防性用途之外，本公开的疫苗还可用于治疗，诸如用于缩短HSV爆发的持续时间或预防潜伏性HSV感染的再活化。
在其他方面，HSV mRNA疫苗接种还导致HSV胞内蛋白ICP0和/或ICP4的表达，二者在潜伏性感染再活化期间早期在宿主细胞内表达。在一些实施方案中，这些胞内蛋白已经过修饰，以防止HSV蛋白表达的有害影响，并且能够引发CD8+T细胞应答，该应答可以清除其中HSV已经从潜伏期中重新出现或正在活跃复制的细胞，如上所讨论。对细胞内HSV蛋白的修饰包括，例如，内部截短，以(i)去除已知CD8+T细胞表位中稀疏的蛋白质区域，从而增加经修饰的蛋白质(例如，ICP0和/或ICP4)的表位密度，和/或(ii)破坏或去除蛋白质的功能部分以改善安全性或免疫原性。在一些实施方案中，用被破坏的核定位信号修饰细胞内HSV蛋白，从而促进在胞质溶胶中的保留、蛋白酶体加工以及向CD8+T细胞的表位呈递。另外，虽然野生型ICP0和ICP4例如抑制先天性免疫功能以促进病毒复制(例如，经由参与抑制Toll样受体信号传导的USP7结合结构域，或参与抑制抗病毒干扰素应答的RING指结构域)，但这些结构域可被破坏以减少或消除这些免疫抑制功能，同时保留免疫原性CD8+T细胞表位。
因此，含有共同编码HSV gB、gC、gD、ICP0和ICP4的mRNA的组合物可用于生成控制病毒复制的糖蛋白特异性抗体和稳健的抗病毒Th1细胞应答，同时限制加剧HSV-2感染的致病性Th2细胞的生成。
一些方面涉及一种单纯疱疹病毒(HSV)信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其包含(a)包含编码HSV糖蛋白B(gB)的开放阅读框的mRNA，该HSV gB相对于野生型HSV gB包含截短的C末端；(b)包含编码HSV糖蛋白C(gC)的开放阅读框的mRNA；(c)包含编码HSV糖蛋白D(gD)的开放阅读框的mRNA；(d)包含编码HSV胞内蛋白0(ICP0)的开放阅读框的mRNA；(e)包含编码HSV胞内蛋白4(ICP4)的开放阅读框的mRNA；以及(f)脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，HSV gB包含截短的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB不包含胞质尾区。
在一些实施方案中，HSV gC相对于野生型HSV gC包含F327A取代和截短的C末端。在一些实施方案中，HSV gC包含截短的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB和/或HSV gC不包含胞质尾区。
在一些实施方案中，HSV ICP0缺少核定位信号和/或RING指结构域。
在一些实施方案中，HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含更高密度的CD8+T细胞表位。
在一些实施方案中，HSV ICP4缺少核定位信号和/或RING指结构域。
在一些实施方案中，HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含更高密度的CD8+T细胞表位。
其他方面涉及一种单纯疱疹病毒(HSV)信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其包含(a)包含编码HSV糖蛋白B(gB)的开放阅读框的mRNA，该HSV gB相对于野生型HSV gB包含截短的C末端；(b)包含编码HSV糖蛋白C(gC)的开放阅读框的mRNA，该HSV gC相对于野生型HSV gC包含截短的C末端；(c)包含编码HSV糖蛋白D(gD)的开放阅读框的mRNA；(d)包含编码HSV胞内蛋白0(ICP0)的开放阅读框的mRNA，该HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含更高密度的CD8+T细胞表位；(e)包含编码HSV胞内蛋白4(ICP4)的开放阅读框的mRNA，该HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含更高密度的CD8+T细胞表位；以及(f)脂质纳米颗粒。
进一步的方面涉及一种单纯疱疹病毒(HSV)信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其包含(a)包含编码HSV糖蛋白B(gB)的开放阅读框的mRNA，任选地其中该gB相对于野生型HSV gB包含截短的C末端；(b)包含编码HSV糖蛋白C(gC)的开放阅读框的mRNA，该HSV gC相对于野生型HSV gC包含F327A取代和截短的C末端；以及(c)包含编码HSV糖蛋白D(gD)的开放阅读框的mRNA；(d)脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，该方法还包含mRNA，该mRNA包含编码HSV胞内蛋白0(ICP0)的开放阅读框，该HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含更高密度的CD8+T细胞表位。
在一些实施方案中，该方法还包含mRNA，该mRNA包含编码HSV胞内蛋白4(ICP4)的开放阅读框，该HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含更高密度的CD8+T细胞表位。
在一些实施方案中，HSV gB和/或HSV gC包含截短的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB和/或HSV gC不包含胞质尾区。
还有其他方面涉及一种单纯疱疹病毒(HSV)信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其包含(a)包含编码HSV糖蛋白C(gC)的开放阅读框的mRNA，该HSV gC相对于野生型HSV gC包含F327A取代和截短的C末端；(b)包含编码野生型HSV糖蛋白D(gD)的开放阅读框的mRNA；(c)包含编码HSV胞内蛋白0(ICP0)的开放阅读框的mRNA，该HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含更高密度的CD8+T细胞表位；(d)包含编码HSV胞内蛋白4(ICP4)的开放阅读框的mRNA，该HSVICP4相对于野生型HSV ICP4包含更高密度的CD8+T细胞表位；以及(e)脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，HSV gC包含截短的胞质尾区。
在一些实施方案中，HSV gC不包含胞质尾区。
在一些实施方案中，疫苗诱导对HSV gC、gB和/或gD的Th1极化的CD4+T细胞介导的免疫应答。
在一些实施方案中，与对选自HSV gB、gC或gD的抗原具有特异性的Th2细胞相比，疫苗引发更多的对该抗原具有特异性的Th1细胞。
在一些实施方案中，对选自HSV gB、gC或gD的抗原具有特异性的CD4+T细胞群体包含超过50％的Th1细胞。
在一些实施方案中，HSV gB、gC或gD中的每一者包含跨膜结构域。
在一些实施方案中：(a)HSV gB具有约798个氨基酸的长度；(b)HSV gC具有约469个氨基酸的长度；(c)HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含核定位信号、RING指结构域和/或USP7结合结构域中的截短；并且/或者(d)HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含核定位信号和/或DNA结合结构域中的截短。
在一些实施方案中，HSV ICP0不包含核定位信号，不包含USP7结合结构域，并且/或者不包含RING指结构域。
在一些实施方案中，HSV ICP0不包含核定位信号并且/或者包含截短的DNA结合结构域。
在一些实施方案中：(a)HSV gB包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列；(b)HSV gC包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列；(c)HSV gD包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列；(d)HSV ICP0包含与SEQ IDNO:47的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列；并且/或者(e)HSV ICP4包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，(c)和(d)的mRNA与(a)、(b)和(c)的mRNA的摩尔比不超过0.8:1。
在一些实施方案中，一种或多种mRNA包含化学修饰。
在一些实施方案中，一种或多种mRNA的100％尿嘧啶核苷酸包含化学修饰。
在一些实施方案中，化学修饰是1-甲基假尿嘧啶。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含可电离脂质、中性脂质、固醇和经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含40-50mol％的可电离脂质、5-15mol％的中性脂质、30-50mol％的固醇和0.5-3mol％的经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中：可电离脂质包含化合物(I)的结构：
中性脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)；
固醇是胆固醇；并且/或者
经PEG修饰的脂质是1,2二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)。
一些方面涉及一种方法，其包括向受试者施用前述方面或实施方案中任一项的疫苗。
在一些实施方案中，受试者患有HSV感染或已暴露于HSV。
在一些实施方案中，疫苗以有效预防受试者的潜伏性HSV感染的量施用。
在一些实施方案中，疫苗以有效预防受试者的潜伏性HSV感染再活化、预防HSV复制、缩短受试者的HSV感染的持续时间、减少受试者中有复制能力HSV颗粒的数量和/或减少受试者中包含HSV基因组的细胞的数量的量施用。
在一些实施方案中，疫苗诱导对HSV gB、gC和/或gD的CD4+T细胞介导的免疫应答，并且CD4+T细胞结合至HSV gB、gC或gD的一个或多个CD4+T细胞表位。
在一些实施方案中，至少50％的CD4+T细胞产生一种或多种选自由IFN-γ、IL-2和TNF-α组成的组的细胞因子。
在一些实施方案中，少于10％的CD4+T细胞产生IL-4、IL-5、IL-9、IL-10或IL-13中的任何一种或多种。
在一些实施方案中，疫苗诱导对HSV ICP0和/或ICP4的CD8+T细胞介导的免疫应答，并且CD8+T细胞结合至HSV ICP0和/或ICP4的一个或多个CD8+T细胞表位。
在一些实施方案中，CD8+T细胞具有细胞毒性。
其他方面涉及一种经修饰的单纯疱疹病毒(HSV)胞内蛋白0(ICP0)，其比野生型HSV ICP0包含更少的氨基酸。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含核定位信号中的截短。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0不包含核定位信号。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含RING指结构域中的截短。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0不包含RING指结构域。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含USP7结合结构域中的截短。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0不包含USP7结合结构域。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含位于经修饰的HSV ICP0的第一部分与经修饰的HSV ICP0的第二部分之间的接头。
在一些实施方案中，接头包含2-10个甘氨酸残基。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含长度不超过野生型HSV IPC0长度的65％的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0氨基酸序列包含的T细胞表位是野生型HSVICP0的至少65％。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含约487个氨基酸。
其他方面涉及核糖核酸(RNA)，其包含编码前述方面或实施方案中任一项的经修饰的HSV ICP0的开放阅读框。
还有其他方面涉及一种经修饰的单纯疱疹病毒(HSV)胞内蛋白4(ICP4)，其比野生型HSV ICP4包含更少的氨基酸。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含核定位信号中的截短。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4不包含核定位信号。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含DNA结合结构域中的截短。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4不包含DNA结合结构域。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含位于经修饰的HSV ICP4的第一部分与经修饰的HSV ICP4的第二部分之间的接头。在一些实施方案中，接头包含2-10个甘氨酸残基。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含长度不超过野生型HSV IPC4长度的65％的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4氨基酸序列包含的T细胞表位是野生型HSVICP4的至少65％。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含约687个氨基酸。
一些方面涉及一种核糖核酸(RNA)，其包含编码前述方面或实施方案中任一项的经修饰的HSV ICP4的开放阅读框。
其他方面涉及一种单纯疱疹病毒(HSV)蛋白，其包含与SEQ ID NO:54、63、47和49中任一者的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
还有其他方面涉及一种信使核糖核酸(mRNA)，其包含编码前述方面或实施方案中任一项的HSV蛋白的开放阅读框。
还有其他方面涉及一种信使核糖核酸(mRNA)，其包含含有与SEQ ID NO:19、28、4、12和14中任一者的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列的开放阅读框。
在一些实施方案中，mRNA包含化学修饰。
在一些实施方案中，mRNA的100％尿嘧啶核苷酸包含化学修饰。
在一些实施方案中，化学修饰是1-甲基假尿嘧啶。
附图说明
图1示出了实施例1中评价的疫苗组合物的mRNA编码的变体HSV蛋白。示出了SEQID NO:78(GGGSGGG)。
图2A-2F示出了用实施例1中评价的包含编码HSV-2gB、gC、gD、ICP0和/或ICP4的mRNA的组合物进行疫苗接种的小鼠中的抗体应答。图2A示出了血清中抗gB IgG的滴度。图2B示出了血清中抗gC IgG的滴度。图2C示出了血清中抗gD IgG的滴度。图2D示出了针对HSV-2的菌株MS的中和抗体滴度。图2E示出了使用HSV-1KOS菌株和在第36天收集的血清进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的曲线下面积。图2F示出了血清阻断HSV-2gC与补体蛋白C3b之间相互作用的程度。
图3A-3F示出了用实施例1中评价的包含编码HSV-2gB、gC、gD、ICP0和/或ICP4的mRNA的组合物进行疫苗接种的小鼠中的T细胞应答。图3A示出了对gB、gC和gD的肽的CD4+T细胞应答。图3B示出了对gB、gC和gD的肽的CD8+T细胞应答。图3C示出了对gB、gC和gD的肽的CD4+T细胞应答。图3D示出了对ICP0和ICP4的肽的CD4+T细胞应答。图3D示出了对ICP0和ICP4的肽的CD8+T细胞应答。图3E示出了各组中累积的产生IFN-γ的CD4+T细胞应答。图3F示出了各组中累积的产生IFN-γ的CD8+T细胞应答。
图4示出了在实施例2中描述的实验中评价的疫苗组合物的mRNA编码的变体HSV蛋白。示出了SEQ ID NO:78(GGGSGGG)。
图5A-5G示出了用实施例2中评价的包含编码HSV-2gB、gC、gD、ICP0和ICP4的mRNA的组合物进行疫苗接种的小鼠中的抗体应答。图5A示出了血清中抗gB IgG的滴度。图5B示出了血清中抗gC IgG的滴度。图5C示出了血清中抗gD IgG的滴度。图5D示出了针对HSV-2的菌株MS的中和抗体滴度。图5E示出了针对HSV-1的菌株KOS的中和抗体滴度。图5F示出了使用HSV-1KOS菌株和在第36天收集的血清进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的曲线下面积。图5G示出了血清阻断HSV-2gC与补体蛋白C3b之间相互作用的程度。
图6A-6F示出了用实施例2中评价的包含编码HSV-2gB、gC、gD、ICP0和ICP4的mRNA的组合物进行疫苗接种的小鼠中的T细胞应答。图6A示出了对gB、gC和gD的肽的CD4+T细胞应答。图6B示出了对gB、gC和gD的肽的CD8+T细胞应答。图6C示出了对gB、gC和gD的肽的CD4+T细胞应答。图6D示出了对ICP0和ICP4的肽的CD4+T细胞应答。图6D示出了对ICP0和ICP4的肽的CD8+T细胞应答。图6E示出了各组中累积的产生IFN-γ的CD4+T细胞应答。图6F示出了各组中累积的产生IFN-γ的CD8+T细胞应答。
图7A-7E示出了用实施例2中评价的包含编码HSV-2gB、gC、gD、ICP0和ICP4的mRNA并且在它们的非翻译区(UTR)中不同的组合物进行疫苗接种的小鼠中的抗体应答。图7A示出了血清中抗gB IgG的滴度。图7B示出了血清中抗gC IgG的滴度。图7C示出了血清中抗gDIgG的滴度。图7D示出了针对HSV-2的菌株MS的中和抗体滴度。图7E示出了使用HSV-1KOS菌株和在第36天收集的血清进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的曲线下面积。
图8A-8B示出了用实施例2中评价的包含编码HSV-2gB、gC、gD、ICP0和ICP4的mRNA并且在它们的非翻译区(UTR)中不同的组合物进行疫苗接种的小鼠中的T细胞应答。图8A示出了对gB、gC、gD、ICP0或ICP4的肽的CD4+T细胞应答。图8B示出了对gB、gC、gD、ICP0或ICP4的肽的CD8+T细胞应答。
图9示出了在豚鼠中HSV攻击、治疗和监测研究的接种、给药和样品收集时间表的概述。在第0天用HSV-2接种豚鼠，并在感染的急性期期间监测14天。在第21天和第35天，向豚鼠施用PBS作为阴性对照，一种含有编码HSV蛋白的mRNA的组合物，或施用另一种比较疫苗作为阳性对照。每天监测阴道病变。
图10A-10D示出了编码截短的HSV胞内蛋白(ICP)的mRNA的设计以及截短的ICP的免疫原性。图10A示出了HSV ICP0中表位的位置，以及由mRNA编码的HSV ICP0区域。图10B示出了HSV ICP4中表位的位置，以及由mRNA编码的ICP4区域。图10C-10D示出了用两剂编码ICP0和/或ICP4的mRNA免疫的小鼠的CD4+(图10D)和CD8+(图10D)T细胞应答。
图11A-11D示出了野生型和经修饰的HSV-2糖蛋白的体外表达。图11A示出了不同形式的HSV-2gB的总表达强度(通过表达gB的细胞的百分比*gB+细胞的中值荧光强度进行测量)。图11B示出了转染后表达不同形式的HSV-2gC的细胞的频率。图11C示出了gC+细胞的中值荧光强度。图11D示出了总表达强度(通过表达gB的细胞的百分比*gB+细胞的MFI进行测量)。
图12A-12C示出了由核酸疫苗的mRNA编码的HSV抗原的概述。图12A示出了可以由核酸疫苗编码的HSV蛋白和变体。图12B示出了与用编码WT HSV gB(左)或融合前HSV gB(右)的mRNA转染的细胞的gB表达相关的流式细胞术数据。图12C示出了用编码WT HSV gB(左)或融合前HSV gB(右)的mRNA转染的细胞的中值荧光强度(MFI)，这些细胞与来自用PBS对照、编码WT gB的mRNA或融合前gB免疫的小鼠的血清一起孵育，然后用标记的抗小鼠IgG染色。
图13A-13I示出了由本文提供的核酸疫苗的mRNA编码的变体HSV蛋白。图13A示出了gB的变体。图13B示出了gC的变体。图13C示出了gD的变体。图13D示出了gE的变体。图13E示出了gH的变体，包括与gL共价连接的gH。示出了SEQ ID NO:121(GSGGSGSGGSSGGGSGSGGSGGSGSGGRRRRR)。图13F示出了gL的变体。图13G示出了gI的变体。图13H示出了ICP0的变体。图13I示出了HSV ICP4的变体。示出了SEQ ID NO:78(GGGSGGG)。
图14A-14C示出了一组疫苗的免疫原性，这些疫苗含有编码gB的融合前H510P突变体(gBpf)、野生型gB(gBwt)、gC的C3b-结合性F327A突变体(gCmut)、gD、可溶性gE(sgE)或gH和gL(gHgL)的mRNA。图14A-14B示出了在第36天收集的血清中针对HSV-1的菌株F(图14A)或HSV-2的菌株MS(图14B)的中和抗体滴度。图14C示出了使用在第36天收集的血清进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的曲线下面积。
图15A-15L示出了从用一组疫苗中的一种疫苗进行疫苗接种的小鼠收集的血清的抗病毒活性，这些疫苗包含编码HSV ICP4、HSV ICP0和HSV ICP4，或gB、gC和gD与任选的一种或多种其他蛋白质的组合的mRNA。图15A示出了从用编码gCmut、gD和gBwt或gBpf的mRNA进行疫苗接种的小鼠收集的血清中针对HSV-1(左侧两条)和HSV-2(右侧两条)的中和抗体滴度。图15B-15C示出了在第36天收集的血清中针对HSV-1的菌株F(图15B)或HSV-2的菌株MS(图15C)的中和抗体滴度。图15D示出了从用编码gBwt、gCmut和gD(碱基)以及sgE和/或gHgL的mRNA进行疫苗接种的小鼠收集的血清中针对HSV-1(左侧四条)和HSV-2(右侧四条)的中和抗体滴度。图15E示出了从用编码HSV gBwt、gCmut和gD(碱基)以及sgE、gHgL和/或ICP4的mRNA进行疫苗接种的小鼠收集的血清中针对HSV-1(左侧五条)和HSV-2(右侧五条)的中和抗体滴度。图15F示出了从用编码HSV gBwt、gCmut和gD(碱基)以及sgE、gHgL、ICP0和/或ICP4的mRNA进行疫苗接种的小鼠收集的血清中针对HSV-1(左侧五条)和HSV-2(右侧五条)的中和抗体滴度。图15G-15H示出了当用豚鼠补体补充在第36天收集的血清至终浓度为2.5％(v/v)时，血清中针对HSV-1的菌株F(图15G)或HSV-2的菌株MS(图15H)的中和抗体滴度。图15I-15J示出了当在中和测定前用可溶性gE进行免疫接种的小鼠中产生的超免疫血清补充在第36天收集的血清时，血清中针对HSV-1的菌株F(图15I)或HSV-2的菌株MS(图15J)的中和抗体滴度。图15K示出了在细胞-细胞扩散测定中针对HSV-1的菌株F的中和滴度。图15L示出了使用在第36天收集的血清进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的曲线下面积。
图16A-16E示出了从用一组疫苗中的一种疫苗进行疫苗接种的小鼠收集的血清中的HSV蛋白特异性抗体滴度，这些疫苗包含编码(a)HSV ICP4、(b)HSV ICP0和HSV ICP4，或(c)gB、gC和gD与任选的一种或多种其他蛋白质的组合的mRNA。图16A示出了血清中抗gBIgG的滴度。图16B示出了血清中抗gC IgG的滴度。图16C示出了血清中抗gD IgG的滴度。图16D示出了血清中抗gHgL IgG的滴度。图16E示出了血清中抗gE和抗gI IgG的滴度。
图17A-17D示出了用一组疫苗中的一种疫苗进行疫苗接种的小鼠中的T细胞应答，这些疫苗包含编码HSV ICP4、HSV ICP0和HSV ICP4，或gB、gC和gD(也称为gD2)与任选的一种或多种其他蛋白质的组合的mRNA。给予小鼠两次疫苗剂量，在第0天和第22天各一次，然后在第36天，即第二次给药后两周进行安乐死，以收集脾用于分析T细胞应答。图17A示出了每组中存活的淋巴细胞的百分比。图17B示出了通过五聚体染色测量的对HSV gB具有特异性的CD8+T细胞的百分比。图17C示出了来自细胞内细胞因子染色(ICS)分析的gD特异性CD4+和CD8+T细胞的细胞因子应答。图17D示出了来自ICS分析的gL特异性CD4+和CD8+T细胞的分析。
图18A-18F示出了从用一组疫苗中的一种疫苗进行疫苗接种的小鼠收集的血清的抗病毒活性，这些疫苗包含不同剂量的编码gB、gC和gD与任选的一种或多种其他蛋白质的组合的mRNA。在第0天和第22天对小鼠施用两剂相同的mRNA疫苗，在第21天(即施用第一剂后三周)和第36天(即施用第二剂后14天)收集血清。图18A-18B示出了来自用含有2μgmRNA/抗原(图18A)或0.4μgmRNA/抗原(图18B)的组合物免疫的小鼠的第36天血清中针对HSV-1F菌株的中和抗体滴度。图18C-18D示出了来自用含有2μgmRNA/抗原(图18C)或0.4μgmRNA/抗原(图18D)的组合物免疫的小鼠的第36天血清中针对HSV-2MS菌株的中和抗体滴度。图18E-18F示出了使用来自用含有2μg mRNA/抗原(图18E)或0.4μg mRNA/抗原(图18F)的组合物免疫的小鼠的第36天血清对感染HSV-1KOS菌株的细胞的ADCC活性。
图19A-19E示出了从用一组疫苗中的一种疫苗进行疫苗接种的小鼠收集的血清中的HSV蛋白特异性抗体滴度，这些疫苗包含不同剂量的编码gB、gC和gD与任选的一种或多种其他蛋白质的组合的mRNA。在第0天和第22天对小鼠施用两剂相同的mRNA疫苗，在第21天(即施用第一剂后三周)和第36天(即施用第二剂后14天)收集血清。图19A示出了血清中抗gB IgG的滴度。图19B示出了血清中抗gC IgG的滴度。图19C示出了血清中抗gD IgG的滴度。图19D示出了血清中抗gE/gI IgG的滴度。图19E示出了血清中抗gHgL IgG的滴度。
图20示出了用一组疫苗中的一种疫苗进行疫苗接种的小鼠中的T细胞应答，这些疫苗包含编码gB、gC和gD与任选的一种或多种其他蛋白质的组合的mRNA。用两剂给定疫苗对小鼠进行免疫，一剂在第0天施用，另一剂在第22天施用，然后在第36天，即第二次给药后两周进行安乐死，以收集脾用于分析T细胞应答。示出了对HSV gB的SSIEFARL(SEQ ID NO:103)表位具有特异性的CD8+T细胞的百分比。
图21A-21G示出了从用一组疫苗中的一种疫苗进行疫苗接种的小鼠收集的血清中的HSV蛋白特异性抗体滴度和抗病毒活性，这些疫苗包含不同剂量的编码gB、gC和gD与任选的一种或多种其他蛋白质的组合的mRNA。在第0天和第22天对小鼠施用两剂相同的mRNA疫苗，在第21天(即施用第一剂后三周)和第36天(即施用第二剂后14天)收集血清。图21A示出了血清中抗gB IgG的滴度。图21B示出了血清中抗gC IgG的滴度。图21C示出了血清中抗gDIgG的滴度。图21D示出了血清中抗gE/gI IgG的滴度。图21E-21F示出了在第36天血清中针对HSV-1F菌株(图21E)和HSV-2MS菌株(图21F)的中和抗体滴度。图21G示出了使用第36天血清对感染HSV-1KOS菌株的细胞的ADCC活性。
图22A-22D示出了从用一组疫苗中的一种疫苗进行疫苗接种的小鼠收集的血清的抗病毒活性，这些疫苗包含编码HSV-2gC、gD和变体gB的mRNA。图22A-22B示出了在第36天收集的血清中针对HSV-1的菌株F(图22A)或HSV-2的菌株MS(图22B)的中和抗体滴度。图22C示出了使用在第36天收集的血清进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的曲线下面积。图22D示出了在第36天从在后续实验中用编码经修饰的HSV-2gB的mRNA免疫的小鼠收集的血清中针对HSV-2的MS菌株的中和抗体滴度。
图23A-23B示出了从用一组疫苗中的一种疫苗进行疫苗接种的小鼠收集的血清的抗病毒活性，这些疫苗包含编码HSV-2gB、gC、gD、sgE、gL的变体以及任选的gH的mRNA。图23A示出了针对HSV-2的菌株MS的中和抗体滴度。图23B示出了使用在第36天收集的血清进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的曲线下面积。
图24A-24C示出了从用一组疫苗中的一种疫苗(含有编码HSV-2gB、gC、gD或sgE的个体mRNA)或组合物(含有各种比率的编码gB、gC和gD以及任选的sgE的mRNA)免疫的小鼠收集的血清的抗病毒活性。图24A示出了针对HSV-2的菌株MS的中和抗体滴度。图24B示出了使用HSV-1KOS菌株和在第36天收集的血清进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的曲线下面积。图24C示出了在第36天从在后续实验中用不同比率的编码HSV-2gB的mRNA免疫的小鼠收集的血清中的中和抗体滴度。
图25A-25C示出了用一组疫苗中的一种疫苗进行疫苗接种的小鼠中的抗体和T细胞应答，这些疫苗包含编码HSV-2gB、gC、gD、ICP0和ICP4的mRNA。图25A示出了在第36天收集的血清中针对HSV-2的MS菌株的中和抗体滴度。图25B示出了小鼠中的CD4+T细胞应答。图25C示出了血清阻断HSV-2gC与补体蛋白C3b之间相互作用的程度。
图26A-26C示出了用包含编码HSV-2gB、gC、gD、ICP0和ICP4的mRNA的组合物进行疫苗接种的小鼠中的抗体和T细胞应答。图26A示出了针对HSV-2的菌株MS的中和抗体滴度。图26B示出了使用HSV-1KOS菌株和在第36天收集的血清进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的曲线下面积。图26C示出了第2组小鼠中的CD4+和CD8+T细胞应答。
具体实施方式
本文提供了信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其基于以下知识构建：经修饰的mRNA可以安全地指导身体的细胞机制产生几乎任何目标蛋白质，从天然蛋白质到抗体和可在细胞内外具有治疗活性的其他全新的蛋白质构建体。本公开的RNA(例如，mRNA)疫苗可用于诱导对单纯疱疹病毒(HSV)的平衡免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫两者，而不会有例如可能发生插入诱变的风险。虽然不希望受理论束缚，但相信呈mRNA多核苷酸形式的RNA疫苗被更好地设计以在翻译时产生适当蛋白质构象，因为这些RNA疫苗选用天然细胞机制。与离体制造并且可触发非所需细胞应答的传统疫苗不同，这些RNA疫苗以更天然方式呈递至细胞系统。
单纯疱疹病毒蛋白
本公开的一些方面提供了包含RNA(例如，mRNA)的疫苗，该RNA包含编码单纯疱疹病毒(HSV)蛋白的开放阅读框。HSV是疱疹病毒科中的双链线性DNA病毒。单纯疱疹病毒家族的两个成员感染人类-被称为HSV-1和HSV-2。HSV感染的症状包括在口腔、嘴唇和/或生殖器的皮肤或粘膜中形成水疱。HSV是一种神经侵入性病毒，其可在受感染个体中引起病毒再活化的散发性反复发作。HSV通过在病毒活化期间与受感染的皮肤区域接触而传播。HSV最常见的是经由口腔或生殖器粘膜感染，并在复层鳞状上皮中复制，然后被摄取到复层鳞状上皮内的分支化无髓鞘感觉神经纤维中。病毒随后被转运到背根神经节中神经元的细胞体中，在那里病毒持续存在于潜伏性细胞感染中(Cunningham AL等人.J Infect Dis.(2006)194(增刊1):S11-S18)。
术语“天然存在的”和“野生型”在本文中可互换使用。天然存在的HSV蛋白是自然界中存在的单纯疱疹病毒(例如，HSV-1或HSV-2)的未经修饰的HSV蛋白，即天然存在的分离物。如本领域已知的，天然存在的蛋白质并非是基因工程化的。天然存在的蛋白质未经基因(或其他方式)修饰，以替代、去除或添加任何氨基酸。在一些实施方案中，HSV的天然存在的分离物是HSV-2菌株HG52(GenBank登录号Z86099.2)。HSV-2菌株HG52的gB、gC、gC、ICP0和ICP4的氨基酸序列分别在UniProt登录号P08666、Q89730、Q69467、P28284和P90493中提供。
在一些实施方案中，野生型HSV gB包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV gC包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV gD包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV gB包含SEQ ID:112的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV gC包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV gD包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSVICP0包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV ICP4包含SEQ IDNO:120的氨基酸序列。野生型核酸和/或蛋白质序列可例如通过对一种或多种病毒分离物的基因组或某些基因，和/或由一种或多种病毒分离物的基因组或某些基因表达的蛋白质进行测序而获得。本公开的一些方面提供了包含RNA(例如，mRNA)的疫苗，该RNA具有编码多种HSV抗原，包括HSV糖蛋白B(gB)、糖蛋白C(gC)和糖蛋白D(gD)的开放阅读框。在一些实施方案中，疫苗包含含有编码HSV糖蛋白B(gB)的开放阅读框的第一RNA(例如，mRNA)、含有编码HSV糖蛋白C(gC)的开放阅读框的第二RNA(例如，mRNA)和含有编码HSV糖蛋白D(gD)的开放阅读框的第三RNA(例如，mRNA)。含有RNA的细胞对gB、gC和gD的表达引发gB-、gC-和gD-特异性抗体和T细胞。由于HSV糖蛋白C、B和D是病毒进入所必需的，因此此类三价疫苗可用于生成预防或限制HSV感染的有效中和抗体应答。另外，可以相对于野生型HSV抗原修饰由疫苗的RNA编码的抗原，以改善由免疫接种(例如，通过将HSV gB稳定在融合前状态)引发的抗体应答或防止HSV蛋白表达的有害影响(例如，补体螯合作用或结合的补体掩蔽表位)。
糖蛋白B(gB)是一种参与单纯疱疹病毒(HSV)的病毒细胞活性的病毒糖蛋白，并且是HSV包膜与细胞膜融合所必需的。它是所有表面糖蛋白中最高度保守的，并且主要充当融合蛋白，从而构成核心融合机制。gB，一种III类膜融合糖蛋白，是具有五个结构域的1型跨膜蛋白三聚体。结构域I包含两个内部融合环，并被认为在病毒-细胞融合期间插入到细胞膜中。结构域II似乎在融合过程期间与gH/gL相互作用，结构域III含有延长的α螺旋，并且结构域IV与细胞受体相互作用。在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码HSV-1gB。在其他实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码HSV-2gB。在一些实施方案中，野生型HSV-1gB包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV-2gB包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码具有截短的C末端的HSV gB。具有截短的C末端的HSV gB是指缺少存在于野生型HSV gB的C末端的一个或多个氨基酸的HSVgB。在一些实施方案中，所编码的HSV gB包含截短的胞质尾区。在其他实施方案中，HSV gB不包含胞质尾区。例如，具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列(登录号P06763)的野生型HSV-2gB包含112个氨基酸长的胞质尾区(SEQ ID NO:112的氨基酸793-904)，并且因此相对于SEQ ID NO:112具有截短的C末端的经修饰的HSV-2gB包含(i)具有少于112个氨基酸的胞质尾区；或(ii)无胞质尾区。类似地，具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列(登录号P10211)的野生型HSV-1gB包含109个氨基酸长的胞质尾区(SEQ ID NO:111的氨基酸796-904)，并且因此相对于SEQ ID NO:111具有截短的C末端的经修饰的HSV-2gB包含(i)具有少于109个氨基酸的胞质尾区；或(ii)无胞质尾区。
在一些实施方案中，HSV gB包含含有不超过105个、不超过100个、不超过90个、不超过80个、不超过70个、不超过60个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过15个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB包含长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB包含长度为10-20、20-30、30-40或40-50个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB包含含有不超过20个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB包含含有不超过10个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB包含含有不超过8个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB包含含有不超过6个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB包含含有不超过5个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB包含含有不超过4个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB包含含有不超过3个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gB包含含有不超过2个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSVgB包含含有不超过1个氨基酸的胞质尾区。
可以通过从胞质尾区的C末端缺失一个或多个氨基酸(例如，SEQ ID NO:112的氨基酸796-904或SEQ ID NO:111的氨基酸793-904)来引入截短。在一些实施方案中，由本公开的疫苗的mRNA编码的HSV gB缺少存在于野生型序列的C末端的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所编码的HSV gB缺少存在于野生型gB氨基酸序列的C末端的1-112、10-112、20-112、30-112、40-112、50-112、60-112、70-112、80-112、90-112、100-112、1-109、10-109、20-109、30-109、40-109、50-109、60-109、70-109、80-109、90-109、100-109、1-103、10-103、20-103、30-103、40-103、50-103、60-103、70-103、80-103、90-103或100-103个氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的mRNA编码不包含胞质尾区的HSV gB。在一些实施方案中，HSV gB包含细胞外结构域和跨膜结构域，并且不包含胞质尾区。
糖蛋白C(gC)是一种参与将病毒附着至宿主细胞的糖蛋白；例如，其充当介导HSV-2病毒与宿主粘附受体(即细胞表面硫酸乙酰肝素和/或硫酸软骨素)结合的附着蛋白。gC通过抑制宿主补体级联活化而在宿主免疫逃避(即病毒免疫逃避)中起作用。特别地，gC与宿主补体成分C3b结合和/或相互作用；然后该相互作用通过使补体级联失调来抑制宿主免疫应答(例如，结合宿主补体C3b以阻断病毒的中和)。
在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码HSV-1gC。在其他实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码HSV-2gC。在一些实施方案中，野生型HSV-1gC包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV-2gC包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码具有截短的C末端的HSV gC。具有截短的C末端的HSV gC是指缺少存在于野生型HSV gC的C末端的一个或多个氨基酸的HSVgC。在一些实施方案中，所编码的HSV gC包含截短的胞质尾区。在其他实施方案中，HSV gC不包含胞质尾区。例如，具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列(登录号Q89730)的野生型HSV-2gC包含12个氨基酸长的胞质尾区(SEQ ID NO:114的氨基酸469-480)，并且因此相对于SEQID NO:114具有截短的C末端的经修饰的HSV-2gC包含(i)具有少于12个氨基酸的胞质尾区；或(ii)无胞质尾区。类似地，具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列(登录号Q8UZ70)的野生型HSV-1gC包含11个氨基酸长的胞质尾区(SEQ ID NO:113的氨基酸501-511)，并且因此相对于SEQ ID NO:113具有截短的C末端的经修饰的HSV-2gC包含(i)具有少于11个氨基酸的胞质尾区；或(ii)无胞质尾区。
在一些实施方案中，HSV gC包含含有不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gC包含长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gC包含长度为1-2、3-4、4-5、6-7、8-9或9-10个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gC包含含有不超过10个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gC包含含有不超过9个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gC包含含有不超过8个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gC包含含有不超过7个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gC包含含有不超过6个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSVgC包含含有不超过5个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gC包含含有不超过4个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gC包含含有不超过3个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gC包含含有不超过2个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSVgC包含含有不超过1个氨基酸的胞质尾区。
可以通过在胞质尾区中的任何位置缺失一个或多个氨基酸(例如，SEQ ID NO:114的氨基酸469-480或SEQ ID NO:113的氨基酸501-511)来引入截短。在一些实施方案中，由本公开的疫苗的mRNA编码的HSV gC缺少存在于野生型序列的C末端的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所编码的HSV gC缺少存在于野生型gC氨基酸序列的C末端的1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2个氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的mRNA编码不包含胞质尾区的HSV gC。在一些实施方案中，HSV gC包含细胞外结构域和跨膜结构域，并且不包含胞质尾区。
在一些实施方案中，由本公开的疫苗的mRNA编码的HSV gC包含对应于野生型HSVgC的F327的残基处的取代。在一些实施方案中，HSV gC包含对应于野生型HSV gC的位置处的丙氨酸(A)。在一些实施方案中，HSV gC包含对应于野生型HSV gC的氨基酸327的残基处的脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸是本领域已知的，并且包括甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸。在一些实施方案中，HSV gC包含对应于野生型HSV gC的氨基酸327的残基处的F327A取代。在一些实施方案中，HSV gC包含对应于野生型HSV gC的氨基酸327的残基处的氨基酸，该氨基酸并非芳香族氨基酸。芳香族氨基酸是本领域已知的，并且包括苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。在一些实施方案中，与野生型HSV gC相比，在对应于野生型HSV gC的氨基酸327的残基处包含非苯丙氨酸(F)的氨基酸的HSV gC以更低的亲和力结合C3b。在一些实施方案中，与野生型HSV gC相比，在对应于野生型HSV gC的氨基酸327的残基处包含非F、Y或W的氨基酸的HSV gC以更低的亲和力结合C3b。
