CN118311175A - 一种刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：A)将刺猬皮原料采用溶剂提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到刺猬皮原料的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸，梯度洗脱。本发明建立刺猬皮(刺猬)药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒HPLC特征图谱方法，为鉴别刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒提供更为科学的鉴别依据。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，尤其涉及一种刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法。
背景技术
刺猬皮为刺猬科动物刺猬Erinaceus europaeus Linnaeus.或短刺猬Hemichianus dauricus Sundevall.的干燥外皮。相比于短刺猬，由于刺猬的分布较广，数量亦多，资源更易获得，故本研究收集的样品基原为刺猬科动物刺猬Erinaceus europaeusLinnaeus.。全年可捕捉，冬季较易，捕后剥皮，用竹叶撑开或钉于木板上，除尽肌肉，内面撒上一层石灰，于通风处阴干。具有理气定痛、凉血止血、降逆止呕、去翳明目、固精止遗的功效。标准汤剂是由药材经炮制后按固定的制备工艺而成的冻干粉。为了确保刺猬皮(刺猬)药材、饮片及其标准汤剂质量的均一、稳定，本文建立一种新的特征图谱方法对其质量进行把控。
发明内容
本发明的目的在于提供一种刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，为鉴别刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒提供更多、更为科学的技术手段。
本发明提供一种刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
A)将刺猬皮原料采用溶剂提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到刺猬皮原料的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸，梯度洗脱。
优选的，所述刺猬皮原料为刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒。
优选的，所述待测液的制备方法如下：
将刺猬皮原料加入10％甲醇超声处理，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
所述超声处理的功率为600W，频率为40kHz；所述提取时间为20～40min，更优选为30min。
优选的，所述刺猬皮标准汤剂和刺猬皮配方颗粒的质量与溶剂(10％甲醇)的体积之比为0.5g：25mL；
刺猬皮药材、饮片的质量与溶剂的体积之比为1g：25mL。
在超声提取与回流提取时，色谱图效果基本一致，且优于加水煎煮后超声提取。故本发明选择超声提取作为供试品提取方法；
在不同提取时间条件下，色谱图效果基本一致。为保障提取充分，供试品提取时间确定为30分钟；
在溶剂加入量为25ml时，特征图谱色谱峰面积适中。故供试品溶剂加入量确定为25ml。
提取溶剂中10％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量较大，峰型较好。
优选的，还包括制备对照品参照物溶液和制备对照药材参照物溶液；
取尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷和鸟苷，加10％甲醇溶解，得到对照品参照物溶液；
取刺猬皮对照药材，加10％甲醇超声提取，得到对照药材参照物溶液。
将所述对照品参照物溶液和对照药材参照物溶液采用高效液相色谱法测定，分别得到对照品和对照药材参照物的色谱图；并根据对照品和对照药材参照物的色谱图对刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行定性测定。
优选的，所述色谱柱为C18柱，规格为5μm，4.6×250mm；柱温20℃。在该柱温下，分离度好，色谱图峰形较为对称且保留时间合适。
优选的，所述流动相流速为0.5mL/min；检测波长为250nm；进样量为10μL。流速为0.5ml/min分离度好，色谱图峰形较为对称且保留时间合适；在检测波长为250nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳；
优选的，所述梯度洗脱具体为：
0～20min，A相：0％、B相：100％；
20～21min，A相：0％～1％、B相：100％～99％；
21～35min，A相：1％、B相：99％；
35～38min，A相：1％～2.5％、B相：99％～97.5％；
38～70min，A相：2.5％、B相：97.5％。
优选的，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中峰2：尿嘧啶峰；峰3(S)：鸟嘌呤峰；峰5：次黄嘌呤峰；峰6：黄嘌呤峰；峰7：肌苷峰；峰8：鸟苷峰；
其中峰3、峰7、峰8应分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应。
优选的，在刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱中，以鸟嘌呤为参照峰S峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.54(峰1)、0.75(峰2)、1.32(峰4)、1.46(峰5)、1.67(峰6)。
本发明提供了一种刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：A)将刺猬皮原料采用溶剂提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到刺猬皮原料的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸，梯度洗脱。本发明建立刺猬皮(刺猬)药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒HPLC特征图谱方法，为鉴别刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒提供更为科学的鉴别依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为标准汤剂不同波长色谱图；
图2为标准汤剂的柱温考察；
图3为标准汤剂的流速考察；
图4为烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂的特征图谱色谱峰指认；
图5为尿嘧啶对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图6为鸟嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图7为次黄嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图8为黄嘌呤对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图9为肌苷对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图10为鸟苷对照品与样品中目标峰光谱叠加图；
