CN118302158A - 心脏类器官和抗电-线粒体失同步治疗 - Google Patents

Abstract

本发明提供治疗有需要的受试者中的特征在于电‑线粒体失同步的疾病或紊乱的方法，包括确认在受试者中的疾病或紊乱的特征在于电‑线粒体失同步和施用在受试者中的疾病或紊乱的组织中调节线粒体钙浓度和/或增加线粒体钙通道活性的试剂。提供了包括心肌细胞和内皮细胞和至少两个同步搏动的腔室的多腔心脏类器官。进一步提供了使用多腔心脏类器官的方法，产生心脏类器官的方法。还提供了在细胞聚集体或组织内进行测量的系统和其用于测试治疗剂的用途。

Description

心脏类器官和抗电-线粒体失同步治疗

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年9月9日提交的美国临时专利申请号63/242,091和2022年4月10日提交的美国临时专利申请号63/329,448的优先权权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及心脏类器官，包括其使用方法。

背景技术

心血管疾病是全球死亡的主要原因，影响着美国近一半的成年人。最近的研究使人们越来越认识到心肌细胞代谢对疾病进展的贡献，显示心力衰竭和心律失常期间发生的代谢变化。这些认识阐明了已有的心脏治疗(比如β阻滞剂)的作用机制，并导致了包括艾拉米雷肽(elamipretide)的靶向代谢途径的几种治疗药物的开发，尽管对这些干预的动态还不完全了解。

长期以来，人们一直假设心肌的机电节律驱动心肌细胞代谢的周期性变化。由血脂异常或胰岛素抵抗引起的细胞代谢改变被认为会导致离子稳态异常，其会增加对心律失常事件的易感性。遗憾的是，离子通道动力学、收缩速率和代谢的差异常常使我们无法将小动物模型的研究结果转化为患者的研究结果。动物模型和人体模型之间的这些差异导致了在分子和代谢水平上对病理事件的不同反应。

人体诱导多能干细胞(hiPSC)衍生的心肌细胞为人体心脏代谢和生理学提供了更相关的模型。最近的工作证明了过渡到三维(3D)心脏组织的实用性，产生了更成熟的组织功能和捕捉到心脏代谢的关键方面的更高的结构复杂性。其他工作则通过增加内皮血管、心外膜细胞层、心脏成纤维细胞或内腔来提高组织的复杂性。与此同时，一些研究小组开发出了可使用异极线、3D打印应变传感器和微电极阵列实时感知收缩动态的构造，该构造为在与人类相关的系统中研究心脏生理学的方面提供了新的机会。

目前仍然非常需要结合细胞和传感器的微生理学超材料，比如用于促进对人类生理学的了解，包括心肌细胞的行为。

发明内容

本申请所涉及的项目得到了欧盟地平线2020研究与创新计划下的欧洲研究理事会(ERC)的资助(资助协议编号[681870])。

在一些实施方式中，本发明部分基于心脏类器官的血管化产生的各向异性应力导致复杂的多腔结构这一发现。这些心脏类器官包括起搏器样细胞簇、成纤维细胞、心外膜壳和心内膜衬里，同时表现出类似体内的基因表达和功能。在双光电倍增管(PMT)传感器平台中整合本文所公开的心脏类器官允许以>10Hz的分辨率同时实时测量氧、场电位和收缩。

代谢失衡是心脏疾病的重要诱因和标志。然而，目前测量代谢的方法很慢，需要数分钟至数小时才能量化代谢通量比如糖酵解、线粒体呼吸或脂肪酸氧化。因此，药物开发仅限于在心脏健康的背景下了解和治疗全身性代谢疾病。作为非限制性实例，高血糖或血脂异常是最终会影响心脏功能的慢性病症，并且因此指示用恩格列净(empagliflozin)或他汀类药物治疗。本申请中开发的电-代谢-机械传感方法允许快速测量控制心律的代谢通量。事实上，40岁以上的成年人中有25％会出现心律失常，并且其确切原因尚不清楚。因此，本专利所述方法可用于开发治疗多种类型心律失常以及缺血性损伤的新药和疗法。

同时电-代谢-机械传感使发明人得以证明，人体心脏类器官中的线粒体功能与它们的电活动是同步的，而不是像以前理论认为的那样与它们的机械作用同步。本发明人证明，任何类型的线粒体钙单向转运体(MCU)抑制都会导致心律失常，并且这种心律失常可以通过(1)阻断药物与MCU蛋白的相互作用，或通过(2)直接或间接增加MCU的活性来逆转。

作为非限制性实例，本发明人显示，化疗剂米托蒽醌对线粒体钙单向转运体的抑制扰乱了这种电-线粒体耦合，从而导致心律失常。本发明人通过联合施用间接激活MCU的二甲双胍部分地逆转了这种影响，从而提出了一种可以阻断化疗诱发的心律失常的联合疗法。

化疗诱发的心律失常是癌症治疗的一种并发症，其会导致发病率和死亡率显著增加。心房颤动、室性异位搏动和QTc延长是接受化疗的癌症患者患有的最常见的心律失常。人们对化疗诱发心律失常的机理了解的不充分，直到发明人利用同步电-代谢-机械传感平台证明它是由线粒体代谢紊乱引起的。

根据第一方面，提供了一种治疗有需要的受试者中的特征在于电-线粒体失同步的疾病或紊乱的方法，该方法包括确认受试者中的疾病或紊乱的特征在于电-线粒体失同步并向受试者施用治疗有效量的试剂，该试剂能够：

a.调节受试者中的疾病或紊乱组织的线粒体钙浓度；

b.调节组织中的线粒体钙通道活性；或

c.其组合；

从而治疗特征在于电-线粒体失同步的疾病或紊乱。

根据一些实施方式，失同步包括与健康对照相比降低的线粒体钙浓度或线粒体钙通道活性并且调节是增加，或者其中失同步包括与健康对照相比增加的线粒体钙浓度或线粒体钙通道活性并且调节是减少。

根据一些实施方式，调节线粒体钙浓度和/或线粒体钙通道活性包括调节线粒体钙单向转运体(MCU)活性。

根据一些实施方式，调节包括施用选自二甲双胍、山奈酚、精胺、A-769662、AICAR、IND 1316、PF 06409577、ZLN 024、Erastin、厚朴酚、依折麦布、双硫仑、Efsevin和亚精胺的试剂。

根据一些实施方式，疾病或紊乱选自：心律失常、心肌病、癫痫发作、癫痫、运动神经元痉挛、肌无力、肌肉萎缩、通道病、儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)、肌病伴锥体外系征(MPXPS)、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(AML)、遗传性痉挛性截瘫、缺血-再灌注损伤、缺血性心脏病、罕见线粒体脑肌病、矢状窦血栓形成、颅内窦血栓形成、斯托莫肯综合征、全身性癫痫伴发热性癫痫发作、视神经萎缩3、常染色体显性病、全身性癫痫伴发热性癫痫发作6型、掌跖角皮症、非表皮松解病和东方马脑炎；任选地，其中心律失常为癌症治疗诱发的心律失常(CTIA)。

根据一些实施方式，失同步包括增加的线粒体钙浓度或线粒体钙通道活性，并且疾病或紊乱选自线粒体脑肌病、矢状窦血栓形成、颅内窦血栓形成、斯托莫肯综合征、全身性癫痫伴发热性癫痫发作、视神经萎缩3、常染色体显性病、全身性癫痫伴发热性癫痫发作6型、掌跖角皮症、非表皮松解病、东方马脑炎和CTIA，任选地，其中癌症治疗是多柔比星。

根据一些实施方式，失同步包括降低的线粒体钙浓度或线粒体钙通道活性，并且疾病或紊乱选自心律失常、心肌病、癫痫发作、癫痫、运动神经元痉挛、肌无力、肌肉萎缩、通道病、CPVT、MPXPS、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、AML、遗传性痉挛性截瘫、缺血-再灌注损伤、缺血性心脏病、罕见病和CTIA。

根据一些实施方式，疾病是CPVT，并且调节包括施用选自精胺、亚精胺、二甲双胍、Erastin、A-769662、AICAR、IND 1316、PF 06409577和ZLN 024的试剂。

根据一些实施方式，疾病或紊乱是由施用引起心脏副作用的试剂造成的，并且其中试剂选自钙信号传导靶向剂、钙通道阻滞剂和抗肿瘤剂，任选地，其中试剂选自表1中提供的试剂。

根据一些实施方式，确认包括以下至少一项：

a.确定从受试者获得的样品中的线粒体钙浓度，并且其中浓度超过预定阈值指示失同步，任选地，其中预定阈值是健康受试者中或患有不是特征在于电-线粒体失同步的疾病或紊乱的受试者中的钙浓度；

b.在患者中观察对通过膜通道靶向电活动的抗心律失常治疗没有反应的心律失常或药物性心律失常症状，因此指示失同步，任选地，其中抗心律失常治疗选自：钠通道阻滞剂、β阻滞剂、钾通道阻滞剂、非二氢吡啶钙通道阻滞剂、腺苷和地高辛；

c.异常读数指示失同步，任选地，其中异常读数包括晚电位、R波减弱和R/R比增加中的至少一种；

d.确认暴露于已知会产生电-线粒体失同步的试剂，任选地，其中试剂为选自表1中提供的那些试剂以及甲苯、三氯乙烷、二甲苯、庚烷、己烷、乙醚、三氯乙烯、三氯三氟乙烷、一氧化碳、二硫化碳、杀虫剂、双酚A(BPA)、甲烷衍生的卤代烃、有机硝酸盐、砷、镉、钴、有机溶剂和金属；和

e.确认包含指示电-线粒体失同步的症状诊断的病史。

根据另一方面，提供了一种多腔心脏类器官，其包括心肌细胞和内皮细胞和至少两个同步搏动的腔室。

根据一些实施方式，所有腔室同步搏动或其中类器官产生双相搏动。

根据一些实施方式，类器官包括起搏器样细胞簇，任选地，其中起搏器样细胞簇是钾/钠超极化激活的环核苷酸门控通道4(HCN4)和矮小同源盒2(SHOX2)阳性。

根据一些实施方式，类器官包括外部心外膜，任选地，其中心外膜包括对维尔姆斯氏肿瘤-1(WT1)和T-盒转录因子18(TBX18)阳性的细胞。

根据一些实施方式，类器官包括内部心内膜，任选地，其中心内膜包括对血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)阳性的细胞。

根据一些实施方式，同步搏动包括在每分钟50和90次搏动(bpm)之间的基础搏动频率。

根据一些实施方式，类器官包括血管结构、围绕中空腔室的周向排列的心肌细胞、以肌节模式组织的细长的心肌细胞、腔室壁内的毛细血管和心脏成纤维细胞样细胞，任选地，其中成纤维细胞样细胞是骨膜蛋白(POSTN)和/或波形蛋白阳性。

根据一些实施方式，类器官包括至少一个与培养中的离体心肌细胞或培养中的胎儿心脏组织相比增加的参数，其中参数选自基础呼吸、氧化磷酸化、线粒体最大容量和至少选自下列的因子的表达：TNNT2、TNNI3、Cx43、MYH7、AKAP6、GJA5、JPH2、SLC8A1、ATP2A2、CACNA1C、RYR2、CASQ2、PLN、CAMK2B、TRDN、CAV3、BIN1、AMP2、SCN5A、KIR2.1、ITPR3、HCN2、SCN1B、HCN1、KCNJ8、KCNH2、PRKAA1、CPT1A、TFAM、PPARGC1A、PPA1、PPP2R4、SLC2A4、MAPK1、PRKACA、α1A、α1B、SCN4B、KCNE1。

根据另一方面，提供了一种产生包括至少两个同步搏动的腔室的多腔心脏类器官的方法，该方法包括在几何限制的培养空间中共同培养心肌细胞和内皮细胞团体，使得在细胞团体中产生各向异性应力梯度，从而产生多腔心脏类器官。