糖蛋白D(gD)是一种包膜糖蛋白，其与细胞表面受体结合和/或经由脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白和/或疱疹病毒进入介质参与细胞附着，从而促进病毒进入。gD与潜在的宿主细胞进入受体(肿瘤坏死因子受体超家族，成员14(TNFRSF14)/疱疹病毒进入介质(HVEM)、脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白1(PVRL1)和/或脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白2(PVRL2)结合，并被提议通过募集由例如gB和gH/gL组成的融合机制来触发与宿主膜的融合。gD与宿主细胞受体TNFRSF14和/或PVRL1和/或PVRL2相互作用并且(1)与gB相互作用(经由大量结构域)；一种可在不存在相关HSV糖蛋白例如gH和/或gL的情况下发生的相互作用；并且(2)gD与gH/gL异二聚体相互作用(经由大量结构域)，该相互作用可以在不存在gB的情况下发生。因此，gD与gB-gH/gL-gD复合物缔合。gD也与UL11间层蛋白相互作用(经由C末端)。
在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码HSV-1gD。在其他实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码HSV-2gD。在一些实施方案中，野生型HSV-1gD包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV-2gD包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码具有截短的C末端的HSV gD。具有截短的C末端的HSV gD是指缺少存在于野生型HSV gD的C末端的一个或多个氨基酸的HSVgD。在一些实施方案中，所编码的HSV gD包含截短的胞质尾区。在其他实施方案中，HSV gD不包含胞质尾区。例如，具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列(登录号P03172)的野生型HSV-2gD包含30个氨基酸长的胞质尾区(SEQ ID NO:116的氨基酸364-393)，并且因此相对于SEQID NO:116具有截短的C末端的经修饰的HSV-2gD包含(i)具有少于30个氨基酸的胞质尾区；或(ii)无胞质尾区，而具有野生型胞质尾区的HSV-2gD包含与SEQ ID NO:116的氨基酸364-393相对应的全部30个氨基酸。类似地，具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列(登录号Q69091)的野生型HSV-1gD包含33个氨基酸长的胞质尾区(SEQ ID NO:115的氨基酸362-394)，并且因此相对于SEQ ID NO:115具有截短的C末端的经修饰的HSV-2gD包含(i)具有少于33个氨基酸的胞质尾区；或(ii)无胞质尾区，而具有野生型胞质尾区的HSV-2gD包含与SEQ ID NO:115的氨基酸362-394相对应的全部33个氨基酸。
在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过35个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过15个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含长度为1-2、3-4、4-5、6-7、8-9、9-10、10-15、15-20、20-25、25-30或30-35个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过10个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过9个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过8个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过7个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过6个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过5个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过4个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过3个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过2个氨基酸的胞质尾区。在一些实施方案中，HSV gD包含含有不超过1个氨基酸的胞质尾区。
可以通过在胞质尾区中的任何位置缺失一个或多个氨基酸(例如，SEQ ID 116的氨基酸469-480或SEQ ID NO:115的氨基酸501-511)来引入截短。在一些实施方案中，由本公开的疫苗的mRNA编码的HSV gD缺少存在于野生型序列的C末端的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所编码的HSV gD缺少存在于野生型gD氨基酸序列的C末端的1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2个氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的mRNA编码不包含胞质尾区的HSV gD。在一些实施方案中，HSV gD包含细胞外结构域和跨膜结构域，并且不包含胞质尾区。
在一些实施方案中，本文提供的疫苗还包含具有编码HSV胞内蛋白0(ICP0)的开放阅读框的RNA(例如，mRNA)。在一些实施方案中，本文提供的疫苗还包含具有编码HSV胞内蛋白4(ICP4)的开放阅读框的RNA(例如，mRNA)。HSV ICP0和/或ICP4的细胞内表达分别促进ICP0-和ICP4-特异性CD8+T细胞的生成，这清除其中HSV活跃复制并表达ICP0和ICP4的细胞。在一些实施方案中，HSV ICP0是相对于野生型HSV ICP0氨基酸序列包含一个或多个内部缺失的经修饰的ICP0。此类缺失可减小ICP0的大小，从而增加可由给定量的氨基酸产生的ICP0蛋白的数量。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含的氨基酸序列的长度不超过野生型HSV ICP0氨基酸序列的75％、70％或65％。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含不超过600、550、500或487个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含约487个氨基酸。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含的氨基酸序列的长度不超过野生型HSV ICP4氨基酸序列的75％、70％或65％。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含不超过800、750、700或687个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含约687个氨基酸。
在经修饰的HSV ICP0和/或ICP4中，相对于野生型HSV ICP0或ICP4氨基酸序列，HSV ICP0和/或ICP4的含有很少或不含T细胞表位的一个或多个区域的缺失也可增加经修饰的HSV ICP0或ICP4中的表位密度，从而增强由经修饰的HSV ICP0或ICP4引发的CD8+T细胞应答。缺失也可去除ICP0或ICP4的全部或部分结构域，以增强经修饰的HSV ICP0或ICP4的免疫原性和/或安全性。例如，经修饰的HSV ICP0或ICP4可以包含核定位信号的缺失，从而促进经修饰的HSV ICP0或ICP4保留在细胞质中，在那里它可以更容易地被蛋白酶体加工成表位，以呈递到CD8+T细胞。作为另一个实例，经修饰的HSV ICP0可以包含USP7结合结构域中的缺失，这抑制Toll样受体介导的信号传导并因此阻碍先天性免疫应答。参见Daubeuf等人,Blood.2009 113(114):3264-3275。此外，经修饰的HSV ICP0可以包含RING指结构域中的缺失，这抑制IRF3-和IRF7-介导的干扰素刺激基因的活化。参见Lin等人,JVirol.2004.78(4):1674-1684。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含DNA结合结构域中的缺失。
在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码HSV-1ICP0。在其他实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码HSV-2ICP0。在一些实施方案中，野生型HSV-1ICP0包含SEQ IDNO:117的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV-2ICP0包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码具有核定位信号、RING指结构域或USP7结合结构域中的一者或多者中的截短的HSV ICP0。例如，具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列(登录号P28284)的HSV-2ICP0包含氨基酸468-549处的核定位信号、氨基酸124-176处的RING指结构域以及氨基酸660-665处的USP7结合结构域。参见Halford等人,PLoSOne.2010.5(8):e12251；和Pfoh等人,PLoS Pathog.2015.11(6):e1004950。因此，在SEQ IDNO:118中，核定位信号对应于氨基酸468-549，并且因此相对于SEQ ID NO:118具有核定位信号中的截短的经修饰的ICP0缺少与SEQ ID NO:118的氨基酸468-549相对应的一个或多个氨基酸。在SEQ ID NO:118中，RING指结构域对应于氨基酸124-176，并且因此相对于SEQID NO:118具有RING指结构域中的截短的经修饰的ICP0缺少与SEQ ID NO:118的氨基酸124-176相对应的一个或多个氨基酸。在SEQ ID NO:118中，USP7结合结构域对应于氨基酸660-665，并且因此相对于SEQ ID NO:118具有USP7结合结构域中的截短的经修饰的ICP0缺少与SEQ ID NO:118的氨基酸660-665相对应的一个或多个氨基酸。
通过截短(例如，USP7-结合和/或RING指结构域，和/或核定位信号)缩短或去除的ICP0的一些部分位于野生型HSV ICP0的内部，并且因此这些结构域中的截短是内部截短。包含这些结构域或信号中的一者或多者中的截短的HSV ICP0在内部被截短，使得其缺少存在于野生型ICP0序列的结构域中的一个或多个氨基酸，但包含位于野生型ICP0序列中缺失的氨基酸侧翼的一个或多个氨基酸。另外，由本公开的疫苗的mRNA编码的HSV ICP0可包含截短的C末端和/或截短的N末端。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0缺少包含存在于野生型ICP0氨基酸序列的C末端的1-200、1-190、1-180、1-170、1-160、1-150、1-140、1-130、1-120、1-110、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-10或1-5、10-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、110-200、120-200、130-200、140-200、150-200、160-200、170-200、180-200、190-200、10-30、30-50、50-75、75-100、100-125、125-150、150-175或175-200个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0缺少包含存在于野生型ICP0氨基酸序列的N末端的1-200、1-190、1-180、1-170、1-160、1-150、1-140、1-130、1-120、1-110、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-10或1-5、10-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、110-200、120-200、130-200、140-200、150-200、160-200、170-200、180-200、190-200、10-30、30-50、50-75、75-100、100-125、125-150、150-175或175-200个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0缺少包含存在于野生型ICP0氨基酸序列的N末端氨基酸与C末端氨基酸之间的1-200、1-190、1-180、1-170、1-160、1-150、1-140、1-130、1-120、1-110、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-10或1-5、10-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200、110-200、120-200、130-200、140-200、150-200、160-200、170-200、180-200、190-200、10-30、30-50、50-75、75-100、100-125、125-150、150-175或175-200个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0缺少包含存在于野生型HSV ICP0的N末端的167个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0缺少包含存在于野生型HSV ICP0的C末端的12个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的HSVICP0缺少包含存在于野生型HSV ICP0的N末端与C末端之间的170个氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含截短的核定位信号。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含截短的核定位信号，该截短的核定位信号包含野生型HSV ICP0的核定位信号长度的不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％或不超过5％。在一些实施方案中，经修饰的HSVICP0包含截短的核定位信号，该截短的核定位信号包含不超过75个、不超过70个、不超过60个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含截短的核定位信号，该截短的核定位信号包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，截短的核定位信号包含1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸。在一些实施方案中，截短的核定位信号包含1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0不包含核定位信号。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0在编码HSV ICP0的mRNA翻译后存在于细胞质中。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0在编码HSV ICP0的mRNA翻译后不定位到细胞核。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含截短的RING指结构域。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含RING指结构域，该RING指结构域包含野生型HSV ICP0的RING指结构域长度的不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％或不超过5％。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含截短的RING指结构域，该截短的RING指结构域包含不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过15个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含截短的RING指结构域，该截短的RING指结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，截短的RING指结构域包含1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸。在一些实施方案中，截短的RING指结构域包含1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0相对于野生型HSV ICP0包含截短的USP7结合结构域。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含USP7结合结构域，该USP7结合结构域包含野生型HSV ICP0的USP7结合结构域长度的不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％或不超过5％。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含截短的USP7结合结构域，该截短的USP7结合结构域包含不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0包含截短的USP7结合结构域，该截短的USP7结合结构域包含1、2、3、4或5个氨基酸。在一些实施方案中，截短的USP7结合结构域包含1-5个氨基酸。在一些实施方案中，截短的USP7结合结构域包含1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0不包含RING指结构域。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0不包含USP7结合结构域。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP0不结合细胞中的USP7。
在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码HSV-1ICP4。在其他实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码HSV-2ICP4。在一些实施方案中，野生型HSV-1ICP4包含SEQ IDNO:119的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型HSV-2ICP4包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗的mRNA编码具有核定位信号、RING指结构域或DNA结合结构域中的一者或多者中的截短的HSV ICP4。具有给定结构域中的截短的HSVICP4是指缺少存在于野生型HSV ICP4的该结构域中的一个或多个氨基酸的HSV ICP4。例如，具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列(登录号P90493)的HSV-2ICP4包含氨基酸751-834处的核定位信号以及氨基酸319-547处的DNA结合结构域。参见，例如，Mullen等人,JVirol.1994.68(5):3250-3266。因此，在SEQ ID NO:120中，核定位信号对应于氨基酸751-834，并且因此相对于SEQ ID NO:120具有核定位信号中的截短的经修饰的ICP4缺少与SEQID NO:120的氨基酸751-834相对应的一个或多个氨基酸。在SEQ ID NO:120中，DNA结合结构域对应于氨基酸319-547，并且因此相对于SEQ ID NO:120具有DNA结合结构域中的截短的经修饰的ICP4缺少与SEQ ID NO:120的氨基酸319-547相对应的一个或多个氨基酸。
通过截短(例如，DNA结合结构域和/或核定位信号)缩短或去除的ICP4的一些部分位于野生型HSV ICP4的内部，并且因此这些结构域中的截短是内部截短。包含这些结构域或信号中的一者或多者中的截短的HSV ICP4在内部被截短，使得其缺少存在于野生型ICP4序列的结构域中的一个或多个氨基酸，但包含位于野生型ICP4序列中缺失的氨基酸侧翼的一个或多个氨基酸。另外，由本公开的疫苗的mRNA编码的HSV ICP4可包含截短的C末端和/或截短的N末端。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4缺少包含存在于野生型ICP4氨基酸序列的C末端的1-400、1-380、1-360、1-340、1-320、1-300、1-280、1-260、1-240、1-220、1-200、1-190、1-180、1-170、1-160、1-150、1-140、1-130、1-120、1-110、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-10或1-5、10-400、20-400、30-400、40-400、50-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400、110-400、120-400、130-400、140-400、150-400、160-400、170-400、180-400、190-400、200-400、220-400、240-400、260-400、280-400、300-400、320-400、340-400、360-400、380-400、10-30、30-50、50-75、75-100、100-125、125-150、150-175、175-200、200-240、240-280、280-320、320-360或360-400个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4缺少包含存在于野生型ICP4氨基酸序列的N末端的1-400、1-380、1-360、1-340、1-320、1-300、1-280、1-260、1-240、1-220、1-200、1-190、1-180、1-170、1-160、1-150、1-140、1-130、1-120、1-110、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-10或1-5、10-400、20-400、30-400、40-400、50-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400、110-400、120-400、130-400、140-400、150-400、160-400、170-400、180-400、190-400、200-400、220-400、240-400、260-400、280-400、300-400、320-400、340-400、360-400、380-400、10-30、30-50、50-75、75-100、100-125、125-150、150-175、175-200、200-240、240-280、280-320、320-360或360-400个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4缺少包含存在于野生型ICP4氨基酸序列的N末端氨基酸与C末端氨基酸之间的1-400、1-380、1-360、1-340、1-320、1-300、1-280、1-260、1-240、1-220、1-200、1-190、1-180、1-170、1-160、1-150、1-140、1-130、1-120、1-110、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-10或1-5、10-400、20-400、30-400、40-400、50-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400、110-400、120-400、130-400、140-400、150-400、160-400、170-400、180-400、190-400、200-400、220-400、240-400、260-400、280-400、300-400、320-400、340-400、360-400、380-400、10-30、30-50、50-75、75-100、100-125、125-150、150-175、175-200、200-240、240-280、280-320、320-360或360-400个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4缺少包含存在于野生型HSV ICP4的N末端的382个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4缺少包含存在于野生型HSV ICP4的C末端的75个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4缺少包含160-200个氨基酸的氨基酸序列、和包含1-10个氨基酸的氨基酸序列、和包含11-30个氨基酸的氨基酸序列，这些氨基酸中的每一者存在于野生型HSV ICP4的N末端与C末端之间。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4缺少包含181个氨基酸的氨基酸序列、和包含5个氨基酸的氨基酸序列、和包含16个氨基酸的氨基酸序列，这些氨基酸中的每一者存在于野生型HSV ICP4的N末端与C末端之间。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4缺少与野生型ICP4的氨基酸1-382、567-571、614-629、741-920和1244-1318相对应的序列。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含对应于野生型HSV ICP4的氨基酸1060-1070的残基处的一个或多个取代。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含对应于野生型HSV ICP4的氨基酸1060-1070的残基处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个取代。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含对应于野生型HSV ICP4的氨基酸1064的残基处的取代。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含对应于野生型HSV ICP4的氨基酸1068的残基处的取代。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含对应于野生型HSV ICP4的氨基酸1069的残基处的取代。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含对应于氨基酸1064、1068和1069的残基处的取代。在一些实施方案中，一个或多个取代是用脂肪族氨基酸取代。在一些实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个取代是用脂肪族氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个取代是丙氨酸取代。在一些实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个取代是丙氨酸取代。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含D1064A取代。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含D1068A取代。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含G1069A取代。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含截短的核定位信号。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含截短的核定位信号。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含截短的核定位信号，该截短的核定位信号包含野生型HSV ICP4的核定位信号长度的不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％或不超过5％。在一些实施方案中，经修饰的HSVICP4包含截短的核定位信号，该截短的核定位信号包含不超过75个、不超过70个、不超过60个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含截短的核定位信号，该截短的核定位信号包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，截短的核定位信号包含1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸。在一些实施方案中，截短的核定位信号包含1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4不包含核定位信号。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4在编码HSV ICP4的mRNA翻译后存在于细胞质中。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4在编码HSV ICP4的mRNA翻译后不定位到细胞核。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4不包含核定位信号。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4在编码HSV ICP4的mRNA翻译后存在于细胞质中。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4在编码HSV ICP4的mRNA翻译后不定位到细胞核。
在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含截短的DNA结合结构域。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4相对于野生型HSV ICP4包含截短的DNA结合结构域。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含DNA结合结构域，该DNA结合结构域包含野生型HSV ICP4的DNA结合结构域长度的不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％或不超过5％。在一些实施方案中，经修饰的HSVICP4包含截短的DNA结合结构域，该截短的DNA结合结构域包含不超过200个、不超过180个、不超过160个、不超过140个、不超过120个、不超过100个、不超过90个、不超过80个、不超过70个、不超过60个、不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过15个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4包含截短的DNA结合结构域，该截短的DNA结合结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，截短的DNA结合结构域包含1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸。在一些实施方案中，截短的DNA结合结构域包含1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4不包含DNA结合结构域。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4不包含DNA结合结构域。在一些实施方案中，经修饰的HSV ICP4不结合细胞中的DNA。
在一些实施方案中，经修饰的ICP0或ICP4包含接头。接头可以是本文在标题为“接头和可切割肽”的部分中描述的2A或GS接头。可替代地，接头可以是本领域已知的另一种接头。经修饰的ICP0或ICP4的接头可以代替相对于ICP0或ICP4的野生型序列的内部截短而存在(即，经修饰的ICP0或ICP4的氨基酸序列包括相对于野生型序列缺失一个或多个氨基酸，和在先前被缺失的氨基酸占据的位置处插入接头)。在一些实施方案中，接头包含2-10个甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头包含2-20、2-15、2-10、2-5、2-3、3-5、5-7、7-10、10-15、15-20、3-10、4-8或5-6个甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头包含5-6个甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列GGGSGGG(SEQ ID NO:78)。在一些实施方案中，经修饰的ICP0或ICP4包含代替来自ICP0或ICP4的野生型序列的一个或多个内部截短的接头。在一些实施方案中，经修饰的ICP0或ICP4包含分别代替相对于野生型ICP0或ICP4的每个内部截短的接头。连接经修饰的ICP0或ICP4的部分的接头可以包含相同的氨基酸序列(例如，每个部分通过具有氨基酸序列GGS的接头连接)。在其他实施方案中，连接经修饰的ICP0或ICP4的不同部分对的接头可以包含不同的氨基酸序列(例如，第一和第二部分通过具有氨基酸序列GGG的接头连接，并且第二和第三部分通过具有氨基酸序列GGS的接头连接)。连接不同部分对的接头可以是相同长度或不同长度。
本公开的疫苗可用于生成HSV特异性抗体和T细胞，这些抗体和T细胞除了可预防尚未暴露于HSV的受试者感染HSV外，还可用于预防潜伏性HSV再活化或缩短先前感染HSV的受试者中HSV爆发的持续时间。
在一些实施方案中，本文提供的疫苗还包含具有编码HSV糖蛋白E(gE)的开放阅读框的RNA(例如，mRNA)。对HSV gE具有特异性的抗体阻止HSV病毒体螯合其他循环抗体，从而允许中和HSV特异性抗体，以便更有效地中和HSV颗粒。
单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)的基因组含有约85个开放阅读框，使得HSV可以生成至少85种独特的蛋白质。这些基因编码4大类蛋白质：(1)与HSV的最外层外部脂双层(包膜)缔合的那些蛋白质；(2)内部蛋白质包衣(衣壳)；(3)将包膜与衣壳包衣连接的中间复合物(间层)；以及(4)负责复制和感染的蛋白质。
包膜蛋白的实例包括UL1(gL)、UL10(gM)、UL20、UL22、UL27(gB)、UL43、UL44(gC)、UL45、UL49A、UL53(gK)、US4(gG)、US5(gJ)、US6(gD)、US7(gI)、US8(gE)和US10。衣壳蛋白的实例包括UL6、UL18、UL19、UL35和UL38。间层蛋白包括UL11、UL13、UL21、UL36、UL37、UL41、UL45、UL46、UL47、UL48、UL49、US9和US10。其他HSV蛋白包括UL2、UL3、UL4、UL5、UL7、UL8、UL9、UL12、UL14、UL15、UL16、UL17、UL23、UL24、UL25、UL26、UL26.5、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL39、UL40、UL42、UL50、UL51、UL52、UL54、UL55、UL56、US1、US2、US3、US81、US11、US12、ICP0和ICP4。
由于包膜(HSV颗粒的最外部部分)是最先与靶细胞接触的部分，因此本公开涵盖与包膜缔合的抗原性多肽作为免疫原性剂。简而言之，表面和膜蛋白—糖蛋白D(gD)、糖蛋白B(gB)、糖蛋白C(gC)、糖蛋白H(gH)、糖蛋白L(gL)—可用作HSV疫苗抗原。
在上皮细胞中，异源二聚体糖蛋白E/糖蛋白I(gE/gI)是通过将新生病毒体分选到细胞连接处而使病毒在细胞间扩散所必需的。一旦病毒到达细胞连接处，病毒颗粒就可以通过与在这些连接处积累的细胞受体的相互作用极快地扩散到邻近的细胞。与此类似，它涉及极化细胞中的基底外侧扩散。在神经元细胞中，gE/gI对于感染在整个宿主神经系统中的顺行扩散至关重要。与US9一起，异二聚体gE/gI参与病毒结构组分向轴突末梢的分选和转运。异源二聚体gE/gI充当宿主IgG的Fc部分的受体。gE/gI与IgG的解离在酸性pH下发生，因此可能参与抗HSV抗体的双极桥接，随后是细胞内胞吞作用和降解，从而干扰宿主IgG介导的免疫应答。gE/gI(经由C末端)与VP22间层蛋白相互作用；这种相互作用对于将VP22募集到高尔基体并将其包装成病毒体是必需的。
在一些实施方案中，本公开的HSV疫苗包含一种或多种编码HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白B、C和D的RNA(例如，mRNA)。在一些实施方案中，HSV疫苗还包含一种或多种编码HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白E和胞内蛋白0(ICP0)的RNA。
在一些实施方案中，HSV疫苗包含编码与HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白B具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HSV(HSV-1或HSV-2)蛋白的RNA(例如，mRNA)，并且具有HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白B活性。
在一些实施方案中，HSV疫苗包含编码与HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白C具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HSV(HSV-1或HSV-2)蛋白的RNA(例如，mRNA)，并且具有HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白C活性。
在一些实施方案中，HSV疫苗包含编码与HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白D具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HSV(HSV-1或HSV-2)蛋白的RNA(例如，mRNA)，并且具有HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白D活性。
在一些实施方案中，HSV疫苗包含编码与HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白E具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HSV(HSV-1或HSV-2)蛋白的RNA(例如，mRNA)，并且具有HSV(HSV-1或HSV-2)糖蛋白E活性。
在一些实施方案中，HSV疫苗包含编码与HSV(HSV-1或HSV-2)胞内蛋白0具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的HSV(HSV-1或HSV-2)蛋白的RNA(例如，mRNA)，并且具有HSV(HSV-1或HSV-2)胞内蛋白0活性。
本公开的HSV蛋白的非限制性实例提供于表2中。
本文提供的HSV RNA(例如，mRNA)疫苗可用于诱导平衡的免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫两者，而没有与DNA疫苗接种相关的许多风险。
本公开的RNA(例如，mRNA)编码目标HSV蛋白，旨在产生针对HSV感染的免疫应答。因此，本公开的HSV蛋白是抗原性的，即它们是抗原。抗原性是作为对给定物质(诸如本公开的HSV蛋白)的免疫应答的结果而生成的抗体特异性识别的能力。因此，抗原是能够诱导免疫应答(例如，使免疫系统产生针对抗原的抗体)的蛋白质。在一些实施方案中，抗原是免疫原。免疫原性是指物质诱导细胞和体液免疫应答的能力。本公开的组合物本身不包含抗原，而是包含具有编码蛋白质抗原(本文简称为“HSV蛋白”)的开放阅读框的RNA(例如，mRNA)，该蛋白质抗原一旦递送到受试者就由受试者体内的细胞表达。RNA(例如，mRNA)的递送是通过以下方式实现的：将RNA配制在适当的载体或递送媒介物(例如，脂质纳米颗粒)中，使得在向细胞、组织或受试者施用时，RNA被细胞摄取，这些细胞进而表达由RNA编码的蛋白质。
应理解，术语“蛋白质”涵盖肽，并且术语“抗原”涵盖抗原性片段。
本公开的疫苗提供优于传统的基于蛋白质的疫苗接种方法的独特优势，在传统的基于蛋白质的疫苗接种方法中蛋白质抗原是在体外纯化或生产的，例如重组蛋白质生产技术。本公开的疫苗包含编码期望的HSV蛋白抗原的RNA(例如，mRNA)，当将这些蛋白质抗原引入体内时，即体内施用于哺乳动物受试者(例如人)时，其引起身体细胞表达期望的抗原。为了促进RNA(例如，mRNA)递送至身体细胞，将RNA包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。在由身体细胞递送和摄取时，RNA在胞质溶胶中翻译，并且宿主细胞机制生成蛋白质抗原。这些蛋白质被呈递并引发适应性体液和细胞免疫应答。中和抗体针对被表达的蛋白质，因此这些蛋白质被认为是疫苗开发的相关靶抗原。
许多蛋白质具有四元或三维结构，其包含缔合到寡聚分子中的一个以上多肽或若干多肽链。如本文所用，术语“亚基”是指单个蛋白质分子，例如由加工新生蛋白质分子产生的多肽或多肽链，该亚基与其他蛋白质分子(例如，亚基或链)组装(或“共组装”)以形成蛋白质复合物。蛋白质可以具有相对少量的亚单位，并且因此被描述为“寡聚的”，或者可以由大量的亚单位组成，并且因此被描述为“多聚的”。寡聚或多聚蛋白的亚基可以是相同的、同源的或完全不同的，并且专用于不同的任务。
蛋白质或蛋白质亚基可以还包含结构域。如本文所用，术语“结构域”是指蛋白质内不同的功能和/或结构单元。通常，“结构域”负责特定的功能或相互作用，有助于蛋白质的整体作用。结构域可以存在于多种生物学环境中。类似的结构域(即，共享结构、功能和/或序列同源性的结构域)可以存在于单个蛋白质中或可以存在于具有类似或不同功能的不同蛋白质中。蛋白质结构域通常是给定蛋白质三级结构或序列的保守部分，其可以独立于蛋白质或其亚基的其余部分起作用和存在。
如本文所用，术语“抗原”与术语“表位”不同，后者是抗原的一种亚结构。抗原是抗体所附接的抗原部分。表位可以是肽，例如，7-10个氨基酸的肽，或碳水化合物结构。本领域描述了以分离形式(例如，分离的蛋白质)递送至受试者或免疫细胞的蛋白质抗原，然而，蛋白质抗原的设计、测试、验证和生产可能是昂贵且耗时的，尤其是当大规模生产蛋白质时。相反，mRNA技术适合于编码多种抗原的mRNA的快速设计和测试。此外，快速生产mRNA并配制在适当的递送媒介物(例如，脂质纳米颗粒)中可以快速进行，并且可以大规模快速生产mRNA疫苗。潜在的益处还在于，由本公开的mRNA编码的抗原由受试者的细胞表达(例如，由人体表达)，并且因此受试者(例如，人体)充当生产抗原的“工厂”，该抗原进而引发期望的免疫应答。
本文提供的疫苗可以包含编码相同或不同HSV菌株的两种或更多种抗原的RNA(例如，mRNA)或多种RNA。本文还提供了组合疫苗，其包含编码一种或多种HSV抗原和不同生物体的一种或多种抗原的RNA(例如，mRNA)。因此，本公开的疫苗可以是组合疫苗，其靶向相同菌株/物种的一种或多种抗原，或不同菌株/物种的一种或多种抗原，例如，诱导对在HSV感染风险高的相同地理区域中发现的生物体或个体在暴露于HSV时可能暴露于的生物体的免疫力的抗原。
本文提供的疫苗可以包含编码不同抗原的多种RNA。
在一些实施方案中，(a)编码HSV ICP0的mRNA与(b)编码HSV gB的mRNA的摩尔比不超过0.8:1。在一些实施方案中，摩尔比为约0.65:1。
在一些实施方案中，(a)编码HSV ICP0的mRNA与(b)编码HSV gC的mRNA的摩尔比不超过1.1:1。在一些实施方案中，摩尔比为约1.0:1。
在一些实施方案中，(a)编码HSV ICP0的mRNA与(b)编码HSV gD的mRNA的摩尔比不超过1.3:1。在一些实施方案中，摩尔比为约1.2:1。
在一些实施方案中，(a)编码HSV ICP4的mRNA与(b)编码HSV gB的mRNA的摩尔比不超过1.0:1。在一些实施方案中，摩尔比为约0.9:1。
在一些实施方案中，(a)编码HSV ICP4的mRNA与(b)编码HSV gC的mRNA的摩尔比不超过1.5:1。在一些实施方案中，摩尔比为约1.4:1。
在一些实施方案中，(a)编码HSV ICP4的mRNA与(b)编码HSV gD的mRNA的摩尔比不超过1.8:1。在一些实施方案中，摩尔比为约1.6:1。
在一些实施方案中，(a)编码HSV ICP0的mRNA和编码HSV ICP4的mRNA与(b)编码HSV gB的mRNA的摩尔比不超过1.6:1。在一些实施方案中，摩尔比为约1.5:1。
在一些实施方案中，(a)编码HSV ICP0的mRNA和编码HSV ICP4的mRNA与(b)编码HSV gC的mRNA的摩尔比不超过2.5:1。在一些实施方案中，摩尔比为约2.4:1。
在一些实施方案中，(a)编码HSV ICP0的mRNA和编码HSV ICP4的mRNA与(b)编码HSV gD的mRNA的摩尔比不超过2.9:1。在一些实施方案中，摩尔比为约2.8:1。
在一些实施方案中，(a)编码HSV ICP0和ICP4的mRNA与(b)编码HSV gB、gC和gD的mRNA的摩尔比不超过0.8:1。在一些实施方案中，摩尔比为约0.7:1。
野生型单纯疱疹病毒蛋白的变体