图11为烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂不同仪器考察；
图12为烫刺猬皮标准汤剂不同色谱柱考察；
图13为烫刺猬皮标准汤剂特征图谱；
图14为标准汤剂对照特征图谱；
图15为提取溶剂考察；
图16为提取方式考察；
图17为提取时间考察；
图18为溶剂加入量考察；
图19为刺猬皮药材特征图谱色谱峰指认；
图20为刺猬皮(刺猬)药材不同仪器考察；
图21为色谱柱耐用性考察；
图22为16批刺猬皮(刺猬)药材特征图谱验证图；
图23为刺猬皮(刺猬)药材对照特征图谱；
图24为烫刺猬皮(刺猬)饮片特征图谱；
图25为烫刺猬皮(刺猬)饮片对照特征图谱；
图26为尿嘧啶紫外吸收光谱图；
图27为鸟嘌呤紫外吸收光谱图；
图28为次黄嘌呤紫外吸收光谱图；
图29为黄嘌呤紫外吸收光谱图；
图30为肌苷紫外吸收光谱图；
图31为鸟苷紫外吸收光谱图；
图32为烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒不同波长色谱图；
图33为柱温考察色谱图；
图34为流速考察色谱图；
图35为提取溶剂考察；
图36为提取方式考察；
图37为提取时间考察；
图38为溶剂加入量考察；
图39为烫刺猬皮(刺猬)成品特征图谱色谱峰指认；
图40为烫刺猬皮(刺猬)成品不同仪器特征图谱比较；
图41为色谱柱耐用性考察；
图42为3批烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒特征图谱验证图；
图43为烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒对照特征图谱。
具体实施方式
本发明提供一种刺猬皮(刺猬)药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒HPLC特征图谱方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种刺猬皮(刺猬)药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒HPLC特征图谱方法，进行详细描述。
实验仪器及材料
仪器：2台不同品牌高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
电热恒温水浴锅：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：3种不同型号色谱柱。
乙酸、乙腈为色谱纯，水为超水，其余试剂均为分析纯。
尿嘧啶(中国食品药品检定研究院，批号：100469-201302，含量以99.6％计)，
鸟嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：140631-202008，含量以98.9％计)，
次黄嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：140661-202005，含量以99.4％计)，
黄嘌呤(中国药品生物制品检定所，批号：140662-200802，无含量要求)，
肌苷(中国食品药品检定研究院，批号：140669-202007，含量以99.2％计)，
鸟苷(中国食品药品检定研究院，批号：111977-202202，含量以88.6％计)，
刺猬皮(刺猬)对照药材(山东博康精细化工有限公司，批号：230156-202305)，
烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂冻干粉(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：TCWP-BT-230601、TCWP-BT-230601、TCWP-BT-230602、TCWP-BT-230603、TCWP-BT-230604、TCWP-BT-230605、TCWP-BT-230606、TCWP-BT-230607、TCWP-BT-230608、TCWP-BT-230609、TCWP-BT-230610、TCWP-BT-230611、TCWP-BT-230612、TCWP-BT-230613、TCWP-BT-230614、TCWP-BT-230615、TCWP-BT-230616)。
刺猬皮药材(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：XXLS202305729、XXLS202305730、XXLS202305731、XXLS202305732、XXLS202305733、XXLS202305734、XXLS202305735、XXLS202305736、XXLS202305737、XXLS202305738、XXLS202305739、XXLS202305740、XXLS202305741、XXLS202305742、XXLS202305743、010091-2306001。
烫刺猬皮(刺猬)饮片(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：TCWP-230601、TCWP-230601、TCWP-230602、TCWP-230603、TCWP-230604、TCWP-230605、TCWP-230606、TCWP-230607、TCWP-230608、TCWP-230609、TCWP-230610、TCWP-230611、TCWP-230612、TCWP-230613、TCWP-230614、TCWP-230615、TCWP-230616)
烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：1903019、2306093、2306094、2306095)。
实施例1烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂HPLC特征图谱
1.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.6ml；柱温为20℃；检测波长为250nm。理论板数按鸟嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取刺猬皮(刺猬)对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取尿嘧啶、鸟嘌呤、鸟苷、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品约0.5g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇溶液25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
1.2色谱条件与系统适用性试验
1.2.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在210nm、230nm、250nm、270nm、290nm、310nm波长下的色谱图，见图1。
结果表明，在检测波长为250nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为250nm。
1.2.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃、35℃时进行考察。见图2。
柱温考察结果表明，在不同柱温下，柱温为20℃分离度好，色谱图峰形较为对称且保留时间合适，故柱温选用20℃。
1.2.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min时进行了考察。见图3。
流速考察结果表明，在不同流速下，流速为0.5ml/min分离度好，色谱图峰形较为对称且保留时间合适，故流速选用0.5ml/min。