根据一些实施方式，该方法包括在包括在直径1-1.2mm之间的微孔中培养约6.8×10^4个细胞。

根据一些实施方式，共同培养包括心肌细胞与内皮细胞的比在1.5:1和2.5:1之间。

根据另一方面，提供了一种多腔心脏类器官，其包括通过本发明的方法产生的至少两个同步搏动的腔室。

根据另一方面，提供了一种评估心脏细胞功能的方法，该方法包括将本发明的多腔心脏类器官暴露于条件并测量多腔心脏类器官的至少一个参数。

根据一些实施方式，条件选自：施用药物或化学品、缺氧条件、循环条件、代谢物暴露变化、激素暴露变化和类器官中细胞的基因突变。

根据一些实施方式，至少一个参数是电-线粒体同步。

根据另一方面，提供了一种感测系统，其包括：

照射源；

第一光电倍增管(PMT)传感器；

第二PMT传感器，和

控制器，其配置为：

控制照射源以用具有第一波长的光子束照射嵌入组织或细胞聚集体中的微粒；

通过第一PMT传感器检测指示从微粒以第一波长反射的光子的第一信号；

通过第二PMT传感器检测指示从微粒以第二波长发射的第二信号，其中微粒包括可被辅因子淬灭的可激发分子；

测量第一信号的频率和光子束的频率之间的偏移，基于测量到的偏移确定背景噪声并从第二信号减少背景噪声；和

基于背景噪声减少的第二信号计算组织或细胞聚集体的时间性辅因子消耗量。

根据一些实施方式，时间性辅因子消耗量指示组织或细胞聚集体中的氧水平。

根据一些实施方式，控制器进一步配置为检测第一信号的强度变化，并基于检测到的变化计算微粒的相对位移。

根据一些实施方式，检测到的信号强度的变化指示微粒的相对位移，任选地，其中位移是在垂直于光子束的轴线上测量的。

根据一些实施方式，控制器进一步配置为从微电极阵列感测组织或细胞聚集体的场电位，用于在检测第一信号和第二信号的同时测量组织或细胞聚集体的电活动。

根据另一方面，提供了一种评估细胞功能的方法，该方法包括：

a.将组织、类器官或细胞聚集体置于本发明的感测系统中，

b.施加条件至组织、类器官或细胞聚集体；和

c.测量组织、类器官或细胞聚集体中的至少辅因子消耗量，

从而评估细胞功能。

根据一些实施方式，感测系统为包括控制器的感测系统，该控制器进一步配置为从微电极阵列感测组织或细胞聚集体的场电位，用于在检测第一信号和第二信号的同时测量组织或细胞聚集体的电活动，并且测量包括测量组织、类器官或细胞聚集体中的辅因子消耗量、位移和电场电位，并且其中施加条件之后的位移、辅因子消耗量和电场电位与施加条件之前的位移、辅因子消耗量和电场电位或与对照未处理的组织、类器官或细胞聚集体相比的显著偏差指示电-线粒体失同步。

根据一些实施方式，将心脏或大脑类器官置于感测系统中。

根据一些实施方式，施加条件选自：施用药物或化学品、施加缺氧条件、施加循环条件、改变代谢物暴露、改变激素暴露和中细胞的基因突变组织、类器官或聚集。

根据另一方面，提供了一种选择患有疾病或紊乱的受试者的方法，该受试者适合用以下试剂治疗，该试剂能够：

a.调节受试者中的疾病或紊乱组织的线粒体钙浓度；

b.调节组织中的线粒体钙通道活性；或

c.其组合；

该方法包括确定受试者中电-线粒体失同步的存在，其中失同步的存在指示受试者适合被治疗。

根据一些实施方式，确定包括以下至少一项：

a.确定从受试者获得的样品中的线粒体钙浓度，并且其中浓度超过预定阈值指示失同步，任选地，其中预定阈值是健康受试者中或患有不是特征在于电-线粒体失同步的疾病或紊乱的受试者中的钙浓度；

b.在患者中观察对通过膜通道靶向电活动的抗心律失常治疗没有反应的心律失常或药物性心律失常症状，因此指示失同步，任选地，其中抗心律失常治疗选自：钠通道阻滞剂、β阻滞剂、钾通道阻滞剂、非二氢吡啶钙通道阻滞剂、腺苷和地高辛；

c.EKG、EEG或EMG，其中异常读数指示失同步，任选地，其中异常读数包括晚电位、R波减弱和R/R比增加中的至少一种；

d.确认暴露于已知会产生电-线粒体失同步的试剂，任选地，其中试剂为选自表1中提供的那些试剂以及甲苯、三氯乙烷、二甲苯、庚烷、己烷、乙醚、三氯乙烯、三氯三氟乙烷、一氧化碳、二硫化碳、杀虫剂、甲烷衍生的卤代烃、有机硝酸盐、砷、镉、钴、有机溶剂和金属；和

e.确认包含指示电-线粒体失同步的症状诊断的病史。

根据另一方面，提供了一种多腔心脏类器官，其包括在几何限制的隔室中的心肌细胞和内皮细胞，其中腔室包括能够搏动的腔室壁。

根据另一方面，提供了一种测试药物的方法，其包括使本发明的多腔心脏类器官与药物接触。

根据另一方面，提供了一种治疗有需要的受试者中的特征在于电-线粒体失同步的疾病或紊乱的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的试剂，该试剂能够：

a.增加受试者中的疾病或紊乱组织的线粒体钙浓度；

b.增加组织中的线粒体钙通道活性；或

c.其组合；

从而治疗特征在于电-线粒体失同步的疾病或紊乱。

根据另一方面，提供了一种用产生心脏副作用的第一试剂治疗有需要的受试者中的疾病的方法，该方法包括施用：

a.第一试剂；和

b.第二试剂，其增加心脏组织中的线粒体钙浓度、增加心脏组织中的线粒体钙通道活性或二者；

从而治疗受试者中的疾病。

根据另一方面，提供了一种产生心脏类器官的方法，该方法包括在使细胞被几何限制的条件下共同培养心肌细胞和内皮细胞，从而产生心脏类器官。

根据另一方面，提供了一种测量组织或细胞聚集体的特性的方法，其包括：

用具有第一波长的光子束照射嵌入组织或细胞聚集体中的微粒；通过第一传感器检测指示从微粒以第一波长反射的光子的第一信号；

检测第一信号的强度变化；和

基于检测到的变化计算微粒的相对位移。

根据另一方面，提供了一种感测系统，其包括：

照射源；

第一光电倍增管(PMT)传感器；和

控制器，其配置为：

控制照射源以用具有第一波长的光子束照射嵌入组织或细胞聚集体中的微粒；通过第一PMT传感器检测指示从微粒以第一波长反射的光子的第一信号；

检测第一信号的强度变化；和

基于检测到的变化计算微粒的相对位移。

根据另一方面，提供了一种测试治疗剂的心脏副作用的方法，该方法包括：

a.将心脏类器官置于本发明的感测系统中；

b.将治疗剂添加到心脏类器官中；和

c.测量心脏类器官中的位移、辅因子消耗量和电场电位；

其中在添加治疗剂之后的位移、辅因子消耗量和电场电位中任一项与添加治疗剂之前的位移、辅因子消耗量和电场电位或对照未处理的心脏类器官的显著偏差指示由治疗剂引起的心脏副作用；

从而测试治疗剂的心脏副作用。

根据一些实施方式，内皮细胞是微血管内皮细胞。

根据一些实施方式，心肌细胞来源于或产生于诱导多能干细胞。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官进一步包括血管结构。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官包括至少2个腔室。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官包括围绕中空腔室的周向排列的心肌细胞。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官包括以肌节模式组织的细长的心肌细胞。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官包括腔室壁内的毛细血管。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官包括心脏成纤维细胞样细胞。

根据一些实施方式，成纤维细胞样细胞是POSTN阳性细胞。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官包括起搏器样细胞簇。

根据一些实施方式，起搏器样细胞簇是HCN4和SHOX2阳性的。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官包括外部心外膜。

根据一些实施方式，心外膜包括对WT1和TBX18阳性的细胞。

根据一些实施方式，腔室壁包括PECAM-1阳性的心内膜样细胞。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官能够同步搏动。

根据一些实施方式，同步搏动在培养中持续至少1周。

根据一些实施方式，搏动是每分钟至少50次搏动(bpm)。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官包括与离体心肌细胞和/或胎儿心脏组织相比，选自KCNJ2、KCNJ8、TMNI3、MYH7、AKAP6、PPKAA2、PGC1A、RAR2、CASQ2和CAV3的至少一种因子的表达增加。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官包括与离体心肌细胞和/或胎儿心脏组织相比，选自KCNJ2、KCNJ8、TMNI3、MYH7、AKAP6、PPKAA2、PGC1A、RAR2、CASQ2和CAV3的2-10个基因的表达增加。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官包括与培养中的心肌细胞相比，增加的基础呼吸、氧化磷酸化或线粒体最大容量中的至少一种。

根据一些实施方式，多腔心脏类器官能够对治疗剂产生生理反应。

根据一些实施方式，治疗剂是肾上腺素。

根据一些实施方式，治疗剂是胺碘酮。

根据一些实施方式，该方法进一步包括在接触后测试多腔心脏类器官的生理输出。

根据一些实施方式，该方法进一步包括将生理输出与接触前测得的输出相比较。

根据一些实施方式，测试是测试心脏的负面副作用。

根据一些实施方式，副作用是心律失常。

根据一些实施方式，药物为抗癌剂。

根据一些实施方式，药物为钙信号传导靶向剂。

根据一些实施方式，药物为钙通道阻滞剂。

根据一些实施方式，该方法进一步包括在接触前在多腔心脏类器官中诱导心脏缺陷、病症或疾病，并且其中药物为旨在治疗该缺陷、病症或疾病的治疗剂。

根据一些实施方式，病症是心律失常。

根据一些实施方式，增加线粒体钙或增加线粒体钙通道活性包括增加线粒体活性。

根据一些实施方式，增加线粒体钙通道活性包括增加线粒体钙单向转运体(MCU)活性。

根据一些实施方式，增加MCU活性的试剂是阻断药物与MCU相互作用的试剂，其中药物抑制MCU活性。

根据一些实施方式，施用的试剂为MCU激活剂。

根据一些实施方式，MCU激活剂是二甲双胍。

根据一些实施方式，疾病或紊乱选自：心律失常、心肌病、癫痫发作、癫痫、运动神经元痉挛、肌无力和肌肉萎缩，任选地，其中心律失常为癌症治疗诱发的心律失常(CTIA)。

根据一些实施方式，第一试剂为钙信号传导靶向剂。

根据一些实施方式，第一试剂为钙通道阻滞剂。

根据一些实施方式，疾病是癌症，并且第一试剂为抗肿瘤剂。

根据一些实施方式，疾病为炎症性疾病，并且第一试剂为抗炎试剂。

根据一些实施方式，疾病是中枢神经系统(CNS)的疾病，并且第一试剂为CNS试剂。

根据一些实施方式，疾病为胃肠道疾病，并且第一试剂为胃肠试剂。

根据一些实施方式，疾病是生殖器或泌尿系统疾病，并且第一试剂为泌尿生殖器试剂。

根据一些实施方式，疾病为过敏反应，并且第一试剂为抗过敏试剂。

根据一些实施方式，疾病为感染，并且第一试剂为抗感染试剂。

根据一些实施方式，疾病为心血管疾病，并且第一试剂为心血管试剂。

根据一些实施方式，第一试剂选自表1中提供的试剂。

根据一些实施方式，增加线粒体钙通道活性包括增加MCU活性。

根据一些实施方式，第二试剂是二甲双胍。

根据一些实施方式，受试者未患有代谢紊乱、未接受代谢综合征治疗或二者。

根据一些实施方式，代谢紊乱是糖尿病或高血糖。

根据一些实施方式，条件是在直径1-1.2mm之间的微孔中约6.8×10^4个细胞的浓度。

根据一些实施方式，共同培养包括心肌细胞与内皮细胞的比在1.5:1至2.5:1之间。

根据一些实施方式，内皮细胞是微血管心脏内皮细胞。

根据一些实施方式，培养包括添加血管内皮生长因子(VEGF)。

根据一些实施方式，培养持续足以形成由心肌细胞包围的多个中空腔室并同步搏动的时间。

根据一些实施方式，该方法是生产本发明的心脏类器官的方法。

根据一些实施方式，培养持续足以形成特征在于本发明的心脏类器官的特征的类器官的时间。

根据一些实施方式，检测到的信号强度的变化与微粒的相对位移成比例。

根据一些实施方式，位移是在垂直于光子束的轴线上测量的。

根据一些实施方式，该方法进一步包括：

通过第二传感器检测指示由嵌入组织或细胞聚集体中的微粒以第二波长发射的第二信号，其中微粒包括可被辅因子淬灭的可激发分子；

基于第一信号和第二信号计算组织或细胞聚集体的时间性辅因子消耗量。

根据一些实施方式，时间性辅因子消耗量与第一信号和第二信号的频率差相关。

根据一些实施方式，时间性辅因子消耗量是组织或细胞聚集体的氧水平。

根据一些实施方式，该方法进一步包括使用光子束参数过滤第二信号。

根据一些实施方式，过滤包括：

测量第二信号的频率和光子束的频率之间的偏移；

基于测量的偏移确定背景噪声；和

从第二信号减少背景噪声。

根据一些实施方式，该方法进一步包括：

从微电极阵列感测组织或细胞聚集体的场电位，用于在光学测量的同时测量组织或细胞聚集体的电活动。

根据一些实施方式，该方法进一步包括比较第一信号、第二信号和组织的场电位的频率。

根据一些实施方式，如果频率之间的比较产生低于阈值的偏差，比较指示健康组织或细胞聚集体。

根据一些实施方式，检测到的信号强度的变化指示微粒的相对位移。

根据一些实施方式，位移是在垂直于光子束的轴线上测量的。

根据一些实施方式，该系统进一步包括：

第二PMT传感器，

并且其中控制器进一步配置为：

从第二PMT传感器检测指示由嵌入组织或细胞聚集体中的微粒以第二波长发射的第二信号，其中微粒包括可被辅因子淬灭的可激发分子；

基于第一信号和第二信号计算组织或细胞聚集体的时间性辅因子消耗量。

根据一些实施方式，时间性辅因子消耗量与第一信号和第二信号的频率差相关。

根据一些实施方式，时间性辅因子消耗量是组织或细胞聚集体的氧水平。

根据一些实施方式，控制器进一步配置为使用光子束参数过滤第二信号。

根据一些实施方式，过滤包括：

测量第二信号的频率和光子束的频率之间的偏移；

基于测量的偏移确定背景噪声；和

从第二信号减少背景噪声。

根据一些实施方式，控制器进一步配置为：

从微电极阵列感测组织或细胞聚集体的场电位，用于在检测第一信号的同时测量组织或细胞聚集体的电活动。

根据一些实施方式，控制器进一步配置为：

比较第一信号、第二信号和组织的场电位的频率。

根据一些实施方式，如果频率之间的比较产生低于阈值的偏差，比较指示健康组织或细胞聚集体。

根据一些实施方式，心脏类器官为能够搏动的心脏类器官。

根据一些实施方式，心脏类器官为本发明的多腔心脏类器官。

本发明进一步的实施方式和全部适用范围将从下文的详细描述中变得显而易见。然而，应当理解的是，虽然表明了本发明的优选实施方式，但是本发明的详细描述和具体实例仅以说明的方式给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将从本详细描述中变得显而易见。