在一些实施方案中，本公开的组合物包含编码HSV蛋白变体的RNA(例如，mRNA)。蛋白质变体是其氨基酸序列与野生型、天然或参考氨基酸序列不同的蛋白质(包括全长蛋白质和肽)。与野生型、天然或参考氨基酸序列相比，蛋白质变体可在其氨基酸序列内的某些位置处具有一个或多个取代、缺失和/或插入。通常，蛋白质变体与野生型、天然或参考序列具有至少50％同一性。在一些实施方案中，蛋白质变体与野生型、天然或参考序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性。
由本公开的RNA(例如，mRNA)编码的蛋白质变体可含有氨基酸改变，该氨基酸改变赋予许多理想性质中的任一种，例如，增强其免疫原性、增强其表达和/或改善其在受试者中的稳定性或PK/PD性质。可以使用常规诱变技术制备蛋白质变体，并进行适当分析以确定它们是否具有期望的性质。确定蛋白质(包括蛋白质变体)的表达水平和免疫原性的测定法是本领域熟知的。类似地，蛋白质变体的PK/PD性质可以使用本领域公认的技术来测量，例如，通过确定接种疫苗的受试者中蛋白质变体随时间的表达和/或通过查看诱导的免疫应答的持久性。由RNA(例如，mRNA)编码的蛋白质变体的稳定性可以通过测定热稳定性或尿素变性时的稳定性来测量，或可以使用例如计算机预测来测量。用于此类实验和计算机确定的方法是本领域已知的。可以使用用于确定蛋白质变体表达水平、免疫原性和/或蛋白质变体的PK/PD性质的其他方法。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含本文提供的序列中的任一者的核苷酸序列或包含与本文提供的序列中的任一者的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列。参见例如，SEQ ID NO:1-34，其在下表1中再现。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框编码蛋白质，该蛋白质包含本文提供的序列中的任一者的氨基酸序列或包含与本文提供的序列中的任一者的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。参见例如，SEQ ID NO:35-68，其在下表2中再现。
“同一性”是指两个或三个或更多个序列(例如，氨基酸序列或核苷酸序列)之间的关系，如通过将序列彼此比较所确定的。同一性还指序列之间或之中的序列相关性程度，如通过氨基酸串(多肽)或核苷酸串(多核苷酸)之间或之中的匹配数所确定的。同一性是由特定数学模型或计算机程序(例如，“算法”)处理的具有缺口比对(如果有的话)的两个或更多个序列中较小序列之间的同一性匹配的百分比的量度。相关多肽和多核苷酸的同一性可以通过已知方法容易地计算。当应用于多肽或多核苷酸序列时，“同一性百分比(％)”被定义为候选(第一)多肽或多核苷酸序列中与第二多肽或多核苷酸序列中的残基相同的残基(氨基酸或核酸残基)在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大百分比同一性后的百分比。
用于比对的方法和计算机程序在本领域中是众所周知的。应理解，同一性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入的缺口和罚分，值可能不同。通常，特定多核苷酸或多肽的变体与特定野生型、天然或参考序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性，如通过本文所述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定的。此类用于比对的工具包括但不限于BLAST套件的工具(Altschul,S.F.等人Nucleic Acids Res.1997；25:3389-3402)；以及基于史密斯-沃特曼算法的工具(Smith,T.F.和Waterman,M.S.J.Mol.Biol.1981；147:195-197)。基于动态编程的通用全局比对技术是尼德曼-翁施算法(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.J.Mol.Biol.1920；48:443-453)。还开发了一种快速最佳全局序列比对算法(FOGSAA)，据称其比其他最佳全局比对方法(包括尼德曼-翁施算法)更快地产生核苷酸和蛋白质序列的全局比对。
因此，相对于野生型、天然或参考序列(例如，本文公开的多肽(例如，蛋白质)序列)包含取代、插入和/或缺失(例如，indels)和共价修饰的多核苷酸和多肽包括在本公开的范围内。例如，可将序列标签或氨基酸，诸如一个或多个赖氨酸，添加到多肽序列中(例如，在N末端和/或C末端)。序列标签可用于肽检测、纯化和/或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解度或允许生物素化。可替代地，位于蛋白质的氨基酸序列的N末端和/或C末端区域的氨基酸残基可任选地缺失，从而提供截短的序列。某些氨基酸(例如，C-末端或N-末端氨基酸)可根据序列的用途而缺失，如例如作为可溶的或连接到固体支持物的较大序列的一部分的序列的表达。在一些实施方案中，用于(或编码)信号序列、终止序列、跨膜结构域、接头、多聚化结构域(例如，折叠区)等的序列被实现相同或类似功能的另选序列取代。在一些实施方案中，可以填充蛋白质核心中的空腔以提高稳定性，例如通过引入更大的氨基酸。在其他实施方案中，用疏水残基置换包埋的氢键网络以改善稳定性。在其他实施方案中，糖基化位点被去除并用适当的残基置换。此类序列是本领域技术人员容易鉴定的。还应理解，本文提供的一些序列含有序列标签或末端肽序列(例如，在N末端或C末端)，这些序列标签或末端肽序列可在例如用于制备RNA(例如，mRNA)疫苗之前缺失。
如本领域技术人员所认识到的，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也被认为在本文提供的HSV蛋白的范围内。例如，本文提供了野生型、天然或参照序列的任何蛋白质片段(意指比野生型、天然或参照序列短至少一个氨基酸残基但在其他方面与野生型、天然或参照序列相同的多肽序列)，前提是该片段具有免疫原性并赋予针对HSV的保护性免疫应答。除了与野生型、天然或参考蛋白质相同但被截短的蛋白质变体之外，在一些实施方案中，蛋白质包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变(例如，取代、插入和/或缺失)，如本文提供或参考的任何序列中所示。蛋白质变体的长度范围可以为约4、6或8个氨基酸至全长蛋白质。
HSV蛋白变体和编码HSV蛋白变体的核苷酸序列的非限制性实例提供于表1和表2中。
表1.编码示例性HSV抗原的核酸序列
“s”表示可溶性蛋白质。“Δct”表示胞质尾区的缺失。“Δsp”表示信号肽的缺失。
本公开的一些方面提供了一种核糖核酸(RNA)，其包含含有与SEQ ID NO:1-35中任一者的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列的开放阅读框。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:1的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:2的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:3的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:4的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:5的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:6的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:7的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:8的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:9的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:10的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:11的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:12的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:13的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:14的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:15的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:16的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:17的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:18的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:19的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:20的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:21的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:22的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:23的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:24的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:25的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:26的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:27的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:28的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:29的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:30的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:31的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:32的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:33的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:34的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框，该开放阅读框包含与SEQID NO:35的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
表2.示例性HSV蛋白变体的氨基酸序列
“Δct”表示胞质尾区的缺失。“Δsp”表示信号肽的缺失。
本公开的一些方面提供了一种单纯疱疹病毒(HSV)蛋白，其包含与SEQ ID NO:36-70中任一者的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HSV蛋白包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
信号肽
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)具有编码与HSV蛋白融合的信号肽的ORF。信号肽包含蛋白质N末端15-60个氨基酸，通常是在分泌途径上跨膜易位所需要的，因此普遍控制真核生物和原核生物中的大多数蛋白质进入分泌途径。在真核生物中，新生前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体引导至粗面内质网(ER)膜，并启动生长的肽链穿过该膜进行加工。ER加工产生成熟蛋白质，其中信号肽通常通过宿主细胞的ER驻留信号肽酶从前体蛋白质中裂解，或者它们保持未裂解并充当膜锚定物。信号肽还可以促进蛋白质靶向细胞膜。
信号肽可以具有15-60个氨基酸的长度。例如，信号肽可以具有15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个或60个氨基酸的长度。在一些实施方案中，信号肽具有20-60个、25-60个、30-60个、35-60个、40-60个、45-60个、50-60个、55-60个、15-55个、20-55个、25-55个、30-55个、35-55个、40-55个、45-55个、50-55个、15-50个、20-50个、25-50个、30-50个、35-50个、40-50个、45-50个、15-45个、20-45个、25-45个、30-45个、35-45个、40-45个、15-40个、20-40个、25-40个、30-40个、35-40个、15-35个、20-35个、25-35个、30-35个、15-30个、20-30个、25-30个、15-25个、20-25个或15-20个氨基酸的长度。
来自异源基因的信号肽(其在自然界中调节HSV蛋白以外的基因的表达)是本领域已知的，并且可以测试其期望的性质，然后将其掺入到本公开的核酸中。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含编码与信号肽融合的HSV蛋白的开放阅读框，该信号肽包含与本文提供的序列中的任一者的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。参见例如，SEQ ID NO:71-75，其在下表3中再现。在一些实施方案中，mRNA包含编码HSV蛋白的开放阅读框，该HSV蛋白包含野生型HSV蛋白的内源信号肽(例如，编码(野生型或经修饰的)HSV gB的mRNA编码HSV gB信号肽)。
表3.信号肽
详述 序列 SEQ ID NO:
HuIgGk信号肽 METPAQLLFLLLLWLPDTTG 71
IgE重链ε-1信号肽 MDWTWILFLVAAATRVHS 72
日本脑炎PRM信号序列 MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS 73
VSVg蛋白信号序列 MKCLLYLAFLFIGVNCA 74
日本脑炎JEV信号序列 MWLVSLAIVTACAGA 75
融合蛋白
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)编码融合蛋白。因此，所编码的蛋白质可包括用或不用接头连接在一起的两种或更多种蛋白质(例如，蛋白质和/或蛋白质片段)。在一些实施方案中，融合蛋白保留每个独立(非融合)蛋白质的功能性质。
在一些实施方案中，融合蛋白包含以下HSV蛋白中的2、3、4、5、6、7、8、9或10个：gB、gC、gD、gE、gH、gL、gI、ICP0和ICP4。本公开的示例性融合蛋白提供于表2中。例如，在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)编码与选自SEQ ID NO:36-70的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的蛋白质。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)编码与选自SEQ ID NO:36-70的序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或相同的蛋白质。在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)疫苗包含与选自SEQID NO:1-35的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的ORF。在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)疫苗包含与选自SEQ ID NO:1-35的序列具有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的ORF。
接头和可切割肽
在一些实施方案中，编码融合蛋白的RNA(例如，mRNA)进一步编码位于融合蛋白的至少一个或每个结构域之间的接头。接头可以是例如可切割接头或蛋白酶敏感接头。在一些实施方案中，接头选自由以下项组成的组：F2A接头、P2A接头、T2A接头、E2A接头及其组合(参见例如，WO 2017/127750)。该家族的自切割肽接头，称为2A肽，已在本领域中描述(参见例如，Kim,J.H.等人PLoS ONE 2011；6:e18556)。在一些实施方案中，接头是F2A接头。
在一些实施方案中，接头是GS接头。GS接头是包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸重复序列的多肽接头。它们包含柔性和亲水性残基，并且可用于进行蛋白质亚基的融合而不干扰蛋白质结构域的折叠和功能，并且不形成二级结构。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)编码包含3至20个氨基酸长的GS接头的融合蛋白。例如，GS接头可以具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度(或具有至少这些数量的氨基酸的长度)。在一些实施方案中，GS接头是(或是至少)15个氨基酸长(例如，GGSGGSGGSGGSGGG(SEQID NO:76))。在一些实施方案中，GS接头是(或是至少)8个氨基酸长(例如，GGGSGGGS(SEQID NO:77))。在一些实施方案中，GS接头是(或是至少)7个氨基酸长(例如，GGGSGGG(SEQ IDNO:78))。在一些实施方案中，GS接头包含氨基酸序列GGGSGG(SEQ ID NO:82)。在一些实施方案中，GS接头是(或是至少)4个氨基酸长(例如，GGGS(SEQ ID NO:79))。在一些实施方案中，GS接头包含(GGGS)n(SEQ ID NO:80)，其中n为1-5的任何整数。在一些实施方案中，GS接头是(或是至少)4个氨基酸长(例如，GSGG(SEQ ID NO:81))。在一些实施方案中，GS接头包含(GSGG)n(SEQ ID NO:80)，其中n为1-5的任何整数。在一些实施方案中，接头是甘氨酸接头，例如具有3个氨基酸的长度(或至少3个氨基酸的长度)(例如，GGG)。在一些实施方案中，由RNA(例如，mRNA)编码的蛋白质包含两个或更多个接头，它们可以彼此相同或不同。
技术人员将理解，其他本领域认可的接头可适用于本公开的构建体(例如，由本公开的核酸编码)。本领域技术人员同样将理解，其他多顺反子构建体(在同一分子内分别编码多于一种蛋白质的RNA(例如，mRNA))可适用于本文提供的用途。
编码单纯疱疹病毒蛋白的核酸
核酸包含核苷酸(核苷酸单体)的聚合物。因此，核酸也称为多核苷酸。核酸可以是或可以包括例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2'-氨基官能化的2'-氨基-LNA和具有2'-氨基官能化的2'-氨基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)和/或嵌合体和/或其组合。
本公开的RNA(例如，mRNA)包含编码HSV蛋白的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)还包含5'非翻译区(UTR)、3'UTR、多聚(A)尾和/或5'帽类似物。
信使RNA
信使RNA(mRNA)是编码(至少一种)蛋白质(天然存在的、非天然存在的或经修饰的氨基酸聚合物)并且可以在体外、体内、原位或离体翻译以产生所编码的蛋白质的RNA。应理解，mRNA并非自扩增RNA(saRNA)(参见例如，Bloom K等人Gene Therapy 2021；28:117-129对mRNA和saRNA的比较)。saRNA包含编码RNA依赖性RNA聚合酶的α病毒复制酶序列。mRNA不包含α病毒复制酶序列。
技术人员将理解，除非另有说明，否则本申请中提出的核酸序列可以在代表性DNA序列中引用“T”，但是当该序列代表mRNA时，“T”将被替换为“U”。因此，本文中由特定序列识别号公开和鉴定的任何DNA也公开了与所述DNA互补的对应mRNA序列，其中DNA序列的每个“T”被“U”取代。
天然存在的真核mRNA分子除了其他结构特征诸如5'-帽结构或3'-多聚(A)尾外，还含有稳定元件，包括但不限于在其5'-端(5'UTR)和/或在其3'-端(3'UTR)的UTR。5'UTR和3'UTR通常都是从基因组DNA转录，并且是成熟mRNA的元件。成熟mRNA的特征性结构特征，诸如5'-帽和3'-多聚(A)尾，通常在mRNA加工期间添加到转录的(未成熟)mRNA中。
编码本公开的HSV蛋白的mRNA的示例性序列提供于表1中。在一些实施方案中，mRNA包含与选自SEQ ID NO:1-35的序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或相同的ORF。在一些实施方案中，mRNA包含与选自SEQ ID NO:1-35的序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或相同的核苷酸序列。
非翻译区(UTR)
本公开的mRNA可包含用作或充当非翻译区的一个或多个区域或部分。“5'非翻译区”(UTR)是指mRNA中不编码多肽的在起始密码子(即，核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)直接上游(即，5')的区域。“3'非翻译区(UTR)”是指mRNA中不编码多肽的在终止密码子(即，传导翻译终止信号的mRNA转录物的密码子)直接下游(即，3')的区域。当生成RNA转录物时，5'UTR可包含启动子序列。此类启动子序列是本领域已知的。应理解，此类启动子序列将不存在于本公开的疫苗中。
当mRNA被设计成编码(至少一种)HSV蛋白时，mRNA可包含5'UTR和/或3'UTR。mRNA的UTR被转录但不被翻译。在mRNA中，5'UTR在转录起始位点开始并延续至起始密码子，但不包括起始密码子；3'UTR在终止密码子后立即开始并延续直至转录终止信号。越来越多的证据表明UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面所起的调节作用。UTR的调节特征可以并入本公开的多核苷酸中，以尤其增强分子的稳定性等。也可并入特定特征以确保在转录物被错误导向不期望的器官位点的情况下转录物的受控下调。多种5'UTR和3'UTR序列是本领域已知的。
还应理解，本公开的mRNA可包含任何5'UTR和/或任何3'UTR。示例性UTR序列包括SEQ ID NO:83-93；然而，可使用其他UTR序列或将其替换为本文所述的任何UTR序列。
在一些实施方案中，本公开的5'UTR包含选自以下的序列：
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUA AGAGCCACC(SEQ ID NO:83)、
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUA AGACCCCGGCGCCGCCACC(SEQ ID NO:84)、
GAGGAAAUCGCAAAAUUUGCUCUUCGCGUUAGAUUUCU UUUAGUUUUCUCGCAACUAGCAAGCUUUUUGUUCUCGCC(SE Q ID NO:85)和
GGAAAUCGCAAAAUUUGCUCUUCGCGUUAGAUUUCUUU UAGUUUUCUCGCAACUAGCAAGCUUUUUGUUCUCGCC(SEQ ID NO:109)。
在一些实施方案中，本公开的3'UTR包含选自以下的序列：UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUU GGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCC CCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:86)、
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCC CCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGU ACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:87)、
UAAAGCUCCCCGGGGGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCAGGAGAUUGAGUGUAGUGACUAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:88)、
UAAAGCUCCCCGGGGGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCAGGAUUGAGACUACGGGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:89)、
UAAAGCUCCCCGGGGGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCAGCAUAGACACUACGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:90)、
UAAAGCUCCCCGGGGGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCAGGAGAUUGAGUGUAGUGGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:91)、
UAAAGCUCCCCGGGGGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCAGGAGAUUGAGUGUAGUGACGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:92)、
UAAAGCUCCCCGGGGGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCC CCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCAGUGG UCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:93)和
UAAAGCUCCCCGGGGGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCC CCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGU ACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:110)。
在一些实施方案中，编码不同HSV抗原的每个mRNA包含3'UTR，该3'UTR包含选自SEQ ID NO:88-93的不同核苷酸序列。在一些实施方案中，编码HSV gB的mRNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:88的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码HSV gC的mRNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:89的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码HSV gD的mRNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:90的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码HSV ICP0的mRNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:91的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码HSV ICP4的mRNA包含3'UTR，该3'UTR包含SEQ ID NO:92的核苷酸序列。
在一些实施方案中，3'UTR按5'至3'的顺序包含：(a)核酸序列UAAAGCUCCCCGGGGGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCU UGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCAG(SEQ IDNO:94)、(b)鉴定和比率确定(IDR)序列和(c)核酸序列UGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ IDNO:95)。在一些实施方案中，编码不同HSV抗原的每个mRNA包含3'UTR，该3'UTR按5'至3'的顺序包含：(a)SEQ ID NO:94的核苷酸序列；(b)不同的IDR序列；以及(c)SEQ ID NO:95的核苷酸序列。IDR序列在本文中描述于标题为“鉴定和比率确定(IDR)序列”的部分中。也可以从本文提供的mRNA中省略UTR。
5'UTR不编码蛋白质(是非编码的)。天然5'UTR具有在翻译起始中发挥作用的特征。它们具有如同通常已知参与核糖体启动许多基因翻译的过程的Kozak序列一样的特征。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID NO:96)，其中R是起始密码子(AUG)上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)三碱基，其后接另一个'G'。还已知5'UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。
在本公开的一些实施方案中，5'UTR是异源UTR，即是在自然界中发现的与不同ORF相关的UTR。在其他实施方案中，5'UTR是合成UTR，即在自然界中不存在。合成的UTR包括已被突变以改善其性质的UTR，例如增加基因表达的UTR以及完全合成的UTR。示例性5'UTR包括非洲爪蟾(Xenopus)或人来源的a-珠蛋白或b-珠蛋白(8278063；9012219)、人细胞色素b-245多肽和羟基类固醇(17b)脱氢酶、以及烟草蚀刻病毒(US8278063、US9012219)。还可使用CMV立即早期1(IE1)基因(US2014/0206753、WO2013/185069)、序列GGGAUCCUACC(SEQ IDNO:97)(WO2014/144196)。在其他实施方案中，5'UTR是TOP基因的缺少5'TOP基序(寡嘧啶序列段)的5'UTR(例如，WO2015/101414、WO2015/101415、WO2015/062738、WO2015/024667、WO2015/024667)；可使用源自核糖体蛋白大32(L32)基因(WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738)的5'UTR元件、源自羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5'UTR的5'UTR元件(WO2015024667)，或源自ATP5A1的5'UTR的5'UTR元件(WO2015/024667)。在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5'UTR。
3'UTR不编码蛋白质(是非编码的)。已知天然或野生型3'UTR中嵌入有腺苷和尿苷链段。这些富含AU的特征在高周转率的基因中尤其普遍。根据其序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可分为三类(Chen等人,1995)：I类ARE在富含U区域内含有多个分散的AUUUA基序拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有这种类型ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III级ARES的定义不太明确。这些富含U区域不含有AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是此类中两个经过充分研究的实例。已知大多数与ARE结合的蛋白质都会破坏信使的稳定性，而ELAV家族的成员，最值得注意的是HuR，已被证明可以增加mRNA的稳定性。HuR与所有三个类别的ARE结合。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3'UTR中将导致HuR结合，并因此导致体内信息的稳定。
3'UTR AU富集元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节本公开的mRNA的稳定性。当工程化特定的核酸时，可引入ARE的一个或多个拷贝以使得本公开的核酸不那么稳定，并且由此缩减翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，ARE可以被识别、去除或突变，以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产生。转染实验可在相关细胞系中使用本公开的核酸进行，并且可在转染后的不同时间点测定蛋白质产生。例如，可用不同的ARE工程分子转染细胞，并通过使用ELISA试剂盒检测相关蛋白质，并测定在转染后6小时、12小时、1天、2天和7天产生的蛋白质。
本领域普通技术人员将理解，异源或合成的5'UTR可与任何期望的3'UTR序列一起使用。例如，异源或合成的5'UTR可与合成的3'UTR或与异源3'UTR一起使用。
非UTR序列也可用作核酸内的区域或亚区域。例如，内含子或内含子序列的部分可以并入本公开的核酸的区域中。内含子序列的并入可以增加蛋白质产量以及核酸水平。
特征的组合可包含在侧翼区中并且可包含在其他特征内。例如，ORF的侧翼可以是5'UTR，其可含有强Kozak翻译起始信号，和/或3'UTR，其可包括用于以模板添加聚-A尾的寡(dT)序列。5'UTR可包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，诸如US2010/0293625和WO2015/085318A2中所述的5'UTR，所述文献中的每一个以引用方式并入本文。
应理解，来自任何基因的任何UTR可并入核酸的区域。此外，可以利用任何已知基因的多个野生型UTR。在本公开的范围内也提供不是野生型区域的变体的人工UTR。这些UTR或其部分可以以与从中选择它们的转录物相同的取向放置，或者可以改变取向或位置。因此，5'UTR或3'UTR可以被倒置、缩短、延长、用一个或多个其他5'UTR或3'UTR制成。如本文所用，术语“改变”在涉及UTR序列时意味着UTR相对于参考序列已经以某种方式发生变化。例如，3'UTR或5'UTR可通过如上文教导的取向或位置的改变而相对于野生型/天然UTR改变，或者可通过包含附加的核苷酸、缺失核苷酸、交换或转座核苷酸而改变。产生“改变的”UTR(无论是3'或5')的任何这些变化都包含变体UTR。
在一些实施方案中，可以使用双重、三重或四重UTR，诸如5'UTR或3'UTR。如本文所用，“双重”UTR是其中同一UTR的两个拷贝串联或基本上串联编码的UTR。例如，可以使用如US2010/0129877中所述的双β-珠蛋白3'UTR，所述文献以引用方式并入本文。
在本公开的范围内也具有模式化UTR。如本文所用，“模式化UTR”是反映重复或交替模式的那些UTR，诸如ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其重复一次、两次或超过3次的变体。在这些模式中，每个字母A、B或C代表核苷酸水平上的不同UTR。
在一些实施方案中，侧翼区选自其蛋白质共享共同功能、结构、特征或性质的转录物家族。例如，目标多肽可以属于在特定细胞、组织中或在发育期间的某个时间表达的蛋白质家族。来自任何这些基因的UTR可以被交换为相同或不同蛋白质家族的任何其他UTR以产生新的多核苷酸。如本文所用，“蛋白质家族”在最广泛的意义上使用，是指共享至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式的一组两种或更多种目标多肽。
非翻译区还可以包含翻译增强子元件(TEE)。作为非限制性实例，TEE可包括在US2009/0226470中描述的那些和本领域中已知的那些，所述文献以引用方式并入本文。
开放阅读框
开放阅读框(ORF)是连续的DNA或RNA链段，以起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG或AUG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA，或UAA、UAG或UGA)结束。ORF通常编码蛋白质。应理解，本文公开的序列可以还包含附加的元件，例如5'和/或3'UTR，但与ORF不同，那些元件不一定存在于本公开的RNA(例如，mRNA)中。
5'端加帽
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含5'末端帽。多核苷酸的5'-加帽可以使用例如以下化学RNA帽类似物在体外转录反应期间伴随地完成，以根据制造商方案生成5'-鸟苷帽结构：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G[ARCA帽]；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。经修饰的RNA(例如，mRNA)的5'-加帽可以使用例如痘苗病毒加帽酶在转录后完成，以生成“帽0”结构：m7G(5')ppp(5')G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。帽1结构可以使用痘苗病毒加帽酶和2'-O甲基转移酶生成以下结构来生成：m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲基。帽2结构可以从帽1结构产生，然后使用2'-O甲基转移酶对5'-倒数第三个核苷酸进行2'-O-甲基化。帽3结构可以从帽2结构产生，然后使用2'-O甲基转移酶对5'-倒数第四个核苷酸进行2'-O-甲基化。酶可以源自重组来源。可以使用其他帽类似物。
聚腺苷酸化加尾
“多聚(A)尾”是mRNA中在3'UTR下游，例如直接下游(即，3')的区域，其含有多个连续的单磷酸腺苷。多聚(A)尾可以含有10至300个单磷酸腺苷。在一些情况下，它可以包含至多约400个腺嘌呤核苷酸。例如，多聚(A)尾可以含有10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，多聚(A)尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关生物环境中(例如，在细胞中，在体内)，多聚(A)尾起到保护mRNA免受酶促降解的作用，例如，在细胞质中，并且有助于转录终止和/或mRNA从细胞核中的输出，以及翻译。在一些实施方案中，3'多聚(A)尾的长度对于单个mRNA的稳定性可能是必需的要素。在一些实施方案中，多聚(A)尾具有约50、约100、约150、约200、约250、约300、约350或约400个核苷酸的长度。在一些实施方案中，多聚(A)尾具有100个核苷酸的长度。
附加的稳定元件
在一些实施方案中，本文提供的RNA(例如，mRNA)包含附加的稳定元件。稳定元件可包括例如组蛋白茎-环。已鉴定出茎环结合蛋白(SLBP)，这是一种32kDa的蛋白质。它与细胞核和细胞质中组蛋白信息的3'端的组蛋白茎环缔合。其表达水平受细胞周期调节；它在S期达到峰值，此时组蛋白mRNA水平也升高。所述蛋白质已被证明对于U7 snRNP对组蛋白前体mRNA进行有效3'端加工至关重要。SLBP在加工后继续与茎环缔合，然后刺激成熟组蛋白mRNA在细胞质中翻译成组蛋白。SLBP的RNA结合结构域在后生动物和原生动物中都是保守的；它与组蛋白茎环的结合取决于环的结构。相对于茎环，最小结合位点包含至少三个核苷酸5'和两个核苷酸3'。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含开放阅读框(编码区)、组蛋白茎-环和任选的多聚(A)序列或聚腺苷酸化信号。多聚(A)序列或聚腺苷酸化信号通常应增强所编码蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，所编码的蛋白质并非组蛋白、报告蛋白(例如，萤光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、EGFP)或标记或选择蛋白(例如，α-珠蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(GPT))。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)包含多聚(A)序列或聚腺苷酸化信号和至少一种组蛋白茎-环的组合，即使两者在性质上代表了另选的机制，它们协同作用以增加蛋白质表达超过用任一单个元件观察到的水平。多聚(A)和组蛋白茎-环的组合的协同效应不依赖于元件的顺序或多聚(A)序列的长度。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)不包含组蛋白下游元件(HDE)。“组蛋白下游元件”(HDE)包含天然存在的茎环的3'处约15至20个核苷酸的富含嘌呤的多核苷酸片段，从而代表U7 snRNA的结合位点，该U7 snRNA参与将组蛋白pre-mRNA加工成成熟组蛋白mRNA。在一些实施方案中，核酸不包含内含子。
RNA(例如，mRNA)可以含有或不含有增强子和/或启动子序列，其可以是经修饰的或未修饰的或者可以是活化的或失活的。在一些实施方案中，组蛋白茎环通常源自组蛋白基因并且包括由间隔子隔开的两个相邻的部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对，该间隔子由形成结构的环的短序列组成。未配对的环区域通常不能与任一茎环元件碱基配对。它更常见于RNA，是许多RNA二级结构的关键组件，但也可能存在于单链DNA中。茎环结构的稳定性通常取决于配对区域的长度、错配或凸起的数量以及碱基组成。在一些实施方案中，可能导致摆动碱基配对(非Watson-Crick碱基配对)。在一些实施方案中，至少一个组蛋白茎环序列包含15至45个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)的一个或多个富含AU的序列被去除。这些序列，有时被称为AURES，是在3'UTR中发现的去稳定序列。可以从mRNA中去除AURES。可替代地，AURES可以保留在mRNA中。
序列优化
在一些实施方案中，编码本公开的蛋白质的开放阅读框是密码子优化的。密码子优化方法是本领域已知的。本文提供的序列中的任何一种或多种的开放阅读框可以是密码子优化的。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；使GC含量偏倚以增加RNA(例如，mRNA)稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运转最小化；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；去除/添加所编码的蛋白质中的翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白质结构域；插入或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和RNA(例如，mRNA)降解位点；调节翻译速率以允许蛋白质的各种结构域正确折叠；或减少或消除多核苷酸内二级结构的问题。密码子优化工具、算法和服务是本领域已知的，非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)和/或专有方法。在一些实施方案中，使用优化算法优化开放阅读框序列。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列开放阅读框(例如，编码HSV蛋白抗原的天然存在的或野生型RNA(例如，mRNA)序列)共享小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码HSV蛋白的天然存在的或野生型RNA(例如，mRNA)序列)共享小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码HSV蛋白的天然存在的或野生型RNA(例如，mRNA)序列)共享小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码HSV蛋白的天然存在的或野生型RNA(例如，mRNA)序列)共享小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码HSV蛋白的天然存在的或野生型RNA(例如，mRNA)序列)共享小于75％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码HSV蛋白的天然存在的或野生型RNA(例如，mRNA)序列)共享65％与85％之间(例如，约67％与约85％之间或约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码HSV蛋白的天然存在的或野生型RNA(例如，mRNA)序列)共享65％与75％之间或约80％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列编码的抗原的免疫原性与由非密码子优化的序列编码的HSV蛋白的免疫原性相同，或免疫原性比其更高(例如，高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)。
当转染至哺乳动物宿主细胞中时，经修饰的mRNA具有12-18小时之间或大于18小时，例如24、36、48、60、72或大于72小时的稳定性并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。