综上所述，烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.5ml；柱温为20℃；检测波长为250nm。理论板数按鸟嘌呤峰计算应不低于5000。
1.3方法学考察
1.3.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂供试品溶液。
参照物溶液的制备：取尿嘧啶、鸟嘌呤、鸟苷、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
刺猬皮(刺猬)对照药材溶液的制备：取刺猬皮(刺猬)对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂阴性对照溶液。。
对烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂特征图谱峰进行定位。见图4～图10。
结果表明，尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品的保留时间和光谱图都能和烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂中目标峰的保留时间和光谱图一一对应，且阴性溶液无干扰，该方法专属性良好。
1.3.2精密度试验
取烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的保留时间。见表1。
表1精密度考察-保留时间
结果表明，精密度各特征峰保留时间RSD为0.04％-0.23％。该仪器精密度良好。
1.3.3重复性考察
精密称取烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂(批号：TCWP-BT-230501)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表2。
表2重复性考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，重复性各特征峰相对保留时间一致，相对保留时间RSD为0.00％～0.81％。该方法重复性良好。
1.3.4中间精密度考察
不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，精密称取烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂12份，制备供试品溶液，分别在高效液相色谱仪1、2上进行测定。见图11，表3。
表3不同仪器考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，该方法中间精密度较好。
1.3.5色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对不同品牌色谱柱1、2、3进行考察。结果见图12，表4。
表4色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，使用不同色谱柱时，相对保留时间RSD值差异较大。推荐使用色谱柱1。
1.3.6稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h、24h时测定。见表5。
表5稳定性考察—保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.14％～1.00％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰保留时间/相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。
1.4特征峰的确定及对照图谱的建立
1.4.1 16批烫刺猬皮(刺猬)标准汤剂验证结果
采用此方法，在16批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间。见图13，表6。图13中，(从下到上批号依次为：TCWP-BT-230601、TCWP-BT-230602、TCWP-BT-230603、TCWP-BT-230604、TCWP-BT-230605、TCWP-BT-230606、TCWP-BT-230607、TCWP-BT-230608、TCWP-BT-230609、TCWP-BT-230610、TCWP-BT-230611、WFG-BT-210912、TCWP-BT-230613、TCWP-BT-230614、TCWP-BT-230615、TCWP-BT-230616)。
表6烫刺猬皮标汤相对保留时间比值
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰3作为S峰时，峰1～峰6特征峰相对保留时间的RSD为0.00％。
1.4.2相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表7：
表7方法学各项目结果RSD(％)汇总标准—相对保留时间
结果表明，除色谱柱耐用性外，峰1到峰6的保留时间或相对保留时间的RSD值较小，基本符合要求；峰7、峰8在中间精密度考察时，相对保留时间差异较大，后续考虑采用对照品参照物进行指认。
最终规定：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰3、峰7、峰8应分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应，与鸟嘌呤对照品参照物相应的峰为S峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.54(峰1)、0.75(峰2)、1.32(峰4)、1.46(峰5)、1.67(峰6)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批刺猬皮标准汤剂进行合成，建立了烫刺猬皮标准汤剂特征图谱的对照图谱。如图14。
1.5烫刺猬皮标准汤剂特征图谱方法确定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟0.5ml；柱温为20℃；检测波长为250nm。理论板数按鸟嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取刺猬皮(刺猬)对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另尿嘧啶、鸟嘌呤、鸟苷、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品约0.5g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇溶液25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例2刺猬皮药材、饮片HPLC特征图谱
2.1色谱条件与系统适应性以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟0.5ml；柱温为20℃；检测波长为250nm。
理论板数按鸟嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取刺猬皮(刺猬)对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)适量，取约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇溶液25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.2供试品溶液的制备考察
2.2.1供试品制备提取溶剂考察