附图说明

图1A-1O包括显示人诱导多能干细胞(hiPSC)衍生的血管化心脏类器官的生产的说明、图表、显微照片和热图。(1A)描述hiPSC衍生的血管化心脏类器官形成的方案。心肌细胞在10天内由hiPSC分化、解离，并与3D支架中的微血管内皮细胞混合。细胞在孔内在4天内形成搏动的类器官，在25天内在各向异性应力下形成多个腔室。(1B)描述氧传感器嵌入的血管化心脏类器官的形成的代表性延时拍摄顺序(time-lapse sequence)的明视野图像。在第4天形成单个团体，在第10天搏动，并在第25天获得光滑的外表和均匀同步的搏动。比例尺＝250μm。(1C)左图：在固体表面(游离类器官)上形成的、微孔中几何限制的或微孔中血管化和限制的3D心脏类器官中冯·米塞斯(von Mises)应力分布的有限元模型。(1D)截面图应力分布图和DNA染色，其显示游离类器官的均匀应力导致心脏球形，几何限制类器官的径向应力梯度导致单腔形成。血管化类器官的各向异性应力分布导致多腔心脏类器官的形成。比例尺＝200μm。(1E)心脏类器官中机械应力标志物Lamin A/C(Lamin)和YAP1的共聚焦截面图和表达分布。游离类器官显示出两种应力标志物的均匀分布，而几何限制的类器官则显示出预测的周向应力。血管化类器官中的各向异性应力分布导致多腔心脏类器官的形成。比例尺＝100μm。(1F)血管化心脏类器官的共聚焦截面图，其显示周向排列的心脏纤维(α-辅肌动蛋白)围绕嵌入有心脏内皮细胞(CEC)的血管网络的垂直状腔室。比例尺＝50μm。类器官壁的共聚焦切片，其显示排列的心脏纤维(cTnT)被开放的微血管毛细管(CEC)穿透。比例尺＝50μm。血管化心脏类器官的扫描电子显微照片显示管腔形成。比例尺＝10μm。(1G)心脏肌钙蛋白T(cTnT)和α-辅肌动蛋白纤维的免疫荧光。纤维形成沿心脏组织排列的长的肌节；这是与成熟心脏组织相关的表型。比例尺＝10μm。(1H)血管化心脏类器官的共聚焦截面图，其显示心肌样层与POSTN心脏成纤维细胞样细胞和表达起搏器相关标记HCN4和SHOX2的孤立细胞簇交织在一起。比例尺＝100μm。(1I)血管化心脏类器官的共聚焦截面图，其显示心脏类器官表面的周向排列的心外膜细胞，表达内嵌心脏内皮细胞(CEC)的血管网络的转录调节因子维尔姆肿瘤基因(Wilm's Tumor Gene)1(WT1)和TBX18。比例尺＝100μm。(1J)共聚焦截面图进一步显示，类器官的腔内衬有PECAM-1类心内膜样细胞。比例尺＝100μm。(1K)将iPS衍生的心肌细胞和胎儿心肌细胞的RNA-Seq数据与血管化心脏类器官和成人心肌细胞的RNA序列进行比较聚类，心脏类器官的RNA序列显示与心内膜、心外膜、心脏成纤维细胞和起搏细胞相关的表达特征。(1L)描绘血管网络明显形成的代表性延时拍摄顺序的共聚焦图像。共聚焦显微镜显示GFP表达的心脏内皮细胞(CEC)在类器官中的分布。第10天时血管网络显而易见。(1M)血管化心脏类器官的共聚焦截面图显示，周向排列的心脏纤维(α-辅肌动蛋白)围绕嵌入有心脏内皮细胞的血管网络的垂直状腔室。(1N)在三种应力机制下腔室形成的量化。在几何限制和血管的作用下，87％的时间会出现多个腔室。(1O)用指示细胞凋亡的TUNEL和被认为是缺氧的内源性生物标志物的碳酸酐酶ix(CA-IX)染色的血管化心脏类器官的共聚焦截面图，用于确定上调的缺氧区域。免疫荧光染色表明TUNEL和CA-IX有轻微表达。比例尺＝100μm。

图2A-2F包括显示人体心脏类器官的功能特征的热图、图表、显微照片、表格和示意图。(2A)iPS衍生的心肌细胞和胎儿心肌细胞与血管化心脏类器官和成人心肌细胞相比的转录组分析。(2B)心脏类器官和成人心肌细胞之间的基因的基因表达模式的主成分分析(PCA)显示，能很好的区分成人和胎儿心脏组织的第2和第3组将心脏类器官与成人组织聚集在一起。2C)血管化心脏类器官显示出每分钟66±5次搏动(bpm)的自发搏动。类器官在药物刺激下保持同步搏动，对药物产生类似生理反应。用100μM肾上腺素刺激使收缩速率增至88±7bpm，并且相对收缩增加18％，而用10μM胺碘酮刺激使速率降至52±4bpm，并且收缩减少28％。(2D)与hiPSC衍生的心肌细胞相比，心脏类器官的Seahorse MitoStress测试。将心肌细胞重建为血管化的心脏类器官使氧化磷酸化增加85％，以及最大呼吸能力增加58％(n＝3，p<0.05)，而糖酵解不受影响。(2E)在培养14天后嵌入氧磷光传感器的血管化心脏类器官的共聚焦截面图。(2F)在心动周期期间血管化心脏类器官的细胞内代谢通量。葡萄糖利用率和计算的ATP产量显示为nmol/min/106个细胞。误差条代表平均值±标准误差(S.E.)。显著性采用单尾异方差学生检验。比例尺＝250μm。

图3A-3L包括显示集成光电传感器可实时同步测量心脏代谢、收缩和动作电位的示意图、图像、显微照片和图表。(3A)集成代谢-电-机械传感器芯片示意图。基于寿命的Ru-CPOx磷光传感器被嵌入心脏类器官中，并通过双频LED调制进行探测。氧气被测量为发射信号(PMT)的相移，而第二检测器则用于降噪和测量组织收缩(cPMT)。使用纳米制造的金微电极阵列(MEA)记录电生理活动。所有测量均由单个微处理器进行同步和实时处理。(3B)光学测量示意图。氧浓度(左)通过环境三重氧对信号的磷光淬灭进行测量，衰减时间缩短，导致相移变短。收缩速率(右)通过监测与心脏收缩相关的平均磷光强度的亚秒级时间变化进行测量。(3C)传感器集成的芯片心脏(heart-on-a-chip)平台的剖视图和图像。该装置由支撑PDMS微孔网格的3D打印外壳组成，该网格层叠在纳米制造的玻璃上金MEA上。该装置由包含MEA引线的连接器的3D打印支架密封。集成MEA的芯片在25×25mm的玻璃芯片上有45个金电极。PDMS微孔阵列支撑着9个携带心脏类器官的支架；每个支架包含5个记录电极。(3D)氧传感器嵌入MEA集成支架中形成的心脏类器官的代表图像。MEA的金电极显示为阴影区域。比例尺＝200μm。(3E)显示集成支架中形成30天的心脏类器官的扫描电子显微照片。比例尺＝200μm。(3F-H)在自发搏动期间心脏类器官的(3F)收缩、(3G)场电位和(3H)间隙氧的同时测量和快速傅立叶变换(FFT)分析(参见图9A)。间隙氧浓度在心动周期期间显示振荡行为，在FFT分析中产生与心脏组织的机械和电行为相关的明显的单频峰。(3I-J)在用100μM肾上腺素刺激下心脏类器官的(3I)收缩和(3J)间隙氧行为的代表图。随着时间的推移，肾上腺素会增加血管化心脏类器官的收缩能力和收缩速率，同时降低类器官内的平均间隙氧浓度(虚线)并增加其振荡频率。分析表明，收缩行为与氧行为相关(参见图9A-9D)。(3K)在用10μM肌球蛋白II抑制剂布比他汀处理(见图9B)后，心脏类器官的收缩、场电位和间隙氧行为及快速傅立叶变换(FFT)的代表图。布比他汀抑制血管化心脏类器官的收缩，但不影响FP或间隙氧振荡的频率和强度，这表明存在不涉及肌动蛋白活性的电-线粒体耦合。(3L)在用25μM的Na_v通道抑制剂河豚毒素(TTX)处理后，心脏类器官的收缩、场电位和间隙氧行为的代表图。暴露于TTX会导致场电位生成和相关机械收缩的完全丧失。氧振荡与场电位同时衰减。

图4A-4G包括显示电-线粒体耦合破坏诱发心律失常行为的显微照片和图表。(4A)在2D培养的hiPSC-衍生的心肌细胞中线粒体膜电位(MMP)的免疫荧光TMRE染色和相应的频率热图。通过活体荧光显微镜捕获的收缩速率和相应的线粒体膜电位振荡(参见材料和方法)。搏动的2D hiPSC-衍生的心肌细胞的线粒体膜电位以收缩频率振荡，而相邻的非搏动细胞没有振荡(n＝5)。比例尺＝25μm。(4B)在用10μM线粒体钙单向转运体(MCU)抑制剂KB-R7943处理后细胞收缩和线粒体钙[Ca²⁺]_m动态变化的动力学测量。在稳定线粒体染料染色(MitoTracker)下，使用Rhod-2AM测量[Ca²⁺]_m。通过目测分析测量收缩(参见材料和方法)。急性MCU抑制会显著降低心肌细胞的收缩能力和[Ca2+]m振荡幅度，但不影响收缩速率。(4C)集成代谢-机电传感器芯片中hiPSC衍生的血管化心脏类器官的相位图像(n＝4)。比例尺＝100μm。(4D)暴露于10μM MCU抑制剂KB-R7943的血管化心脏类器官的间隙氧含量和细胞内代谢通量的实时测量。在暴露于10μM KB-R7943后的0分钟、15分钟和25分钟计算通量。葡萄糖利用率和计算的ATP产量显示为nmol/min/106个细胞(参见材料和方法)。间隙氧含量表明MCU抑制导致心脏类器官摄氧量逐渐减少，导致ATP产量减少和ATP缺口增大。(4E)暴露于10μM KB-R7943的心脏类器官的收缩、场电位和间隙氧含量的代表性动力学测量(n＝9)。(4F)在MCU抑制后收缩频率、氧振荡频率和场电位振荡频率的同步动力学测量。MCU抑制导致所有振荡速率相关增加。与振荡速率相比，MCU抑制会逐渐降低心肌细胞的收缩幅度、电活动和摄氧量，并导致心脏致心律失常行为(n＝9)。(4G)由于用10μM KB-R7943处理导致收缩、场电位和间隙氧含量的单次收缩测量的代表性变化。MCU抑制导致线粒体与机电活动解耦合，导致心脏心律失常。

图5A-5E包括显示MCU的CRISPR/Cas9敲除破坏电-线粒体耦合并诱导心律失常行为的显微照片、曲线图、图表和示意图。(5A)在搏动的2D培养hiPSC-衍生的心肌细胞中线粒体膜电位(MMP)的动力学Rhod-2AM测量。非靶向sgRNA对[Ca²⁺]_m没有影响显示0.8Hz的主频，而MCU敲除(MCU^KO)显示[Ca²⁺]_m和振荡幅度下降50％，同时振荡频率增加到1.3Hz(n＝7，p<0.01)。(5B)非同源MCU^KO嵌合血管化心脏类器官中MCU的免疫荧光染色。免疫荧光染色表明MCU表达明显减少。比例尺＝100μm。(5C-5D)非同源MCU^KO或sgRNA嵌合心脏类器官中收缩、场电位和间隙氧含量的(5C)代表性动力学测量和(5D)动态分析(n＝9，p<0.001)。破坏MCU在类器官中的表达会降低类器官的收缩能力，减少氧振荡幅度，并在类器官场电位中表现出明显的致心律失常行为。(5E)描述MCU抑制导致心肌细胞中电活动、线粒体活动和机械活动之间相互作用变化的方案。电-线粒体耦合是这种协调的基础，并且MCU抑制使其解耦合导致不协调的活动和致心律失常行为。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。采用双尾异方差学生检验确定显著性。