在一些实施方案中，密码子优化的RNA(例如，mRNA)可以是其中G/C水平增强的RNA。核酸分子(例如，mRNA)的G/C含量可影响RNA的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA(例如，mRNA)在功能上比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA更稳定。作为实例，WO02/098443公开了含有通过翻译区中的序列修饰而稳定的RNA(例如，mRNA)的药物组合物。由于遗传密码的简并性，修饰通过用现有密码子取代那些促进更大的RNA稳定性而不改变所得氨基酸的密码子来起作用。该方法限于RNA(例如，mRNA)的编码区。
未经化学修饰的核苷酸
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)未被化学修饰，并且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，诸如存在于转录的RNA中的那些(例如，A、G、C或U)。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包括标准脱氧核糖核苷，诸如存在于DNA中的那些脱氧核糖核苷(例如，dA、dG、dC、或dT)。
经化学修饰的核苷酸
在一些实施方案中，本公开的组合物包含具有编码HSV蛋白的开放阅读框的RNA，其中该核酸包含可以是标准的(未修饰的)或如本领域已知的经修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包括经修饰的核苷酸或核苷。此类经修饰的核苷酸和核苷可以是天然存在的经修饰的核苷酸和核苷或非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷。此类修饰可包括如本领域所公认的在核苷酸和/或核苷的糖、主链或核碱基部分的那些修饰。
在一些实施方案中，本公开的天然存在的经修饰的核苷酸或核苷是如本领域通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类天然存在的经修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于广泛认可的MODOMICS数据库中。
在一些实施方案中，本公开的非天然存在的经修饰的核苷酸或核苷是本领域通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于国际公布号WO2013052523A1；WO2014093924A1；WO2015051173A2；WO2015051169A2；WO2015089511A2；或WO2017153936A1中，所述国际公布中的每一个以引用方式并入本文。
因此，本公开的核酸(例如，DNA和RNA，诸如mRNA)可包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或它们的任何组合。
在一些实施方案中，本公开的核酸(例如，DNA和RNA，诸如mRNA)包含各种(多于一种)不同类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。在一些实施方案中，核酸的特定区域含有一种、两种或更多种(任选地不同)类型的标准和/或修饰的核苷酸和核苷。
在一些实施方案中，引入细胞或生物体的经修饰的RNA(例如，mRNA)相对于包含标准核苷酸和核苷的未修饰的核酸分别在细胞或生物体中表现出降低的降解。
在一些实施方案中，引入细胞或生物体的经修饰的RNA(例如，mRNA)相对于包含标准核苷酸和核苷的未修饰的核酸分别在细胞或生物体中表现出降低的免疫原性(例如，降低的先天应答)。
在一些实施方案中，核酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含在核酸的合成期间或合成后引入以实现期望的功能或性质的非天然经修饰的核苷酸。修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可以通过化学合成或用聚合酶引入到链末端或链中的任何其他位置处。可对核酸的任何区域进行化学修饰。
本公开提供了核酸(例如，RNA，诸如mRNA)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称作“核碱基”)组合的糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。“核苷酸”是指核苷，包括磷酸基团。修饰的核苷酸可以通过例如像化学、酶促或重组的任何有用方法合成，以包括一个或多个修饰的或非天然的核苷。核酸可以包含连接的核苷的一个或多个区域。此类区域可能具有可变的主链键联。键联可以是标准的磷酸二酯键联，在这种情况下，核酸将包含核苷酸区域。
修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准的腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且涵盖核苷酸和/或包含非标准或修饰碱基的修饰核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键接受体的排列允许非标准碱基与标准碱基之间或两个互补的非标准碱基结构之间的氢键结，例如，在具有至少一个化学修饰的那些核酸中。此种非标准碱基配对的一个实例是修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可以并入本公开的核酸中。
在一些实施方案中，核酸(例如，RNA，诸如mRNA)中的经修饰的核碱基包括1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)和/或假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，核酸(例如，RNA，诸如mRNA)中的修饰核碱基包括5-甲氧基甲基尿苷、5-甲硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括至少两种(例如，2种、3种、4种或更多种)任何上述修饰(包括但不限于化学修饰)的核碱基的组合。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置处的5-甲基胞苷取代。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的假尿苷(ψ)取代。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的假尿苷(ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置处的5-甲基胞苷取代。
在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的尿苷。
在一些实施方案中，对于特定修饰，RNA(例如，mRNA)被统一修饰(例如，完全修饰，在整个序列中修饰)。例如，核酸可用1-甲基-假尿苷统一修饰，这意味着RNA(例如，mRNA)序列中的所有尿苷残基均被1-甲基-假尿苷置换。类似地，核酸可以通过用修饰的残基(诸如上文所阐述的那些残基)置换而针对存在于序列中的任何类型的核苷残基进行统一修饰。
本公开的核酸可以沿着分子的整个长度被部分或完全修饰。例如，在本公开的核酸中，或在其预定序列区域中(例如，在包括或不包括多聚(A)尾的RNA(例如，mRNA)中)，可统一修饰一种或多种或全部或给定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一种或多种或所有)。在一些实施方案中，本公开的核酸(或其序列区域)中的所有核苷酸X都是修饰的核苷酸，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。
核酸可以含有约1％至约100％的修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即，A、G、U或C中的任一者或多者)或任何中间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％及95％至100％)。应理解，任何剩余的百分比都是由未修饰的A、G、U或C的存在所占的。
RNA(例如，mRNA)可含有最少1％和最多100％的经修饰的核苷酸，或任何中间百分比，诸如至少5％的经修饰的核苷酸、至少10％的经修饰的核苷酸、至少25％的经修饰的核苷酸、至少50％的经修饰的核苷酸、至少80％的经修饰的核苷酸、或至少90％的经修饰的核苷酸。例如，核酸可含有修饰的嘧啶，诸如修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，核酸中的至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶被修饰的尿嘧啶(例如，5-取代的尿嘧啶)置换。修饰的尿嘧啶可以被具有单一独特结构的化合物置换，或者可以被具有不同结构(例如2、3、4或更多个独特结构)的多个化合物置换。在一些实施方案中，核酸中的至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被修饰的胞嘧啶(例如，5-取代的胞嘧啶)置换。经修饰的胞嘧啶可以被具有单一独特结构的化合物置换，或者可以被具有不同结构(例如，2、3、4或更多个独特结构)的多个化合物置换。
核酸生产
化学合成
固相化学合成.本公开的核酸可以全部或部分使用固相技术制造。核酸的固相化学合成是一种自动化方法，其中分子固定在固相支持物上并在反应物溶液中逐步合成。固相合成可用于在核酸序列中位点特异性引入化学修饰。
通过连续添加单体结构单元来合成本公开的核酸可以在液相中进行。
上文讨论的合成方法各有其优点和局限性。已尝试将这些方法结合起来以克服这些局限性。此类方法的组合是在本公开的范围内。使用固相或液相化学合成与酶连接的组合提供了一种有效的方式来生成仅通过化学合成无法获得的长链核酸。
连接
也可使用通过连接酶组装核酸。DNA或RNA连接酶通过形成磷酸二酯键促进多核苷酸链的5'和3'端的分子间连接。核酸诸如嵌合多核苷酸和/或环状核酸可通过连接一个或多个区域或亚区域来制备。DNA片段可通过连接酶催化的反应接合以产生具有不同功能的重组DNA。两个寡脱氧核苷酸，一个具有5'磷酰基基团，另一个具有游离的3'羟基基团，用作DNA连接酶的底物。
纯化
本文所述的核酸的纯化可包括但不限于核酸净化、质量保证和质量控制。可通过本领域已知的方法进行净化，诸如但不限于珠(Beckman CoulterGenomics,Danvers,MA)、聚-T珠、LNATM寡聚-T捕获探针(Inc,Vedbaek,Denmark)或基于HPLC的纯化方法，诸如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)。术语“纯化的”当与核酸诸如“纯化的核酸”相关使用时，是指与至少一种污染物分离的核酸。“污染物”是指使另一种物质变得不合格、不纯净或劣等的任何物质。因此，纯化的核酸(例如，DNA和RNA)以与其在自然界中发现的形式或背景不同的形式或背景存在，或者以与在对其进行处理或纯化方法之前就已存在的形式或背景不同的形式或背景存在。
质量保证和/或质量控制检查可以使用诸如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析型HPLC的方法进行。
在一些实施方案中，可以通过包括但不限于逆转录酶-PCR的方法对核酸进行测序。
定量
在一些实施方案中，本公开的核酸可以在外泌体中或当源自一种或多种体液时进行定量。体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper's fluid)或射精前液、汗液、粪便、头发、眼泪、囊液、胸水和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺吸出物、囊胚腔液和脐带血。或者，外泌体可从选自由肺、心脏、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳腺、前列腺、脑、食道、肝和胎盘组成的组的器官回收。
可使用构建体特异性探针、细胞计量术、qRT-PCR、实时PCR、PCR、流式细胞术、电泳、质谱或它们的组合进行测定，而可使用免疫组织化学方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法分离外泌体。外泌体还可通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合来分离。
这些方法为研究者提供了实时监测剩余或递送的核酸水平的能力。这是可能的，因为在一些实施方案中，本公开的核酸由于结构或化学修饰而不同于内源形式。
在一些实施方案中，可以使用诸如但不限于紫外可见光谱(UV/Vis)的方法来定量核酸。UV/Vis光谱仪的非限制性实例是光谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)。可以分析定量的核酸以确定核酸是否具有适当的大小，检查核酸是否没有发生降解。核酸的降解可以通过诸如但不限于以下的方法来检查：琼脂糖凝胶电泳；基于HPLC的纯化方法，诸如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)、疏水作用HPLC(HIC-HPLC)；液相色谱-质谱联用(LCMS)；毛细管电泳(CE)；和毛细管凝胶电泳(CGE)。
体外转录
编码本文所述的多核苷酸的cDNA可使用体外转录(IVT)系统转录。RNA(例如，mRNA)的体外转录是本领域已知的，并且描述于国际公布WO 2014/152027中，所述国际公布以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，本公开的RNA根据WO 2018/053209或WO2019/036682中描述的任一种或多种方法制备，所述文献中的每一个以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，在体外转录反应中使用非扩增的线性化DNA模板生成RNA(例如，mRNA)转录物，以生成RNA转录物。在一些实施方案中，模板DNA是分离的DNA。在一些实施方案中，模板DNA是cDNA。在一些实施方案中，cDNA通过RNA(例如但不限于HSV mRNA)的逆转录形成。在一些实施方案中，用质粒DNA模板转染细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌，例如DH-1细胞。在一些实施方案中，培养转染的细胞以复制质粒DNA，然后分离并纯化该质粒DNA。在一些实施方案中，DNA模板包含RNA聚合酶启动子，例如位于目标基因的5'并与目标基因可操作地连接的T7启动子。
在一些实施方案中，体外转录模板编码5'非翻译(UTR)区，含有开放阅读框，并编码3'UTR和多聚(A)尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于模板所编码的RNA(例如，mRNA)。
在一些实施方案中，核酸(例如，模板DNA和/或RNA)包括200至3,000个核苷酸。例如，核酸可包含200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000个核苷酸。
体外转录系统通常包含转录缓冲液(例如，具有镁)、核苷酸三磷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)。在一些实施方案中，NTP中的一种或多种是经化学修饰的NTP(例如，用1-甲基假尿苷或本文所述和/或本领域已知的其他化学修饰)。
在一些实施方案中，NTP包含三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸尿苷(UTP)和三磷酸鸟苷(GTP)，或每个相应NTP的类似物。NTP的比率可以变化。在一些实施方案中，GTP:ATP:CTP:UTP的比率为1:1:1:1。在一些实施方案中，GTP或其类似物的量大于UTP或其类似物的量。在一些实施方案中，GTP的量大于UTP的量。在一些实施方案中，ATP的量大于UTP的量，并且CTP的量大于UTP的量。在一些实施方案中，GTP或其类似物的量大于UTP或其类似物的量。在一些实施方案中，IVT系统包含至少2:1比率的GTP浓度与ATP浓度、至少2:1比率的GTP浓度与CTP浓度和至少4:1比率的GTP浓度与UTP浓度。在一些实施方案中，IVT系统包含2:1比率的GTP浓度与ATP浓度、2:1比率的GTP浓度与CTP浓度和4:1比率的GTP浓度与UTP浓度。在一些实施方案中，IVT系统包含二磷酸鸟苷(GDP)。在一些实施方案中，IVT系统包含至少3:1比率的GTP加GDP浓度与ATP浓度、至少6:1比率的GTP加GDP浓度与CTP浓度和至少6:1比率的GTP加GDP浓度与UTP浓度。
NTP可内部制造，可从供应商处选择，或可如本文所述合成。NTP可选自但不限于本文所述的那些，包括天然和非天然(修饰的)NTP。
任何数量的RNA聚合酶或变体可以用于本公开的方法中。聚合酶可选自但不限于噬菌体RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和/或突变体聚合酶，例如但不限于能够并入修饰的核酸和/或修饰的核苷酸(包括化学修饰的核酸和/或核苷酸)中的聚合酶。一些实施方案排除了DNA酶的使用。
在一些实施方案中，IVT系统包含镁缓冲液、二硫苏糖醇(DTT)亚精胺、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，IVT系统省略了RNA酶抑制剂。IVT系统可以在25摄氏度或37摄氏度下孵育。可以使用其他温度，这部分地取决于聚合酶(例如，使用变体聚合酶)。
在一些实施方案中，RNA转录物经由酶促加帽来加帽。在一些实施方案中，RNA包含5'末端帽，例如7mG(5')ppp(5')NlmpNp。
鉴定和比率确定(IDR)序列
在一些实施方案中，一种或多种核酸包含鉴定和比率确定序列。鉴定和比率确定(IDR)序列是生物分子(例如，核酸或蛋白质)的序列，当与靶生物分子的序列组合时，其用于鉴定靶生物分子。通常，IDR序列是结合在靶生物分子的序列内或附加到靶生物分子的序列上的异源序列，并且可以用作鉴定靶分子的参考。因此，在一些实施方案中，核酸(例如，mRNA)包含(i)目标靶序列(例如，编码治疗性和/或抗原性肽或蛋白质的编码序列)；以及(ii)独特的IDR序列。
RNA种类(例如，具有给定编码序列的RNA)可包含与其他RNA种类(例如，具有不同编码序列的RNA)的IDR序列不同的IDR序列。因此，每个IDR序列鉴定特定的RNA种类，并且因此可以测量IDR序列的丰度以确定组合物中每个RNA种类的丰度。使用不同的IDR序列来鉴定RNA种类允许分析多价RNA组合物(例如，含有多个RNA种类)，所述多价RNA组合物含有编码序列和/或长度类似的RNA种类，使用基于PCR或色谱法的全长RNA分析可能难以区分这些RNA种类。
多价RNA组合物中的每个RNA种类可包含IDR序列，所述IDR序列并非是多价RNA组合物中的另一个RNA种类的IDR序列的序列异构体(例如，IDR序列不具有与组合物中的另一种IDR序列相同数量的腺苷核苷酸、相同数量的胞嘧啶核苷酸、相同数量的鸟嘌呤核苷酸和相同数量的尿嘧啶核苷酸，即使那些序列具有不同的序列)。具有相同的核苷酸组成导致序列异构体具有相同的质量，这对使用基于质量的鉴定方法(例如，质谱法)区分序列异构体提出了挑战。
多价RNA组合物中的每个RNA种类可包含IDR序列，其质量不同于多价RNA组合物中每个其他RNA种类的IDR序列的质量。例如，每个IDR序列的质量可以与其他IDR序列的质量相差至少9Da、至少25Da、至少25Da或至少50Da。使用具有不同质量的IDR序列允许使用基于质量的分析方法(例如，质谱法)来区分包含不同IDR序列的RNA片段，所述分析方法不需要对RNA进行逆转录、扩增或测序。
RNA组合物中的每个RNA种类可以包含具有不同长度的IDR序列。例如，每个IDR序列可以具有独立地选自0至25个核苷酸的长度。核酸的长度影响核酸穿过色谱柱的速率，因此在不同的RNA种类上使用不同长度的IDR序列允许使用基于色谱的方法(例如，LC-UV)来区分具有不同IDR序列的RNA片段。
可以选择IDR序列，使得没有IDR序列包含起始密码子“AUG”。在IDR序列中缺少起始密码子可防止IDR序列内和/或下游的核苷酸序列发生不期望的翻译。
可以选择IDR序列，使得没有IDR序列包含限制性酶的识别位点。在一个实例中，没有IDR序列包含XbaI的识别位点“UCUAG”。缺少限制性酶的识别位点(例如，XbaI识别位点“UCUAG”)允许限制性酶用于生成和修饰用于体外转录的DNA模板，而不影响IDR序列或转录后的RNA的序列。
不同IDR序列的非限制性实例包括：GAGAUUGAGU GUAGUGACUAG(SEQ ID NO:98)、GAGAUUGAGUGUAGUGAC(SEQ ID NO:99)、GAGAUUGAGUGUAGUG(SEQ ID NO:100)、GAUUGAGACUACGGG(SEQ ID NO:101)和CAUAGACACUACG(SEQ ID NO:102)。在本文所述的组合物的一些实施方案中，编码不同蛋白质的每个mRNA包含3'UTR，该3'UTR包含选自SEQ IDNO:98-102的不同IDR序列。
脂质组合物
在一些实施方案中，核酸被配制为脂质组合物，诸如包含脂质纳米颗粒、脂质体和/或脂质复合物的组合物。在一些实施方案中，核酸被配制为脂质纳米颗粒(LNP)组合物。脂质纳米颗粒通常包含氨基脂质、非阳离子脂质、结构脂质和PEG脂质组分以及目标核酸货物。脂质纳米颗粒可使用本领域通常已知的组分、组合物和方法生成，参见例如PCT/US2016/052352；PCT/US2016/068300；PCT/US2017/037551；PCT/US2015/027400；PCT/US2016/047406；PCT/US2016/000129；PCT/US2016/014280；PCT/US2017/038426；PCT/US2014/027077；PCT/US2014/055394；PCT/US2016/052117；PCT/US2012/069610；PCT/US2017/027492；PCT/US2016/059575；PCT/US2016/069491；PCT/US2016/069493；和PCT/US2014/066242，所述文献中的每一个以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含至少一种可电离氨基脂质、至少一种非阳离子脂质、至少一种固醇和/或至少一种聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为20-60％的可电离氨基脂质、5-25％的非阳离子脂质、25-55％的结构脂质和0.5-15％的经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为20-60％的可电离氨基脂质、5-30％的非阳离子脂质、10-55％的结构脂质和0.5-15％的经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含40-50mol％的可电离脂质，任选地45-50mol％，例如45-46mol％、46-47mol％、47-48mol％、48-49mol％或49-50mol％，例如约45mol％、45.5mol％、46mol％、46.5mol％、47mol％、47.5mol％、48mol％、48.5mol％、49mol％或49.5mol％。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含20-60mol％的可电离氨基脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含20-50mol％、20-40mol％、20-30mol％、30-60mol％、30-50mol％、30-40mol％、40-60mol％、40-50mol％或50-60mol％可电离氨基脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含20mol％、30mol％、40mol％、50mol％或60mol％的可电离氨基脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、39mol％、40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％、50mol％、51mol％、52mol％、53mol％、54mol％或55mol％的可电离氨基脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含45-55摩尔百分比(mol％)的可电离氨基脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55mol％的可电离氨基脂质。
可电离氨基脂质
式(AI)
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质是式(AI)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R'a为R'支链；其中
R'支链为：其中表示连接点；
其中Raα、Raβ、Raγ和Raδ各自独立地选自由C2-12烷基和C2-12烯基组成的组；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4选自由以下组成的组：-(CH2)nOH，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组，和
其中表示连接点；其中
R10为N(R)2；每个R独立地选自由C1-6烷基、C2-3烯基和H组成的组；并且n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'各自独立地选自由-C(O)O-和-OC(O)-组成的组；
R'为C1-12烷基或C2-12烯基；
l选自由1、2、3、4和5组成的组；并且
m选自由5、6、7、8、9、10、11、12和13组成的组。
在式(AI)化合物的一些实施方案中，R'a为R'支链；R'支链为 表示连接点；Raα、Raβ、Raγ和Raδ各自为H；R2和R3各自为C1-14烷基；R4为-(CH2)nOH；n为2；每个R5为H；每个R6为H；M和M'各自为-C(O)O-；R'为C1-12烷基；l为5；并且m为7。
在式(AI)化合物的一些实施方案中，R'a为R'支链；R'支链为 表示连接点；Raα、Raβ、Raγ和Raδ各自为H；R2和R3各自为C1-14烷基；R4为-(CH2)nOH；n为2；每个R5为H；每个R6为H；M和M'各自为-C(O)O-；R'为C1-12烷基；l为3；并且m为7。
在式(AI)化合物的一些实施方案中，R'a为R'支链；R'支链为 表示连接点；Raα为C2-12烷基；Raβ、Raγ和Raδ各自为H；R2和R3各自为C1-14烷基；R4为R10NH(C1-6烷基)；n2为2；R5为H；每个R6为H；M和M'各自为-C(O)O-；R'为C1-12烷基；l为5；并且m为7。
在式(AI)化合物的一些实施方案中，R'a为R'支链；R'支链为 表示连接点；Raα、Raβ和Raδ各自为H；Raγ为C2-12烷基；R2和R3各自为C1-14烷基；R4为-(CH2)nOH；n为2；每个R5为H；每个R6为H；M和M'各自为-C(O)O-；R'为C1-12烷基；l为5；并且m为7。
在一些实施方案中，式(AI)化合物选自：
在一些实施方案中，式(AI)的可电离氨基脂质是式(AIa)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链；其中
R'支链为：其中表示连接点；
其中Raβ、Raγ和Raδ各自独立地选自由C2-12烷基和C2-12烯基组成的组；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4选自由以下组成的组：-(CH2)nOH，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组，和
其中表示连接点；其中
R10为N(R)2；每个R独立地选自由以下组成的组：C1-6烷基、C2-3烯基和H；并且n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'各自独立地选自由-C(O)O-和-OC(O)-组成的组；
R'为C1-12烷基或C2-12烯基；
l选自由1、2、3、4和5组成的组；并且
m选自由5、6、7、8、9、10、11、12和13组成的组。
在一些实施方案中，式(AI)的可电离氨基脂质是式(AIb)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R'a为R'支链；其中
R'支链为：其中表示连接点；
其中Raα、Raβ、Raγ和Raδ各自独立地选自由C2-12烷基和C2-12烯基组成的组；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4为-(CH2)nOH，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'各自独立地选自由-C(O)O-和-OC(O)-组成的组；
R'为C1-12烷基或C2-12烯基；
l选自由1、2、3、4和5组成的组；并且
m选自由5、6、7、8、9、10、11、12和13组成的组。
在式(AI)或(AIb)的一些实施方案中，R'a为R'支链；R'支链为 表示连接点；Raβ、Raγ和Raδ各自为H；R2和R3各自为C1-14烷基；R4为-(CH2)nOH；n为2；每个R5为H；每个R6为H；M和M'各自为-C(O)O-；R'为C1-12烷基；l为5；并且m为7。
在式(AI)或(AIb)的一些实施方案中，R'a为R'支链；R'支链为 表示连接点；Raβ、Raγ和Raδ各自为H；R2和R3各自为C1-14烷基；R4为-(CH2)nOH；n为2；每个R5为H；每个R6为H；M和M'各自为-C(O)O-；R'为C1-12烷基；l为3；并且m为7。
在式(AI)或(AIb)的一些实施方案中，R'a为R'支链；R'支链为 表示连接点；Raβ和Raδ各自为H；Raγ为C2-12烷基；R2和R3各自为C1-14烷基；R4为-(CH2)nOH；n为2；每个R5为H；每个R6为H；M和M'各自为-C(O)O-；R'为C1-12烷基；l为5；并且m为7。
在一些实施方案中，式(AI)的可电离氨基脂质是式(AIc)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R'a为R'支链；其中
R'支链为：其中表示连接点；
其中Raα、Raβ、Raγ和Raδ各自独立地选自由C2-12烷基和C2-12烯基组成的组；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4为
其中表示连接点；其中R10为N(R)2；每个R独立地选自由C1-6烷基、C2-3烯基和H组成的组；n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'各自独立地选自由-C(O)O-和-OC(O)-组成的组；
R'为C1-12烷基或C2-12烯基；
l选自由1、2、3、4和5组成的组；并且
m选自由5、6、7、8、9、10、11、12和13组成的组。
在一些实施方案中，R'a为R'支链；R'支链为 表示连接点；Raβ、Ra γ和Raδ各自为H；Raα为C2-12烷基；R2和R3各自为C1-14烷基；R4为 表示连接点；R10为NH(C1-6烷基)；n2为2；每个R5为H；每个R6为H；M和M'各自为-C(O)O-；R'为C1-12烷基；l为5；并且m为7。
在一些实施方案中，式(AIc)化合物为：
在一些实施方案中，可电离氨基脂质是式(AII)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R'支链为：并且R'环状为：并且
R'b为：
其中表示连接点；
Raγ和Raδ各自独立地选自由H、C1-12烷基和C2-12烯基组成的组，其中Raγ和Raδ中的至少一者选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
Rbγ和Rbδ各自独立地选自由H、C1-12烷基和C2-12烯基组成的组，其中Rbγ和Rbδ中的至少一者选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4选自由以下组成的组：-(CH2)nOH，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组，和
其中表示连接点；其中R10为N(R)2；每个R独立地选自由C1-6烷基、C2-3烯基和H组成的组；并且n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
每个R'独立地为C1-12烷基或C2-12烯基；
Ya是C3-6碳环；
R*”a选自由C1-15烷基和C2-15烯基组成的组；并且
s是2或3；
m选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；
l选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在一些实施方案中，式(AII)的可电离氨基脂质是式(AII-a)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R'支链为：并且R'b为：
其中表示连接点；
Raγ和Raδ各自独立地选自由H、C1-12烷基和C2-12烯基组成的组，其中Raγ和Raδ中的至少一者选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
Rbγ和Rbδ各自独立地选自由H、C1-12烷基和C2-12烯基组成的组，其中Rbγ和Rbδ中的至少一者选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4选自由以下组成的组：-(CH2)nOH，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组，和
其中表示连接点；其中R10为N(R)2；每个R独立地选自由C1-6烷基、C2-3烯基和H组成的组；并且n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
每个R'独立地为C1-12烷基或C2-12烯基；
m选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；
l选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在一些实施方案中，式(AII)的可电离氨基脂质是式(AII-b)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R'支链为：并且R'b为：
其中表示连接点；
Raγ和Rbγ各自独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4选自由以下组成的组：-(CH2)nOH，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组，和
其中表示连接点；其中R10为N(R)2；每个R独立地选自由C1-6烷基、C2-3烯基和H组成的组；并且n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
每个R'独立地为C1-12烷基或C2-12烯基；
m选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；
l选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在一些实施方案中，式(AII)的可电离氨基脂质是式(AII-c)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R'支链为：并且R'b为：
其中表示连接点；
其中Raγ选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4选自由以下组成的组：-(CH2)nOH，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组，和
其中表示连接点；其中R10为N(R)2；每个R独立地选自由C1-6烷基、C2-3烯基和H组成的组；并且n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
R'为C1-12烷基或C2-12烯基；
m选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；
l选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在一些实施方案中，式(AII)的可电离氨基脂质是式(AII-d)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R'支链为：并且R'b为：
其中表示连接点；
其中Raγ和Rbγ各自独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
R4选自由以下组成的组：-(CH2)nOH，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组，和
其中表示连接点；其中R10为N(R)2；每个R独立地选自由C1-6烷基、C2-3烯基和H组成的组；并且n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
每个R'独立地为C1-12烷基或C2-12烯基；
m选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；
l选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在一些实施方案中，式(AII)的可电离氨基脂质是式(AII-e)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R'支链为：并且R'b为：
其中表示连接点；
其中Raγ选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4是-(CH2)nOH，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组；
R'为C1-12烷基或C2-12烯基；
m选自1、2、3、4、5、6、7、8和9；
l选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，m和l各自独立地选自4，5和6。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，m和l各自为5。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，每个R'独立地为C1-12烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，每个R'独立地为C2-5烷基。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'b为：并且R2和R3各自独立地为C1-14烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'b为：并且R2和R3各自独立地为C6-10烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'b为：并且R2和R3各自为C8烷基。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：并且R'b为：Raγ为C1-12烷基并且R2和R3各自独立地为C6-10烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：并且R'b为：Raγ为C2-6烷基并且R2和R3各自独立地为C6-10烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：并且R'b为：Raγ为C2-6烷基并且R2和R3各自为C8烷基。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：R'b为：并且Raγ和Rbγ各自为C1-12烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：R'b为：并且Raγ和Rbγ各自为C2-6烷基。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，m和l各自独立地选自4、5和6，并且每个R'独立地为C1-12烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，m和l各自为5，并且每个R'独立地为C2-5烷基。
在(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：R'b为：m和l各自独立地选自4、5和6，每个R'独立地为C1-12烷基，并且Raγ和Rbγ各自为C1-12烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：R'b为：m和l各自为5，每个R'独立地为C2-5烷基，并且Raγ和Rbγ各自为C2-6烷基。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：并且R'b为：m和l各自独立地选自4、5和6，R'为C1-12烷基，Raγ为C1-12烷基并且R2和R3各自独立地为C6-10烷基。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：并且R'b为：m和l各自为5，R'为C2-5烷基，Raγ为C2-6烷基，并且R2和R3各自为C8烷基。
在(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R4为其中R10为NH(C1-6烷基)并且n2为2。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R4为其中R10为NH(CH3)并且n2为2。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：R'b为：m和l各自独立地选自4、5和6，每个R'独立地为C1-12烷基，Raγ和Rbγ各自为C1-12烷基，并且R4为其中R10为NH(C1-6烷基)，并且n2为2。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：R'b为：m和l各自为5，每个R'独立地为C2-5烷基，Raγ和Rbγ各自为C2-6烷基，并且R4为其中R10为NH(CH3)并且n2为2。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：并且R'b为：m和l各自独立地选自4、5和6，R'为C1-12烷基，R2和R3各自独立地为C6-10烷基，Raγ为C1-12烷基，并且R4为其中R10为NH(C1-6烷基)并且n2为2。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：并且R'b为：m和l各自为5，R'为C2-5烷基，Raγ为C2-6烷基，R2和R3各自为C8烷基，并且R4为其中R10为NH(CH3)并且n2为2。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R4为-(CH2)nOH并且n为2、3或4。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R4为-(CH2)nOH并且n为2。
在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：R'b为：m和l各自独立地选自4、5和6，每个R'独立地为C1-12烷基，Raγ和Rbγ各自为C1-12烷基，R4为-(CH2)nOH，并且n为2、3或4。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)的化合物的一些实施方案中，R'支链为：R'b为：m和l各自为5，每个R'独立地为C2-5烷基，Raγ和Rbγ各自为C2-6烷基，R4为-(CH2)nOH，并且n为2。
在一些实施方案中，式(AII)的可电离氨基脂质是式(AII-f)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R'支链为：并且R'b为：
其中表示连接点；
Raγ是C1-12烷基；
R2和R3各自独立地是C1-14烷基；
R4是-(CH2)nOH，其中n选自由1、2、3、4和5组成的组；
R'是C1-12烷基；
m选自4、5和6；并且
l选自4、5和6。
在式(AII-f)化合物的一些实施方案中，m和l各自为5，并且n为2、3或4。
在式(AII-f)化合物的一些实施方案中，R'为C2-5烷基，Raγ为C2-6烷基，并且R2和R3各自为C6-10烷基。
在式(AII-f)化合物的一些实施方案中，m和l各自为5，并且n为2、3或4，R'为C2-5烷基，Raγ为C2-6烷基，并且R2和R3各自为C6-10烷基。
在一些实施方案中，式(AII)的可电离氨基脂质是式(AII-g)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体；其中
Raγ为C2-6烷基；
R'是C2-5烷基；并且
R4选自由以下组成的组：-(CH2)nOH，其中n选自由3、4和5组成的组，和
其中表示连接点，R10为NH(C1-6烷基)，并且n2选自由1、2和3组成的组。
在一些实施方案中，式(AII)的可电离氨基脂质是式(AII-h)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体；其中
Raγ和Rbγ独立地为C2-6烷基；
每个R'独立地是C2-5烷基；并且
R4选自由以下组成的组：-(CH2)nOH，其中n选自由3、4和5组成的组，和
其中表示连接点，R10为NH(C1-6烷基)，并且n2选自由1、2和3组成的组。
在式(AII-g)或(AII-h)的化合物的一些实施方案中，R4为其中
R10为NH(CH3)并且n2为2。
在式(AII-g)或(AII-h)的化合物的一些实施方案中，R4为-(CH2)2OH。
式(AIII)
一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质可以是式(AIII)化合物中的一者或多者：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4是-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2，或(ii)当n为1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