取本品粉末(过三号筛)(批号：010091-2306001)适量，取约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入水、10％甲醇、30％甲醇、70％甲醇、甲醇、10％乙醇各25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图15。
结果表明，提取溶剂中10％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量较大，峰型较好，故供试品提取溶剂确定为10％甲醇。
2.2.2供试品制备提取方式考察
取本品粉末(过三号筛)(批号：010091-2306001)适量，取约1.0g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇25ml，分别对供试品提取方法为回流、超声(功率600W，频率40kHz)进行考察，提取时间30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。当为水提时，加入25ml水，煮沸半小时，滤过，蒸干，残渣加入10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图16。
结果表明，在超声提取与回流提取时，色谱图效果基本一致，且优于加水煎煮后超声提取。故本实验选择超声提取作为供试品提取方法。
2.2.3供试品制备提取时间考察
取本品粉末(过三号筛)(批号：010091-2306001)适量，取约1.0g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇25ml，密塞，分别对供试品超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟、30分钟、40分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图17。
结果表明，在不同提取时间条件下，色谱图效果基本一致。为保障提取充分，供试品提取时间确定为30分钟。
2.2.4溶剂加入量考察
取本品粉末(过三号筛)(批号：010091-2306001)适量，取约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入10％甲醇10ml、25ml、50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图18。
结果表明，在溶剂加入量为25ml时，特征图谱色谱峰面积适中。故供试品溶剂加入量确定为25ml。
2.2.5确定供试品制备方法
取本品粉末(过三号筛)适量，取约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇溶液25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3方法学考察
2.3.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备刺猬皮(刺猬)药材供试品溶液。
参照物溶液的制备：取尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
烫刺猬皮对照药材溶液的制备：取刺猬皮(刺猬)对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺刺猬皮(刺猬)药材阴性对照溶液。
对刺猬皮(刺猬)药材特征图谱峰进行定位。见图19。
综上，将药材中的8个特征峰纳入后续考察，并进行方法学研究。
2.3.2精密度试验
取刺猬皮(刺猬)药材供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的保留时间。见表8。
表8精密度考察—特征峰保留时间
结果表明，精密度各特征峰保留时间RSD为0.05％-0.41％。该仪器精密度良好。
2.3.3重复性考察
精密称取刺猬皮(刺猬)药材(批号：010091-2306001)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表9。
表9重复性考察—特征峰相对保留时间
结果表明，重复性各特征峰相对保留RSD为0.00％-1.56％，该方法重复性良好。
2.3.4中间精密度考察
在以上拟定的实验条件基础上，精密称取刺猬皮(刺猬)药材12份，制备供试品溶液，分别在高效液相色谱仪1、2上进行测定。见图20，表10。
表10中间精密度-相对保留时间比值
结果表明，该方法中间精密度较好。
2.3.5耐用性考察
2.3.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对不同品牌色谱柱1、2、3进行考察。图21，见表11。
表11色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间
结果表明，使用不同色谱柱时，相对保留时间RSD值差异较大。推荐使用色谱柱1。
2.3.5.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h、24h时测定。见表12。
表12 24小时稳定性考察—特征峰保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.27％～1.56％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰保留时间/相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。
2.4特征峰的确定及对照图谱的建立
2.4.1 16批刺猬皮(刺猬)药材验证结果
采用拟定的方法对本品16批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间。见图22，表13。图22中，各图谱代表批次号为S1：XXLS202305729；S2：XXLS202305730；S3：XXLS202305731；S4：XXLS202305732；S5：XXLS202305733；S6：XXLS202305734；S7：XXLS202305734；S8：XXLS202305736；S9：XXLS202305737；S10：XXLS202305738；S11：XXLS202305739；S12：XXLS202305740；S13：XXLS202305741；S14：XXLS202305742；S15：XXLS202305743；S16：010091-2306001。
表13 16批刺猬皮(刺猬)药材相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。
2.4.2相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表14：
表14方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间(保留时间)
结果表明，除色谱柱耐用性外，峰1到峰6的保留时间或相对保留时间的RSD值较小，基本符合要求；峰7、峰8在中间精密度考察时，相对保留时间差异较大，后续考虑采用对照品参照物进行指认。
最终规定为：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰3、峰7、峰8应分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应，与鸟嘌呤对照品参照物相应的峰为S峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.54(峰1)、0.75(峰2)、1.32(峰4)、1.46(峰5)、1.67(峰6)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批刺猬皮(刺猬)药材特征图谱进行合成，建立了刺猬皮药材特征图谱的对照图谱。见图23。