图6A-6F包括显示二甲双胍可部分逆转米托蒽醌对电-线粒体耦合和由此导致的心律失常的抑制的表格、示意图和图表。(6A)米托蒽醌和二甲双胍的结构、临床适应症和最大生理浓度(Cmax)。(6B)描述心肌细胞暴露于米托蒽醌后，电-线粒体耦合被破坏，以及加入二甲双胍后恢复的方案。米托蒽醌抑制MCU会导致去极化时ATP产量不足，导致心律失常。添加二甲双胍可改善去极化期间钙进入线粒体，并且允许更多的ATP产生。(6C-6D)使用Rhod-2AM染料在不同的hiPSC-衍生的心肌细胞培养物中的实时成像测量的(6C)代表性记录和(6D)线粒体钙的平均值，培养物用10μM MCU抑制剂米托蒽醌或DMSO(对照)处理，然后用10μM米托蒽醌(mitoxantrone)或10μM米托蒽醌和100μM AMP激活的蛋白激酶激活剂二甲双胍(米托蒽醌+二甲双胍；n＝4)处理)。单独使用米托蒽醌会导致线粒体钙降低79％(p<0.001)。向米托蒽醌处理中加入100μM二甲双胍可使线粒体钙的平均含量增加3.4倍(p<0.001)。(6E)在暴露于DMSO(对照)、10μM米托蒽醌(mitoxantrone)或10μM米托蒽醌和100μM二甲双胍(米托蒽醌+二甲双胍)的心脏类器官中收缩、场电位和间隙氧含量的代表性同步动力学测量。米托蒽醌会导致心脏收缩和场电位不规则。同时使用二甲双胍处理可使该效应逆转，显示出规则的心脏收缩和场电位。(6F)由于用10μM米托蒽醌或同时使用10μM米托蒽醌和100μM二甲双胍处理，单次收缩测量的收缩、场电位和间隙氧含量的代表性变化。米托蒽醌抑制MCU会导致电-线粒体解耦合，引起心脏心律失常行为。同时用二甲双胍和米托蒽醌处理可缓解心脏心律失常行为，显示出协调的心脏行为。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001.误差条代表±S.E.。采用双尾异方差学生检验显著性。

图7A-7C包括显示生成多腔血管化心脏器官的示意图和显微照片。在固体表面(游离类器官)形成的、在微孔中几何限制的或在微孔中血管化并限制的3D心脏类器官的(7A)冯·米塞斯应力分布和(7B)高斯位移的有限元模型。有限元模型显示，机械应力梯度有助于心脏腔室的形成。(7C)用机械应力标志物Lamin A/C(Lamin)和YAP1染色的类器官共聚焦截面图。游离类器官显示出两种应力标志物的均匀分布，而几何限制的类器官则显示出预测的周向应力。血管化类器官中的各向异性应力分布导致多腔心脏类器官的形成。比例尺＝100μm。

图8A-8D包括显示集成的2-PMT芯片心脏平台的建立的示意图和曲线图。(8A)描述相对于单PMT系统使用2-PMT系统的优势的方案和典型测量结果。测量激发信号的第二检测器(cPMT)的添加降低了噪音，并实现亚秒级分辨率的精确测量。第二PMT还允许测量与发射无关的组织收缩(参见材料和方法)。(8B)第二PMT在不同位移下测量的反射信号的校准测量。曲线拟合显示通过峰-峰电压(V_P-P)测量的发射强度与传感器位移之间的正弦关系。心脏位移是在当珠移动到距离焦点不同的距离时，在收缩期间通过心脏类器官内嵌入的氧气珠测量的。S拟合显示相关性为R-平方：0.9835并且RMSE低于4。(8C)使用升降光刻技术制造MEA的过程示意图。计算机辅助设计用于设计MEA。使用清洁的显微载玻片作为基底。在基底上旋涂一层LOR 5b和AZ1505/正性光刻胶。在版图中绘制图案后，使用直接激光写入器(LW405-A)。在AZ 726MIF显影后，分别进行了钛和金的溅射沉积。在丙酮中剥离光刻胶后，制作过程结束。(8D)安装在MEA透明芯片上的PDMS微型支架支持9个心脏类器官的形成。PDMS支架是使用激光切割数控机床制造的，并使用氧等离子激活共价结合在MEA芯片上。图8A是现有技术的系统和根据本发明的一些实施方式的系统的示意图。示意图使得使用2-PMT系统的优势消失。氧气是通过由光电倍增管(PMT)检测到的发射信号与激发信号之间的相移来测量的。因此，增加测量激发信号的第二检测器(cPMT)可以降低噪声，以实现亚秒级分辨率的精确测量。第二PMT还允许测量与发射无关的组织收缩。(8B)S曲线拟合检验了使用2-PMT系统以峰-峰电压(V_P-P)测量的氧气珠发射强度与其位移之间的关系。心脏位移是在当氧气珠移动到距离焦点不同的距离时，在心肌收缩期间由心脏类器官内嵌入的氧气珠测量的。S拟合显示相关性为R-平方：0.9835，并且RMSE低于4。

图8E是根据本发明的一些实施方式测量组织或细胞聚集体的特性的方法的流程图。

图9A-9D包括显示血管化心脏器官的实时代谢测量的非限制性方案和图表。(9A)在自发搏动期间心脏类器官中的收缩、场电位和间隙氧的同时测量。间隙氧浓度在心动周期期间显示出振荡行为，在FFT分析中产生(9B)与心脏组织的机械和电行为相关的明显的单频峰。(9C)与MEA连接以同时实时跟踪自发心脏场电位(FP)的电生理学记录系统示意图。场电位使用集成信号调节电路(AD8232)进行放大和过滤，该电路具有2极可调高通滤波器、3极可调低通滤波器、可调增益和医疗仪器放大器。将Arduino MEGA微控制器用作模数转换器(ADC)。(9D)心脏器官的代表性原始和滤波场电位测量结果。使用自定义编写的MATLAB代码(方法)实时应用有限脉冲响应滤波器。定期使用抗混叠滤波器消除工作区不同仪器电磁场产生的频率高于8Hz的噪声。

图10A-10G显示了在肾上腺素刺激下血管化心脏类器官的实时代谢测量。(10A)在100μM肾上腺素的长时间刺激下，分析类器官收缩速率的动力学行为。动力学分析表明，肾上腺素刺激会导致类器官收缩速率发生类S形变化。(10B-10C)在延长的肾上腺素刺激下，(10B)收缩幅度(收缩能力)-收缩速率和(10C)间隙氧含量-收缩速率之间的代表性关系图。分析表明，心脏类器官收缩能力的增加与耗氧量之间的相关性。(10D)在用100μM肾上腺素刺激后0、15和90分钟时间隙氧测量值的代表性频率直方图。分析表明，耗氧量的增加与间隙氧含量可变性的增加相关，间隙氧含量可变性与测量到的氧振幅增加相关。(10E-10F)(10E)氧振荡频率与收缩频率和(10F)氧振荡振幅与收缩能力之间的代表性相关分析显示间隙氧的振荡行为与类器官收缩之间的直接线性相关性。(10G)快速傅立叶变换(FFT)分析的代表图，显示在用10μM肌球蛋白II抑制剂布比他汀处理后心脏类器官的收缩、场电位和间隙氧频率行为。布比他汀处理阻止了心脏收缩和传感器运动，但没有影响场电位或氧振荡频率和强度。

图11A-11L包括显示线粒体活体成像的显微照片、图表和热图，其显示线粒体膜电位的振荡。(11A)使用TMRE染料活体成像测量的线粒体膜电位(ΔΨm)免疫荧光显微照片。(11B)使用TMRE对线粒体膜电位(ΔΨm)的动力学分析。hiPSC衍生的心肌细胞的线粒体膜电位以收缩频率振荡。非搏动细胞的线粒体膜电位不会振荡，并且整体较低。(11C-11D)(11C)显示平均线粒体膜电位的热图显微照片和(11D)ΔΨm的主要振荡频率的彩虹热图。图像显示线粒体平均膜电位高的区域与振荡频率相关。(11E)使用JC-1染料的活体成像测量线粒体膜电位(ΔΨm)的免疫荧光显微照片。(11F)JC-1染料聚集后线粒体膜电位(ΔΨm)的动力学分析。线粒体膜电位在收缩细胞中显示出明显的极化峰，而非搏动细胞则没有振荡，并且显示出总体较低的线粒体膜电位。(11G-11H)(11G)用JC-1测得的线粒体平均膜电位和(11H)ΔΨm的主要振荡频率的彩虹热图(参见材料和方法)。与TMRE测量的行为类似，JC-1热图表现出线粒体平均膜电位高的区域与振荡频率之间的相关性。(11I)2D培养的hiPSC-衍生的心肌细胞的活体成像显示，搏动细胞中线粒体钙[Ca²⁺]_m的快速振荡与细胞的收缩频率精确相关。(11J)在用10μM线粒体钙单运体(MCU)抑制剂KB-R7943处理后线粒体钙含量动态变化的免疫荧光显微照片。线粒体钙通过Rhod-2AM染料实时成像测量，线粒体含量通过MitoTracker染色测量，并且收缩通过可视收缩分析测量(参见材料和方法)。(11K)在用10μM KB-R7943处理后线粒体钙和心肌细胞收缩的代表性单次收缩测量。急性MCU抑制降低了心肌细胞收缩的幅度及其对线粒体钙的高效振荡的依赖性。(11L)在用10μM KB-R7943处理后线粒体钙振幅和心肌细胞收缩能力的动态分析。分析表明，线粒体钙振荡幅度与收缩能力相关，表明线粒体钙振荡对维持收缩幅度至关重要。比例尺＝25μm。

图12A-12C包括显示MCU的CRISPR/Cas9敲除破坏电-线粒体耦合并诱导心律失常行为的图表和显微照片。(12A)在搏动的2D培养的hiPSC-衍生的心肌细胞中线粒体膜电位(MMP)的动力学Rhod-2AM测量。非靶向sgRNA对[Ca²⁺]_m没有影响，显示主频为0.8Hz，而MCU敲除(MCU^KO)显示[Ca²⁺]_m和振荡幅度下降35-50％，同时振荡速率增加到1.3-1.4Hz。(12B-12C)(12B)RT-qPCR和(12C)免疫荧光共聚焦显微镜检查显示MCU在mRNA和蛋白质水平上的表达明显减少。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。误差条表示±S.E。采用双尾异方差学生检验显著性。比例尺＝100μm。

图13A-13E包括显示电-线粒体耦合在体外猪模型中的验证的显微照片、图表和示意图。(13A)描述使用嵌入氧传感器并置于多电极阵列上的受刺激猪的左心室解剖组织(参见材料和方法)作为体外验证模型的示意图。(13B)电极阵列上解剖的猪组织(绿色)的照片。比例尺＝5mm。(13C)显示氧传感器(伪彩色)粘附在猪心脏组织切片上的扫描电子显微照片。比例尺＝25μm。(13D)暴露于DMSO(对照)、10μM布比他汀(blebbistatin)、10μM米托蒽醌或10μM米托蒽醌和100μM二甲双胍(米托蒽醌+二甲双胍)的猪心脏组织的收缩、场电位和间隙氧含量的代表性同步动力学测量。肌球蛋白II抑制剂布比他汀阻止心脏收缩，但不影响场电位和氧振荡频率。暴露于米托蒽醌会诱发致心律失常行为，使猪组织的搏动频率从1Hz增加到2Hz。同时用二甲双胍可部分逆转猪组织中的这种效应，使搏动频率降至1.4Hz。(13E)暴露于米托蒽醌的猪心脏组织的间隙氧的连续测量显示线粒体活性受抑制的动力学过程。在暴露后50分钟用二甲双胍处理显示功能逐渐恢复，并逆转了米托蒽醌的影响。

具体实施方式

本发明在一些实施方式中提供了治疗特征在于电-线粒体失同步化的疾病或紊乱的方法。还提供了包括内皮细胞、心肌细胞和至少两个同步搏动的腔室的多腔心脏类器官。还提供了产生多腔心脏类器官的方法和使用其的方法，以及感测系统及其用途。

心脏类器官

根据第一方面，提供了一种心脏类器官。

如本文所使用的，“类器官”是指体外产生的器官的的简化版本。在一些实施方式中，类器官小于体内器官。在一些实施方式中，心脏类器官为本发明的心脏类器官。在一些实施方式中，类器官具有与器官类似的显微解剖学或细胞组织。在一些实施方式中，细胞组织是2D组织。在一些实施方式中，细胞组织是3D细胞组织。在一些实施方式中，类器官的功能与器官相似。在一些实施方式中，类器官具有与器官类似的基因表达。在一些实施方式中，基因表达是基因表达谱。在一些实施方式中，类器官的跳动与器官相似。在一些实施方式中，类器官细胞的同步与器官细胞相似。在一些实施方式中，类器官对钙的反应与器官相似。在一些实施方式中，类器官具有与器官线粒体功能相似的线粒体。在一些实施方式中，类器官发出的信号与器官相似。在一些实施方式中，类器官对药物或化合物的反应与器官相似。在一些实施方式中，类器官可用于测试将用于该器官的药物。在一些实施方式中，类器官可用于测试该器官的药物或化合物的副作用。在一些实施方式中，类器官可用于对器官疾病建模。在一些实施方式中，器官是心脏。在一些实施方式中，器官是心脏的一部分。在一些实施方式中，该部分是心室。在一些实施方式中，该部分是心房。在一些实施方式中，类器官可自我更新。在一些实施方式中，类器官没有永生化。