在一些实施方案中，式(AIII)化合物的另一个子集包括满足以下条件的那些，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5元至14元杂环烷基，所述杂环烷基被一个或多个选自氧代(＝O)、OH、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基和C1-3烷基的取代基取代，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(AIII)化合物的另一个子集包括满足以下条件的那些，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR9)N(R)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当Q为5元至14元杂环且(i)R4为-(CH2)nQ，其中n为1或2，或(ii)R4为-(CH2)nCHQR，其中n为1，或(iii)R4为-CHQR和-CQ(R)2时，则Q为5元至14元杂芳基或8元至14元杂环烷基；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(AIII)化合物的另一个子集包括满足以下条件的那些，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR9)N(R)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(AIII)化合物的另一个子集包括满足以下条件的那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4为-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q为-N(R)2，并且n选自3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C1-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(AIII)化合物的另一个子集包括满足以下条件的那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环；
R4选自由-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2组成的组，其中Q为-N(R)2，并且n选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C1-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在某些实施方案中，式(AIII)化合物的子集包括式(AIII-A)的那些：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M'；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、
-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R')-、-P(O)(OR')O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。例如，m为5、7或9。例如，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。例如，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在某些实施方案中，式(AIII)化合物的子集包括式(AIII-B)的那些：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中所有变量如本文所定义。例如，m选自5、6、7、8和9；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为H、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R')-、-P(O)(OR')O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。例如，m为5、7或9。例如，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。例如，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在某些实施方案中，式(AIII)化合物的子集包括式(AIII-C)的那些：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1为键或M'；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n为2、3或4，并且Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)M”-C(O)O-、-C(O)N(R')-、-P(O)(OR')O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，式(AIII)化合物具有式(AIII-D)，
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所描述。
在另一个实施方案中，式(AIII)化合物具有式(AIII-E)，
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所描述。
在另一个实施方案中，式(AIII)化合物具有式(AIII-F)或(AIII-G)：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所描述。
在另一个实施方案中，式(AIII)化合物具有式(AIII-H)：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中M为-C(O)O-或-OC(O)-，M”为C1-6烷基或C2-6烯基，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组，并且n选自2、3和4。
在另外的实施方案中，式(AIII)化合物具有式(AIII-I)：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、R'、R”和R2至R6如本文所述。例如，R2和R3各自可独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质包含具有以下结构的化合物：
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质包含具有以下结构的化合物：
在另外的实施方案中，式(AIII)化合物具有式(AIII-J)，
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M'；M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R')-、-P(O)(OR')O-、-S-S-、芳基基团和杂芳基基团；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。例如，M”为C1-6烷基(例如，C1-4烷基)或C2-6烯基(例如，C2-4烯基)。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，可电离氨基脂质具有式(AIII)，或其盐或异构体，其中：
R1为-R”M'R'；
R2和R3各自独立地选自C1-14烷基和C2-14烯基；
R4为-(CH2)nQ，其中Q为OH并且n选自3、4和5；
M和M'各自独立地为-OC(O)-；
R5、R6和R7各自为H；
R'为直链C1-12烷基，或被C6-9烷基取代的C1-12烷基；
R”为C3-14烷基；
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在一些实施方案中，可电离氨基脂质具有式(AIII)，或其盐或异构体，其中：
R1为R”M'R'；
R2和R3各自独立地为C1-14烷基；
R4为-(CH2)nQ，其中Q为OH并且n为4；
M和M'各自独立地为-OC(O)-；
R5、R6和R7各自为H；
R'为被C6-9烷基取代的C1-12烷基；
R”为C3-14烷基；并且
m为6。
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质包含具有以下结构的化合物：
在一些实施方案中，可电离氨基脂质具有式(AIII)，或其盐或异构体，其中：
R1为C5-20烯基；
R2和R3各自独立地选自C1-14烷基和C2-14烯基；
R4为-(CH2)nQ，其中Q为OH并且n选自3、4和5；
M和M'各自独立地为C(O)O-；
R5、R6和R7各自为H；
R'为直链C1-12烷基，或被C6-9烷基取代的C1-12烷基；
R”为C3-14烷基；
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在一些实施方案中，可电离氨基脂质具有式(AIII)，或其盐或异构体，其中：
R1为C5-20烯基；
R2和R3各自独立地为C1-14烷基；
R4为-(CH2)nQ，其中Q为OH并且n为3；
M为-C(O)O-；
R5、R6和R7各自为H；并且
m为6。
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质包含具有以下结构的化合物：
在一些实施方案中，可电离氨基脂质是美国申请号62/220,091、62/252,316、62/253,433、62/266,460、62/333,557、62/382,740、62/393,940、62/471,937、62/471,949、62/475,140和62/475,166以及PCT申请号PCT/US2016/052352中所描述的化合物中的一者或多者。
根据式(AIII)、(AIII-A)、(AIII-B)、(AIII-C)、(AIII-D)、(AIII-E)、(AIII-F)、(AIII-G)、(AIII-H)、(AIII-I)或(AIII-J)的脂质的中心胺部分可在生理pH下质子化。因此，脂质在生理pH下可具有正电荷或部分正电荷。此类氨基脂质可称为阳离子脂质、可电离脂质、阳离子氨基脂质或可电离氨基脂质。氨基脂质还可以是两性离子的，即，具有正电荷和负电荷两者的中性分子。
式(AIV)
一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质可以是式(AIV)化合物中的一者或多者，
或其盐或异构体，其中
W是
环A为
t为1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z是CH2或不存在，其中当Z是CH2时，虚线(1)和(2)各自表示单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和(2)都不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由C5-20烷基、C5-20烯基、-R"MR'、-R*YR"、-YR"和-R*OR"组成的组；
RX1和RX2各自独立地是H或C1-3烷基；
每个M独立地选自由-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基基团和杂芳基基团组成的组；
M*为C1-C6烷基，
W1和W2各自独立地选自由-O-和-N(R6)-组成的组；
每个R6独立地选自由H和C1-5烷基组成的组；
X1、X2和X3独立地选自由键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)O-、-OC(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-OC(O)-、-C(O)O-(CH2)n-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基和C3-6碳环组成的组；
每个R'独立地选自由C1-12烷基、C2-12烯基和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-12烷基、C3-12烯基和-R*MR'组成的组；并且
n是1-6的整数；
其中当环A为时，则
i)X1、X2和X3中的至少一者不是-CH2-；和/或
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为-R”MR'。
在一些实施方案中，化合物具有式(AIVa)-(AIVh)中的任一者：
在一些实施方案中，可电离氨基脂质为
或其盐。
式(AIV)、(AIVa)、(AIVb)、(AIVc)、(AIVd)、(AIVe)、(AIVf)、(AIVg)或(AIVh)的脂质的中心胺部分可以在生理pH下质子化。因此，脂质在生理pH值下可以具有正电荷或部分正电荷。
式(AV)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R1为任选取代的C1-C24烷基或任选取代的C2-C24烯基；
R2和R3各自独立地为任选取代的C1-C36烷基；
R4和R5各自独立地为任选取代的C1-C6烷基，或者R4和R5与它们所连接的N一起连接形成杂环基或杂芳基；
L1、L2和L3各自独立地为任选取代的C1-CI8亚烷基；
G1为直接键、-(CH2)nO(C＝O)-、-(CH2)n(C＝O)O-或-(C＝O)-；
G2和G3各自独立地为-(C＝O)O-或-0(C＝O)-；并且n为大于0的整数。
式(AVI)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
G1为-N(R3)R4或-OR5；
R1为任选取代的支链、饱和或不饱和的C12-C36烷基；
当L为-C(＝O)-时，R2为任选取代的支链或非支链的、饱和或不饱和的C12-C36烷基；或当L为C6-C12亚烷基、C6-C12亚烯基或C2-C6亚炔基时，R2为任选取代的支链或非支链的、饱和或不饱和的C4-C36烷基；
R3和R4各自独立地为H、任选取代的支链或非支链的、饱和或不饱和的C1-C6烷基；或当L为C6-C12亚烷基、C6-C12亚烯基或C2-C6亚炔基时，R3和R4各自独立地为任选取代的支链或非支链的、饱和或不饱和的C1-C6烷基；或R3和R4与它们所连接的氮一起连接形成杂环基；
R5为H或任选取代的C1-C6烷基；
L为-C(＝O)-、C6-C12亚烷基、C6-C12亚烯基或C2-C6亚炔基；并且
n为1至12的整数。
式(AVII)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Rla独立地为氢、Rlc或Rld；
每个Rlb独立地为Rlc或Rld；
每个R1c独立地为-[CH2]2C(O)X1R3；
每个Rld独立地为-C(O)R4；
每个R2独立地为-[C(R2a)2]cR2b；
每个R2a独立地为氢或C1-C6烷基；
R2b为-N(L1-B)2；-(OCH2CH2)6OH；或-(OCH2CH2)bOCH3；
每个R3和R4独立地为C6-C30脂肪族；
每个I.3独立地为C1-C10亚烷基；
每个B独立地为氢或可电离的含氮基团；
每个X1独立地为共价键或O；
每个a独立地为1-10的整数；
每个b独立地为1-10的整数；并且
每个c独立地为1-10的整数。
式(AVIII)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
X为N，且Y不存在；或X为CR，且Y为NR；
L1为-O(C-O)R1、-(C＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc或-NRaC(＝O)OR1；
L2为-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf；-NRdC(＝O)OR2或与R2的直接键；
L3为-O(C＝O)R3或-(C＝O)OR3；
G1和G2各自独立地为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
当X为CR且Y为NR时，G3为C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C1-C24杂亚烷基或C2-C24杂亚烯基；并且当X为N且Y不存在时，G3为C1-C24杂亚烷基或C2-C24杂亚烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地为H或C1-C12烷基或C1-C12烯基；
Rc和Rf各自独立地为C1-C12烷基或C2-C12烯基；
每个R独立地为H或C1-C12烷基；
R1、R2和R3各自独立地为C1-C24烷基或C2-C24烯基；并且x为0、1或2，并且
其中每个烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、杂亚烷基和杂亚烯基独立地为取代的或未取代的，除非另有说明。
式(AIX)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1和L2各自独立地为-0(C＝0)-、-(C＝0)0-、-C(＝0)-、-0-、-S(0)x-s-S-S-、-C(＝0)S-、-SC(＝0)-、-NRaC(＝0)-、-C(＝0)NRa-、-NRaC(＝0)NRa-、-OC(＝0)NRa-、-NRaC(＝0)0-或直接键；
G1为C、-C2亚烷基、-(C＝0)-、-0(C＝0)-、-SC(＝0)-、-NRaC(＝0)-或直接键；
G2为-C(0)-、-(CO)O-、-C(＝0)S-、-C(＝0)NRa-或直接键；
G3为C1-C6亚烷基；
Ra为H或C1-C12烷基；
Rla和Rlb在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)Rla为H或C1-C12烷基，并且RIb与其所键合的碳原子一起与相邻的Rlb及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R2a为H或C1-C12烷基，并且R2b与其所键合的碳原子一起与相邻的R2b及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为(a)：H或C1-C12烷基；或(b)R3a为H或C1-C12烷基，并且R3b与其所键合的碳原子一起与相邻的R及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R4A和R4B在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R4A为H或C1-C12烷基，并且R4B与其所键合的碳原子一起与相邻的R4B及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地为H或甲基；
R7为H或C、-C20烷基；
R8为OH、-N(R9)(C＝0)R10、-(C＝0)NR9R10、-NR9R10、-(C＝0)0R"1或-0(C＝0)R"，前提是当R8为-NR9R10时，G3为C4-C6亚烷基，
R9和R10各自独立地为H或C1-C12烷基；
R"为芳烷基；
a、b、c和d各自独立地为1至24的整数；并且x为0、1或2，
其中每个烷基、亚烷基和芳烷基为任选取代的。
式(AX)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
X和X'各自独立地为N或CR；
Y和Y'各自独立地不存在，为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或NR，前提是：
a)当X为N时，Y不存在；
b)当X'为N时，Y'不存在；
c)当X为CR时，Y为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或NR；以及
d)当X'为CR时，Y'为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或NR，
L1和L1'各自独立地为-O(C＝O)R'、-(C＝O)OR'、-C(＝O)R'、-OR1、-S(O)zR'，-S-SR1、-C(＝O)SR'、-SC(＝O)R'、-NRaC(＝O)R'、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc，-OC(＝O)NRbRc或-NRaC(＝O)OR'；
L2和L2'各自独立地为-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)zR2，-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf，-OC(＝O)NReRf；-NRdC(＝O)OR2或与R2的直接键；
G1。G1'、G2和G2'各自独立地为C2-Ci2亚烷基或C2-C12亚烯基；
G为C2-C24杂亚烷基或C2-C24杂亚烯基；
Ra、Rb、Rd和Re在每次出现时独立地为H、C1-C12烷基或C2-C12烯基；
Rc和Rf在每次出现时独立地为C1-C12烷基或C2-C12烯基；
R在每次出现时独立地为H或C1-C12烷基；
R1和R2在每次出现时独立地为支链C6-C24烷基或支链C6-C24烯基；
z为0、1或2，并且其中每个烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、杂亚烷基和杂亚烯基独立地为取代的或未取代的，除非另有说明。
式(AXI)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
L1为-O(C＝O)R1、-(C＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1，-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc或-NRaC(＝O)OR1；
L2为-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2，-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf；-NRdC(＝O)OR2或与R2的直接键；
G1和G2各自独立地为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3为C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地为H或C1-C12烷基或C1-C12烯基；
Rc和Rf各自独立地为C1-C12烷基或C2-C12烯基；
R1和R2各自独立地为支链C6-C24烷基或支链C6-C24烯基；
R3为-N(R4)R5；
R4为C1-C12烷基；
R5为取代的C1-C12烷基；并且
x为0、1或2，并且
其中每个烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基、亚环烯基、芳基和芳烷基独立地为取代的或未取代的，除非另有说明。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
L1为-O(C＝O)R1、-(C＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc或-NRaC(＝O)OR1；
L2为-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf；-NRdC(＝O)OR2或与R2的直接键；
G1a和G2b各自独立地为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G1b和G2b各自独立地为C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3为C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地为H或C1-C12烷基或C2-C12烯基；
Rc和Rf各自独立地为C1-C12烷基或C2-C12烯基；
R1和R2各自独立地为支链C6-C24烷基或支链C6-C24烯基；
R3a为-C(＝O)N(R4a)R5a或-C(＝O)OR6；
R3b为-NR4bC(＝O)R5b；
R4a为C1-C12烷基；
R4b为H、C1-C12烷基或C2-C12烯基；
R5a为H、C1-C8烷基或C2-C8烯基；
当R4b为H时，R5b为C2-C12烷基或C2-C12烯基；或当R4b为C1-C12烷基或C2-C12烯基时，R5b为C1-C12烷基或C2-C12烯基；
R6为H、芳基或芳烷基；并且
x为0、1或2，并且
其中每个烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基、亚环烯基、芳基和芳烷基独立地为取代的或未取代的。
式(AXII)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1为-OH、-R3R4、-(C＝0)R5或-R3(C＝0)R5；
G2为-CH2-或-(C＝0)-；
R在每次出现时独立地为H或OH；
R1和R2各自独立地为任选取代的支链、饱和或不饱和的C12-C36烷基；
R3和R4各自独立地为H或任选取代的直链或支链、饱和或不饱和的Ci-C6烷基；
R5为任选取代的直链或支链、饱和或不饱和的Ci-C6烷基；并且
n为2至6的整数。
式(AXIII)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1或G2中的每一者在每次出现时为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-N(Ra)C(＝O)-、-C(＝O)N(Ra)-、-N(Ra)C(＝O)N(Ra)-、-OC(＝O)N(Ra)-或-N(Ra)C(＝O)O-，并且G1或G2中的另一者在每次出现时为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-N(Ra)C(＝O)-、-C(＝O)N(Ra)-、-N(Ra)C(＝O)N(Ra)-、-OC(＝O)N(Ra)-或-N(Ra)C(＝O)O-或直接键；
L在每次出现时为～O(C＝O)-，其中～表示与X的共价键；
X为CRa；
当n为1时，Z为烷基、环烷基或包含至少一个极性官能团的单价部分；或当n大于1时，Z为亚烷基、亚环烷基或包含至少一个极性官能团的多价部分；
Ra在每次出现时独立地为H、C1-C12烷基、C1-C12羟基烷基、C1-C12氨基烷基、C1-C12烷基氨基烷基、C1-C12烷氧基烷基、C1-C12烷氧基羰基、C1-C12烷基羰基氧基、C1-C12烷基羰基氧基烷基或C1-C12烷基羰基；
R在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R与其所键合的碳原子一起与相邻的R及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R1和R2在每次出现时分别具有以下结构：
a1和a2在每次出现时独立地为3至12的整数；b1和b2在每次出现时独立地为0或1；
c1和c2在每次出现时独立地为5至10的整数；d1和d2在每次出现时独立地为5至10的整数；y在每次出现时独立地为0至2的整数；并且n为1至6的整数，
其中每个烷基、亚烷基、羟基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、烷基羰基氧基烷基和烷基羰基任选地被一个或多个取代基取代。
式(AXIV)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
L1或L2中的一者为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-RaC(＝O)-、-C(＝O)Ra-、RaC(＝O)Ra-、-OC(＝O)Ra-或-RaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一者为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-RaC(＝O)-、-C(＝O)Ra-、RaC(＝O)Ra-、-OC(＝O)Ra-或-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地为未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3为C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra为H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3为H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-R5C(＝O)R4；
R4为C1-C12烷基；
R5为H或C1-C6烷基；并且
x为0、1或2。
式(AXV)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1和L2各自独立地为-0(C＝0)-、-(C＝0)0-、-C(＝0)-、-0-、-S(0)x-、-S-S-、-C(＝0)S-、-SC(＝0)-、-RaC(＝0)-、-C(＝0)Ra-、-RaC(＝0)Ra-、-OC(＝0)Ra-、-RaC(＝0)0-或直接键；
G1为Ci-C2亚烷基、-(C＝0)-、-0(C＝0)-、-SC(＝0)-、-RaC(＝0)-或直接键：
G2为-C(＝0)-、-(C＝0)0-、-C(＝0)S-、-C(＝0)NRa-或直接键；
G3为C1-C6亚烷基；
Ra为H或C1-C12烷基；
Rla和Rlb在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)Rla为H或C1-C12烷基，并且Rlb与其所键合的碳原子一起与相邻的Rlb及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R2a为H或C1-C12烷基，并且R2b与其所键合的碳原子一起与相邻的R2b及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为(a)：H或C1-C12烷基；或(b)R3a为H或C1-C12烷基，并且R3b与其所键合的碳原子一起与相邻的R及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R4a为H或C1-C12烷基，并且R4b与其所键合的碳原子一起与相邻的R4b及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地为H或甲基；
R7为C4-C20烷基；
R8和R9各自独立地为C1-C12烷基；或R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环；
a、b、c和d各自独立地为1至24的整数；并且x为0、1或2。
式(AXVI)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1和L2各自独立地为-0(C＝0)-、-(C＝0)0-或碳-碳双键；
Rla和Rlb在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或(b)Rla为H或C1-C12烷基，并且Rlb与其所键合的碳原子一起与相邻的Rlb及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或(b)R2a为H或C1-C12烷基，并且R2b与其所键合的碳原子一起与相邻的R2b及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或(b)R3a为H或C1-C12烷基，并且R3b与其所键合的碳原子一起与相邻的R3b及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或(b)R4a为H或C1-C12烷基，并且R4b与其所键合的碳原子一起与相邻的R4b及其所键合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地为甲基或环烷基；
R7在每次出现时独立地为H或C1-C12烷基；R8和R9各自独立地为未取代的C1-C12烷基；或R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成包含一个氮原子的5、6或7元杂环；
a和d各自独立地为0至24的整数；b和c各自独立地为1至24的整数；并且e为1或2，
前提是：
Rla、R2a、R3a或R4a中的至少一者为C1-C12烷基，或L1或L2中的至少一者为-0(C＝0)-或-(C＝0)0-；并且
当a为6时，Rla和Rlb不是异丙基，并且当a为8时，二者不是正丁基。
式(AXVII)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐，其中
R1和R2相同或不同，各自为具有1-9个碳的直链或支链烷基，或为具有2至11个碳原子的烯基或炔基，
L1和L2相同或不同，各自为具有5至18个碳原子的直链烷基，或与N形成杂环，
X1为键，或为-CG-G-，由此形成L2-CO-O-R2，
X2为S或O，
L3为键或低级烷基，或与N形成杂环，
R3为低级烷基，并且
R4和R5相同或不同，各自为低级烷基。
化合物(A1)-(A11)
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的可电离脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
非阳离子脂质
在某些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒包含一种或多种非阳离子脂质。非阳离子脂质可以是磷脂。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含5-25mol％非阳离子脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含5-20mol％、5-15mol％、5-10mol％、10-25mol％、10-20mol％、10-25mol％、15-25mol％、15-20mol％或20-25mol％非阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含5mol％、10mol％、15mol％、20mol％或25mol％非阳离子脂质。
在一些实施方案中，本公开的非阳离子脂质包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂或它们的混合物。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含5-15mol％、5-10mol％或10-15mol％的DSPC。例如，脂质纳米颗粒可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mol％DSPC。
在某些实施方案中，本文所公开的脂质纳米颗粒组合物的脂质组合物可以包含一种或多种磷脂，例如，一种或多种饱和或(多)不饱和磷脂或它们的组合。一般来说，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可选自例如由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂组成的非限制性组。
脂肪酸部分可选自例如由月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚麻油酸、α-次亚麻油酸、芥子酸、植烷酸、花生酸、花生油酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸组成的非限制性组。
特定磷脂可促进与膜的融合。举例来说，阳离子磷脂可以与膜(例如，细胞膜或细胞内膜)的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可以允许含脂质的组合物(例如，LNP)的一种或多种要素(例如，治疗剂)通过膜，从而允许例如将所述一种或多种要素递送至靶组织。
还预期非天然磷脂物质，包括具有包括支链、氧化、环化和炔烃在内的修饰和取代的天然物质。举例来说，磷脂可以被一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键置换的烯基)官能化或与所述一种或多种炔烃交联。在适当反应条件下，炔烃基团可以在暴露于叠氮化物后经历铜催化的环加成。此类反应可用于将纳米颗粒组合物的脂质双层官能化以促进膜渗透或细胞识别，或者可用于使纳米颗粒组合物缀合至可用组分，诸如靶向或成像部分(例如，染料)。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括磷酸鞘脂，诸如鞘磷脂。
在一些实施方案中，磷脂包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂或它们的混合物。
式(HI)
在某些实施方案中，磷脂是DSPC的类似物或变体。在某些实施方案中，磷脂是式(HI)化合物：
或其盐，其中：
每个R1独立地是任选取代的烷基；或者任选地两个R1与间插原子连接在一起以形成任选取代的单环碳环基或任选取代的单环杂环基；或者任选地三个R1与间插原子连接在一起以形成任选取代的双环碳环基或任选取代的双环杂环基；
n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有下式：
L2在每种情况下独立地是键或任选取代的C1-6亚烷基，其中任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
R2在每种情况下独立地是任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；
RN在每种情况下独立地是氢、任选取代的烷基或氮保护基；
环B是任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p为1或2。
在某些实施方案中，化合物不具有下式：
其中R2的每个示例独立地为未取代的烷基、未取代的烯基或未取代的炔基。
在一些实施方案中，磷脂可以是PCT申请号PCT/US2018/037922中描述的磷脂中的一种或多种。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含相对于其他脂质组分，摩尔比为5-25％的非阳离子脂质。例如，脂质纳米颗粒可以包含摩尔比为5-30％、5-15％、5-10％、10-25％、10-20％、10-25％、15-25％、15-20％、20-25％或25-30％的非阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为5％、10％、15％、20％、25％或30％的非阳离子脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含相对于其他脂质组分，摩尔比为5-25％的磷脂。例如，脂质纳米颗粒可以包含摩尔比为5-30％、5-15％、5-10％、10-25％、10-20％、10-25％、15-25％、15-20％、20-25％或25-30％的磷脂。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为5％、10％、15％、20％、25％或30％的磷脂脂质。
结构脂质
本文所公开的药物组合物的脂质组合物可以包含一种或多种结构脂质。如本文所用，术语“结构脂质”包括固醇并且还指含有固醇部分的脂质。
在脂质纳米颗粒中掺入结构脂质可帮助减轻颗粒中其他脂质的聚集。结构脂质可选自包括但不限于胆固醇、粪固醇、植固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、西红柿碱、西红柿苷、熊果酸、α-生育酚、藿烷、植物固醇、类固醇以及它们的混合物的组。在一些实施方案中，结构脂质为固醇。如本文所定义，“固醇”是由类固醇类醇组成的类固醇子组。在某些实施方案中，结构脂质是类固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇的类似物。在某些实施方案中，结构脂质是α-生育酚。
在一些实施方案中，结构脂质可以是美国申请号16/493,814中所描述的一种或多种结构脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含相对于其他脂质组分，摩尔比为25-55％的结构脂质。举例来说，脂质纳米颗粒可以包含摩尔比为10-55％、25-50％、25-45％、25-40％、25-35％、25-30％、30-55％、30-50％、30-45％、30-40％、30-35％、35-55％、35-50％、35-45％、35-40％、40-55％、40-50％、40-45％、45-55％、45-50％或50-55％的结构脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的结构脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含30-45mol％的固醇，任选地35-40mol％，例如，30-31mol％、31-32mol％、32-33mol％、33-34mol％、35-35mol％、35-36mol％、36-37mol％、38-38mol％、38-39mol％或39-40mol％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含25-55mol％固醇。例如，脂质纳米颗粒可包含25-50mol％、25-45mol％、25-40mol％、25-35mol％、25-30mol％、30-55mol％、30-50mol％、30-45mol％、30-40mol％、30-35mol％、35-55mol％、35-50mol％、35-45mol％、35-40mol％、40-55mol％、40-50mol％、40-45mol％、45-55mol％、45-50mol％或50-55mol％甾醇。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％或55mol％的固醇。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含35-40mol％的胆固醇。例如，脂质纳米颗粒可包含35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5或40mol％胆固醇。
聚乙二醇(PEG)-脂质
本文所公开的药物组合物的脂质组合物可以包含一种或多种聚乙二醇(PEG)脂质。
如本文所用，术语“PEG-脂质”或“PEG修饰的脂质”是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。PEG-脂质的非限制性实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。此类脂质也被称作PEG化脂质。举例来说，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG-脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二硬脂基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油烯基、PEG-二油烯基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一些实施方案中，PEG-脂质选自由PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油和它们的混合物组成的组。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是PEG-DMG、PEG-c-DOMG(也称作PEG-DOMG)、PEG-DSG和/或PEG-DPG。
在一些实施方案中，PEG-脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22、优选约C14至约C16的那些。在一些实施方案中，PEG部分(例如，mPEG-NH2)的大小为约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG-脂质是PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可包含PEG脂质，其为不可扩散PEG。不可扩散PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG-脂质是本领域中已知的，诸如美国专利号8158601和国际公布号WO 2015/130584 A2中所描述的那些，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
一般来说，本文所述的各式的一些其他脂质组分(例如，PEG脂质)可如2016年12月10日提交的标题为“Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents”的国际专利申请第PCT/US2016/000129号中所述合成，所述专利申请以引用的方式整体并入。
脂质纳米颗粒组合物的脂质组分可以包括一种或多种包含聚乙二醇的分子，诸如PEG或PEG修饰的脂质。此类物质可替代地称为PEG化脂质。PEG脂质是用聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可选自包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物的非限制性组。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是经修饰的PEG DMG。PEG-DMG具有以下结构：
在一些实施方案中，PEG脂质可为描述于国际公布第WO2012099755号中的PEG化脂质，所述国际公布的内容以引用的方式整体并入本文。本文所述的这些示例性PEG脂质中的任一者均可经修饰为在PEG链上包含羟基。在某些实施方案中，PEG脂质是PEG-OH脂质。如本文一般所定义，“PEG-OH脂质”(本文中也称为“羟基-PEG化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)基团的PEG化脂质。在某些实施方案中，PEG-OH脂质包含在PEG链上的一个或多个羟基。在某些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质包含在PEG链的末端的-OH基团。每种可能性代表单独的实施方案。
式(PI)
在某些实施方案中，PEG脂质是式(PI)化合物：
或其盐，其中：
R3是-ORO；
RO是氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r是介于1与100之间的整数，首尾包括在内；