2.5烫刺猬皮(刺猬)饮片特征图谱验证
按“2.2供试品溶液的制备考察”结果制备16批饮片的供试品溶液，并按“2.1色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定分析，计算相对保留时间。结果见图24，表15。图24中，各图谱代表批次号为S1：TCWP-230601；S2：TCWP-230602；S3：TCWP-230603；S4：TCWP-230604；S5：TCWP-230605；S6：TCWP-230606；S7：TCWP-230607；S8：TCWP-230608；S9：TCWP-230609；S10：TCWP-230610；S11：TCWP-230611；S12：TCWP-230612；S13：TCWP-230613；S14：TCWP-230614；S15：TCWP-230615；S16：TCWP-230616。
表15 16批烫刺猬皮饮片特征峰相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。
最终规定为：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰3、峰7、峰8应分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应，与鸟嘌呤对照品参照物相应的峰为S峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.54(峰1)、0.75(峰2)、1.32(峰4)、1.46(峰5)、1.67(峰6)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批烫刺猬皮饮片特征图谱进行合成，建立了烫刺猬皮饮片特征图谱的对照图谱。见图25。
2.6刺猬皮(刺猬)药材、饮片特征图谱方法确定
色谱条件与系统适应性以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.5ml；柱温为20℃；检测波长为250nm。理论板数按鸟嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取刺猬皮(刺猬)对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取鸟嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，分别加10％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例3烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒HPLC特征图谱
3.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为250nm。理论板数按鸟嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取刺猬皮(刺猬)对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取鸟嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，分别加10％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.2色谱条件与系统适用性试验
3.2.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在210nm、230nm、250nm、270nm、290nm、310nm波长下的色谱图，见图26～32。
结果表明，在检测波长为250nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为250nm。
3.2.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃、35℃时进行考察，见图33。
柱温考察结果表明，在不同柱温下，柱温为20℃分离度好，色谱图峰形较为对称且保留时间合适，故柱温选用20℃。
3.2.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min时进行了考察。见图34。
流速考察结果表明，在不同流速下，流速为0.5ml/min分离度好，色谱图峰形较为对称且保留时间合适，故流速选用0.5ml/min。
综上所述，烫刺猬皮配方颗粒特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟1.0ml；柱温为25℃；检测波长为246nm。理论板数按丙氨酸峰计算应不低于5000。
3.3供试品溶液的制备考察
3.3.1提取溶剂考察
取本品(批号：1903019)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入水、10％甲醇、30％甲醇、70％甲醇、甲醇、10％乙醇各25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图35。
结果表明，提取溶剂中10％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量较大，峰型较好，故供试品提取溶剂确定为10％甲醇。
3.3.2提取方式考察
取本品(批号：1903019)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇25ml，密塞，分别对供试品提取方法为回流、超声(功率600W，频率40kHz)进行考察，提取时间30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图36。
结果表明，在超声提取与回流提取时，色谱图效果基本一致。本实验选择超声提取作为供试品提取方法。
3.3.3提取时间考察
取本品(批号：1903019)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入10％甲醇25ml，密塞，分别对供试品超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图37。
结果表明，在不同提取时间条件下，色谱图效果基本一致。为保障提取充分，供试品提取时间确定为30分钟。
3.3.4溶剂加入量考察
取本品(批号：1903019)适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入10％甲醇10ml、25ml、50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图38。
结果表明，在溶剂加入量为25ml时，特征图谱色谱峰面积适中。故供试品溶剂加入量确定为25ml。
综上所述，烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇溶液25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4方法学考察
3.4.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒供试品溶液。
参照物溶液的制备：取尿嘧啶、鸟嘌呤、鸟苷、黄嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
刺猬皮(刺猬)对照药材溶液的制备：取刺猬皮(刺猬)对照药材约1.0g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒阴性对照溶液。
对烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图39。