在一些实施方式中，类器官未被基因操纵。在一些实施方式中，类器官包括二倍体细胞。在一些实施方式中，类器官由二倍体细胞组成。在一些实施方式中，类器官没有非整倍体细胞。在一些实施方式中，类器官包括心肌细胞。在一些实施方式中，心肌细胞源自多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方式中，心肌细胞获得自PSC。在一些实施方式中，心肌细胞是人体心肌细胞。在一些实施方式中，iPSC是人体iPSC。多能干细胞分化成心肌细胞的方法在本领域是众所周知的，并且可采用任何这种方法。此外，下文还提供了一种示例性方法。在一些实施方式中，iPSC被分化成心肌细胞。

如本文所使用的，术语“心肌细胞”是指构成心肌(心脏肌肉)的心肌细胞。每个心肌细胞都含有肌原纤维，肌原纤维是由长的肌节链(肌肉细胞的基本收缩单位)组成的特化类器官。心肌细胞呈现出与骨骼肌细胞的那些类似的条纹。与多核骨骼肌细胞不同的是，大多数心肌细胞只包含一个细胞核，但也可能多达四个。心肌细胞具有高线粒体密度，这允许它们快速产生三磷酸腺苷(ATP)，使其高度耐疲劳。

“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指源自不是PSC的细胞(即，源自相对于PSC分化的细胞)的PSC。iPSC可源自多种不同类型的细胞，包括终末分化的细胞。iPSC具有类似ES细胞的形态，生长为扁平的菌落，具有较大的核-细胞质比率、明确的边界和突出的核。此外，iPSC表达一种或多种本领域普通技术人员已知的关键多能性标记，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT和zfp42。生成和表征iPSC的方法的实例可参见例如，美国专利公开号US20090047263、US20090068742、US20090191159、US20090227032、US20090246875和US20090304646。一般来说，为了产生iPSC，向体细胞提供本领域已知的重编程因子(例如，Oct4、SOX2、KLF4、MYC、Nanog、Lin28等)，以将体细胞重编程为多能干细胞。

在一些实施方式中，类器官包括内皮细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是微血管内皮细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是心脏内皮细胞。在一些实施方式中，心脏类器官包括在几何限制的隔室中的内皮细胞。在一些实施方式中，类器官的细胞在几何限制的隔室中。在一些实施方式中，类器官包括心肌细胞和内皮细胞的混合体。在一些实施方式中，混合体包括比为约2:1的心肌细胞与内皮细胞。

在一些实施方式中，类器官包括至少100、1000、5000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、68000、70000、75000、80000、85000、90000、95000或100000个细胞。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，类器官包括至少68000个细胞。在一些实施方式中，类器官包括至少75000个细胞。在一些实施方式中，类器官包括至多65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、125000、150000、175000、200000、300000、400000、500000、1000000、10000000、100000000或1000000000个细胞。每种可能性表示本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，心脏类器官为多腔心脏类器官。在一些实施方式中，类器官为多腔类器官。在一些实施方式中，多腔包括至少2个腔室。在一些实施方式中，多腔包括至少3个腔室。在一些实施方式中，多腔包括至少4个腔室。在一些实施方式中，腔室包括腔室壁。在一些实施方式中，腔室壁包括心内膜。在一些实施方式中，腔室壁是心内膜。在一些实施方式中，腔室壁能够搏动。在一些实施方式中，类器官为搏动类器官。在一些实施方式中，搏动是自发搏动。在一些实施方式中，腔室壁能够收缩。在一些实施方式中，搏动或收缩是对刺激的反应。在一些实施方式中，刺激为内源性刺激。在一些实施方式中，刺激为外源性刺激。在一些实施方式中，刺激为内分泌或激素刺激。在一些实施方式中，刺激是化学刺激。在一些实施方式中，刺激为电刺激。在一些实施方式中，类器官自发搏动，并且也会响应刺激而搏动或改变搏动。在一些实施方式中，搏动是同步的。

在一些实施方式中，心脏类器官进一步包括血管结构或多个血管结构。在一些实施方式中，心脏类器官包括内皮细胞。在一些实施方式中，内皮细胞的加入形成了血管结构。在一些实施方式中，该结构由添加的内皮细胞自然形成，无需进一步刺激。在一些实施方式中，在添加促血管生成刺激物后，该结构由添加的内皮细胞自然形成。促血管生成蛋白在本领域是众所周知的，并且可以使用任何促血管生成蛋白。在一些实施方式中，刺激物是蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是VEGF。在一些实施方式中，VEGF是VEGF-A。在一些实施方式中，血管结构包括或选自：动脉、小动脉、毛细血管、静脉、小静脉、静脉窦或其任意组合。在一些实施方式中，血管结构包括毛细血管。在一些实施方式中，腔室壁包括毛细血管。在一些实施方式中，类器官包括各向异性应力梯度。在一些实施方式中，类器官包括低应力区。在一些实施方式中，脉管系统是响应各向异性应力形成的。

在一些实施方式中，心脏类器官包括周向排列的心肌细胞。在一些实施方式中，周向排列的心肌细胞围绕腔室。在一些实施方式中，腔室是中空的。在一些实施方式中，腔室包括流体。在一些实施方式中，流体是培养基。在一些实施方式中，腔室被心肌细胞包围。在一些实施方式中，腔室被心肌细胞分层。在一些实施方式中，腔室壁包括周向排列的心肌细胞。在一些实施方式中，周长是心室的周长。在一些实施方式中，周长是心肌细胞的周长。在一些实施方式中，心脏类器官的腔室包括围绕腔室的壁内的至少一条毛细血管。在一些实施方式中，腔室被心内膜包围。在一些实施方式中，心内膜被心外膜包围。

在一些实施方式中，心脏类器官包括细长的心肌细胞。在一些实施方式中，心肌细胞是细长的心肌细胞。在一些实施方式中，心肌细胞以肌节模式组织。在一些实施方式中，心肌细胞被组织成肌节。如本文所使用的，术语“肌节模式”是指与肌节，例如，横纹肌或肌肉组织的最小功能单位类似地或基本上相同地组织。在一些实施方式中，心肌细胞是α-辅肌动蛋白阳性的。在一些实施方式中，心肌细胞是心脏肌钙蛋白阳性的。肌肉肌节的结构以及确定其的方法(比如，通过组织学和/或显微镜)是常见的，并且对本领域普通技术人员来说是显而易见的。

在一些实施方式中，心脏类器官包括至少一种成纤维细胞样细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞样细胞为成纤维细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞样细胞为心脏成纤维细胞样细胞。在一些实施方式中，心脏类器官包括心脏成纤维细胞样细胞。在一些实施方式中，心肌细胞层包括成纤维细胞样细胞。在一些实施方式中，腔室壁包括成纤维细胞样细胞。成纤维细胞样细胞表现出与其特定位置和功能相关的结构特征和抗原特征。成纤维细胞样细胞的非限制性实例包括但不限于肌成纤维细胞、外周神经鞘细胞、Ito细胞、内分泌成纤维细胞样细胞、肠道中的pericryptal和绒毛成纤维细胞、肌间神经丛(myentericplexus)中的成纤维细胞样细胞、淋巴器官树突状细胞和不同部位的成纤维细胞，包括肌腱、真皮和角膜。

在一些实施方式中，成纤维细胞样细胞是骨膜蛋白(POSTN)阳性细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞样细胞的特征在于POSTN表达。在一些实施方式中，成纤维细胞样细胞包含POSTN mRNA、其蛋白产物或两者。识别成纤维细胞样细胞的方法和进行识别的标志物是技术人员众所周知的。在一些实施方式中，阳性是蛋白质阳性。在一些实施方式中，阳性是mRNA阳性。在一些实施方式中，阳性是表达阳性。

在一些实施方式中，心脏类器官包括起搏器样细胞。在一些实施方式中，起搏器样细胞位于簇中。在一些实施方式中，心脏类器官包括起搏器样细胞簇。在一些实施方式中，起搏器样细胞是钾/钠超极化激活的环核苷酸门控通道4(HCN4)阳性。在一些实施方式中，起搏器样细胞簇为HCN4阳性。在一些实施方式中，起搏器样细胞是矮小同源盒2(SHOX2)阳性。在一些实施方式中，起搏器样细胞簇为SHOX2阳性。在一些实施方式中，起搏器样细胞是HCN4和SHOX2双阳性。在一些实施方式中，起搏器样细胞簇为HCN4和SHOX2双阳性。在一些实施方式中，起搏器样细胞簇包括：HCN4 mRNA、其蛋白产物或两者，SHOX2 mRNA、其蛋白产物或两者，或其任意组合。在一些实施方式中，起搏器样细胞是起搏细胞。

在一些实施方式中，成纤维样细胞与起搏器样细胞接触。在一些实施方式中，心肌细胞与起搏器样细胞接触。在一些实施方式中，与起搏器样细胞的接触位于心肌细胞层中。在一些实施方式中，腔室壁包括起搏器样细胞。

本文所述的确定因子或表达“阳性”的方法是常见的，并且对本领域普通技术人员来说是显而易见的。确定表达的方法的非限制性实例包括但不限于PCR、RT-PCR、定量RT-PCR、Northern印迹法、RNA原位杂交、点印迹法、蛋白质印迹法等。

在一些实施方式中，心脏类器官包括心外膜。在一些实施方式中，心外膜是外部心外膜。在一些实施方式中，外部心外膜是外壳。在一些实施方式中，腔室和腔室壁被心外膜包围。在一些实施方式中，心肌细胞层被心外膜包围。在一些实施方式中，心外膜包括对维尔姆斯氏肿瘤-1(WT1)阳性的细胞。在一些实施方式中，心外膜包括对T-盒转录因子18(TBX18)阳性的细胞。在一些实施方式中，心外膜包括对WT1和TXB18阳性的细胞。在一些实施方式中，心外膜细胞包括WT1 mRNA、其蛋白产物或两者，TBX18 mRNA、其蛋白产物或两者，或其任意组合。

在一些实施方式中，腔室壁包括心内膜样细胞。在一些实施方式中，腔室壁包括心内膜。在一些实施方式中，心内膜样细胞是血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)阳性。在一些实施方式中，心内膜包括对PECAM-1阳性的细胞。在一些实施方式中，心内膜是内部心内膜。在一些实施方式中，类器官包括内部心内膜。在一些实施方式中，类器官包括内部心内膜和外部心外膜。在一些实施方式中，腔室壁包括PECAM-1mRNA、其蛋白产物或两者。在一些实施方式中，类器官包括心内膜样细胞层。在一些实施方式中，腔室被心内膜样细胞层分层。在一些实施方式中，腔室的一部分被心内膜样细胞层分层。

在一些实施方式中，类器官包括高应激细胞环。在一些实施方式中，高应力细胞是高应力区域。在一些实施方式中，高应力由Lamanin A/C(LMNA)标记。在一些实施方式中，类器官包括Yes-相关蛋白1(YAP1)的梯度。在一些实施方式中，梯度围绕中心腔或腔室。

在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官能够搏动。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官的特征在于能够同步搏动。在一些实施方式中，心脏类器官同步搏动。在一些实施方式中，心脏类器官包括同步搏动的腔室。在一些实施方式中，类器官的至少两个腔室同步搏动。在一些实施方式中，类器官的所有腔室都同步搏动。在一些实施方式中，类器官产生多相搏动。在一些实施方式中，类器官包括多相搏动。在一些实施方式中，多相搏动是双相搏动。在一些实施方式中，类器官包括同步搏动的至少第一组的两个腔室和同步搏动的至少第二组的两个腔室。在一些实施方式中，第一组的两个腔室和第二组的两个腔室不同步。在一些实施方式中，第一组的两个腔室和第二组的两个腔室在不同时间搏动。在一些实施方式中，不同时间的搏动包括两组腔室的同步，使得当一个腔室搏动时，另一个腔室不搏动，并且反之亦然。在一些实施方式中，搏动是自发搏动。在一些实施方式中，同步搏动是指至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的本文所公开的心脏类器官的细胞或收缩细胞同时收缩。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，同步收缩是对刺激的反应。在一些实施方式中，细胞都对相同的刺激做出反应。

在一些实施方式中，同步搏动在培养中持续至少1、2、3、4、5周或更多周，或其间的任何值和范围。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，类器官能够在培养过程中同步搏动至少1、2、3、4、5周或更多周，或两者之间的任何数值和范围。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，同步搏动在培养中持续1-10周、2-12周、3-15周、4-10周、5-25周。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，同步搏动在培养中持续至少1周。

在一些实施方式中，搏动速率为至少每分钟20次搏动(bpm)、至少30bpm、至少35bpm、至少40bpm、至少45bpm、至少50bpm、至少55bpm、至少60bpm、至少65bpm、至少70bpm、至少75bpm、至少80bpm、至少85bpm、至少88bpm、至少90bpm或其间的任何值和范围。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，搏动速率为至少50bpm。在一些实施方式中，搏动速率为至少52bpm。在一些实施方式中，搏动速率为至少60bpm。在一些实施方式中，搏动速率为至少65bpm。在一些实施方式中，搏动为约66bpm。在一些实施方式中，搏动速率为至少88bpm。在一些实施方式中，搏动为约88bpm。在一些实施方式中，类器官与器官以相似的速率搏动。在一些实施方式中，类器官的搏动速率是未受刺激的搏动速率。可以理解的是，添加刺激剂或其他试剂可增加或降低搏动速率，但是标准/未处理的搏动速率将如所示。