L1是任选取代的C1-10亚烷基，其中任选取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可裂解的部分；
m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有下式：
L2在每种情况下独立地是键或任选取代的C1-6亚烷基，其中任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
R2在每种情况下独立地是任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；
RN在每种情况下独立地是氢、任选取代的烷基或氮保护基；
环B是任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p为1或2。
在某些实施方案中，式(PI)化合物为PEG-OH脂质(即，R3为-ORO，并且RO为氢)。在某些实施方案中，式(PI)化合物具有式(PI-OH)：
或其盐。
式(PII)
在某些实施方案中，PEG脂质是PEG化的脂肪酸。在某些实施方案中，PEG脂质是式(PII)化合物。在一些实施方案中，式(PII)化合物具有下式：
或其盐，其中：
R3是-ORO；
RO是氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r是介于1与100之间的整数，首尾包括在内；
R5是任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地R5的一个或多个亚甲基被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN在每种情况下独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基。
在某些实施方案中，式(PII)化合物具有式(PII-OH)：
或其盐。在一些实施方案中，r为40-50。
在其他实施方案中，式(PII)化合物是：
或其盐。
在一些实施方案中，式(PII)化合物是
在一些实施方案中，本文所公开的药物组合物的脂质组合物不包含PEG-脂质。
在一些实施方案中，PEG-脂质可以是美国申请号US15/674,872中所描述的一种或多种PEG脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含相对于其他脂质组分，摩尔比为0.5-15％的PEG脂质。举例来说，脂质纳米颗粒可以包含摩尔比为0.5-10％、0.5-5％、1-15％、1-10％、1-5％、2-15％、2-10％、2-5％、5-15％、5-10％或10-15％的PEG脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的PEG-脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含1-5％的PEG修饰的脂质，任选地1-3mol％，例如，1.5至2.5mol％、1-2mol％、2-3mol％、3-4mol％或4-5mol％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含0.5-15mol％PEG修饰的脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含0.5-10mol％、0.5-5mol％、1-15mol％、1-10mol％、1-5mol％、2-15mol％、2-10mol％、2-5mol％、5-15mol％、5-10mol％或10-15mol％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含0.5mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％PEG修饰的脂质。
一些实施方案包括将PEG添加到包含包封核酸的LNP的组合物中(例如，所述组合物已经包含上述量的PEG)。在实施方案中，包括在形成LNP组合物(例如，其已经含有本文别处列出的量的PEG)之后，向LNP组合物中添加约0.5mol％或更多的PEG，诸如约1mol％、约1.5mol％、约2mol％、约2.5mol％、约3mol％、约3.5mol％、约4mol％、约5mol％或更多。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离氨基脂质、5-25mol％非阳离子脂质、25-55mol％固醇和0.5-15mol％PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含化合物1的可电离氨基脂质，其中非阳离子脂质是DSPC，结构脂质是胆固醇，并且PEG脂质是DMG-PEG。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含化合物2的可电离氨基脂质，其中非阳离子脂质是DSPC，结构脂质是胆固醇，并且PEG脂质是DMG-PEG。
在一些实施方案中，LNP包含式(AIII)、(AIV)或(AV)中任一者的可电离氨基脂质、包含DSPC的磷脂、结构脂质和包含PEG-DMG的PEG脂质。
在一些实施方案中，LNP包含式(AIII)、(AIV)或(AV)中任一者的可电离氨基脂质、包含DSPC的磷脂、结构脂质和包含具有式(PII)的化合物的PEG脂质。
在一些实施方案中，LNP包含式(AIII)、(AIV)或(AV)的可电离氨基脂质、包含具有式(HI)的化合物的磷脂、结构脂质和包含具有式(PI)或(PII)的化合物的PEG脂质。
在一些实施方案中，LNP包含式(AIII)、(AIV)或(AV)的可电离氨基脂质、包含具有式(HI)的化合物的磷脂、结构脂质和包含具有式(PI)或(PII)的化合物的PEG脂质。
在一些实施方案中，LNP包含式(AIII)、(AIV)或(AV)的可电离氨基脂质、具有式(HI)的磷脂、结构脂质和包含具有式(PII)的化合物的PEG脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含49mol％的可电离氨基脂质、10mol％的DSPC、38.5mol％的胆固醇和2.5mol％的DMG-PEG。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含49mol％的可电离氨基脂质、11mol％的DSPC、38.5mol％的胆固醇和1.5mol％的DMG-PEG。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含48mol％的可电离氨基脂质、11mol％的DSPC、38.5mol％的胆固醇和2.5mol％的DMG-PEG。
在一些实施方案中，LNP包含约2:1至约30:1的N:P比。
在一些实施方案中，LNP包含约6:1的N:P比。
在一些实施方案中，LNP包含约3:1、4:1或5:1的N:P比。
在一些实施方案中，LNP包含约10:1至约100:1的可电离氨基脂质组分与RNA的重量/重量比。
在一些实施方案中，LNP包含约20:1的可电离氨基脂质组分与RNA的重量/重量比。
在一些实施方案中，LNP包含约10:1的可电离氨基脂质组分与RNA的重量/重量比。
一些实施方案包含具有一种或多种LNP的组合物，所述一种或多种LNP具有约150nm或更小，诸如约140nm、130nm、120nm、110nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm或20nm或更小的直径。一些实施方案包含具有约150nm或更小，诸如约140nm、130nm、120nm、110nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm或20nm或更小的平均LNP直径的组合物。在一些实施方案中，组合物具有约30nm至约150nm的平均LNP直径，或约60nm至约120nm的平均直径。
LNP可包含一种或多种类型的脂质，包括但不限于氨基脂质(例如，可电离的氨基脂质)、中性脂质、非阳离子脂质、带电荷脂质、PEG修饰的脂质、磷脂、结构脂质和固醇。在一些实施方案中，LNP还可包含一种或多种运载物分子，包括但不限于核酸(例如，mRNA、质粒DNA、DNA或RNA寡核苷酸、siRNA、shRNA、snRNA、snoRNA、lncRNA等)、小分子、蛋白质和肽。
在一些实施方案中，组合物包含脂质体。脂质体是包含脂质的脂质颗粒，这些脂质围绕中心区域排列成一个或多个同心脂质双层。脂质体的中心区域可包含水溶液、悬浮液或其他水性组合物。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可包含两种或更多种组分(例如，氨基脂质和核酸、PEG-脂质、磷脂、结构脂质)。例如，脂质纳米颗粒可包含氨基脂质和核酸。包含脂质纳米颗粒(诸如本文所述的那些)的组合物可用于多种应用，包括治疗有效负载的隐身递送、具有最小的不良先天免疫应答。
核酸的有效体内递送代表了持续的医学挑战。外源核酸(即，源自细胞或生物体的外部)在体内容易例如被免疫系统降解。因此，将核酸有效递送至细胞通常需要使用颗粒载体(例如，脂质纳米颗粒)。颗粒载体应被配制成具有最小的颗粒聚集，在细胞内递送前相对稳定，在细胞内有效递送核酸，并且无免疫应答或免疫应答最小。为了实现最小的颗粒聚集和递送前稳定性，许多常规颗粒载体依赖于某些组分(例如，PEG-脂质)的存在和/或浓度。然而，已发现某些组分可降低包封的核酸(例如，mRNA分子)的稳定性。降低的稳定性可能限制颗粒载体的广泛适用性。因此，仍然需要改善包封在脂质纳米颗粒内的核酸(例如，mRNA)的稳定性的方法。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种可电离分子、多核苷酸和任选的组分，例如结构脂质、固醇、中性脂质、磷脂和能够减少颗粒聚集的分子(例如，聚乙二醇(PEG)、PEG修饰的脂质)，诸如上述那些。
在一些实施方案中，本文所述的LNP可包含一种或多种可电离分子(例如，氨基脂质或可电离脂质)。可电离分子可包含带电荷基团并且可具有一定的pKa。在某些实施方案中，可电离分子的pKa可大于或等于约6、大于或等于约6.2、大于或等于约6.5、大于或等于约6.8、大于或等于约7、大于或等于约7.2、大于或等于约7.5、大于或等于约7.8、大于或等于约8。在一些实施方案中，可电离分子的pKa可以小于或等于约10、小于或等于约9.8、小于或等于约9.5、小于或等于约9.2、小于或等于约9.0、小于或等于约8.8、或小于或等于约8.5。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于6且小于或等于约8.5)。其他范围也是可能的。在多于一种类型的可电离分子存在于颗粒中的实施方案中，每种类型的可电离分子可独立地具有在一个或多个上述范围内的pKa。
一般来说，可电离分子包含一个或多个带电荷基团。在一些实施方案中，可电离分子可以是带正电荷或带负电荷的。例如，可电离分子可以是带正电荷的。例如，可电离分子可包含胺基团。如本文所用，术语“可电离分子”具有其在本领域中的普通含义，并且可指包含一个或多个带电荷部分的分子或基质。如本文所用，“带电荷部分”是携带形式电子电荷的化学部分，例如为单价(+1或-1)、二价(+2或-2)、三价(+3或-3)等。带电荷部分可以是阴离子的(即，带负电荷)或阳离子的(即，带正电荷)。带正电荷部分的实例包括胺基团(例如，伯胺、仲胺和/或叔胺)、铵基团、吡啶鎓基团、胍鎓基团和咪唑鎓基团。在一个特定实施方案中，带电荷部分包含胺基。带负电荷的基团或其前体的实例包括羧酸根基团、磺酸根基团、硫酸根基团、膦酸根基团、磷酸根基团、羟基基团等。带电荷部分的电荷在一些情况下可随环境条件而变化，例如，pH的变化可改变所述部分的电荷，和/或使所述部分变得带电荷或不带电荷。一般来说，可根据需要选择分子和/或基质的电荷密度。
在一些情况下，可电离分子(例如，氨基脂质或可电离脂质)可包括一个或多个可被转化成带电荷部分的前体部分。例如，可电离分子可包括可水解形成带电荷部分的中性部分，诸如上述那些。作为非限制性具体实例，分子或基质可包括酰胺，其可分别水解形成胺。本领域普通技术人员将能够确定给定的化学部分是否携带形式电荷(例如，通过检查、pH滴定、离子电导率测量等)，和/或给定的化学部分是否可反应(例如，水解)以形成携带形式电荷的化学部分。
可电离分子(例如，氨基脂质或可电离脂质)可具有任何合适的分子量。在某些实施方案中，可电离分子的分子量小于或等于约2,500g/mol、小于或等于约2,000g/mol、小于或等于约1,500g/mol、小于或等于约1,250g/mol、小于或等于约1,000g/mol、小于或等于约900g/mol、小于或等于约800g/mol、小于或等于约700g/mol、小于或等于约600g/mol、小于或等于约500g/mol、小于或等于约400g/mol、小于或等于约300g/mol、小于或等于约200g/mol或小于或等于约100g/mol。在一些情况下，可电离分子的分子量大于或等于约100g/mol、大于或等于约200g/mol、大于或等于约300g/mol、大于或等于约400g/mol、大于或等于约500g/mol、大于或等于约600g/mol、大于或等于约700g/mol、大于或等于约1000g/mol、大于或等于约1,250g/mol、大于或等于约1,500g/mol、大于或等于约1,750g/mol、大于或等于约2,000g/mol或大于或等于约2,250g/mol。上述范围的组合(例如，至少约200g/mol且小于或等于约2,500g/mol)也是可能的。在多于一种类型的可电离分子存在于颗粒中的实施方案中，每种类型的可电离分子可独立地具有在一个或多个上述范围内的分子量。
在一些实施方案中，颗粒内单一类型的可电离分子(例如，氨基脂质或可电离脂质)和/或所有可电离分子的百分比(例如，按重量计或按摩尔计)可大于或等于约15％、大于或等于约16％、大于或等于约17％、大于或等于约18％、大于或等于约19％、大于或等于约20％、大于或等于约21％、大于或等于约22％、大于或等于约23％、大于或等于约24％、大于或等于约25％、大于或等于约30％、大于或等于约35％、大于或等于约40％、大于或等于约42％、大于或等于约45％、大于或等于约48％、大于或等于约50％、大于或等于约52％、大于或等于约55％、大于或等于约58％、大于或等于约60％、大于或等于约62％、大于或等于约65％或大于或等于约68％。在一些情况下，百分比(例如，按重量计或按摩尔计)可小于或等于约70％、小于或等于约68％、小于或等于约65％、小于或等于约62％、小于或等于约60％、小于或等于约58％、小于或等于约55％、小于或等于约52％、小于或等于约50％或小于或等于约48％。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于20％且小于或等于约60％、大于或等于40％且小于或等于约55％等)。在多于一种类型的可电离分子存在于颗粒中的实施方案中，每种类型的可电离分子可独立地具有在一个或多个上述范围内的百分比(例如，按重量计或按摩尔计)。百分比(例如，按重量计或按摩尔计)可通过使用例如有机溶剂从干燥颗粒中提取可电离分子，并使用高压液相色谱(即，HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)、核磁共振(NMR)或质谱(MS)测量试剂的量来确定。本领域普通技术人员知道使用上述技术确定组分的量的技术。例如，HPLC可用于通过例如将HPLC色谱图曲线下面积与标准曲线进行比较来定量组分的量。
应当理解，术语“带电荷的”或“带电荷部分”不是指分子上的“部分负电荷”或“部分正电荷”。术语“部分负电荷”和“部分正电荷”被赋予它们在本领域中的普通含义。“部分负电荷”可在官能团包含键时产生，该键被极化使得电子密度被拉向该键的一个原子，从而在该原子上产生部分负电荷。一般来说，本领域普通技术人员通常将认识到可以这种方式变得极化的键。
根据本文的公开内容，脂质组合物可包含一种或多种本文所述的脂质。此类脂质可包括可用于制备如上所述或本领域已知的脂质纳米颗粒调配物的那些。
稳定化合物
本文所述的组合物的一些实施方案是稳定化的药物组合物。各种非病毒递送系统，包括纳米颗粒调配物，提供了克服与mRNA递送相关联的许多挑战的有吸引力的机会。近年来，脂质纳米颗粒(LNP)已经引起特别的关注，因为各种LNP调配物已经显示出在各种药物应用中的前景。然而，脂质已被证明会降解核酸，包括mRNA，并且脂质纳米颗粒调配物在作为冷藏液体储存时经历纯度的快速损失。此外，包封在LNP内的mRNA的储存稳定性低于未包封的mRNA。
已经发现一类化合物稳定脂质载体(诸如LNP)内的核酸，这是一个出乎意料且空前的发现，其使得能够实现应用，包括延长冷藏液体保质期、延长在室温下的使用期以及延长在高达更高温度(诸如40℃)的生理温度下的使用稳定性。此类稳定化合物解决了关键问题，因为目前的制造工艺和调配物在LNP形成和加工期间经历5％-10％的纯度损失，这对于目前的大规模LNP生产是典型的。
在一些实施方案中，稳定化的药物组合物包含核酸调配物，该核酸调配物包含核酸和稳定化合物(例如，式(I)、式(II)的化合物或其互变异构体或溶剂化物)。在一些实施方案中，稳定化的药物组合物包含核酸调配物，该核酸调配物包含核酸和脂质，以及式(I)化合物：
或其互变异构体或溶剂化物，其中：
为单键或双键；
R1为H；R2为OCH3，或与R3一起为OCH2O；R3为OCH3，或与R2一起为OCH2O；R4为H；R5为H或OCH3；R6为OCH3；R7为H或OCH3；R8为H；R9为H或CH3；并且X为药学上可接受的阴离子，例如卤化物，诸如氯化物。
在一些实施方案中，式(I)化合物具有以下结构：
或其互变异构体或溶剂化物。
在一些实施方案中，稳定化的药物组合物包含核酸调配物，该核酸调配物包含核酸和脂质，以及式(II)化合物：
或其互变异构体或溶剂化物，其中：
R10为H；R11为H；R12与R13一起为OCH2O；R14为H；R15与R16一起为OCH2O；R17为H；并且X为药学上可接受的阴离子，例如卤化物，诸如氯化物。
在一些实施方案中，式(II)化合物具有以下结构：
或其互变异构体或溶剂化物。
式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(II)和(IIa)的稳定化合物描述于国际申请号PCT/US2022/025967中，其以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，核酸调配物包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，核酸是mRNA。
在一些实施方案中，稳定化合物(“化合物”)具有至少70％、80％、90％、95％或99％的纯度。在一些实施方案中，化合物含有少于100ppm的元素金属。在一些实施方案中，稳定化的药物组合物(“组合物”)包含药学上可接受的金属螯合剂，例如，EDTA(乙二胺四乙酸)或DTPA(二乙烯三胺五乙酸)。
在一些实施方案中，组合物是水溶液。在一些实施方案中，化合物以约0.1mM至约10mM的浓度存在于水溶液中。在一些实施方案中，水溶液具有约5至8的pH，包括约5、5.5、6、6.5、7、7.5或8的pH。在一些实施方案中，水溶液不包含NaCl。在一些实施方案中，水溶液包含浓度或约为150mM的NaCl。在一些实施方案中，水溶液包含磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、乙酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，组合物中的微生物生长被化合物抑制。
在一些实施方案中，组合物的特征在于，在储存至少三十天后具有大于60％、大于70％、大于80％或大于90％主峰mRNA纯度的mRNA纯度水平。在一些实施方案中，组合物在储存至少六个月后包含大于50％主峰mRNA纯度的mRNA纯度水平。在一些实施方案中，储存在室温下。
在一些实施方案中，组合物包含包封mRNA的脂质纳米颗粒，并且组合物在储存至少三十天后包含少于50％、少于60％、少于70％、少于80％、少于90％或少于95％的RNA片段。在一些实施方案中，储存温度高于室温。在一些实施方案中，储存温度为约4℃。
在一些实施方案中，化合物与包含在脂质纳米结构(例如，脂质纳米颗粒、脂质体或脂质复合物)内的核酸相互作用，例如，经由π-π堆叠和/或通过改变核酸的主链螺旋性。在一些实施方案中，化合物插入有核酸。在一些实施方案中，化合物与核酸结合，例如可逆结合，和/或结合至核酸的单链区。在一些实施方案中，化合物自缔合、结合至核酸核糖接触点和/或结合至核酸碱基接触点。在一些实施方案中，化合物基本上不结合至核酸磷酸盐接触点。在一些实施方案中，化合物的正电荷有助于核酸结合。在一些实施方案中，与核酸的相互作用具有由小于10-3M(例如，小于10-4M、小于10-5M、小于10-5M、小于10-7M、小于10-8M或小于10-9M)的平衡解离常数定义的结合亲和力。
在一些实施方案中，化合物与核酸相互作用并提供对溶剂例如水的屏蔽。在一些实施方案中，化合物对核糖的溶剂屏蔽作用大于所述化合物对核酸的磷酸基团的屏蔽作用。在一些实施方案中，通过溶剂可及表面积(SASA)测量溶剂暴露。在一些实施方案中，稳定化合物将核糖的溶剂可及面积减少至约5-10nm2。在一些实施方案中，稳定化合物将核糖的溶剂可及面积减少至约6-8nm2。在一些实施方案中，稳定化合物将磷酸盐的溶剂可及面积减少至约9-12nm2。在一些实施方案中，稳定化合物将磷酸盐的溶剂可及面积减少至约10-11nm2。
在一些实施方案中，通过化合物构象稳定的核酸表现出比不存在化合物时更高的热解折叠温度(例如，通过圆二色性或DSC测量)。在一些实施方案中，化合物赋予折叠结构的核酸增加的稳定性，例如热稳定性，例如相对于其未折叠或较少折叠或更线性的形式。在一些实施方案中，化合物在与核酸相互作用时引起核酸的压缩。在一些实施方案中，化合物在与核酸相互作用时引起核酸分子的流体动力学半径减小。在一些实施方案中，稳定化合物引起核酸分子压缩或流体动力学半径减小5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多。在一些实施方案中，当稳定化合物的浓度为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM或100μM时，所述化合物引起核酸分子压缩或流体动力学半径减小。
mRNA-脂质加合物
已经确定某些可电离脂质容易形成脂质-多核苷酸加合物。具体地，包含叔胺基团的可电离脂质可分解成仲胺和反应性醛物质中的一种或两种，所述仲胺和反应性醛物质能够与多核苷酸(诸如mRNA)相互作用以形成可电离脂质-多核苷酸加合物杂质，其可以通过反相离子对色谱法(RP-IP HPLC)检测。例如，叔胺的氧化可导致N-氧化物形成，其可在胺处经历酸/碱催化的水解以生成醛和仲胺，所述醛和仲胺可与mRNA形成加合物。因此，在一些方面，可电离脂质-多核苷酸加合物杂质是醛-mRNA加合物杂质。
还已经确定此类加合物可破坏mRNA翻译并影响脂质纳米颗粒(LNP)配制的mRNA产品的活性。因此，制备和使用可电离脂质-多核苷酸加合物杂质含量降低的LNP组合物可能是有利的，诸如其中小于约20％、小于约10％、小于约5％、或小于约1％的mRNA是可电离脂质-多核苷酸加合物杂质的形式，如可以通过RP-IP HPLC测量的。因此，根据一些方面，提供了一种LNP组合物，其中小于约10％、小于约5％、或小于约1％的mRNA是可电离脂质-多核苷酸加合物杂质的形式，包括小于10％、小于5％、或小于1％，如可通过RP-IP HPLC测量的。
在一些方面，组合物中脂质醛的量小于约50ppm，包括小于50ppm。此外或另选地，在一些方面，组合物中的N-氧化物化合物的量小于约50ppm，包括小于50ppm。此外或另选地，在一些方面，组合物中的过渡金属(诸如Fe)的量小于约50ppm，包括小于50ppm。此外或另选地，在一些方面，组合物中的烷基卤化物化合物的量小于约50ppm，包括小于50ppm。此外或另选地，在一些方面，组合物中的酸酐化合物的量小于约50ppm，包括小于50ppm。此外或另选地，在一些方面，组合物中的酮化合物的量小于约50ppm，包括小于50ppm。此外或另选地，在一些方面，组合物中的共轭二烯化合物的量小于约50ppm，包括小于50ppm。
在一些方面，组合物对于可电离脂质-多核苷酸加合物杂质的形成是稳定的。在一些方面，当在约25℃或更低的温度下储存时，组合物中的可电离脂质-多核苷酸加合物杂质的量以小于每天约2％的平均速率增加，包括以小于每天2％的平均速率增加。在一些方面，当在约5℃或更低的温度下储存时，组合物中的可电离脂质-多核苷酸加合物杂质的量以小于每天约0.5％的平均速率增加，包括以小于每天0.5％的平均速率增加。在一些方面，当在冷藏温度下储存时，组合物中的可电离脂质-多核苷酸加合物杂质的量以小于每天约0.5％的平均速率增加，任选地其中所述冷藏温度为约5℃。
具有降低的可电离脂质-多核苷酸加合物杂质含量的脂质媒介物(例如，LNP)组合物可以通过抑制N-氧化物和醛中的一者或两者形成的方法来制备。此类方法可以包括处理包含可电离脂质的组合物，所述可电离脂质包含叔胺基团，以抑制N-氧化物和醛中的一者或两者的形成，诸如通过用还原剂处理组合物；用螯合剂处理组合物；调节组合物的pH；调节组合物的温度；并调节组合物中的缓冲液。此类方法可包括以下中的一项或多项：在将可电离脂质与多核苷酸组合之前，用清除剂处理可电离脂质；用还原处理剂处理可电离脂质；用还原剂处理可电离脂质；用螯合剂处理可电离脂质；用还原剂处理多核苷酸；以及用螯合剂处理多核苷酸。
根据前述项中的任一项，清除剂、还原处理剂和/或还原剂可以是与醛、酮、酸酐和/或二烯化合物反应的剂。清除剂可包括选自以下的一种或多种：(O-(2,3,4,5,6-五氟苄基)羟胺盐酸盐)(PFBHA)、甲氧胺(例如，甲氧胺盐酸盐)、苄氧胺(例如，苄氧胺盐酸盐)、乙氧胺(例如，乙氧胺盐酸盐)、4-[2-(氨基氧基)乙基]吗啉二盐酸盐、丁氧胺(例如，叔丁氧胺盐酸盐)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、三乙胺(TEA)、哌啶4-羧酸酯(BPPC)及其组合。还原处理剂可包括硼化合物(例如，硼氢化钠和/或联硼酸频那醇酯)。还原处理剂可包括硼化合物，诸如硼氢化钠和或联硼酸频那醇酯中的一种或两种。螯合剂可包括固定化亚氨基二乙酸。还原剂可包括固定化还原剂，诸如二氧化硅上的固定化二苯膦(Si-DPP)、琼脂糖上的固定化硫醇(Ag-Thiol)、二氧化硅上的固定化半胱氨酸(Si-半胱氨酸)、二氧化硅上的固定化硫醇(Si-Thiol)或其组合。还原剂可包括游离还原剂，诸如焦亚硫酸钾、硫代乙醇酸钠、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、硫代硫酸钠、N-乙酰基半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇(DTT)、胱胺、二硫赤藓糖醇(DTE)、二氯二苯基三氯乙烷(DDT)、高半胱氨酸、硫辛酸或其组合。
根据前述项中的任一项，pH可为或者可调节为约7至约9的pH。
根据前述项中的任一项，缓冲液可选自磷酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、组氨酸、组氨酸-HCl、苹果酸钠、碳酸钠和TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)。根据前述项中的任一项，缓冲液可以是TRIS，并且可以是或调节为约20mM至约150mM TRIS。
根据前述项中的任一项，组合物的温度可以是或调节至25℃或更低。
组合物还可包含游离还原剂或抗氧化剂。
多价疫苗
本文提供的组合物可包含编码相同或不同物种的两种或更多种抗原的RNA(例如，mRNA)或多种RNA(例如，mRNA)。在一些实施方案中，组合物包含编码两种或更多种HSV蛋白的RNA(例如，mRNA)或多种RNA(例如，mRNA)。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)可编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个HSV蛋白。
在一些实施方案中，可以将编码抗原的两种或更多种不同的RNA(例如，mRNA)配制在相同的脂质纳米颗粒中。在其他实施方案中，可以将编码抗原的两种或更多种不同的RNA(例如，mRNA)配制在单独的脂质纳米颗粒中(每种RNA(例如，mRNA)配制在单个脂质纳米颗粒中)。然后可以将脂质纳米颗粒组合并作为单一疫苗组合物(例如，包含编码多种抗原的多种RNA(例如，mRNA))施用，或者可以分开施用。
药物调配物
例如，本文提供了用于预防或治疗人和其他哺乳动物的HSV的组合物(例如，药物组合物，诸如疫苗)、方法、试剂盒和试剂。本文提供的组合物可用作治疗剂或预防剂。它们可用于药物中以预防和/或治疗HSV感染。
在一些实施方案中，如本文所述的含有RNA(例如，mRNA)的组合物可施用于受试者(例如，哺乳动物受试者，诸如人受试者)，并且RNA(例如，mRNA)在体内翻译以产生抗原性多肽(抗原)。
组合物(例如，包含RNA(例如，mRNA))的“有效量”至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、RNA(例如，mRNA)的物理特性(例如，长度、核苷酸组成和/或经修饰的核苷的程度)、疫苗的其他组分和其他决定因素，诸如受试者的年龄、体重、身高、性别和总体健康状况。通常，有效量的组合物提供作为受试者细胞中抗原产生的函数的诱导或增强的免疫应答。在一些实施方案中，含有具有至少一种化学修饰的RNA(例如，mRNA)的组合物的有效量比含有编码相同抗原或肽抗原的对应未修饰的多核苷酸的组合物更有效。增加的抗原产生可通过增加的细胞转染(用RNA(例如，mRNA)疫苗转染的细胞的百分比)、增加的从多核苷酸的蛋白质翻译和/或表达、减少的核酸降解(如例如通过增加的从经修饰的多核苷酸的蛋白质翻译的持续时间所证明的)或改变的宿主细胞的抗原特异性免疫应答来证明。
术语“药物组合物”是指活性剂(例如，mRNA)与惰性或活性载体(例如，脂质组合物，例如，LNP))的组合，所述组合使该组合物尤其适合于体内或离体诊断或治疗用途。“药学上可接受的载体”在施用于受试者或受试者身上后，不会引起不期望的生理效应。药物组合物中的载体也必须是“可接受的”，即它与活性成分相容并且能够稳定活性成分。一种或多种增溶剂可以用作用于递送活性剂的药物载体。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以获得可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和十二烷基硫酸钠。附加的合适的药物载体和稀释剂以及其使用的药物必需品在Remington's Pharmaceutical Sciences中有描述。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物(包含多核苷酸及其编码的多肽)可用于治疗或预防HSV感染。组合物可以作为主动免疫接种方案的一部分向健康个体预防性或治疗性地施用，或者在感染早期在潜伏期或在症状出现后的主动感染期间施用。在一些实施方案中，提供给细胞、组织或受试者的RNA(例如，mRNA)的量可以是有效用于免疫预防的量。
组合物可与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，预防性或治疗性化合物可以是佐剂或加强剂。如本文所用，当提及预防性组合物诸如疫苗时，术语“加强剂”是指预防性(疫苗)组合物的额外施用。加强剂(或加强疫苗)可在预防性组合物的较早施用之后给予。在预防性组合物的初始施用与加强剂之间的施用时间可以是但不限于，12小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。在示例性实施方案中，在预防性组合物的初始施用与加强剂之间的施用时间可以是但不限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月或6个月。如本文所述，与预防性组合物的较早施用相比，加强剂可包含相同或不同的RNA(例如，mRNA)。在一些实施方案中，加强剂是单价的(例如，RNA(例如，mRNA)编码单一抗原)。在一些实施方案中，加强剂是多价的(例如，RNA(例如，mRNA)编码多于一种抗原)。
在一些实施方案中，“施用(administering)”或“施用(administration)”意指以药理学上有用的方式向受试者提供材料。在一些实施方案中，本文公开的组合物经肠施用于受试者。在一些实施方案中，组合物的肠内施用是口服。在一些实施方案中，本文公开的组合物肠胃外施用于受试者。在一些实施方案中，本文公开的组合物经皮下、眼内、玻璃体内、视网膜下、静脉内(IV)、脑室内、肌内、鞘内(IT)、脑池内、腹膜内、经由吸入、局部或通过直接注射至一种或多种细胞、组织或器官而施用于受试者。
组合物可用于各种环境中，这取决于感染的流行率或未满足的医学需要的程度或水平。作为非限制性实例，mRNA疫苗可用于治疗和/或预防HSV。mRNA疫苗具有优越的性质，因为与市售疫苗相比，它们产生更大的抗体滴度、更好的中和免疫、产生更持久的免疫应答和/或更早产生应答。
本文提供了药物组合物，其包含任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的RNA(例如，mRNA)和/或复合物。
RNA(例如，mRNA)可以单独或与一种或多种其他组分一起配制或施用。例如，疫苗可包含其他组分，包括但不限于佐剂。
在一些实施方案中，疫苗不包含佐剂(它们不含佐剂)。
RNA(例如，mRNA)可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少一种附加的活性物质，诸如例如治疗活性物质、预防活性物质或两者的组合。疫苗组合物可以是无菌的、无热原的或既无菌又无热原的。在配制和/或制造药剂诸如疫苗组合物方面的一般考虑因素可见于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，向人，即人患者或受试者施用疫苗。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指其中所含的RNA(例如，mRNA)，例如，编码HSV蛋白抗原的RNA(例如，mRNA)。
本文所述的疫苗组合物的调配物可以通过药理学领域已知或以后开发的任何方法制备。一般来说，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分(例如，mRNA)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，并且然后，如果必要和/或需要，将产物分割、成型和/或包装成期望的单剂量单位或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何附加成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、体型和/或状况并且进一步取决于组合物的施用途径而变化。举例来说，组合物可包含0.1％与100％之间，例如0.5％与50％之间、1％-30％之间、5％-80％之间、至少80％(w/w)之间的活性成分。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)可使用一种或多种赋形剂来配制以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，从贮库调配物)；(4)改变生物分布(例如，靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加所编码的蛋白质的体内翻译；和/或(6)改变所编码的蛋白质(抗原)的体内释放概况。除了传统的赋形剂诸如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂外，赋形剂可包括但不限于类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用RNA(例如，mRNA)转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物以及它们的组合。
预防/治疗方法
本文提供了用于预防和/或治疗人和其他哺乳动物的HSV感染的组合物(例如，疫苗)、方法、试剂盒和试剂。组合物可用作治疗剂或预防剂。在一些实施方案中，组合物用于提供针对HSV感染的预防性保护。在一些实施方案中，组合物用于治疗HSV感染。在一些实施方案中，组合物用于免疫效应细胞的引发，例如，离体活化外周血单核细胞(PBMC)，然后将其输注(再输注)到受试者体内。
受试者可以是任何哺乳动物，包括非人灵长类动物和人受试者。通常，受试者是人受试者。
在一些实施方案中，一种组合物以诱导抗原特异性免疫应答的有效量施用于受试者(例如，哺乳动物受试者，诸如人受试者)。编码HSV蛋白的RNA在体内表达和翻译以产生抗原，然后该抗原刺激受试者的免疫应答。
在施用本公开的组合物之后，可以实现针对HSV的预防性保护。组合物可以施用一次、两次、三次、四次或更多次，但可能施用一次组合物就足够了(任选地随后施用一次加强剂)。尽管不太理想，但也可以对受感染的个体施用组合物以实现治疗应答。可能需要相应地调整剂量。
在本公开的方面中提供了一种在受试者中引发针对HSV蛋白(或多种抗原)的免疫应答的方法。在一些实施方案中，一种方法包括向受试者施用包含具有编码HSV蛋白(或多种抗原)的开放阅读框的RNA(例如，mRNA)的疫苗，从而在受试者中诱导对HSV蛋白(或多种抗原)具有特异性的免疫应答，其中相对于用预防有效剂量的针对抗原的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗抗原抗体滴度，疫苗接种后受试者中的抗抗原抗体滴度增加。“抗抗原抗体”是特异性结合至抗原的血清抗体。
预防有效剂量是在临床上可接受的水平上防止病毒感染的有效剂量。在一些实施方案中，有效剂量是疫苗包装说明书中列出的剂量。本文所用的传统疫苗是指除本公开的RNA(例如，mRNA)疫苗之外的疫苗。例如，传统疫苗包括但不限于活微生物疫苗、灭活微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白抗原疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒(VLP)疫苗等。在示例性实施方案中，传统疫苗是已获得监管部门批准和/或由国家药物监管机构(例如美国食品和药物管理局(FDA)或欧洲药品管理局(EMA))注册的疫苗。
在一些实施方案中，疫苗接种后受试者中的抗抗原抗体滴度相对于用预防有效剂量的针对HSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度增加1个对数至10个对数。在一些实施方案中，疫苗接种后受试者中的抗抗原抗体滴度相对于用预防有效剂量的针对HSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度增加1个对数、2个对数、3个对数、4个对数、5个对数或10个对数。
在本公开的其他方面提供了一种在受试者中引发针对HSV的免疫应答的方法。所述方法包括向所述受试者施用包含RNA(例如，mRNA)的组合物，所述RNA包含编码HSV蛋白的开放阅读框，从而在所述受试者中诱导对HSV具有特异性的免疫应答，其中所述受试者中的免疫应答等同于用相对于所述组合物2倍至100倍剂量水平的针对HSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫应答。
在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等同于用相对于本公开的组合物两倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫应答。在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等同于用相对于本公开的组合物三倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫应答。在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等同于用相对于本公开的组合物4倍、5倍、10倍、50倍或100倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫应答。在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等同于用相对于本公开的组合物10倍至1000倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫应答。在一些实施方案中，受试者中的免疫应答等同于用相对于本公开的组合物100倍至1000倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫应答。
在其他实施方案中，通过测定受试者中的[蛋白质]抗体滴度来评估免疫应答。在其他实施方案中，测试来自免疫受试者的血清或抗体中和病毒摄取或减少人B淋巴细胞的HSV转化的能力。在其他实施方案中，使用本领域公认的技术来测量促进稳健T细胞应答的能力。
本公开的其他方面提供了在受试者中引发针对HSV的免疫应答的方法，方法是通过向受试者施用包含具有编码HSV蛋白的开放阅读框的mRNA的组合物，从而在受试者中诱导对HSV蛋白具有特异性的免疫应答，其中受试者中的免疫应答相对于用预防有效剂量的针对HSV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱导的免疫应答早2天至10周诱导。在一些实施方案中，在用相对于本公开的组合物2倍至100倍剂量水平的预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱导受试者中的免疫应答。
在一些实施方案中，受试者中的免疫应答相对于用预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱导的免疫应答早2天、3天、1周、2周、3周、5周或10周诱导。
本文还提供了通过向受试者施用具有编码至少一种HSV蛋白的开放阅读框的mRNA而在所述受试者中引发针对HSV的免疫应答的方法，其中所述mRNA不包含稳定元件，并且其中佐剂不与所述疫苗共同配制或共同施用。
组合物可以通过导致治疗有效结果的任何途径施用。这些途径包括但不限于皮内、肌内、鼻内和/或皮下施用。本公开提供了包括向有需要的受试者施用RNA(例如，mRNA)疫苗的方法。所需的确切量将根据受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式等而在受试者之间变化。为了方便施用和剂量一致，RNA(例如，mRNA)通常按单位剂型调配。然而，应理解，RNA(例如，mRNA)的总日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；所用特定化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所用的特定化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域公知的类似因素。
如本文提供的mRNA的有效量(例如，有效剂量)可以低至20μg，例如以单剂量或以两个10μg剂量(例如，第一有效疫苗剂量和第二有效疫苗剂量)施用。在一些实施方案中，第一有效疫苗剂量和第二有效疫苗剂量是相同的量。在一些实施方案中，第一有效疫苗剂量和第二有效疫苗剂量是不同的量。在一些实施方案中，有效量为5μg-30μg、5μg-25μg、5μg-20μg、5μg-15μg、5μg-10μg、10μg-30μg、10μg-25μg、10μg-20μg、10μg-15μg、15μg-30μg、15μg-25μg、15μg-20μg、20μg-30μg、25μg-30μg或25μg-300μg的总剂量。在一些实施方案中，有效剂量(例如，有效量)为组合物的至少10μg且小于25μg。在一些实施方案中，有效剂量(例如，有效量)为组合物的至少5μg且小于25μg。例如，有效量可以为5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、250μg或300μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量(例如，有效剂量)为10μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为20μg的总剂量(例如，两个10μg剂量)。在一些实施方案中，有效量为25μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为30μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为50μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为60μg的总剂量(例如，两个30μg剂量)。在一些实施方案中，有效量为75μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为100μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为150μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为200μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为250μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为300μg的总剂量。
本文所述的RNA(例如，mRNA)可被配制成本文所述的剂型，诸如鼻内、气管内或可注射的(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、皮内、心内、腹膜内和皮下)。
疫苗功效
本公开的一些方面提供了组合物的调配物(例如，RNA疫苗)，其中以有效量配制mRNA以在受试者中产生抗原特异性免疫应答(例如，产生对HSV抗原具有特异性的抗体)。“有效量”是有效产生抗原特异性免疫应答的mRNA的剂量。本文还提供了在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法。