3.4.2精密度试验
取烫刺猬皮配方颗粒供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的保留时间。见表16。
表16精密度考察—特征峰保留时间
结果表明，精密度各特征峰保留时间RSD值为0.01％～0.32％。该仪器精密度良好。
3.4.3重复性考察
精密称取烫刺猬皮配方颗粒6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表17。
表17重复性考察—特征峰相对保留时间
结果表明，重复性各特征峰相对保留时间RSD值为0.00％～1.04％，结果表明，该方法重复性良好。
3.4.4中间精密度考察
在以上拟定的实验条件基础上，精密称取烫刺猬皮配方颗粒12份，制备供试品溶液，分别在高效液相色谱仪1、2上进行测定，见图40，表18。
表18中间精密度-相对保留时间比值
结果表明，该方法中间精密度较好。
3.4.5耐用性考察
3.4.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对不同品牌色谱柱1、2、3进行考察。见表19，图41。
表19色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间
结果表明，使用不同色谱柱时，特征峰相对保留时间RSD值差异较大。推荐使用色谱柱1。
3.4.5.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，4h，8h，12h，16h，24h时测定。见表20。
表20稳定性考察—特征峰保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD值为0.15％～0.95％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述8个特征峰纳入后续考察。
3.5特征峰的确定及对照图谱的建立
3.5.1批烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒验证结果
采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间。见图42，表21。
表21 3批烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。
3.5.2相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表22：
表22方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间
供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，其中峰3、峰7、峰8应与对照品参照物峰保留时间相对应，与鸟嘌呤对照品参照物相应的峰为S峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.54(峰1)、0.75(峰2)、1.32(峰4)、1.46(峰5)、1.67(峰6)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批烫刺猬皮配方颗粒特征图谱进行合成，建立了烫刺猬皮配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图43。
3.6烫刺猬皮(刺猬)配方颗粒特征图谱方法确定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.5ml；柱温为20℃；检测波长为250nm。理论板数按鸟嘌呤峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取刺猬皮(刺猬)对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取鸟嘌呤、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，分别加10％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
A)将刺猬皮原料采用溶剂提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到刺猬皮原料的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％乙酸，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括制备对照品参照物溶液和制备对照药材参照物溶液；
取尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷和鸟苷，加10％甲醇溶解，得到对照品参照物溶液；
取刺猬皮对照药材，加10％甲醇超声提取，得到对照药材参照物溶液。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述色谱柱为C18柱，规格为5μm，4.6×250mm；柱温20℃。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述流动相流速为0.5mL/min；检测波长为250nm；进样量为10μL。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
0～20min，A相：0％、B相：100％；
20～21min，A相：0％～1％、B相：100％～99％；
21～35min，A相：1％、B相：99％；
35～38min，A相：1％～2.5％、B相：99％～97.5％；
38～70min，A相：2.5％、B相：97.5％。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中峰2：尿嘧啶峰；峰3(S)：鸟嘌呤峰；峰5：次黄嘌呤峰；峰6：黄嘌呤峰；峰7：肌苷峰；峰8：鸟苷峰；
其中峰3、峰7、峰8应分别与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，在刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱中，以鸟嘌呤为参照峰S峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.54(峰1)、0.75(峰2)、1.32(峰4)、1.46(峰5)、1.67(峰6)。
8.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A)具体为：将刺猬皮原料加入10％甲醇超声处理，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
所述超声处理的功率为600W，频率为40kHz；所述提取时间为20～40min。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述刺猬皮原料为刺猬皮药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，刺猬皮标准汤剂和刺猬皮配方颗粒的质量与溶剂的体积之比为0.5g：25mL；
刺猬皮药材、饮片的质量与溶剂的体积之比为1g：25mL。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 周邦华 等: "刺猬皮提取工艺优化及其提取物TLC鉴别研究", 辽宁中医杂志, vol. 47, no. 09, 30 September 2020 (2020-09-30), pages 119 - 124 * |
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