在一些实施方式中，搏动在20和90bpm之间、30和90bpm之间、40和90bpm之间、50和90bpm之间、60和90bpm之间、55和90bpm之间、45和90bpm之间、20和88bpm之间、30和88bpm之间、40和88bpm之间、50和88bpm之间、60和88bpm之间、55和88bpm之间、45和88bpm之间、20和80bpm之间、30和80bpm之间、40和80bpm之间、50和80bpm之间、60和80bpm之间、55和80bpm之间、45和80bpm之间、35和90bpm之间、55和80bpm之间或55和75bpm之间。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，搏动在40和80bpm之间。在一些实施方式中，搏动在50和80bpm之间。在一些实施方式中，搏动在40和90bpm之间。在一些实施方式中，搏动在50和90bpm之间。在一些实施方式中，类器官通过增加搏动速率对刺激剂的处理做出反应。在一些实施方式中，类器官通过增加收缩幅度对刺激剂的处理做出反应。增加心率的刺激剂在本领域是众所周知的，并且可以使用任何这种刺激剂。在一些实施方式中，刺激剂是肾上腺素。在一些实施方式中，类器官通过降低搏动频率对钾通道阻滞剂做出反应。在一些实施方式中，类器官通过降低收缩幅度对钾通道阻滞剂做出反应。在一些实施方式中，类器官通过降低搏动速率对抗心律失常药物的治疗做出反应。在一些实施方式中，类器官通过降低收缩幅度对抗心律失常药物的治疗做出反应。降低心率的药物在本领域是众所周知的，并且可以使用任何这种药物。在一些实施方式中，降低心率和/或收缩幅度的药物是胺碘酮。

在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官包括包含图2A中提供的因子中的至少一种因子的表达增加的细胞。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官包括包含至少一种选自下列的因子的表达增加的细胞：肌钙蛋白T2(TNNT2)、肌钙蛋白I(TNNI3)、连接蛋白43(Cx43，又称GJA1)、肌球蛋白重链7(MYH7)、A-激酶锚定蛋白6(AKAP6)、间隙连接蛋白α5(GJA5)、亲联蛋白2(JPH2)、溶质运载家族8成员1(SLC8A1)、ATPase Ca++运输心肌慢抽搐2(ATP2A2，又称SERCA2)、钙通道电压依赖型L型α1C亚基(CACNA1C)、利阿诺定(Ryanodine)受体2(RYR2)、肌钙集蛋白2(CASQ2)、受磷蛋白(PLN，又称PLB)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II型β链(CAMK2B)、Triadin(TRDN)、微囊蛋白(CAV3)、Myc盒依赖性相互作用蛋白1(BIN1)、两性蛋白(AMP2，又称AMPH)、钠通道蛋白5型亚基α(SCN5A)、钾电压门控通道J亚家族成员2(KIR2.1，又称KCNJ2)、肌醇1,4,5-三磷酸受体3型(ITPR3)、钾/钠超极化激活的环核苷酸门控离子通道2(HCN2)、钠通道亚基β-1(SCN1B)、钾/钠超极化激活的环核苷酸门控离子通道1(HCN1)、钾内向整流通道J亚家族成员8(KCNJ8)、钾电压门控通道H亚家族成员2(KCNH2，又称hERG)、5'-AMP-激活的蛋白激酶催化亚基α-1(PRKAA1)、肉碱棕榈酰基转移酶I(CPT1A)、线粒体转录因子A(TFAM)、过氧化物酶体增殖激活受体γ辅助激活剂1-α(PPARGC1A)、无机焦磷酸酶1(PPA1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A调节亚基B(PPP2R4)、葡萄糖转运体4型(SLC2A4，又称GLUT4)、有丝分裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1，又称ERK2)、蛋白激酶A催化亚基α(PRKACA)、α-1A肾上腺素能受体(α1A，又称ADRA1A)、α-1B肾上腺素能受体(α1B，又称ADRA1B)、钠通道β亚基4(SCN4B)和钾电压门控通道E亚家族成员1(KCNE1)。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官的特征在于或包括选自下列的至少一种因子的表达增加：TNNT2、TNNI3、Cx43、MYH7、AKAP6、GJA5、JPH2、SLC8A1、ATP2A2、CACNA1C、RYR2、CASQ2、PLN、CAMK2B、TRDN、CAV3、BIN1、AMP2、SCN5A、KIR2.1、ITPR3、HCN2、SCN1B、HCN1、KCNJ8、KCNH2、PRKAA1、CPT1A、TFAM、PPARGC1A、PPA1、PPP2R4、SLC2A4、MAPK1、PRKACA、α1A、α1B、SCN4B和KCNE1。在一些实施方式中，增加是与离体心肌细胞相比。在一些实施方式中，增加是与心肌细胞培养物相比。在一些实施方式中，心肌细胞是与用于产生类器官相同的心肌细胞。在一些实施方式中，心肌细胞源自iPSC。在一些实施方式中，增加是与胎儿心脏组织相比。在一些实施方式中，与胎儿心肌相比，类器官包括与成人心肌更相似的基因表达。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官包括包含以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或全部的表达增加的细胞：TNNT2、TNNI3、Cx43、MYH7、AKAP6、GJA5、JPH2、SLC8A1、ATP2A2、CACNA1C、RYR2、CASQ2、PLN、CAMK2B、TRDN、CAV3、BIN1、AMP2、SCN5A、KIR2.1、ITPR3、HCN2、SCN1B、HCN1、KCNJ8、KCNH2、PRKAA1、CPT1A、TFAM、PPARGC1A、PPA1、PPP2R4、SLC2A4、MAPK1、PRKACA、α1A、α1B、SCN4B和KCNE1。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官的特征在于或包括以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或全部的表达增加：TNNT2、TNNI3、Cx43、MYH7、AKAP6、GJA5、JPH2、SLC8A1、ATP2A2、CACNA1C、RYR2、CASQ2、PLN、CAMK2B、TRDN、CAV3、BIN1、AMP2、SCN5A、KIR2.1、ITPR3、HCN2、SCN1B、HCN1、KCNJ8、KCNH2、PRKAA1、CPT1A、TFAM、PPARGC1A、PPA1、PPP2R4、SLC2A4、MAPK1、PRKACA、α1A、α1B、SCN4B和KCNE1。每种可能性表示本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，增加的表达是增加的mRNA表达。在一些实施方式中，增加的表达是增加的蛋白质表达。在一些实施方式中，增加的表达包括mRNA分子、蛋白质分子或两者或本文所公开的至少一种因子的增加的水平或量。在一些实施方式中，增加是至少：10、15、20、23、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、40或500％增加，或其间的任何值和范围。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，增加是10-1,000％、150-900％、200-990％、300-1,200％、500-975％或600-1,100％。每种可能性表示本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，心脏类器官对条件产生生理反应。在一些实施方式中，条件是诱导条件。在一些实施方式中，条件是生理条件或与生理条件平行。在一些实施方式中，条件是应用、施用或接触治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂是药物。在一些实施方式中，条件是应用、施用或接触化学品。在一些实施方式中，化学品是有害化学品。在一些实施方式中，化学品是毒素。在一些实施方式中，化学品是溶剂。在一些实施方式中，溶剂是有机溶剂。例如，可导致心脏疾病/紊乱或副作用的化学品的实例可参见，例如Kurppa等人，1984“Chemical exposures at work and cardiovascular morbidity”，Scand.J.WorkEnviron.Healthy 10:381-388，Assadi,2017,“Electrocardiographic changes andexposure to solvents”，J Arrhythm.,Dec 14；34(1):65-70和Tsutsumi,2015，“Prevention and management of work-related cardiovascular disorders”，Int JOccup Med Environ Health；28(1):4-7，在本文中通过引用以其整体并入。

在一些实施方式中，条件是缺氧。在一些实施方式中，条件是缺氧条件。缺氧是指细胞处于低氧状态。在一些实施方式中，缺氧包括氧气水平低于6、5、4、3、2.5、2、1.5、1、0.75、05、0.25或0.1％的氧气。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，缺氧包括2％或更少的氧气。在一些实施方式中，条件是循环条件。在一些实施方式中，条件是循环的应用。在一些实施方式中，循环是不规则或异常的循环。在一些实施方式中，不规则循环是低循环。在一些实施方式中，不规则循环是高循环。在一些实施方式中，高、低、规则和异常都是与健康心脏的循环相比。在一些实施方式中，低循环包括流过类器官的低液流和/或高循环包括流过类器官的高液流。在一些实施方式中，低循环是缺血状态。在一些实施方式中，条件是缺血状态。在一些实施方式中，低循环包括低营养物质。在一些实施方式中，营养物质是葡萄糖。在一些实施方式中，营养物质是氨基酸。在一些实施方式中，条件是暴露于代谢物。在一些实施方式中，条件是代谢物暴露的变化。在一些实施方式中，条件是代谢物排出。在一些实施方式中，代谢物是葡萄糖。在一些实施方式中，条件是暴露于激素。在一些实施方式中，条件是激素暴露的变化。在一些实施方式中，条件是激素排出。在一些实施方式中，条件是类器官细胞的基因突变。在一些实施方式中，条件模拟糖尿病、缺血、遗传病或任何其他病症、疾病或损伤。在一些实施方式中，心脏类器官对条件产生与心脏组织或心脏基本相同的生理反应。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官是模拟心脏的类器官。

在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官包括包含增加的氧化磷酸化的细胞。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官的特征在于或包括增加的氧化磷酸化。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官包括包含增加的基础呼吸的细胞。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官的特征在于或包括增加的基础呼吸。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官包括包含增加的线粒体最大容量的细胞。在一些实施方式中，本文所公开的心脏类器官的特征在于或包括增加的线粒体最大容量。在一些实施方式中，基础呼吸增加至少30％。在一些实施方式中，基础呼吸增加至少35％。在一些实施方式中，基础呼吸增加约35％。在一些实施方式中，氧化磷酸化增加至少80％。在一些实施方式中，氧化磷酸化增加至少85％。在一些实施方式中，氧化磷酸化增加约85％。在一些实施方式中，线粒体最大容量增加至少90％。在一些实施方式中，线粒体最大容量增加至少100％。在一些实施方式中，线粒体最大容量增加至少200％。在一些实施方式中，线粒体最大容量增加约2倍。在一些实施方式中，线粒体最大容量增加约100％。

在一些实施方式中，类器官进一步包括氧传感颗粒。在一些实施方式中，颗粒是珠子。在一些实施方式中，颗粒是合成的。在一些实施方式中，颗粒是非有机的。在一些实施方式中，颗粒嵌入类器官中。在一些实施方式中，类器官进一步包括传感器。在一些实施方式中，传感器是电化学传感器。在一些实施方式中，传感器是葡萄糖传感器。在一些实施方式中，传感器是乳酸传感器。在一些实施方式中，传感器是谷氨酰胺传感器。在一些实施方式中，传感器被配置为测量或感测葡萄糖、乳酸或谷氨酰胺中的至少一种。在一些实施方式中，类器官的特征是脂肪酸氧化是主要代谢途径。在一些实施方式中，类器官的特征在于亚秒级分辨率的间隙氧变化。

生产方法

根据另一方面，提供了一种生产心脏类器官的方法。

根据另一方面，提供了一种通过本发明的方法生产的心脏类器官。

在一些实施方式中，该方法包括共同培养心肌细胞和内皮细胞。在一些实施方式中，共同培养是共同培养心肌细胞和内皮细胞团体。在一些实施方式中，内皮细胞是微血管细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是心脏细胞。微血管心脏内皮细胞是商业上可获得的，或者可通过本领域已知的任何方法生产。在一些实施方式中，心肌细胞源自iPSC。在一些实施方式中，类器官是人体类器官，并且心肌细胞是人体细胞。在一些实施方式中，类器官是人体类器官，并且内皮细胞是人体细胞。在一些实施方式中，该方法进一步包括将iPSC分化成心肌细胞。在一些实施方式中，分化如下所述。可以理解的是，可以使用本领域已知的任何分化方法。