如本文所用，对本公开的疫苗的免疫应答是受试者中针对由存在于疫苗中的RNA(例如，mRNA)编码的(一种或多种)HSV蛋白的体液和/或细胞免疫应答的发展。出于本公开的目的，“体液”免疫应答是指由抗体分子(包括例如分泌性(IgA)或IgG分子)介导的免疫应答，而“细胞”免疫应答是指由T淋巴细胞(例如，CD4+辅助细胞和/或CD8+T细胞(例如，CTL)和/或其他白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面包括溶细胞性T细胞(CTL)的抗原特异性应答。CTL对肽抗原具有特异性，肽抗原与由主要组织相容性复合物(MHC)编码并在细胞表面上表达的蛋白质缔合来呈递。CTL有助于诱导和促进细胞内微生物的破坏或被此类微生物感染的细胞的溶解。细胞免疫的另一个方面包括辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞用于帮助刺激非特异性效应细胞的功能，并将其活性集中于展示与其表面MHC分子缔合的肽抗原的细胞。细胞免疫应答还导致产生细胞因子、趋化因子和由活化的T细胞和/或其他白细胞(包括源自CD4+和CD8+T细胞的白细胞)产生的其他此类分子。细胞免疫应答可进一步分为Th1和Th2应答，从而分别产生Th1型细胞因子和Th2型细胞因子。Th1型细胞因子倾向于产生负责杀死细胞内寄生虫(例如，病毒)和维持自身免疫应答的促炎应答。主要的Th1细胞因子是干扰素γ(IFN-γ)。在一些实施方案中，促炎应答(例如，基于Th1的应答)被Th2型细胞因子抵消。Th2型细胞因子包括白介素4、5和13，它们促进与特应症中的IgE和嗜酸性细胞应答有关，以及白介素-10，其是抗炎的。过量时，Th2将抵消Th1介导的杀微生物作用。在一些实施方案中，Th2应答平衡过量的Th1应答，以减轻由于炎症引起的组织损伤。然而，Th2应答也阻碍Th1细胞的抗病毒活性，这在HSV感染中可能是有害的。在一些实施方案中，施用本文提供的疫苗可导致Th17应答。T辅助17细胞(Th17)是促炎性T辅助细胞的子集，其由白介素17的产生定义。Th17细胞维持粘膜屏障，并有助于病原体在粘膜表面清除。Th17型细胞因子靶向先天性免疫细胞和上皮细胞，以产生G-CSF和Il-8，从而导致嗜中性粒细胞的产生和募集。在一些实施方案中，本公开的组合物(例如，疫苗)产生Th1应答。在一些实施方案中，本公开的组合物(例如，疫苗)产生Th2应答。在一些实施方案中，本公开的组合物(例如，疫苗)产生Th17应答。在一些实施方案中，本公开的组合物(例如，疫苗)产生Th1和Th2应答、Th1和Th17应答、Th2和Th17应答或Th1、Th2和Th17应答。
本文所述的疫苗的一些实施方案引发向Th1表型极化的T细胞应答(即，包括比HSV特异性Th2细胞更多的HSV特异性Th1细胞)。向Th1表型的极化有利于预防或治疗HSV感染，至少部分是因为Th1细胞分泌促炎细胞因子，包括IFN-γ和TNF-α，它们促进病毒体的吞噬作用和受感染细胞的清除。相反，Th2细胞和它们分泌的细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-10或IL-13)在HSV-2感染中是致病性的，从而增加发病率和死亡率而不是有助于病毒控制或清除。参见，例如，Nakajima等人,J Neuroimmunol.2000.110(1-2):106-113。因此，使CD4+T细胞应答向Th1表型极化可增加本文所述的HSV疫苗的预防和/或治疗功效。在一些实施方案中，向Th1表型的极化的特征在于，至少50％的对由疫苗的mRNA编码的HSV抗原具有特异性的CD4+T细胞(HSV特异性CD4+T细胞)产生Th1细胞因子(例如，IFN-y、TNF-a和/或IL-2)。在一些实施方案中，至少50％的对HSV gB具有特异性的CD4+T细胞产生Th1细胞因子。在一些实施方案中，至少50％的对HSV gC具有特异性的CD4+T细胞产生Th1细胞因子。在一些实施方案中，至少50％的对HSV gD具有特异性的CD4+T细胞产生Th1细胞因子。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至多100％的HSV特异性CD4+T细胞产生IFN-γ。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至多100％的HSV特异性CD4+T细胞产生TNF-a。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至多100％的HSV特异性CD4+T细胞产生IL-2。在一些实施方案中，向Th1表型的极化的特征在于，少于50％的HSV特异性CD4+T细胞产生Th2细胞因子(例如，IL-4、IL-5和/或IL-13)。在一些实施方案中，少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或少至0％的HSV特异性CD4+T细胞产生IL-4。在一些实施方案中，少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或少至0％的HSV特异性CD4+T细胞产生IL-5。在一些实施方案中，少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或少至0％的HSV特异性CD4+T细胞产生IL-13。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答的特征在于，测量施用本文提供的组合物的受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度。抗体滴度是受试者体内抗体例如对特定抗原或抗原表位具有特异性的抗体的量的测量值。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)是用于测定抗体滴度的常见测定。
可使用多种血清学试验来测量针对所编码的目标抗原(例如，HSV抗原)的抗体。这些试验包括血凝抑制试验、补体固定试验、荧光抗体试验、酶联免疫吸附测定(ELISA)和噬斑减少中和试验(PRNT)。这些试验中的每一个测量不同的抗体活性。在示例性实施方案中，噬斑减少中和试验或PRNT(例如，PRNT50或PRNT90)用作保护的血清学相关性。PRNT测量体外病毒中和的生物学参数，并且是某些类别病毒中最具血清学病毒特异性的试验，与防止病毒感染的血清水平密切相关。PRNT的基本设计允许在试管或微量滴定板中发生病毒-抗体相互作用，然后通过将混合物铺板在病毒易感细胞(优选哺乳动物来源的细胞)上来测量抗体对病毒感染性的影响。用限制子代病毒传播的半固体培养基覆盖细胞。引发生产性感染的每种病毒产生可以以多种方式检测的局部感染区域(噬斑)。对噬斑进行计数与病毒的起始浓度进行比较，以确定总病毒感染性的降低百分比。在PRNT中，所测试的血清样品通常在与标准化量的病毒混合之前进行系列稀释。病毒的浓度保持恒定，使得当添加到易感细胞中并用半固体培养基覆盖时，可以辨别和计数单个噬斑。以这种方式，可以在任何选定的病毒活性降低百分比下计算每个血清样品的PRNT终点滴度。
在旨在评估疫苗免疫原性的功能性测定中，用于抗体滴定的血清样品稀释系列应理想地在“血清保护性”阈值滴度以下开始。关于抗疱疹病毒(例如，抗HSV)中和抗体，在某些实施方案中，1:10的血清阳性阈值可被认为是血清保护阈值。
PRNT终点滴度表示为最后血清稀释度的倒数，其示出了期望的噬斑计数减少百分比。PRNT滴度可以基于噬斑计数减少50％或更多(PRNT50)来计算。对于疫苗血清，PRNT50滴度优于使用较高截止值(例如，PRNT90，反映90％或更大的减少)的滴度，从而提供来自滴定曲线的线性部分的更准确结果。
有几种计算PRNT滴度的方法。计算滴度的最简单和最广泛使用的方法是对噬斑进行计数，并基于输入噬斑的反滴定，将滴度报告为最后血清稀释度的倒数，以显示输入噬斑计数减少>50％。使用几种血清稀释度的曲线拟合方法可以计算更精确的结果。有多种可用于此的计算机分析程序(例如，SPSS或GraphPad Prism)。
在一些实施方案中，抗体滴度用于评估受试者是否已患有感染或确定是否需要免疫接种。在一些实施方案中，抗体滴度用于确定自身免疫应答的强度，确定是否需要加强免疫接种，确定先前的疫苗是否有效，以及鉴定任何最近或先前的感染。根据本公开，抗体滴度可用于确定受试者中由RNA疫苗诱导的免疫应答的强度。
在一些实施方案中，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度相对于对照增加至少1个对数。例如，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度可以相对于对照增加至少1.5、至少2、至少2.5或至少3个对数。在一些实施方案中，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度相对于对照增加1、1.5、2、2.5或3个对数。在一些实施方案中，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度相对于对照增加1-3个对数。例如，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度可以相对于对照增加1-1.5、1-2、1-2.5、1-3、1.5-2、1.5-2.5、1.5-3、2-2.5、2-3或2.5-3个对数。
在一些实施方案中，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度可以相对于对照增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度相对于对照增加2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度相对于对照增加2-10倍。例如，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度可以相对于对照增加2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10倍。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答被测量为血清中和抗体滴度与疱疹病毒(例如，HSV)的几何平均滴度(GMT)的比率，被称为几何平均比率(GMR)。几何平均滴度(GMT)是通过将所有值相乘并取数字的n次方根来计算的一组受试者的平均抗体滴度，其中n是具有可用数据的受试者数量。
在一些实施方案中，对照是在未施用RNA(例如，mRNA)疫苗的受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度。在一些实施方案中，对照是在施用了重组或纯化的蛋白疫苗的受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度。重组蛋白疫苗通常包括在异源表达系统(例如，细菌或酵母)中产生的或从大量病原生物体中纯化的蛋白质抗原。
在一些实施方案中，在鼠模型中测量RNA(例如，mRNA)疫苗有效的能力。例如，可将组合物施用于鼠模型，并对鼠模型进行诱导中和抗体滴度的测定。细菌攻击研究也可用于评估本公开的疫苗的功效。例如，可将组合物施用于鼠模型，用病毒攻击鼠模型，并测定鼠模型的存活和/或免疫应答(例如，中和抗体应答、T细胞应答(例如，细胞因子应答))。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量是与重组蛋白疫苗的护理标准剂量相比减少的剂量。如本文提供的“护理标准”是指医学或心理治疗指南，并且可以是一般的或特定的。“护理标准”基于科学证据以及参与治疗给定病状的医疗专业人员之间的合作来指定适当的治疗。这是医生/临床医生针对某种类型的患者、疾病或临床情况应遵循的诊断和治疗过程。本文提供的“护理标准剂量”是指医生/执业医师或其他医疗专业人员在遵循治疗或预防HSV感染或相关疾病的护理标准指南时，为治疗或预防HSV感染或相关疾病而对受试者施用的重组或纯化的蛋白疫苗、或减毒活疫苗或灭活疫苗、或VLP疫苗的剂量。
在一些实施方案中，在施用了有效量的组合物的受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度等同于在施用了护理标准剂量的重组或纯化的蛋白疫苗、或减毒活疫苗或灭活疫苗、或VLP疫苗的对照受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度。
可以使用标准分析来评估疫苗功效(参见，例如，Weinberg等人,J InfectDis.2010年6月1日；201(11):1607-10)。例如，疫苗功效可以通过双盲、随机化、临床对照试验来测量。疫苗功效可以表示为未接种疫苗(ARU)和已接种疫苗(ARV)研究群组之间疾病发作率(AR)的成比例降低，并且可以使用以下公式根据疫苗接种组中疾病的相对风险(RR)进行计算：
功效＝(ARU-ARV)/ARU x 100；并且
功效＝(1-RR)x 100。
同样，可以使用标准分析来评估疫苗有效性(参见例如Weinberg等人,J InfectDis.2010年6月1日；201(11):1607-10)。疫苗有效性是对疫苗(可能已经被证明具有高疫苗功效)如何减少人群疾病的评估。此量度可以评估自然场地条件下而不是在受控临床试验中的疫苗接种程序(而不仅仅是疫苗本身)的益处和不利影响的净平衡。疫苗有效性与疫苗功效(效力)成正比，但也受到群体中目标组的受免疫程度以及影响住院、门诊就诊或成本的“现实世界”结果的其他非疫苗相关因素的影响。例如，可以使用回顾性病例对照分析，其中比较了一组感染病例和适当对照之间的疫苗接种率。疫苗有效性可表示为比率差异，使用尽管接种疫苗但仍发生感染的优势比(OR)：
有效性＝(1-OR)x 100。
在一些实施方案中，相对于未接种疫苗的对照受试者，RNA(例如，mRNA)疫苗的功效为至少60％。例如，相对于未接种疫苗的对照受试者，组合物的功效可以为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少98％或100％。
消除性免疫.消除性免疫是指防止有效病原体感染宿主的独特免疫状态。在一些实施方案中，本公开的组合物的有效量足以在受试者中提供至少1年的消除性免疫。例如，本公开的组合物的有效量足以在受试者中提供至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年、至少10年或更长时间的消除性免疫。在一些实施方案中，本公开的组合物的有效量足以在受试者中以相对于对照低至少5倍的剂量提供消除性免疫。例如，有效量可以足以在受试者中以相对于对照低至少10倍、15倍或20倍的剂量提供消除性免疫。
可检测抗原.在一些实施方案中，本公开的组合物的有效量足以产生如在施用后1-72小时在受试者的血清中测量的可检测水平的HSV抗原。
滴度.抗体滴度是受试者体内抗体(例如，对特定抗原(例如，抗HSV抗原)具有特异性的抗体)数量的测量值。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)是用于测定抗体滴度的常见测定。
在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量的，本公开的组合物的有效量足以产生1,000-10,000的中和抗体滴度，所述中和抗体滴度是由针对特定抗原的中和抗体产生的。在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量的，有效量足以产生1,000-5,000的中和抗体滴度，所述中和抗体滴度是由针对特定抗原的中和抗体产生的。在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量的，有效量足以产生5,000-10,000的中和抗体滴度，所述中和抗体滴度是由针对特定抗原的中和抗体产生的。
在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少100NT50。例如，中和抗体滴度可以为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000NT50。在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少10,000NT50。
在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少100中和单位每毫升(NU/mL)。例如，中和抗体滴度可以为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000NU/mL。在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少10,000NU/mL。
在一些实施方案中，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度相对于对照增加至少1个对数。例如，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度可以相对于对照增加至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个对数。
在一些实施方案中，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，在受试者中产生的抗疱疹病毒(例如，抗HSV)抗原抗体滴度相对于对照增加至少3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在一些实施方案中，几何平均值，即n个数的乘积的n次方根，通常用于描述成比例增长。在一些实施方案中，几何平均值用于表征受试者中产生的抗体滴度。
对照可以是例如未接种疫苗的受试者，或施用了重组蛋白疫苗或减毒病毒疫苗的受试者。
附加的实施方案
本公开的附加的实施方案由以下带编号的段落涵盖：
1.一种单纯疱疹病毒(HSV)信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其包含
(a)包含编码单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白B(gB)的开放阅读框的mRNA；
(b)包含编码HSV糖蛋白C(gC)的开放阅读框的mRNA；
(c)包含编码HSV糖蛋白D(gD)的开放阅读框的mRNA；以及
(d)包含编码HSV胞内蛋白(ICP)的开放阅读框的mRNA，所述胞内蛋白选自由HSVICP0和HSV ICP4组成的组。
2.如段落1所述的疫苗，其中相对于包含HSV gB的野生型氨基酸序列诸如SEQ IDNO:36的HSV gB，所述HSV gB包含脯氨酸稳定化突变或在其C末端截短。
3.一种单纯疱疹病毒(HSV)信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其包含
(a)包含编码单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白B(gB)的开放阅读框的mRNA，其中相对于包含HSV gB的野生型氨基酸序列诸如SEQ ID NO:36的HSV gB，所述HSV gB包含脯氨酸稳定化突变或在其C末端截短；
(b)包含编码HSV糖蛋白C(gC)的开放阅读框的mRNA；以及
(c)包含编码HSV糖蛋白D(gD)的开放阅读框的mRNA。
4.如段落2或3所述的疫苗，其中所述HSV gB包含脯氨酸稳定化突变。
5.如段落4所述的疫苗，其中所述脯氨酸稳定化突变在对应于HSV gB蛋白的位置H510的位置处，所述HSV gB蛋白包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
6.如段落5所述的疫苗，其中所述HSV gB包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列，并且其中所述脯氨酸稳定化突变在对应于H510的位置处。
7.如段落2-4中任一项所述的疫苗，其中所述HSV gB包含两个脯氨酸稳定化突变。
8.如段落7所述的疫苗，其中所述脯氨酸稳定化突变在对应于HSV gB蛋白的以下位置的位置处：
(a)位置I518和A519；
(b)位置M514和L515；
(c)位置H510和V511；或
(d)位置H506和I507，
所述HSV gB蛋白包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
9.如段落1-8中任一项所述的疫苗，其中所述HSV gB包含与SEQ ID NO:50-53中任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
10.如段落2-8中任一项所述的疫苗，其中相对于包含HSV gB的野生型氨基酸序列诸如SEQ ID NO:35的HSV gB，所述HSV gB在其C末端截短。
11.如段落9所述的疫苗，其中所述HSV gB具有不长于850、840、830、820、810、800或799个氨基酸的长度。
12.如段落9或10所述的疫苗，其中所述HSV gB包含与SEQ ID NO:54-57中任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
13.如段落3-12中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包含mRNA，所述mRNA包含编码HSV胞内蛋白(ICP)的开放阅读框，所述胞内蛋白选自由HSV ICP0和HSV ICP4组成的组。
14.如段落1或13所述的疫苗，其中所述疫苗包含：包含编码HSV ICP0的开放阅读框的mRNA和包含编码HSV ICP4的开放阅读框的mRNA。
15.如段落1或13-14中任一项所述的疫苗，其中所述HSV ICP0包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
16.如段落1或13-15中任一项所述的疫苗，其中所述HSV ICP0缺少核定位信号和/或RING指结构域。
17.如段落16所述的疫苗，其中所述HSV ICP0包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
18.如段落1或13-17中任一项所述的疫苗，其中所述HSV ICP4包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
19.如段落1或13-18所述的疫苗，其中所述HSV ICP4缺少核定位信号和/或RING指结构域。
20.如段落19所述的疫苗，其中所述HSV ICP4包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
21.如前述段落中任一项所述的疫苗，其中所述HSV gC包含补体结合结构域中的突变。
22.如段落21所述的疫苗，其中所述补体结合结构域中的所述突变是在对应于HSVgC蛋白的位置F327的位置处的氨基酸取代，所述HSV gC蛋白包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。
23.如段落22所述的疫苗，其中所述HSV gC包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列，并且其中所述突变是在位置F327处的氨基酸取代。
24.如段落22或23所述的疫苗，其中所述氨基酸取代是F327A。
25.如段落1-20中任一项所述的疫苗，其中所述HSV gC包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
26.如段落21-25中任一项所述的疫苗，其中所述HSV gC对人C3b蛋白的结合亲和力是包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HSV gC的结合亲和力的至多1/1.5、1/2.0、1/2.5、1/3.0、1/3.5、1/4.0、1/4.5、1/5.0、1/6.0、1/7.0、1/8.0、1/9.0或1/10.0。
27.如前述段落中任一项所述的疫苗，其中所述HSV gD包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
28.如前述段落中任一项所述的疫苗，其还包含mRNA，所述mRNA包含编码HSV糖蛋白E(gE)的开放阅读框。
29.如段落28所述的疫苗，其中所述HSV gE包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
30.如段落28所述的疫苗，其中所述HSV gE是可溶性的。
31.如段落30所述的疫苗，其中相对于包含HSV gE的野生型氨基酸序列诸如SEQID NO:41的HSV gE，所述HSV gE在其C末端截短。
32.如段落31所述的疫苗，其中所述HSV gE具有不长于450、440、430、420、410或400个氨基酸的长度。
33.如段落30或31所述的疫苗，其中所述HSV gE包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
34.如前述段落中任一项所述的疫苗，其中(a)的mRNA与(b)的mRNA与(c)的mRNA的摩尔比为1:1:1或3:1:1。
35.如段落1-33中任一项所述的疫苗，其中(a)的mRNA与(b)的mRNA与(c)的mRNA的质量比为1:1:1或3:1:1。
36.如前述段落中任一项所述的疫苗，其中(a)的mRNA、(b)的mRNA和/或(c)的mRNA包含化学修饰。
37.如段落36所述的疫苗，其中(a)的mRNA、(b)的mRNA和/或(c)的mRNA的100％尿嘧啶包含化学修饰。
38.如段落36或37所述的疫苗，其中所述化学修饰是1-甲基假尿嘧啶。
39.如前述段落中任一项所述的疫苗，其中所述mRNA在脂质纳米颗粒中。
40.如段落39所述的疫苗，其中所述脂质纳米颗粒包含可电离脂质、中性脂质、固醇和经PEG修饰的脂质。
41.一种方法，其包括向受试者施用如前述段落中任一项所述的疫苗，其中所述受试者患有HSV感染、已暴露于HSV或处于HSV感染的风险中。
42.如段落41所述的方法，其中所述疫苗以有效预防所述受试者的潜伏性HSV感染的量施用。
43.如段落41所述的方法，其中所述疫苗以有效预防所述受试者的潜伏性HSV感染再活化的量施用。
44.如段落41所述的方法，其中所述疫苗以有效预防HSV复制的量施用。
45.如段落41所述的方法，其中所述疫苗以有效缩短所述受试者的HSV感染的持续时间的量施用。
46.如段落41所述的方法，其中所述疫苗以有效减少所述受试者中有复制能力HSV颗粒的数量的量施用。
47.如段落41所述的方法，其中所述疫苗以有效减少所述受试者中包含HSV基因组的细胞的数量的量施用。
48.如段落41所述的方法，其中所述疫苗以有效诱导所述受试者中T细胞介导的免疫应答的量施用。
49.如段落48所述的方法，其中所述T细胞介导的免疫应答包含IFN-γ+CD4+T细胞、IL-2+CD4+T细胞和/或TNF-α+CD4+T细胞。
50.一种单纯疱疹病毒(HSV)蛋白，其包含与SEQ ID NO:36-70中任一者的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
51.一种核糖核酸(RNA)，其包含编码如段落50所述的HSV蛋白的开放阅读框。
52.一种核糖核酸(RNA)，其包含含有与SEQ ID NO:1-35中任一者的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列的开放阅读框。
53.如段落51或52所述的RNA，其中所述RNA是信使RNA。
54.如段落51-53中任一项所述的RNA，其中所述RNA在脂质纳米颗粒中。
55.如段落54所述的RNA，其中所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、中性脂质、固醇和经PEG修饰的脂质。
实施例
方法
根据本公开，多核苷酸和/或其部分或区域的制造可利用标题为“ManufacturingMethods for Production of RNA Transcripts”的国际公布WO2014/152027中教导的方法实现，所述国际公布的内容以引用的方式整体并入本文。
纯化方法可包括国际公布WO2014/152030和国际公布WO2014/152031中教导的那些，所述国际公布中的每一个以引用的方式整体并入本文。
多核苷酸的检测和表征方法可如国际公布WO2014/144039中所教导的那样进行，所述国际公布以引用的方式整体并入本文。
本公开的多核苷酸的表征可以使用多核苷酸作图、逆转录酶测序、电荷分布分析、RNA杂质的检测或前述两者或更多者的任何组合来完成。例如，“表征”包括确定RNA转录物序列，确定RNA转录物的纯度，或确定RNA转录物的电荷异质性。此类方法在例如国际公布WO2014/144711和国际公布WO2014/144767中教导，所述国际公布中的每一个的内容以引用的方式整体并入本文。
编码HSV抗原的mRNA疫苗的生产、纯化和评价可使用国际公布WO 2017/070623和国际公布WO 2018/170256中描述的方法来完成，所述国际公布中的每一个的内容以引用的方式整体并入本文。
在使用脂质纳米颗粒(LNP)调配物的实验中，调配物包含48mol％的化合物1的可电离脂质、11mol％的1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、38.5mol％的胆固醇和2.5mol％的经PEG修饰的1,2二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2500 DMG)。
生成编码一种或多种HSV蛋白(包括糖蛋白D、糖蛋白B、糖蛋白C、糖蛋白E、糖蛋白H、糖蛋白L、胞内蛋白0(ICP0)和/或胞内蛋白(ICP4))的mRNA，并将其包封在脂质纳米颗粒中(图12A)。所编码的HSV糖蛋白B是野生型糖蛋白B(gBwt)，或包含H510P取代以将gB稳定在其融合前构象中的糖蛋白B(gBpf)。为了证实这种取代不干扰免疫原性，将HEK293细胞用编码gB的mRNA(与来自用PBS对照免疫的小鼠的稀释(1:100、1:1,000或1:10,000)血清一起孵育)、编码gBwt的mRNA或编码gBpf的mRNA转染，然后用Alexa Fluor647标记的抗小鼠IgG染色，以检测与细胞结合的小鼠抗体。用任一种mRNA转染的细胞被血清有效标记，特别是仅稀释100倍的更浓缩的血清(图12B)，并且来自用任一种mRNA免疫的小鼠的10,000倍稀释的血清以相当的平均荧光强度标记所有细胞(图12C)。这些结果表明，gBwt与gBpf之间共享许多表位，从而允许编码HSV gBpf的mRNA生成对野生型HSV gB蛋白具有特异性的抗体。
生成编码HSV表面蛋白和糖蛋白(包括gB、gC、gD、gE、gH、gL和gHgL)的野生型和变体版本的mRNA，以测试突变、缺失、截短和接头对免疫原性的影响。另外，还对胞内蛋白0和4(ICP0和ICP4)进行了广泛的突变、缺失和接头修饰，并对其免疫原性进行了评价。这些变体蛋白中的每一种中存在的突变示于图1、4和13A-13I中。变体HSV gB蛋白含有上述的H510P取代、在指定位置处的2个脯氨酸取代、胞质尾区的截短，和/或胞质尾区的多个脯氨酸取代和缺失(图1、4、13A)。变体gC蛋白含有F327A突变，用于消除gC与人补体蛋白C3b的结合，以及任选的gC胞质尾区的缺失(图1、4、13B)。变体gD蛋白含有gD胞质尾区的缺失(图13C)。变体gE蛋白是可溶性的或含有gE胞质尾区的缺失(图13D)。变体gH蛋白含有gH与gL结构域的融合体，其中gH和gL通过柔性接头连接(图13E)。变体gL蛋白含有信号肽的缺失(图13F)。变体gI蛋白是可溶性的或含有gI胞质尾区的缺失(图13G)。变体HSV ICP0蛋白含有两个氨基酸序列的缺失，42个氨基酸长，或N末端166个氨基酸的缺失和附加的170个内部氨基酸(图1、4、13H)。变体HSV ICP4蛋白含有多个氨基酸取代，以及任选的N末端382个氨基酸的缺失和附加的181个内部氨基酸(图1、4、13I)。
免疫接种方法
将含有mRNA的脂质纳米颗粒的疫苗组合物按照以下施用时间表施用给小鼠。用两种剂量的给定组合物免疫C57BL/6小鼠，在第0天接受第一剂量，在第22天接受第二剂量。在第21天，即第一次(初免)给药后三周，但在第二次(加强)给药前，和第36天，即第二次(加强)给药后两周，收集血清。当评价T细胞时，在第36天将小鼠安乐死，收集脾脏并进行加工以收获脾脏细胞。在高尔基体阻断剂存在下，用一组肽库中的一种刺激脾脏细胞，每个池含有来自单一HSV抗原的肽，使得响应于刺激而产生细胞因子的细胞将保留细胞因子而不是分泌细胞因子。对细胞表面进行淋巴细胞标志物(包括CD3、CD4和CD8)染色，对细胞进行透化处理并对多种细胞因子染色。将染色后的细胞与活力染料一起孵育，并通过流式细胞术进行分析。
中和测定
血清中的抗体，当与感染所必需的病毒表面蛋白结合时，可防止病毒感染靶细胞，这种活动被称为“中和”。为了确定mRNA组合物生成针对HSV-1和/或HSV-2的中和抗体的能力，使用中和测定对血清的中和活性进行定量。对于每个测定，将ARPE-19细胞以2*104个细胞/孔的密度铺板在96孔板中，并孵育20-24小时。然后，在不含酚红的cDMEM中制备每种血清样品的3倍系列稀释液。将含有编码GFP的基因的稳定量的HSV(HSV-1或HSV-2)报告病毒与每种血清稀释样品一起孵育，以允许任何HSV特异性抗体与病毒结合。孵育后，洗涤细胞，并与HSV/血清混合物一起孵育。孵育24小时后，测量每个孔中的GFP荧光以确定感染程度。对于给定的血清样品，将50％中和滴度(NT50)计算为观察到50％ GFP+细胞时的血清稀释度的倒数。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定
血清中的抗体，当与在受感染细胞表面表达的病毒蛋白结合时，可被效应细胞诸如自然杀伤(NK)细胞识别。效应细胞识别与靶细胞结合的抗体的恒定(Fc)区，并且在识别后，释放在受感染的靶细胞中诱导细胞凋亡的细胞毒性颗粒。该过程被称为“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)。为了确定mRNA组合物生成可促进ADCC的抗体的能力，使用ADCC测定对血清的ADCC活性进行定量。该测定使用组成型表达小鼠FcγRIV的Jurkat细胞，从而允许识别抗体Fc区，和在NFAT途径控制下的荧光素酶，其在Fc识别后被活化。在每个测定中，将Vero细胞以2.5*104个细胞/孔的密度铺板在96孔板中，孵育20-24小时，然后以5个噬斑形成单位(PFU)/细胞的感染复数(MOI)接种HSV-1。接种16小时后，在仅含少量IgG的RPMI+4％胎牛血清(FBS)中制备血清样品的连续3倍稀释液，以减少背景。向各孔中添加血清样品，使抗体与表达病毒表面蛋白的受感染Vero细胞结合。然后，将报告效应细胞在RPMI+4％低-IgG FBS中连续稀释，添加到孔中，并孵育6小时，以允许识别表面结合的抗体和荧光素酶的表达。孵育6小时后，将荧光素酶底物添加到孔中，使得存在的任何荧光素酶与底物反应以产生光。测量从孔发射的光，以定量荧光素酶活性的量作为ADCC活性的测量值。
实施例1：用含有编码HSV糖蛋白和胞内蛋白的mRNA的组合物以渐增的剂量对进行小鼠免疫接种。
用含有编码gB、gC、gD以及任选的ICP0和ICP4变体蛋白的mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠，如图1所示。每种组合物的mRNA编码的抗原如表4所示。在第0天施用第一剂量(初免)，在第22天施用第二剂量(加强)。在第21天，即施用第一剂后三周，但在加强剂量施用前，和在第36天，即加强剂量施用后两周，收集血清。在第36天，还将小鼠安乐死以收集脾脏，用于通过细胞表面标志物和细胞内细胞因子染色对T细胞进行分析。评价血清的抗病毒活性，诸如中和、ADCC活性、抑制HSV gC的补体C3b结合和防止HSV的细胞-细胞扩散。
表4：含有不同剂量的编码HSV糖蛋白和胞内蛋白的mRNA的mRNA疫苗组。
Δ＝d＝缺失；CT＝胞质尾区
对于每种糖蛋白，在施用含有大约2:1:1质量比(38:20:20)的编码HSV gB、gC和gD的mRNA的组合物后，所有组中抗原特异性抗体滴度类似(图2A-2C)。此外，包含编码HSVICP0和ICP4的mRNA基本上不会减少糖蛋白特异性抗体滴度的生成(图2A-2C，比较G2 v.G5和G3 v.G6)。
关于中和抗体滴度，在施用仅含有编码gB、gC和gD的mRNA的组合物的小鼠中观察到最高的NT50滴度(图2D，G7)，但是与阳性对照高滴度人血清相比，用mRNA组合物进行疫苗接种的所有小鼠均表现出更高的NT50滴度(图2D，PC)。此外，gB胞质尾区的截短使滴度增加约1.5倍(图2D，比较G2 v.G4和G5 v.G7)。总体而言，组间差异极小(<2倍差异)。
关于ADCC活性，在施用仅含有编码gB、gC和gD的mRNA的组合物的小鼠中再次观察到最高的NT50滴度，但是包含编码ICP0和ICP4的mRNA所导致的信号减少是最小的(图2E，G2v.G5和G3v.G6)，组间最大差异小于3倍。与中和滴度一样，所有用mRNA组合物进行疫苗接种的小鼠的血清都表现出比阳性对照人血清显著更高的ADCC活性。
在评价gC/C3b结合活性的功能性测定中，用编码含有截短的胞质尾区的gC的mRNA进行免疫接种引发了能够抑制gC的C3b结合活性的抗体(FIG.2F,G2-G7 v.G1的假疫苗接种小鼠)。另外，包含编码ICP0和ICP4的mRNA对功能性抗体应答的影响很小，在用mRNA组合物进行疫苗接种的小鼠组之间没有观察到显著差异。
关于T细胞应答，在所有免疫组中观察到对HSV gB、gC和gD的肽的稳健CD4+T细胞应答，并且在用含有编码这些抗原的mRNA的组合物免疫的所有组中观察到对HSV ICP0和ICP4的肽的应答(图3A、3C、3E)。虽然组合物中包含编码ICP0和ICP4的mRNA适度降低了Th1细胞(表达IFN-γ、TNF-α和/或IL-2)对糖蛋白肽的应答，但它们的存在也限制了Th2细胞(表达IL-4、IL-5和IL-13)的生成(图3A、3C)。由于Th2细胞和相关细胞因子IL-4、IL-5和IL-13与HSV-2感染的发病率和死亡率增加相关，因此含有编码HSV gB、gC、gD、ICP0和ICP4的mRNA的组合物引发抗病毒Th1应答同时限制致病性Th2应答的能力可用于预防和控制HSV感染。
另外，观察到对除HSV gC之外的所有抗原的肽的稳健CD8+T细胞应答(图3B、3D、3F)。不同疫苗组的CD8+T细胞应答类似，并以gB特异性CD8+T细胞为主(图3F)。这种现象被认为是由C57BL/6J小鼠中免疫显性的CD8+T细胞表位(gB498-505)引起的。
实施例2：用含有编码HSV糖蛋白和胞内蛋白的mRNA的组合物以渐增的剂量对小鼠进行免疫接种。
用含有编码gBΔCT、gCmutΔCT、gD、变体ICP0和变体ICP4的mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠，如图4所示。每个剂量中mRNA的总质量在每只小鼠0.625μg至10μg之间变化。每种组合物中的mRNA剂量和mRNA之间的比率示于表5中。在第0天施用第一剂量(初免)，在第22天施用第二剂量(加强)。在第21天，即施用第一剂后三周，但在加强剂量施用前，和在第36天，即加强剂量施用后两周，收集血清。在第36天，还将小鼠安乐死以收集脾脏，用于通过细胞表面标志物和细胞内细胞因子染色对T细胞进行分析。评价血清的抗病毒活性，诸如中和、ADCC活性和抑制HSV gC的补体C3b结合。
表5：含有不同剂量的编码HSV糖蛋白和胞内蛋白的mRNA的mRNA疫苗组。
关于糖蛋白特异性抗体应答，所有剂量的mRNA疫苗组合物引发针对gB、gC和gD中每一者的强结合抗体应答(图5A-5C)。尽管观察到一些剂量依赖性，但无论每种糖蛋白的剂量如何，结合抗体滴度都很高。
关于中和抗体应答，用增加剂量的mRNA组合物进行免疫接种显示出能够抑制HSV-2感染(图5D)和交叉中和HSV-1感染(图5E)的剂量依赖性中和抗体应答。所有剂量水平均优于在每个测定板上运行的高滴度阳性对照人血清(PC)。
关于ADCC活性，来自所有疫苗接种小鼠组的血清类似地优于阳性对照血清，特别是2.5-10μg的剂量(图5F，G2-G6，PC v.G1的假疫苗接种小鼠)。
关于C3b结合抑制，来自所有疫苗接种小鼠组的血清降低HSV gC的C3b结合，其中较高剂量增加竞争性抑制(图5G，G2-G6，PC v.G1的假疫苗接种小鼠)。所有疫苗接种小鼠的血清都优于阳性对照血清(PC)。通过用含有5μg编码具有完整胞质尾区的gC-F327A的mRNA的LNP对小鼠进行免疫接种，生成了PC血清，而如表5中所示，本研究中的小鼠是使用编码gCΔCT-F327A的mRNA免疫的。甚至低剂量的编码gCΔCT-F327A的mRNA生成更有效抑制HSV gC的C3b结合活性的血清的能力进一步证明了通过截短HSV gC胞质尾区实现的表达的改善。
关于T细胞应答，CD4+T细胞应答随着mRNA剂量增加，其中糖蛋白抗原在5μg mRNA/动物剂量时达到平台(图6A、6C)。在所有剂量下，HSV特异性CD4+T细胞群体偏向Th1表型，因为对于任何抗原观察到最小Th2细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-13)至无Th2细胞因子(图6A、6C、6E)。CD8+T细胞应答随着mRNA剂量增加，高达5μg mRNA/动物，其中在10μg/动物剂量下产生IFN-γ的CD8+T细胞的比例略微降低(图6B、6D、6F)。如C57BL/6J小鼠中预期的，由于免疫显性CD8+T细胞表位gB498-505的存在，CD8+T细胞应答以gB特异性T细胞为主。
在另一个实验中，用含有编码gB、gC、gD、ICP0和ICP4变体蛋白的mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠。每种组合物的mRNA编码的抗原如表6所示。在第一组组合物中，mRNA含有SEQID NO:86的5'和3'UTR。在第二组中，编码相同抗原的mRNA含有SEQ ID NO:88-92的不同5'和3'UTR。在第0天施用第一剂量(初免)，在第22天施用第二剂量(加强)。在第21天，即施用第一剂后三周，但在加强剂量施用前，和在第36天，即加强剂量施用后两周，收集血清。在第36天，还将小鼠安乐死以收集脾脏，用于通过细胞表面标志物和细胞内细胞因子染色对T细胞进行分析。评价血清的抗病毒活性，诸如中和、ADCC活性、抑制HSV gC的补体C3b结合。
表6：含有不同剂量的编码HSV糖蛋白和胞内蛋白的mRNA的mRNA疫苗组，其5'UTR和3'UTR各不相同。
关于结合抗体应答，mRNA疫苗组合物引发针对gB、gC和gD中每一者的强结合抗体应答(图7A-7C)。v2.0 5'和3'UTR的使用增加了针对每种糖蛋白的结合抗体滴度，其中在低剂量下这种增加幅度更大(图7A-7C，G2 v.G4和G3 v.G5)。
关于功能性抗体应答，v2.0 5'和3'UTR的使用显著增加了NT50滴度，其中在较低的总mRNA剂量下观察到更大的增加(图7D，G2 v.G4和G3 v.G5)。对于ADCC活性观察到类似的趋势(图7E，G2 v.G4和G3 v.G5)。
在所有疫苗接种小鼠组中观察到对糖蛋白抗原的稳健CD4+T细胞应答。与v1.1UTR相比，v2.0 5'和3'UTR的使用降低了两种剂量下对gB、gC和gD的肽具有特异性的Th2细胞的比例(图8A)。还观察到对gB的稳健CD8+T细胞应答，这与免疫显性gB498-505肽以及其他HSV抗原的存在一致(图8B)。这些结果表明，在mRNA中包含SEQ ID NO:85的5'UTR和SEQ IDNO:88-92的3'UTR进一步抑制HSV感染中有害的Th2细胞的生成。
实施例3：在潜伏性HSV感染期间用不同剂量的编码HSV抗原的mRNA对豚鼠进行免疫接种。
用HSV-2接种豚鼠以引发初次感染，其中病毒在症状阶段消退后建立潜伏期。该研究的时间过程如图9所示。接种后14天，对豚鼠进行检查，将患有无症状或严重原发疾病(显著阴道瘢痕形成)的豚鼠从研究中排除。在接种后第21天和第35天，在感染的潜伏期期间，向豚鼠施用含有编码如本文所述的HSV抗原的mRNA的mRNA组合物(总共50μg mRNA)，或施用PBS作为阴性对照。
从接种后第14天至第21天、免疫接种前以及免疫接种后每周两次，每天收集阴道拭子，以通过qPCR定量HSV-2基因组拷贝并测量病毒脱落。从接种后第14天开始，每天对豚鼠进行检查，以检查指示活跃HSV-2复制的生殖器病变。在第21天(第一次疫苗给药前)、第35天(第一次疫苗给药后2周，但在第二次给药前)、第56天(第二次给药后3周)和第70天(第二次给药后5周)收集血清。在接种后第45天，即第二次疫苗给药后10天，收集血液，以分析循环T细胞中的HSV-2特异性T细胞应答。在第70天，即第二次疫苗给药后5周，将豚鼠安乐死，并加工脾脏和阴道粘膜，以分析HSV-2特异性T细胞应答。还收集背根神经节，以分析潜伏性病毒负荷。
实施例4：编码截短的HSV细胞内抗原的mRNA的设计。
分析HSV蛋白ICP0和ICP4的蛋白序列，以鉴定含有高密度T细胞表位的区域。
HSV ICP0和HSV ICP4的富含T细胞表位的区域如图10A-10B所示。设计含有表位富集区的每种蛋白质的经修饰形式。与全长形式相比，这些经修饰的蛋白质含有更高密度的T细胞表位，并且因此可用于引发针对这些蛋白质的T细胞应答。另外，这些经修饰形式中不存在生物活性结构域，诸如HSV ICP0和HSV ICP4的核定位信号，从而允许蛋白质被保留在细胞质中，并且被蛋白酶体更有效地加工，以呈递至T细胞。
实施例5：用含有编码不同HSV胞内蛋白的mRNA的组合物对小鼠进行免疫接种。
用含有编码HSV胞内蛋白ICP0或ICP4，或ICP0和ICP4两者的mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠。由mRNA编码的ICP4变体包括SEQ ID NO.14和35中所示的那些，以及SEQ IDNO.14和35中每一者的对照HSV ICP4构建体，所述构建体缺少一个或多个已知的CD8+T细胞表位，如图10B所示。mRNA和所编码的抗原如表13所示。在第0天施用第一剂量(初免)，在第22天施用第二剂量(加强)。在第28天，将小鼠安乐死以收集脾脏，用于分析免疫细胞群体，诸如细胞内细胞因子染色。
表7：含有编码HSV胞内蛋白的mRNA的疫苗组合物。
实施例6：用含有编码不同HSV胞内蛋白的mRNA的组合物对小鼠进行免疫接种。
用含有编码HSV胞内蛋白ICP0或ICP4，或ICP0和ICP4两者的mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠。如图9B所示，由mRNA编码的ICP4变体包含具有SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的变体ICP4和缺少几种已知T细胞表位的对照截短的ICP4蛋白。在第0天施用含有2μg mRNA/所编码蛋白的第一剂量(初免)，并且在第22天施用第二相同剂量(加强)。在第28天，将小鼠安乐死以收集脾脏，用于通过表面标志物和细胞内细胞因子染色分析免疫细胞群体。在所有组中，施用编码给定蛋白质的mRNA引发对所编码蛋白质的IFN-γ+CD4+(图10C)。此外，与编码截短的对照ICP4的mRNA相比，编码具有SEQ ID NO:49所示序列的ICP4变体的mRNA引发更多的IFN-γ+CD4+T细胞。当编码ICP4和ICP0的mRNA一起施用时，观察到一些干扰，因为与施用仅编码一种抗原的mRNA(2μg剂量)的小鼠相比，在施用两种mRNA(2μg编码ICP0的mRNA和2μg编码ICP4的mRNA)的小鼠中观察到较少的对给定抗原具有特异性的IFN-γ+CD4+T细胞。
与在该实验中观察到的有效IFN-γ+CD4+T细胞应答相反，在每组中观察到很少的对ICP0或ICP4具有特异性的CD8+T细胞(图10D)。这种结果可能是由于小鼠CD8+T细胞识别的或小鼠MHC-I蛋白呈递的表位之间的差异。
实施例7：评价截短的HSV糖蛋白的体外表达。