在一些实施方式中，心肌细胞和内皮细胞以约1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1的比共同培养。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，心肌细胞和内皮细胞以约2:1的比共同培养。在一些实施方式中，心肌细胞和内皮细胞以至少1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1或2.5:1的比共同培养。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，心肌细胞和内皮细胞以至少2:1的比共同培养。在一些实施方式中，心肌细胞和内皮细胞以1:1至3:1、1.1:1至3:1、1.2:1至3:1、1.3:1至3:1、1.4:1至3:1、1.5:1至3:1、1.6:1至3:1、1.7:1至3:1、1.8:1至3:1、1.9:1至3:1、2:1至3:1、1:1至2.9:1、1.1:1至2.9:1、1.2:1至2.9:1、1.2.9:1至2.9:1、1.4:1至2.9:1、1.5:1至2.9:1、1.6:1至2.9:1、1.7:1至2.9:1、1.8:1至2.9:1、1.9:1至2.9:1、2:1至2.9:1、1:1至2.8:1、1.1:1至2.8:1、1.2:1至2.8:1、1.3:1至2.8:1、1.4:1至2.8:1、1.5:1至2.8:1、1.6:1至2.8:1、1.7:1至2.8:1、1.8:1至2.8:1、1.9:1至2.8:1、2:1至2.8:1、1:1至2.7:1、1.1:1至2.7:1、1.2:1至2.7:1、1.3:1至2.7:1、1.4:1至2.7:1、1.5:1至2.7:1、1.6:1至2.7:1、1.7:1至2.7:1、1.8:1至2.7:1、1.9:1至2.7:1、2:1至2.7:1、1:1至2.6:1、1.1:1至2.6:1、1.2:1至2.6:1、1.3:1至2.6:1、1.4:1至2.6:1、1.5:1至2.6:1、1.6:1至2.6:1、1.7:1至2.6:1、1.8:1至2.6:1、1.9:1至2.6:1、2:1至2.6:1、1:1至2.5:1、1.1:1至2.5:1、1.2:1至2.5:1、1.3:1至2.5:1、1.4:1至2.5:1、1.5:1至2.5:1、1.6:1至2.5:1、1.7:1至2.5:1、1.8:1至2.5:1、1.9:1至2.5:1、2:1至2.5:1、1:1至2.4:1、1.1:1至2.4:1、1.2:1至2.4:1、1.3:1至2.4:1、1.4:1至2.4:1、1.5:1至2.4:1、1.6:1至2.4:1、1.7:1至2.4:1、1.8:1至2.4:1、1.9:1至2.4:1、2:1至2.4:1、1:1至2.3:1、1.1:1至2.3:1、1.2:1至2.3:1、1.3:1至2.3:1、1.4:1至2.3:1、1.5:1至2.3:1、1.6:1至2.3:1、1.7:1至2.3:1、1.8:1至2.3:1、1.9:1至2.3:1、2:1至2.3:1、1:1至2.2:1、1.1:1至2.2:1、1.2:1至2.2:1、1.3:1至2.2:1、1.4:1至2.2:1、1.5:1至2.2:1、1.6:1至2.2:1、1.7:1至2.2:1、1.8:1至2.2:1、1.9:1至2.2:1、2:1至2.2:1、1:1至2.1:1、1.1:1至2.1:1、1.2:1至2.1:1、1.3:1至2.1:1、1.4:1至2.1:1、1.5:1至2.1:1、1.6:1至2.1:1、1.7:1至2.1:1、1.8:1至2.1:1、1.9:1至2.1:1、2:1至2.1:1、1:1至2:1、1.1:1至2:1、1.2:1至2:1、1.3:1至2:1、1.4:1至2:1、1.5:1至2:1、1.6:1至2:1、1.7:1至2:1、1.8:1至2:1或1.9:1至2:1的比共同培养。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，心肌细胞和内皮细胞以1.5:1至2.5:1的比共同培养。在一些实施方式中，共同培养物是混合物。

在一些实施方式中，共同培养是在3D支架中进行的。在一些实施方式中，细胞培养在足以形成3D细胞结构的培养基中。在一些实施方式中，共同培养是在细胞培养基质中。在一些实施方式中，共同培养是在基底膜基质中。在一些实施方式中，基质是溶解的。在一些实施方式中，基质是基质胶(Matrigel)。在一些实施方式中，基质胶是生长因子减少的基质胶。在一些实施方式中，基质胶不含生长因子。在一些实施方式中，生长因子是补充生长因子。在一些实施方式中，细胞悬浮在基质/支架中。

在一些实施方式中，共同培养的细胞以每μl约6.8×10⁴个细胞的密度共同培养。在一些实施方式中，共同培养的细胞以每μl约1、2、3、4、4.5、5、5.5、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、8、9或10×10⁴个细胞的密度共同培养。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，共同培养的细胞以每μl约6.8×10⁴个细胞的密度接种。在一些实施方式中，共同培养的细胞以每μl至少1、2、3、4、4.5、5、5.5、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8×10⁴个细胞的密度共同培养。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中、共同培养的细胞以每μl至多6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100×10⁴个细胞的密度共同培养。每种可能性表示本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，共同培养物在微孔中。在一些实施方式中，将共同培养物转移到微孔中。在一些实施方式中，使共同培养物在微孔中扩增。在一些实施方式中，使共同培养物在微孔中形成类器官。在一些实施方式中，使共同培养物在微孔中聚结(coalesce)。在一些实施方式中，心肌细胞和内皮细胞的混合物在微孔中进行共同培养。在一些实施方式中，微孔的大小可使细胞按接种密度生长。在一些实施方式中，微孔的大小允许给定数量的细胞生长。在一些实施方式中，微孔包括约1mm的直径。在一些实施方式中，微孔包括约1.2mm的直径。在一些实施方式中，微孔包括约1.5mm的直径。在一些实施方式中，微孔包括在1-1.5mm之间的直径。技术人员可以理解，虽然1-1.5mm的微孔对于约1.1ul的基质胶中含有的7.48×10^4个细胞来说是足够大的尺寸，但可以通过按比例增加微孔的体积和支架/细胞的体积来扩大或缩小类器官的大小。

在一些实施方式中，共同培养是在几何限制的空间中进行的。在一些实施方式中，几何限制的空间是微孔。在一些实施方式中，在几何限制的空间中共同培养会在细胞中产生各向异性应力梯度。在一些实施方式中，共同培养在细胞中产生各向异性应力梯度。在一些实施方式中，在细胞中是在细胞团体中。在一些实施方式中，该方法包括在细胞中产生各向异性应力梯度。在一些实施方式中，各向异性应力梯度是通过在几何限制的空间中共同培养产生的。在一些实施方式中，空间限制细胞的生长。在一些实施方式中，限制细胞包括细胞生长到与空间壁接触。本领域技术人员可以理解，为了限制形成的类器官，培养孔/盘的大小必须根据加入的细胞数量校准。如果加入的细胞太少，培养物就不会被限制，并且因此会形成单个细胞团体，而因均匀应力不会形成多腔结构。细胞过多，并且类器官就不能如本文所述正常地组织结构。支架(例如，基质胶)中的细胞也是如此。孔的大小必须根据添加的支架体积进行校准。

在一些实施方式中，基质/支架中的细胞在培养基中培养。在一些实施方式中，培养基为培养物培养基。在一些实施方式中，培养基为组织培养基。在一些实施方式中，培养基是RPMI或等效培养基。在一些实施方式中，RPMI是RPMI-1640。组织培养基是众所周知的，并且技术人员也能理解哪些是等效的。在一些实施方式中，培养基是用于非粘附细胞的培养基。在一些实施方式中，培养基是非粘附细胞培养基。在一些实施方式中，培养基中补充有B27。在一些实施方式中，培养基中没有补充胰岛素。在一些实施方式中，培养基中补充有生长因子。在一些实施方式中，生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)。在一些实施方式中，VEGF是VEGF-A。在一些实施方式中，生长因子的浓度为约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8ng/ml。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，生长因子的浓度为至少0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5，ng/ml。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，生长因子的浓度为至多5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10ng/ml。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，生长因子的浓度为约5ng/ml。在一些实施方式中，生长因子的浓度在2.5-7.5ng/ml之间。在一些实施方式中，生长因子的浓度在3-7ng/ml之间。在一些实施方式中，生长因子的浓度在4-6ng/ml之间。在一些实施方式中，生长因子的浓度在4.25-5.75ng/ml之间。在一些实施方式中，生长因子的浓度在4.5-5.5ng/ml之间。

在一些实施方式中，培养细胞持续足以使其开始搏动的时间。在一些实施方式中，搏动是同步搏动。在一些实施方式中，搏动是自发搏动。在一些实施方式中，搏动是由本发明的类器官产生的搏动。在一些实施方式中，将细胞培养足以产生本发明的类器官的时间。在一些实施方式中，将细胞培养足以产生显示或包括本发明的类器官的至少一种特征的类器官的时间。本发明的类器官的特征如上文中所描述。在一些实施方式中，心脏类器官是本发明的心脏类器官。在一些实施方式中，方法是生产本发明的类器官的方法。

使用方法

根据另一方面，提供了测试治疗剂或化合物的方法，该方法包括将本发明的心脏类器官与治疗剂或化合物接触。

根据另一方面，提供了一种评估心脏细胞功能的方法，该方法包括将本发明的心脏类器官暴露于条件，从而评估心脏细胞功能。

在一些实施方式中，该方法为诊断方法。在一些实施方式中，该方法为体外方法。在一些实施方式中，该方法为离体方法。在一些实施方式中，该方法是非患者特异性方法。在一些实施方式中，该方法为培养方法。在一些实施方式中，该方法是确定疗效的方法。在一些实施方式中，该方法是确定副作用的方法。在一些实施方式中，该方法是确定剂量的方法。在一些实施方式中，剂量是治疗有效剂量。在一些实施方式中，接触是与治疗有效剂量接触。

在一些实施方式中，该方法进一步包括在接触或暴露后测试心脏类器官的生理输出。在一些实施方式中，该方法进一步包括在接触或暴露后测量心脏类器官的至少一个参数。在一些实施方式中，参数是输出。在一些实施方式中，参数是电-线粒体同步。在一些实施方式中，输出是机械输出。在一些实施方式中，输出是电输出。在一些实施方式中，输出是搏动速率。在一些实施方式中，输出是呼吸。在一些实施方式中，输出是氧化磷酸化。在一些实施方式中，输出是线粒体最大容量。在一些实施方式中，输出是收缩节律。在一些实施方式中，节律是窦性节律。在一些实施方式中，输出是基因表达。在一些实施方式中，输出是蛋白质表达。

在一些实施方式中，该方法进一步包括将生理输出与接触或暴露前测量的输出相比较。在一些实施方式中，测试包括比较。在一些实施方式中，增加表示试剂或化合物的有效性。在一些实施方式中，降低表示试剂或化合物的有效性。在一些实施方式中，增加表示试剂或化合物的副作用。在一些实施方式中，降低表示试剂或化合物的副作用。

在一些实施方式中，该方法包括在接触或暴露之前测试心脏类器官的生理输出。在一些实施方式中，该方法包括在接触后测试心脏类器官的生理输出。在一些实施方式中，该方法包括在接触前测试心脏类器官的生理输出，在接触后测试心脏类器官的生理输出，并比较两次测试结果。

在一些实施方式中，测试是或包括测试心脏的负面副作用。在一些实施方式中，副作用是负面副作用。在一些实施方式中，负面副作用是心脏负面副作用。在一些实施方式中，心脏负面副作用是电-线粒体失同步。在一些实施方式中，心脏负面副作用是心律失常。在一些实施方式中，心脏负面副作用包括心律失常。如本文所使用的，术语“心律失常”是指或包括任何异常或不规则的心跳速率或节律。在一些实施方式中，心律失常选自：额外搏动、室上性心动过速、室性心律失常或过缓心律失常。在一些实施方式中，额外搏动包括房性早搏、室性早搏和交界性早搏中的任一种。在一些实施方式中，室上性心动过速包括心房颤动、心房扑动和阵发性室上性心动过速中的任一种。在一些实施方式中，室性心律失常包括室颤和室性心动过速中的任一种。在一些实施方式中，缓慢性心律失常包括窦房结功能障碍诱发的缓慢性心律失常和房室传导障碍诱发的缓慢性心律失常中的任一种。在一些实施方式中，心律失常是治疗诱发的心律失常。在一些实施方式中，治疗药物是抗癌治疗药物。在一些实施方式中，抗癌疗法是癌症治疗。在一些实施方式中，心律失常是癌症治疗诱发的心律失常(CTIA)。在一些实施方式中，癌症治疗是多柔比星。在一些实施方式中，癌症治疗选自表1中提供的抗癌药物。

诱发心脏副作用的治疗剂或条件在本领域是众所周知的，并且受试者可以服用任何这种治疗剂或暴露于任何这种条件。在一些实施方式中，受试者正在服用诱发心脏副作用的治疗剂。在一些实施方式中，受试者暴露于诱发心脏副作用的环境。在一些实施方式中，测试是测试具有心脏副作用或已知会产生心脏副作用的试剂。在一些实施方式中，测试是测试已知会产生心脏副作用的条件。例如，具有心脏副作用的试剂的实例可参见，例如Mamoshina等人，2021“Toward a broader view of mechanisms of drugcardiotoxicity”，Cell Reports Medicine，3月16日；2(3):100216，在此通过引用以其整体并入。在一些实施方式中，治疗剂选自表1中提供的那些。在一些实施方式中，治疗剂是抗肿瘤剂。在一些实施方式中，抗肿瘤剂是抗癌剂。在一些实施方式中，治疗剂是抗炎剂。在一些实施方式中，治疗剂是中枢神经系统试剂。在一些实施方式中，治疗剂是胃肠道试剂。在一些实施方式中，治疗剂是泌尿生殖系统试剂。在一些实施方式中，治疗剂是抗过敏试剂。在一些实施方式中，治疗剂是抗感染试剂。在一些实施方式中，治疗剂是心血管试剂。这些具有心脏副作用的制剂的实例可参见表1。