为了评价不同HSV-2gB变体的表达，用500ng mRNA转染106293个细胞，所述mRNA编码(i)野生型gB、(ii)缺失120个氨基酸以截短胞质尾区的gB、(iii)具有H506P和I507P突变以将蛋白质稳定在融合前构象中的gB、或(iv)具有H506P和I507P突变并缺失120个氨基酸以截短胞质尾区的gB。然后使用对HSV-2gB具有特异性的单克隆抗体或含有gB特异性抗体的多克隆小鼠血清与荧光标记的二级抗体组合对细胞进行染色，并使用流式细胞术测量细胞表面上gB表达的程度。胞质尾区的截短使gB的表面表达提高了大约两倍(图11A)。然而，含有H506P和I507P突变的gB的表面表达是最小的。
在类似的实验中，用编码野生型gC、含有F327A突变的gC、或含有F327A突变并缺失11个C末端氨基酸以截短胞质尾区的gC的mRNA转染293个细胞。转染24小时后，用对HSV-2gC具有特异性的单克隆抗体和荧光标记的二级抗体对细胞进行染色，并使用流式细胞术测量荧光细胞的百分比(图11B)、中值荧光强度(图11C)。将荧光细胞的百分比乘以MFI，以计算总表达强度的测量值(图11D)。与gB一样，胞质尾区的截短显著提高了gC的表达。另外，F327A突变对表达没有负面影响。这些结果表明，在将mRNA引入细胞后，gCmutΔCT由编码mRNA稳健地表达。
实施例8：评价免疫血清对HSV gC的人补体结合的抑制作用。
在第36天，即施用第二剂mRNA疫苗后两周，收集来自如实施例2-7所述免疫的小鼠的血清，并在竞争性抑制测定中测试其阻止gC与人补体蛋白C3b结合的能力。在该测定中，将C3b固定在固体表面诸如96孔板上，并将生物素化的gC蛋白与血清或媒介物对照一起预孵育，以形成免疫复合物。然后将血清:gC免疫复合物添加到C3b蛋白中，以测定抗体阻止gC与C3b结合的程度。洗涤去除未结合至固定化C3b的gC后，添加链霉亲和素-HRP。然后计算相对于用媒介物对照观察到的信号，将信号减少50％所需的血清稀释度。
实施例9：用编码HSV蛋白的mRNA对小鼠进行免疫接种。
在C57BL/6小鼠中测试一组mRNA疫苗组合物，其各自含有包封编码不同HSV抗原的mRNA的脂质纳米颗粒。用两剂表8中所列的组合物之一免疫小鼠，在第0天接受第一剂量，在第22天接受第二剂量。在第36天，即第二次给药后两周，收集血清以评价体外抗HSV感染的中和活性和针对受HSV-1感染的细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。编码融合前或野生型gB、gD或gHgL蛋白的mRNA引发了减少HSV-1的F菌株或HSV-2的MS菌株对靶细胞的感染的抗体(图14A-14B)。由编码gCmut的mRNA引发的抗体显示出针对HSV-2而非HSV-1的中和活性，而由编码sgE的mRNA引发的抗体不中和任一菌株。
还在ADCC测定中测试了来自用表8中所示的每种mRNA组合物免疫的小鼠的血清促进效应细胞活化的能力。来自用编码gB的mRNA免疫的小鼠的血清导致ADCC报告细胞中NFAT途径的稳健活化，其中与野生型形式相比，融合前形式(gBpf)引发更大的活化(图14C)。编码gD的mRNA生成导致最小活化的血清，而来自用编码gCmut、sgE或gHgL的其他mRNA免疫的小鼠的血清不会导致可检测的活化。这些结果表明，受HSV感染的细胞表面上针对gB的抗体对于刺激受感染细胞的ADCC活性至关重要。此外，比野生型构象相比，gB的融合前构象引发更多的gB特异性抗体。
表8：在小鼠体内测试的mRNA疫苗组。
在C57BL/6小鼠中使用前一段落中所述的相同免疫接种方案测试另一组mRNA疫苗组合物，其各自含有包封编码不同HSV抗原的mRNA的脂质纳米颗粒。用两剂表9中所列的组合物之一免疫小鼠，在第0天接受第一剂量，在第22天接受第二剂量。在第36天，即第二次给药后两周，收集血清以评价体外抗HSV感染的中和活性(图15A-15J)、通过复制HSV-1防止细胞-细胞扩散(图15K)、针对受抗HSV-1感染的细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(图15L)和HSV表面蛋白特异性IgG的量(图16A-16E)。
表9：在小鼠体内测试的mRNA疫苗组。
关于仅编码gB、gC和gD的mRNA，来自用编码gB的融合前形式而不是野生型形式的mRNA免疫的小鼠的血清在中和HSV-1和HSV-2方面略微更有效(图15A)。来自用编码gB、gC和gD的mRNA免疫的小鼠的血清中和HSV-1的F菌株和HSV-2的MS菌株，而来自用仅编码胞内蛋白(ICP4和ICP0)的mRNA免疫的小鼠的血清不中和任一病毒(图15B-15C)。包含编码sgE的mRNA引发了针对HSV-1和HSV-2两者的略微更高的中和抗体滴度(图15D)。向包含编码HSVgB、gC、gD和sgE的mRNA的组合物中添加编码HSV ICP4的mRNA导致较低的中和滴度(图15E)，而进一步添加编码HSV ICP0的mRNA增加了中和滴度(图15F)。为了评价补体在促进血清中抗体中和方面的作用，在中和测定之前，用豚鼠补体补充一些血清样品至2.5％(v/v)补体的终浓度。相对于在未补充的血清中观察到的中和滴度，添加补体使中和滴度增加约10倍(图15G-15H)。进行类似的实验以评价sgE在血清抗体中和HSV-1或HSV-2方面的作用，其中在中和测定前用sgE特异性血清补充血清。sgE特异性血清补充的作用在所有测定中都是最小的，这表明，虽然在mRNA中包含编码sgE的开放阅读框略微增强了针对HSV-1和HSV-2的中和抗体的生成，但sgE特异性抗体的存在并不是血清抗体病毒中和的限制因素(图15I-15J)。
在血清活化ADCC效应细胞的能力方面观察到类似的趋势，其中gB的融合前构象、sgE的添加以及HSV ICP0的添加增加ADCC活性和抑制细胞-细胞扩散，而HSV ICP4的添加降低ADCC活性和抑制细胞-细胞扩散(图15K-15L)。来自用编码gB、gC和gD的mRNA免疫的小鼠的血清均含有对这三种抗原中的每一种具有特异性的IgG，无论mRNA编码的是融合前还是野生型gB，也无论组合物中是否含有编码其他HSV抗原的mRNA(图16A-16C)。编码gHgL的每种mRNA也引发了对这些蛋白质具有特异性的稳健抗体(图16D)。然而，用编码sgE的mRNA免疫的小鼠的血清中基本上不存在针对gE和gI的抗体(图16E)。
在第一次免疫接种后第36天，即接受第二次疫苗剂量后2周，将小鼠安乐死以收获脾脏，对脾脏进行加工，以通过细胞内细胞因子染色(ICS)分析T细胞应答。在高尔基体阻断剂存在下，用一组肽库中的一种刺激脾脏细胞，每个池含有来自单一HSV抗原的肽，使得响应于刺激而产生细胞因子的细胞将保留细胞因子而不是分泌细胞因子。对细胞表面进行淋巴细胞标志物(包括CD3、CD4和CD8)染色，对细胞进行透化处理并对多种细胞因子染色。将染色后的细胞与活力染料一起孵育，并通过流式细胞术进行分析。这些实验的结果如图17A-17D所示。
淋巴细胞大部分是存活的，并且不受免疫接种或肽刺激的不利影响(图17A)。在脾脏中存在的CD8+T细胞中，与gB、gC和gD的基线组合相比，用编码更多抗原的mRNA免疫的小鼠中识别gB肽的T细胞的频率略高(图17B)。因此，在mRNA疫苗中包含附加的抗原并未减少对HSV gB的CD8+T细胞应答。
用源自gD的肽库进行刺激揭示了CD4+T细胞稳健产生Th1相关细胞因子IFN-γ，IL-2和TNF-α，但CD8+T细胞产生的这些细胞因子较少(图17C)。包含附加的抗原(诸如HSVsgE、ICP0和ICP4)并未减弱这些应答，尽管包含附加的抗原导致CD4+T细胞产生Th2相关细胞因子IL-5和IL-13。除了CD4+T细胞和CD8+T细胞都观察到Th1相关细胞因子的稳健产生外，在对gL肽库的应答中观察到类似的趋势(图17D)。
用来自HSV ICP0的N末端一半(ICP0-1)或HSV ICP0的C末端一半(ICP0-2)的肽库进行刺激导致CD4+T细胞产生一些Th1相关细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α，但CD8+T细胞产生的细胞因子可忽略不计(数据未示出)。用来自HSV ICP4的N末端一半(ICP4-1)的肽库进行刺激导致一些细胞因子产生，但用来自HSV ICP4的C末端一半(ICP4-2)的肽观察到较少的细胞因子产生(数据未示出)。经任一ICP4肽库刺激后，CD8+T细胞产生的细胞因子较少。在所有情况下，包含附加的抗原(诸如HSV sgE、gB、gC、gD或gHgL)并未降低对HSV ICP0或HSV ICP4的应答。
尽管对源自HSV ICP0和HSV ICP4的肽的T细胞应答是微小的，但小鼠并不总是复制观察到的对人体内相同抗原的T细胞应答。造成这种差异的部分原因可能是抗原的蛋白酶体加工的差异、影响呈递给T细胞的肽的MHC多样性以及不同物种之间TCR重排的差异。因此，在mRNA疫苗中包含编码HSV ICP0和/或HSV ICP4的mRNA可以在人体内引发保护性T细胞应答。
实施例10：用不同剂量的编码HSV抗原的mRNA对小鼠进行免疫接种。
在C57BL/6小鼠中使用如上文方法中所述的免疫接种方案测试一组mRNA疫苗组合物，其各自含有包封编码不同HSV抗原的mRNA的脂质纳米颗粒。用两剂表10中所列的组合物之一免疫小鼠，在第0天接受第一剂量，在第22天接受第二剂量。在一些组中，每个LNP含有编码给定抗原的2μg mRNA(例如，编码gB的2μgmRNA、编码gC的2μg mRNA或编码gD的2μgmRNA)，而在其他组中，每个LNP含有编码给定抗原的0.4μg mRNA(例如，编码gB的0.4μgmRNA、编码gC的0.4μg mRNA或编码gD的0.4μgmRNA)。如图24B所示，施用于第8组和第16组小鼠的mRNA所编码的对照HSV ICP4变体缺少存在于SEQ ID NO:14的mRNA所编码的HSV ICP4变体中的已知CD8+T细胞表位。在第21天，即第一次给药后三周，和第36天，即第二次给药后两周，收集血清。
表10：在小鼠体内测试的mRNA疫苗组。
测试来自第36天的血清的中和(图18A-18D)和ADCC(图18E-18F)活性。分析来自两个时间点的血清中HSV表面蛋白特异性IgG的量(图19A-19E)。
将来自用mRNA组合物免疫的小鼠的中和抗体滴度与来自人血清库的血清中的中和抗体滴度进行比较。按针对给定HSV(HSV-1F菌株或HSV-2MS菌株)的中和抗体滴度对80份人血清样品进行排序，并将其分成大小相同的三组。在每组中，计算几何平均NT50，并将其用作“高”、“中”或“低”中和活性的基准。在中和测定中，将有效的血清样品用作阳性对照。将每个所编码抗原的mRNA的剂量从2μg/抗原降低5倍至0.4μg/抗原仅引起中和滴度的适度降低，对于HSV-1不超过2.7倍(图18A-18B)并且对于HSV-2不超过2倍(图18C-18D)。然而，降低剂量改善了ADCC活性，特别是对于包含编码HSV ICP0的mRNA的组合物(图18E-18F)。更高的剂量以及特定的免疫接种途径促进更强烈的生发中心反应，从而使抗体应答偏向免疫显性表位。参见，例如，Angeletti等人Proc Natl Acad Sci U S A.2019.116(27):13474-13479。因此，较低的mRNA剂量可以减少这种偏倚，从而有利于免疫应答，其特征在于，适度地降低中和抗体滴度但改善效应细胞功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，从而允许体液免疫和细胞免疫之间的平衡。这种增加的细胞免疫应答特别适用于在建立潜伏性感染之前通过杀死含有HSV蛋白的受感染细胞来治疗或预防疱疹病毒感染。
通过ELISA对gB-、gC-和gD-特异性IgG滴度的分析显示，与含有2μg相同mRNA的单剂量相比，含有0.4μg mRNA/抗原的单剂量引发更少的针对所编码蛋白的抗体(图19A-19C)。然而，在第36天(即第二次给药后两周)收集的血清中，两个剂量组之间的抗体类似，但gD特异性滴度除外，其在接受2μg编码HSV ICP4的mRNA的小鼠中显著较低(图19C)。如实施例9所示，对gE/gI具有特异性的IgG的滴度都很低(图19D)。最后，相对于添加仅编码gL的mRNA，向组合物中添加编码gHgL的mRNA增加了两个剂量组中对gHgL具有特异性的IgG的滴度(图19E)。
在第36天，还将小鼠安乐死以收集脾脏，用于如上文方法中所述的T细胞分析。在所有组中，大部分CD8+T细胞对HSV gB的SSIEFARL(SEQ ID NO:103)表位具有特异性(图20)。观察到针对HSV gD、gE、gL和ICP0的稳健Th1应答，因为来自用编码那些抗原的mRNA组合物免疫的小鼠的CD4+T细胞在用来自那些抗原的肽刺激后产生Th1细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2(表11)。CD8+细胞在用来自gD、gE和gL的肽刺激后也产生IFN-γ、TNF-α和IL-2，但对HSV ICP0和ICP4肽的应答较差(表11)。用编码更多抗原(诸如gB、gC、gD、sgE和ICP0的组合)的mRNA进行免疫接种也引发了一些Th2细胞，其产生IL-5、IL-9、IL-10和IL-13(数据未示出)。与来自其他抗原的肽相比，当用gD肽刺激时，更多的CD4+细胞产生Th1细胞因子，这表明gD含有免疫显性表位(表11)。
表11：疫苗诱导的T细胞应答如表6所示。
-0％-0.25％的CD4+或CD8+细胞
*0.25％-0.5％的CD4+或CD8+细胞
**0.5％-1.0％的CD4+或CD8+细胞
***1.0％-1.5％的CD4+或CD8+细胞
在剂量滴定研究中，用包封不同剂量的编码融合前gB、补体结合突变体gC、gD和可溶性gE的相同mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠。mRNA的剂量(μg/抗原)如表12所示。用两剂表12中所列的组合物之一免疫小鼠，在第0天接受第一剂量，在第22天接受第二剂量。在第21天，即第一次给药后三周，和第36天，即第二次给药后两周，收集血清。分析来自两个时间点的血清的HSV蛋白特异性IgG(图21A-21D)，并测试来自第36天的血清的中和(图21E-21F)和ADCC(图21G)活性。
通过ELISA对gB-、gC-和gD-特异性IgG滴度的分析显示，对于第21天和第36天的血清，较低剂量的mRNA引发较低的IgG滴度(图21A-21C)。在第21天，所有组中对gE/gI的IgG特异性滴度可忽略不计，但在第二次给药后滴度增加，其中在接受最高mRNA剂量的小鼠中观察到最高滴度(图21D)。关于中和活性，含有少至0.5μgmRNA/抗原的剂量引发的中和抗体滴度与含有高达4μg mRNA/抗原的较高剂量引发的中和抗体滴度相当(图21E-21F)。类似地，ADCC活性在来自用含有4μg、2μg、1μg或0.5μg mRNA/抗原的组合物免疫的小鼠的血清中大致相等(图21G)。这些结果表明，相对少量的mRNA足以引发针对HSV的中和抗体，以及促进针对受HSV感染的细胞的细胞效应子功能的抗体。
表12：在小鼠体内测试的mRNA疫苗的剂量。
实施例11：用编码HSV蛋白变体的mRNA对小鼠进行免疫接种。
在C57BL/6小鼠中使用如上文方法中所述的免疫接种方案测试一组mRNA疫苗组合物，其各自含有包封编码不同HSV抗原的mRNA的脂质纳米颗粒。用两剂表13中所列的组合物之一免疫小鼠，在第0天接受第一剂量，在第22天接受第二剂量。一种组合物包含编码野生型gB的mRNA，另一种组合物包含编码上文方法中所述的融合前(pf)gB的mRNA，并且其他组合物包含编码不同稳定化形式的gB的mRNA。每个LNP含有1μg编码给定抗原的mRNA(例如，1μg编码gB的mRNA、1μg编码gC的mRNA和1μg编码gD的mRNA)。在第21天，即第一次给药后三周，和第36天，即第二次给药后两周，收集血清。
表13：在小鼠体内测试的mRNA疫苗组。
测试来自第36天的血清的中和(图22A-22B)和ADCC(图22C)活性。相对于编码野生型gB或H510P融合前gB的mRNA，编码具有两个脯氨酸(2P)突变以将gB稳定在融合前构象中和/或缺失氨基酸799-901以去除胞质尾区的gB蛋白的mRNA显著增加中和滴度。针对HSV-1和HSV-2两者的中和抗体滴度增加，但这种作用对于HSV-2更明显。用H510P和V511P突变的组合，或用H506P和I507P突变的组合，观察到中和抗体滴度的最大增加。类似地，通过用编码缺少胞质尾区或含有2P-稳定化突变的gB的组合物进行免疫接种所生成的血清中的ADCC活性更高。
在后续实验中，使用前两段中所述的相同免疫接种和血清收集方案，用脂质纳米颗粒对小鼠进行疫苗接种，所述脂质纳米颗粒包含编码HSV gCmut、gD和野生型gB、含有2P稳定化突变H506P和I507P的gB、或缺失120个C末端氨基酸(782-901)以除去胞质尾区的相同2P-稳定化gB的mRNA。与先前的实验(其中脂质纳米颗粒含有等质量的编码每种抗原的mRNA)相反，该实验使用2:1:1比率的编码gB:gC:gD的mRNA。在该比率下，与编码2P稳定的gB的mRNA组合引发与编码野生型gB的mRNA组合类似的中和抗体滴度。然而，相对于具有全长胞质尾区的匹配对照，去除gB的胞质尾区仍然提高了免疫原性(图22D)。
在C57BL/6小鼠中使用如上文方法中所述的免疫接种方案测试另一组mRNA疫苗组合物，其各自含有包封编码不同HSV抗原的mRNA的脂质纳米颗粒。用两剂表14中所列的组合物之一免疫小鼠，在第0天接受第一剂量，在第22天接受第二剂量。每种组合物包含编码如实施例11所述的融合前H510 gB、gC、gD和gE，以及gL或gHgL的变体的mRNA。每个LNP含有2μg编码给定抗原的mRNA(例如，2μg编码gB的mRNA、2μg编码gC的mRNA和2μg编码gD的mRNA)。一些组合物包含野生型gL，而一种组合物包含编码缺少信号肽(Δsp)以防止分泌的变体gL的mRNA，并且另一种组合物包含编码通过接头连接的gH和gL的mRNA。一种组合物包含等质量的编码gH的mRNA和编码gL的mRNA(各1μg)，而另一种组合物包含等摩尔量的两种mRNA(2μg编码gH和gL的总mRNA)。在第21天，即第一次给药后三周，和第36天，即第二次给药后两周，收集血清。
表14：在小鼠体内测试的mRNA疫苗组。
测试来自第36天的血清的中和(图23A)和ADCC(图23B)活性。将编码gH的mRNA(作为与gL分开的蛋白质或作为与gL连接的蛋白质)添加到组合物中降低了中和抗体滴度和ADCC活性。
在第36天，还将小鼠安乐死以收集脾脏，用于如上文方法中所述的T细胞分析。为了测定对gB的应答，制备含有来自gB的不同肽的两个库，并用每个库分别刺激细胞。使用相同的方法测定对gH的应答。这些刺激的结果如表15所示。
表15：疫苗诱导的T细胞应答如表10所示。
-0％-0.25％的CD4+或CD8+细胞
*0.25％-0.5％的CD4+或CD8+细胞
**0.5％-1.0％的CD4+或CD8+细胞
***1.0％-1.5％的CD4+或CD8+细胞
****>1.5％的CD4+或CD8+细胞
观察到针对gB(池1)、gD、gH(池1和2)和gL的稳健Th1应答，因为来自用编码那些抗原的mRNA组合物免疫的小鼠的CD4+T细胞在用来自那些抗原的肽刺激后产生Th1细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2。CD8+细胞在用来自gB(池2)、gD和gL的肽刺激后也产生IFN-γ、TNF-α和IL-2。Th2细胞应答最小，因为很少CD4+T细胞产生IL-4、IL-5或IL-13(数据未示出)。与来自其他抗原的肽相比，当用gD肽刺激时，更多的CD4+细胞产生Th1细胞因子，这表明gD含有免疫显性MHC-II表位(表15)。在CD8+T细胞中出现了向gB肽的相同偏倚，这表明gB含有免疫显性MHC-I表位。
与抗体滴度的降低一致，向组合物中添加编码gH的mRNA降低了gB和gD特异性Th1细胞的水平，以及gD特异性CD8+T细胞的水平。
关于gL特异性应答，含有编码gL、gLΔsp的mRNA或等质量的编码gH和gL的mRNA的组合物引发类似水平的gL特异性Th1和CD8+T细胞。然而，含有等摩尔量的编码gH和gL的mRNA或编码连接的gHgL的mRNA的组合物引发对gL的较低CD8+T细胞应答。
关于gH特异性应答，具有等摩尔量或等质量的编码单独的gH和gL蛋白的mRNA的组合物引发等同的Th1和CD8+T细胞应答。然而，编码连接的gHgL的mRNA引发较少的gH特异性Th1和CD8+T细胞。
实施例12：用含有不同比率的编码HSV抗原的mRNA的组合物对小鼠进行免疫接种。
用含有编码一种或多种HSV抗原的mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠。编码每种抗原的mRNA的比率如表16所示。一些组合物含有等质量的每种mRNA，而另一些含有等摩尔量的mRNA。在一些组合物中，改变mRNA比率，使得所施用的mRNA的剂量相对于所生成的抗体滴度是饱和的。使用来自实施例11中所示的剂量递减研究的数据确定饱和剂量。在第0天施用第一剂量(初免)，在第22天施用第二剂量(加强)。在第21天，即施用第一剂后三周，但在加强剂量施用前，和在第36天，即加强剂量施用后两周，收集血清。评价血清的抗病毒活性，诸如中和和ADCC活性。
表16：含有不同比率的编码HSV抗原的mRNA的疫苗组合物。
编码gB或gD的mRNA引发中和抗体，所述中和抗体有效减少HSV-2的MS菌株对靶细胞的感染(图24A)。含有编码gB、gC和gD的mRNA的三价组合物和含有编码gB、gC、gD和sgE的mRNA的四价组合物也引发中和抗体，其滴度在由编码gD的mRNA组合物引发的滴度与由编码gB的mRNA组合物引发的滴度之间变化。在用三价和四价组合物免疫的小鼠中，随着组合物中编码gB的mRNA的量相对于其他mRNA增加，抗体滴度增加。
还在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定中测试了来自用表16中所示的每种mRNA组合物免疫的小鼠的血清促进效应细胞活化的能力。来自用编码gB或gD的mRNA免疫的小鼠的血清导致ADCC报告细胞中NFAT途径的稳健活化，其中编码gD的mRNA引发更强烈的ADCC应答(图24B)。与中和抗体应答一样，含有更多编码gB的mRNA的三价和四价组合物引发更强烈的ADCC应答。出乎意料地，与来自用仅编码单一抗原的单价组合物免疫的小鼠的血清相比，来自用三价和四价组合物免疫的小鼠的血清促进ADCC报告细胞中更大的NFAT活化。这在一定程度上是出乎意料的，因为当测试中和抗体应答时，单价和多价组合物引发类似的NT50滴度。这些结果表明，受HSV感染的细胞表面上针对gB和gD的抗体有助于去除受感染细胞的ADCC活性，并且与对单一抗原的应答相比，对多种表面表达的抗原(包括gB、gD和gC，或gB、gD、gC和gE)的组合应答促进更大的抗病毒ADCC活性。
在后续实验中，使用前三段中所述的相同免疫接种和血清收集方案，用包含编码HSV gB、gCmut和gD的mRNA的脂质纳米颗粒对小鼠进行疫苗接种。脂质纳米颗粒包含质量比为1:1:1、2:1:1或5:1:1的编码gB、gCmut和gD的mRNA，其中每个脂质纳米颗粒中总共有1μgmRNA(例如，对于2:1:1组，0.5μg编码gB的mRNA、0.25μg编码gCmut的mRNA或0.25μg编码gD的mRNA)。增加编码gB的mRNA的量也增加了通过免疫接种获得的中和抗体滴度，其中最有效的中和抗体应答发生在用含有5:1:1比率的编码gB、gCmut和gD的mRNA的组合物进行疫苗接种的小鼠中(图24C)。
实施例13：用含有编码HSV糖蛋白和胞内蛋白的mRNA的组合的组合物对小鼠进行免疫接种。
在小鼠中使用如上文方法中所述的相同免疫接种方案测试一组mRNA疫苗组合物，其各自含有包封编码不同HSV抗原的mRNA的脂质纳米颗粒。每种组合物的mRNA编码的抗原和每种组合物中mRNA的比率如表17所示。在含有编码gB、gC和gD的mRNA的组合物中，mRNA以2gB:1gC:1gD的质量比存在。在含有编码gB、gC、gD、ICP0和ICP4的mRNA的组合物中，mRNA以2gB:1gC:1gD:0.8ICP0:1.6ICP4的质量比存在。用含有mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠，在第0天接受第一剂量，在第22天接受第二剂量。在第21天，即第一次给药后三周，和第36天，即第二次给药后两周，收集血清。图25A和25C示出了使用第36天血清进行的中和和ADCC测定的结果。如图25B所示，还在第36天将小鼠安乐死以收集脾脏，用于通过表面标志物和细胞内细胞因子染色分析T细胞。
表17：在小鼠体内测试的mRNA疫苗组。
与图24C所示的结果一致，用编码gB、gC和gD的mRNA免疫的小鼠表现出稳健的中和抗体滴度。然而，当组合物中包含编码ICP0和ICP4的mRNA(主要由T细胞靶向)时，观察到一些干扰，因为在那些小鼠中中和抗体滴度较低(图25A)。尽管这干扰了中和抗体的生成，但是包含编码ICP0和ICP4的mRNA显著增加了对HSV-2抗原具有特异性的IFN-γ+CD4+T细胞的总数(图25B)。这些结果表明，HSV糖蛋白B、C和D诱导强烈的CD4+T细胞应答。
在相同的研究中，一些小鼠用含有编码不同形式的gC的mRNA的组合物进行免疫，这些不同形式包括野生型gC、含有F327A取代的gC(gCmut)或含有F327A取代并缺失11个氨基酸以截短胞质尾区的gC(gCmutΔCT)。将免疫接种后第36天收集的血清用于实施例8中所述的gC:C3b结合抑制测定，以确定组合物引发能够阻断C3b结合的gC特异性抗体的程度，该C3b结合有助于HSV-2的免疫逃避。相对于用编码野生型gC的mRNA进行免疫接种，用编码gCmutΔCT的mRNA进行免疫接种将对gC的抗体应答增加了约100倍(图25C)。与实施例1的体外表达数据(其显示与野生型gC相比，gCmutΔCT的表达提高)一起，这些结果表明，gC的胞质尾区的截短提高了蛋白质表达和免疫原性两者。
在另一个实验中，根据相同的免疫接种、血清收集和T细胞收集方案，用表18中所示的另一组组合物免疫小鼠。脂质纳米颗粒含有总共5.2μg mRNA，其中编码gB、含有F327A取代的gC、gD、ICP0和ICP4的mRNA的比率为2gB:1gC:1gD:0.4ICP0:0.8ICP4。一种组合物含有编码野生型gB的mRNA，而另一种组合物含有编码含有H506P和I507P取代并缺失氨基酸782-901以截短胞质尾区的gB(gB2P4ΔCT)的mRNA。
表18：在小鼠体内测试的mRNA疫苗组。
这两种组合物都引发稳健的中和抗体和ADCC应答，其中在用含有编码gB2P4ΔCT的mRNA的组合物免疫的小鼠中ADCC活性略高(图26A-26B)。另外，在小鼠中检测到对每种所编码的抗原具有特异性的IFN-γ+CD4+T细胞(图26C)。CD8+T细胞应答，虽然也很高，以对小鼠中免疫显性的gB肽具有特异性的T细胞为主。
实施例14：用含有编码不同gE和gI蛋白的mRNA的组合物对小鼠进行免疫接种。
用含有编码gB、gC、gD和任选的gE和/或gI的mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠。每种组合物的mRNA编码的抗原如表19所示。在第0天施用第一剂量(初免)，在第22天施用第二剂量(加强)。在第21天，即施用第一剂后三周，但在加强剂量施用前，和在第36天，即加强剂量施用后两周，收集血清。评价血清的抗病毒活性，诸如中和、ADCC活性和防止HSV的细胞-细胞扩散。
表19：含有编码不同HSV gE和gI蛋白的mRNA的疫苗组合物。
“ΔCT”表示胞质尾区的缺失。
实施例15：用含有编码不同gD蛋白的mRNA的组合物对小鼠进行免疫接种。
用含有编码gB、gC、gD和任选的gE和/或gI的mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠。每种组合物的mRNA编码的抗原如表20所示。gD-gp120是指HSV gD和HIV-1gp120的融合蛋白。在第0天施用第一剂量(初免)，在第22天施用第二剂量(加强)。在第21天，即施用第一剂后三周，但在加强剂量施用前，和在第36天，即加强剂量施用后两周，收集血清。评价血清的抗病毒活性，诸如中和、ADCC活性和防止HSV的细胞-细胞扩散。
表20：含有编码不同HSV gD蛋白的mRNA的疫苗组合物。
序列
等同形式和范围
虽然本文已描述和示出了若干发明实施方案，但本领域普通技术人员将容易地设想用于执行本文所述的功能和/或获得结果和/或一个或多个优点的多种其他手段和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一者被认为在本文所述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文描述的所有参数、大小、材料和构造旨在是示例性的，并且实际的参数、大小、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的一个或多个具体应用。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本文所述的具体发明实施方案的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方案仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，可以不同于具体描述和要求保护的方式来实践发明实施方案。本公开的发明实施方案涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不是相互矛盾的，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合均包括在本公开的发明范围内。
如本文所定义和使用的所有定义应理解为控制字典定义、以引用方式并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均以引用的方式并入，就每个所引用的主题而言，在一些情况下，可以涵盖文档的全部内容。
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如本文在说明书和权利要求中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表内具体标识的要素之外的要素可任选地存在，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地，“A和/或B中的至少一个”)在一些实施方案中可指至少一个，任选地包括多于一个A而不存在B(并且任选地包括除B以外的元件)；在另一个实施方案中，指至少一个、任选地包括多于一个B而不存在A(并且任选地包括除A以外的要素)；在又一个实施方案中，指至少一个、任选地包括多于一个A和至少一个、任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等等。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
应理解，除非明确地相反指示，否则说明书中数值和数值范围的公开内容包括i)指定的精确值或范围，和ii)为指定的值或范围“约”的值(例如，落入合理范围内的值或范围(例如，约10％类似))，如本领域普通技术人员将理解的。
还应理解，除非明确地相反指示，否则在本文公开的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不必限于所公开方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求以及以上说明书中，所有过渡性短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由…构成”等应理解为开放式的，即意指包括但不限于。仅过渡性短语“由…组成”和“基本上由…组成”应分别是如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述的封闭式或半封闭式过渡性短语。

Claims (72)

1.一种单纯疱疹病毒(HSV)信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其包含
(a)包含编码HSV糖蛋白B(gB)的开放阅读框的mRNA，所述HSV gB相对于野生型HSV gB包含截短的C末端；
(b)包含编码HSV糖蛋白C(gC)的开放阅读框的mRNA；
(c)包含编码HSV糖蛋白D(gD)的开放阅读框的mRNA；
(d)包含编码HSV胞内蛋白0(ICP0)的开放阅读框的mRNA；
(e)包含编码HSV胞内蛋白4(ICP4)的开放阅读框的mRNA；以及
(f)脂质纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSV gB包含截短的胞质尾区。
3.如权利要求1所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSV gB不包含胞质尾区。
4.如权利要求1-3中任一项所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSV gC相对于野生型HSVgC包含F327A取代和截短的C末端。
5.如权利要求4所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSV gC包含截短的胞质尾区。
6.如权利要求4所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSV gB和/或HSV gC不包含胞质尾区。
7.如权利要求1-6中任一项所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSVICP0缺少核定位信号和/或RING指结构域。
8.如权利要求1-7中任一项所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSVICP0相对于野生型HSVICP0包含更高密度的CD8+T细胞表位。
9.如权利要求1-8中任一项所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSVICP4缺少核定位信号和/或RING指结构域。
10.如权利要求1-9中任一项所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSVICP4相对于野生型HSVICP4包含更高密度的CD8+T细胞表位。
11.一种单纯疱疹病毒(HSV)信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其包含
(a)包含编码HSV糖蛋白B(gB)的开放阅读框的mRNA，任选地其中所述gB相对于野生型HSV gB包含截短的C末端；
(b)包含编码HSV糖蛋白C(gC)的开放阅读框的mRNA，所述HSV gC相对于野生型HSV gC包含F327A取代和截短的C末端；以及
(c)包含编码野生型HSV糖蛋白D(gD)的开放阅读框的mRNA；
(d)脂质纳米颗粒。
12.如权利要求11所述的HSV mRNA疫苗，其还包含：包含编码HSV胞内蛋白0(ICP0)的开放阅读框的mRNA，所述HSV ICP0相对于野生型HSVICP0包含更高密度的CD8+T细胞表位。
13.如权利要求11或12所述的HSV mRNA疫苗，其还包含：包含编码HSV胞内蛋白4(ICP4)的开放阅读框的mRNA，所述HSV ICP4相对于野生型HSVICP4包含更高密度的CD8+T细胞表位。
14.如权利要求11-13中任一项所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSV gB和/或HSV gC包含截短的胞质尾区。
15.如权利要求11-13中任一项所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSV gB和/或HSV gC不包含胞质尾区。
16.一种单纯疱疹病毒(HSV)信使核糖核酸(mRNA)疫苗，其包含
(a)包含编码HSV糖蛋白C(gC)的开放阅读框的mRNA，所述HSV gC相对于野生型HSV gC包含F327A取代和截短的C末端；
(b)包含编码野生型HSV糖蛋白D(gD)的开放阅读框的mRNA；
(c)包含编码HSV胞内蛋白0(ICP0)的开放阅读框的mRNA，所述HSVICP0相对于野生型HSVICP0包含更高密度的CD8+T细胞表位；
(d)包含编码HSV胞内蛋白4(ICP4)的开放阅读框的mRNA，所述HSVICP4相对于野生型HSVICP4包含更高密度的CD8+T细胞表位；以及
(e)脂质纳米颗粒。
17.如权利要求16所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSV gC包含截短的胞质尾区。
18.如权利要求16或17所述的HSV mRNA疫苗，其中所述HSV gC不包含胞质尾区。
19.如前述权利要求中任一项所述的HSV疫苗，其中所述疫苗诱导对所述HSV gC、gB和/或gD的Th1极化的CD4+T细胞介导的免疫应答。
20.如前述权利要求中任一项所述的HSV疫苗，其中与对选自HSV gB、gC或gD的抗原具有特异性的Th2细胞相比，所述疫苗引发更多的对所述抗原具有特异性的Th1细胞。
21.如前述权利要求中任一项所述的HSV疫苗，其中对选自HSV gB、gC或gD的抗原具有特异性的CD4+T细胞群体包含超过50％的Th1细胞。
22.如前述权利要求中任一项所述的HSV疫苗，其中所述HSV gB、gC和gD中的每一者包含跨膜结构域。
23.如前述权利要求中任一项所述的HSV疫苗，其中：
(a)所述HSV gB具有约798个氨基酸的长度；
(b)所述HSV gC具有约469个氨基酸的长度；
(c)所述HSVICP0相对于野生型HSVICP0包含核定位信号、RING指结构域和/或USP7结合结构域中的截短；以及/或者
(d)所述HSVICP4相对于野生型HSVICP4包含核定位信号和/或DNA结合结构域中的截短。
24.如权利要求23所述的HSV疫苗，其中所述HSVICP0不包含核定位信号，不包含USP7结合结构域，并且/或者不包含RING指结构域。
25.如权利要求23或24所述的HSV疫苗，其中所述HSVICP0不包含核定位信号并且/或者包含截短的DNA结合结构域。
26.如前述权利要求中任一项所述的HSV疫苗，其中：
(a)所述HSV gB包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列；
(b)所述HSV gC包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列；
(c)所述HSV gD包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列；
(d)所述HSVICP0包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列；并且/或者
(e)所述HSVICP4包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
27.如前述权利要求中任一项所述的HSV疫苗，其中(c)和(d)的mRNA与(a)、(b)和(c)的mRNA的摩尔比不超过0.8:1。
28.如前述权利要求中任一项所述的HSV疫苗，其中所述一种或多种mRNA包含化学修饰。
29.如前述权利要求中任一项所述的HSV疫苗，其中所述一种或多种mRNA的100％尿嘧啶核苷酸包含化学修饰。
30.如权利要求28或29所述的HSV疫苗，其中所述化学修饰是1-甲基假尿嘧啶。
31.如前述权利要求中任一项所述的HSV疫苗，其中所述脂质纳米颗粒包含可电离脂质、中性脂质、固醇和经PEG修饰的脂质。
32.如权利要求31所述的HSV疫苗，其中所述脂质纳米颗粒包含40-50mol％的可电离脂质、5-15mol％的中性脂质、30-50mol％的固醇和0.5-3mol％的经PEG修饰的脂质。
33.如权利要求31或32所述的HSV疫苗，其中：
所述可电离脂质包含化合物(I)的结构：
所述中性脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)；
所述固醇是胆固醇；并且/或者
所述经PEG修饰的脂质是1,2二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)。
34.一种方法，其包括向受试者施用如前述权利要求中任一项所述的疫苗。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述受试者患有HSV感染或已暴露于HSV。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述疫苗以有效预防所述受试者的潜伏性或活动性HSV感染的量施用。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疫苗以有效预防所述受试者的潜伏性HSV感染再活化、预防HSV复制、缩短所述受试者的HSV感染的持续时间、减少所述受试者中有复制能力HSV颗粒的数量和/或
减少所述受试者中包含HSV基因组的细胞的数量的量施用。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疫苗诱导对HSV gB、gC和/或gD的CD4+T细胞介导的免疫应答，并且所述CD4+T细胞结合至所述HSV gB、gC或gD的一个或多个CD4+T细胞表位。
39.如权利要求38所述的方法，其中至少50％的所述CD4+T细胞产生一种或多种选自由IFN-γ、IL-2和TNF-α组成的组的细胞因子。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中少于10％的所述CD4+T细胞产生IL-4、IL-5、IL-9、IL-10或IL-13中的任何一种或多种。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疫苗诱导对所述HSVICP0和/或ICP4的CD8+T细胞介导的免疫应答，并且所述CD8+T细胞结合至所述HSVICP0和/或ICP4的一个或多个CD8+T细胞表位。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述CD8+T细胞具有细胞毒性。
43.一种经修饰的单纯疱疹病毒(HSV)胞内蛋白0(ICP0)，其比野生型HSVICP0包含更少的氨基酸。
44.如权利要求43所述的经修饰的HSVICP0，其中所述经修饰的HSVICP0相对于野生型HSVICP0包含核定位信号中的截短。
45.如权利要求43所述的经修饰的HSVICP0，其中所述经修饰的HSVICP0不包含核定位信号。
46.如权利要求43-45中任一项所述的经修饰的HSVICP0，其中所述经修饰的HSVICP0相对于野生型HSVICP0包含RING指结构域中的截短。
47.如权利要求43-45中任一项所述的经修饰的HSVICP0，其中所述经修饰的HSVICP0不包含RING指结构域。
48.如权利要求43-47中任一项所述的经修饰的HSVICP0，其中所述经修饰的HSVICP0相对于所述野生型HSVICP0包含USP7结合结构域中的截短。
49.如权利要求43-47中任一项所述的经修饰的HSVICP0，其中所述经修饰的HSVICP0不包含USP7结合结构域。
50.如权利要求43-49中任一项所述的经修饰的HSVICP0，其中所述经修饰的HSVICP0包含位于所述经修饰的HSVICP0的第一部分与所述经修饰的HSVICP0的第二部分之间的接头。
51.如权利要求50所述的经修饰的HSVICP0，其中所述接头包含2-10个甘氨酸残基。
52.如权利要求43-51中任一项所述的经修饰的HSVICP0，其中所述经修饰的HSVICP0包含长度不超过所述野生型HSVIPC0长度的65％的氨基酸序列。
53.如权利要求43-52中任一项所述的经修饰的HSVICP0，其中所述经修饰的HSVICP0氨基酸序列包含的T细胞表位是所述野生型HSVICP0的至少65％。
54.如权利要求43-53中任一项所述的经修饰的HSVICP0，其中所述经修饰的HSVICP0包含约487个氨基酸。
55.一种核糖核酸(RNA)，其包含编码如权利要求43-54中任一项所述的经修饰的HSVICP0的开放阅读框。
56.一种经修饰的单纯疱疹病毒(HSV)胞内蛋白4(ICP4)，其比野生型HSVICP4包含更少的氨基酸。
57.如权利要求56所述的经修饰的HSVICP4，其中所述经修饰的HSVICP4相对于所述野生型HSVICP4包含核定位信号中的截短。
58.如权利要求56所述的经修饰的HSVICP4，其中所述经修饰的HSVICP4不包含核定位信号。
59.如权利要求56-58中任一项所述的经修饰的HSVICP4，其中所述经修饰的HSVICP4相对于所述野生型HSVICP4包含DNA结合结构域中的截短。
60.如权利要求59所述的经修饰的HSVICP4，其中所述经修饰的HSVICP4不包含DNA结合结构域。
61.如权利要求56-60中任一项所述的经修饰的HSVICP4，其中所述经修饰的HSVICP4包含位于所述经修饰的HSVICP4的第一部分与所述经修饰的HSVICP4的第二部分之间的接头。
62.如权利要求61所述的经修饰的HSVICP4，其中所述接头包含2-10个甘氨酸残基。
63.如权利要求56-62中任一项所述的经修饰的HSVICP4，其中所述经修饰的HSVICP4包含长度不超过所述野生型HSVIPC4长度的65％的氨基酸序列。
64.如权利要求56-63中任一项所述的经修饰的HSVICP4，其中所述经修饰的HSVICP4氨基酸序列包含的T细胞表位是所述野生型HSVICP4的至少65％。
65.如权利要求56-64中任一项所述的经修饰的HSVICP4，其中所述经修饰的HSVICP4包含约687个氨基酸。
66.一种核糖核酸(RNA)，其包含编码如权利要求56-65中任一项所述的经修饰的HSVICP4的开放阅读框。
67.一种单纯疱疹病毒(HSV)蛋白，其包含与SEQ ID NO:54、63、47和49中任一者的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
68.一种信使核糖核酸(mRNA)，其包含编码如权利要求67所述的HSV蛋白的开放阅读框。
69.一种信使核糖核酸(mRNA)，其包含含有与SEQ ID NO:19、28、4、12和14中任一者的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列的开放阅读框。
70.如权利要求68或69所述的mRNA，其中所述mRNA包含化学修饰。
71.如权利要求68-70中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA的100％尿嘧啶核苷酸包含化学修饰。
72.如权利要求71所述的mRNA，其中所述化学修饰是1-甲基假尿嘧啶。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116194151A (zh) * 2020-06-23 2023-05-30 摩登纳特斯有限公司 包含具有延长的半衰期的mRNA治疗剂的LNP组合物
CN119405793A (zh) * 2025-01-07 2025-02-11 昆明医科大学第一附属医院(云南省皮肤病医院) 一种单纯疱疹病毒II型mRNA疫苗及其应用
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