表1：具有心脏副作用的治疗剂

在一些实施方式中，治疗药物选自5-氟尿嘧啶、三氧化二砷、贝伐单抗、硼替佐米、顺铂、阿糖胞苷、道诺霉素、达沙替尼、多西他赛、阿霉素、伊达比星、伊马替尼、伊匹单抗、拉帕替尼、尼洛替尼、纳武单抗、紫杉醇、罗米地普、索拉非尼、舒尼替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、长春碱、双氯芬酸、依托考昔、布洛芬、吲哚美辛、萘普生、罗非昔布、中枢神经系统试剂、苯氟雷司、布比卡因、对氯苯丁胺、氯氮平、可卡因、右芬氟拉明、麦角胺、氟苯丙胺、氟西汀、氟哌啶醇、左美沙丁乙酸盐、利多卡因、美西麦角、培高利特、苯丁胺、丙氧芬、舍吲哚、西布曲明、硫利达嗪、文拉法辛、齐拉西酮、西沙必利、洛哌丁胺、奥美拉唑、替加色罗、特罗地林、阿司咪唑、苯海拉明、特非那定、叠氮胸苷、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、格雷沙星、索非布韦、司帕沙星、喷他脒、丁咯地尔、多非利特、恩卡胺、利多氟嗪、咪拉地尔、奥西那林、普尼拉明、普罗布考、阿格列汀、氯丁替诺、罗格列酮和沙格列汀。在一些实施方式中，治疗剂与MCU相互作用。在一些实施方式中，与MCU的相互作用抑制MCU活性。在一些实施方式中，MCU活性是钙转运。在一些实施方式中、治疗剂与钙通道相互作用。在一些实施方式中，与MCU相互作用的治疗剂选自索拉非尼、舒尼替尼、凡德他尼、布比卡因、可卡因、氟西汀、氟哌啶醇、左美沙丁、丙氧芬、舍吲哚、硫利达嗪、文拉法辛、齐拉西酮、西沙必利、洛哌丁胺、特罗地林、阿司咪唑、苯海拉明、特非那定、阿奇霉素、米托蒽醌、克拉霉素、红霉素、格雷沙星、索非布韦、司帕沙星、喷他脒、丁咯地尔、多非利特、恩卡胺、利多氟嗪、咪拉地尔、奥西那林、普尼拉明、普罗布考和氯丁替诺。

在一些实施方式中，心脏副作用是电-线粒体失同步。在一些实施方式中，心脏副作用是心律失常。在一些实施方式中，心律失常是室性心律失常。在一些实施方式中，心律失常是室上性心律失常。在一些实施方式中，心律失常是遗传性心律失常。在一些实施方式中，心律失常是心动过缓。在一些实施方式中，心律失常是心动过速。在一些实施方式中，心律失常是瓣膜性心房颤动。在一些实施方式中，心脏副作用是局部缺血。在一些实施方式中，局部缺血是心肌局部缺血。在一些实施方式中，心脏副作用是心力衰竭。在一些实施方式中，心力衰竭是收缩性心力衰竭。在一些实施方式中，心脏副作用是QT间期延长。在一些实施方式中，心脏副作用是心动过速。在一些实施方式中，心动过速是室性心动过速。在一些实施方式中，心脏副作用是心动过缓。在一些实施方式中，心脏副作用是左心室功能障碍。在一些实施方式中，心脏副作用是心肌炎。在一些实施方式中，心肌炎是致命性心肌炎。在一些实施方式中，心脏副作用是心肌梗塞。在一些实施方式中，心脏副作用是长QT。在一些实施方式中，心脏副作用是左心射血分数。在一些实施方式中，心脏副作用为血栓形成事件。在一些实施方式中，心脏副作用是高血压。在一些实施方式中，心脏副作用是瓣膜性心脏病。在一些实施方式中，心脏副作用是心肌抑制。在一些实施方式中，心脏副作用是肺心病。在一些实施方式中，心脏副作用是心肌炎。在一些实施方式中，心脏副作用是心肌病。在一些实施方式中，心肌病是扩张型心肌病。在一些实施方式中，心脏副作用是左心室肥大。在一些实施方式中，心脏副作用是扭转型心动过速(TdP)。在一些实施方式中，心脏副作用是心源性猝死。在一些实施方式中，心脏副作用是心脏骤停。在一些实施方式中，心脏副作用是长QT综合征。在一些实施方式中，心脏副作用是心室颤动。在一些实施方式中，心脏副作用是心悸。

在一些实施方式中，治疗剂是药物。在一些实施方式中，治疗剂是小分子。在一些实施方式中，治疗剂是生物制剂。在一些实施方式中，治疗剂是心脏治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂是非心脏治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂是被怀疑会引起心脏副作用的治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂是全身施用的试剂。在一些实施方式中，治疗剂是配制成全身施用的试剂。在一些实施方式中，治疗剂是正在考虑用于全身施用的试剂。

在一些实施方式中，治疗剂是抗癌治疗剂。在一些实施方式中，抗癌剂是化疗剂。在一些实施方式中，化疗剂是米托蒽醌。在一些实施方式中，治疗剂适用于治疗、预防或改善心脏病或与之相关的病症或症状。在一些实施方式中，治疗剂是钙信号传导靶向剂。在一些实施方式中，钙信号传导靶向剂包括任何能够调节细胞中钙转运、调动、交换或其任意组合的化合物。在一些实施方式中，调节包括增加或增强。在一些实施方式中，调节包括减少或抑制。

在一些实施方式中，钙信号传导靶向剂减少线粒体膜的钙通量。在一些实施方式中，钙信号传导试剂降低线粒体膜的钙振荡频率。在一些实施方式中，钙信号传导试剂降低线粒体膜的钙通量、振荡、调动、转移或其任意组合的速率。在一些实施方式中，线粒体膜包括线粒体内膜、线粒体外膜或两者。

在一些实施方式中，抗癌剂是或包括钙信号传导靶向剂。在一些实施方式中，试剂包括或为钙通道阻滞剂。在一些实施方式中，抗癌剂诱导、刺激、增强、促进心律失常或其任意组合。在一些实施方式中，抗癌剂被怀疑会诱发CTIA。钙通道阻滞剂的类型对于一般技术熟练的医生来说是显而易见的。这种钙通道阻滞剂的非限制性实例包括但不限于氨氯地平(活络喜(Norvasc))、地尔硫卓(恬尔心(Cardizem)、Tiazac等)、非洛地平、依拉地平、尼卡地平、硝苯地平(利心平(Procardia))、尼索地平(Sular)和维拉帕米(Calan SR、Verelan)等。在一些实施方式中，增加线粒体钙包括增加线粒体活性。在一些实施方式中，线粒体活性包括氧化磷酸化。

在一些实施方式中，该方法进一步包括在接触前在心脏类器官中诱导心脏缺陷、病症或疾病，或其模拟病症。在一些实施方式中，诱导包括对类器官细胞的遗传修饰。在一些实施方式中，治疗剂被设计用于治疗所诱导的缺陷、病症或疾病或模拟病症。在一些实施方式中，该方法是测试治疗剂疗效的方法。技术人员可以理解，可以在类器官中诱导某种病症或疾病，以便测试旨在治疗该病症或疾病的试剂。在一些实施方式中，病症或疾病是或包括心律失常。在一些实施方式中，通过将类器官与米托蒽醌接触来诱导心律失常。

根据另一方面，提供了一种治疗受试者中的心律失常的方法。

根据另一方面，提供了一种治疗受试者中的疾病或紊乱的方法。

在一些实施方式中，疾病或紊乱的特征在于电-线粒体失同步。在一些实施方式中，疾病或紊乱的症状是由电-线粒体失同步引起的。正如下文首次描述的那样，线粒体功能和组织的电活动可能会不同步。这种不同步会导致细胞功能受损。众所周知，线粒体功能受损(例如，能量输出)会导致疾病和紊乱，并且已知离子水平对线粒体功能有影响，但迄今为止，人们还不知道进入细胞和线粒体的离子通量必须保持同步，以协调耗氧量和其他细胞功能，并维持细胞平衡。因此，即使线粒体的能量输出以及线粒体和组织中的电活动单独看起来都正常，但当二者不再同步时，正常生物功能也会受损。

在一些实施方式中，疾病选自：心律失常、心肌病、癫痫发作、癫痫、运动神经元痉挛、肌无力、肌肉萎缩、通道病、儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)、肌病伴锥体外系征(MPXPS)、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(AML)、遗传性痉挛性截瘫、缺血-再灌注损伤、缺血性心脏病、罕见线粒体脑肌病、矢状窦血栓形成、颅内窦血栓形成、斯托莫肯综合征、全身性癫痫伴发热性癫痫发作、视神经萎缩3、常染色体显性病、全身性癫痫伴发热性癫痫发作6型、掌跖角皮症、非表皮松解病和东方马脑炎。技术人员可以理解，以上列出的疾病/病症是特征在于电-线粒体失同步的疾病/病症的实例。然而，并非所有这些疾病/病症的病例都如此表征(即，在一些受试者中，疾病/病症的表现并不存在失同步组分)，并且因此技术人员需要确定在任何给定的受试者中是否存在失同步。在一些实施方式中，心律失常是癌症治疗诱发的心律失常(CTIA)。在一些实施方式中，癌症治疗是多柔比星。在一些实施方式中，癌症治疗选自表1中提供的抗癌剂。通道病在本领域中是众所周知的，并且在例如，Kim,2014,“Channelopathies”，Korean J.Pediatr.；57(1):1-18进行概述，在此通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方式中，该方法进一步包括确认电-线粒体失同步。在一些实施方式中，该方法进一步包括确认疾病或紊乱的特征在于电-线粒体失同步。在一些实施方式中，该方法进一步包括确认受试者的电-线粒体失同步。在一些实施方式中，该方法进一步包括确认疾病或紊乱在受试者中表现为电-线粒体失同步。技术人员可以理解的是，虽然许多疾病都可能具有电-线粒体性质的成分、症状或病因，但并不是每种疾病的表现都会有电-线粒体性质的成分、症状或病因。因此，该方法可包括确定患有该疾病的特定受试者是否存在电-线粒体失同步。在一些实施方式中，确认是在受试者体中。在一些实施方式中，确认是在受试者的组织中。在一些实施方式中，组织是电组织。电组织的实例包括但不限于神经元和心脏组织。在一些实施方式中，组织是心脏组织。在一些实施方式中，组织是神经元组织。在一些实施方式中，组织是神经元。在一些实施方式中，组织是中枢神经系统组织。在一些实施方式中，组织是大脑。在一些实施方式中，组织是外周神经系统组织。在一些实施方式中，组织是病变组织。在一些实施方式中，组织是疾病或紊乱的组织。在一些实施方式中，组织来自受试者。在一些实施方式中，组织源自受试者的细胞。在一些实施方式中，源自包括扩增自。在一些实施方式中，源自包括分化自。在一些实施方式中，组织是活组织切片。在一些实施方式中，组织是与药物或试剂接触的组织。在一些实施方式中，受试者正在接受药物或试剂。在一些实施方式中，该方法进一步包括选择患有疾病或紊乱的受试者。在一些实施方式中，该方法进一步包括确定受试者的疾病或紊乱的症状是由电-线粒体失同步引起的。

在一些实施方式中，失同步是线粒体功能和电活动的失同步。在一些实施方式中，电活动是线粒体中的电活动。在一些实施方式中，电活动是组织中的电活动。在一些实施方式中，组织是包括线粒体的组织。任何同时确定电活动和线粒体功能的方法都可用于评估同步性。在一些实施方式中，确认/确定电-线粒体失同步的方法是在体外的。在一些实施方式中，确认/确定电-线粒体失同步的方法是在体内的。在一些实施方式中，确认/确定电-线粒体失同步的方法是离体的。在一些实施方式中，确认/确定电-线粒体失同步的方法是本发明的方法。在一些实施方式中，确认/确定电-线粒体失同步的方法是下文所述的方法。在一些实施方式中，确认/确定电-线粒体失同步的方法包括评估本发明的系统中的组织。在一些实施方式中，确认/确定电-线粒体失同步的方法包括使用本发明的系统测量电-线粒体失同步。在一些实施方式中，确认/确定包括测量线粒体活性。在一些实施方式中，线粒体活性包括耗氧量。在一些实施方式中，线粒体活性包括线粒体钙水平。在一些实施方式中，确认/确定包括测量组织中的场电位和组织中的收缩。在一些实施方式中，确认/确定包括测量组织中的场电位和组织中的耗氧量。在一些实施方式中，确认/确定包括测量组织中的场电位和组织中的钙水平。在一些实施方式中，确认/确定包括测量组织中的耗氧量和组织中的收缩。在一些实施方式中，确认/确定包括测量组织中的钙水平和组织中的收缩。在一些实施方式中，确认/确定包括测量组织中的场电位、组织中的耗氧量和组织中的收缩。在一些实施方式中，确认/确定包括测量组织中的场电位、组织中的钙水平和组织中的收缩。在一些实施方式中，确认/确定电-线粒体失同步的方法包括使用本发明的系统测量组织中的耗氧量和组织中的钙水平。在一些实施方式中，确认/确定电-线粒体失同步的方法包括使用本发明的系统测量组织中的收缩和组织中的耗氧量。在一些实施方式中，测量是同时测量。

除了本文提供的确认/确定电-线粒体失同步的方法之外，本领域已知的其他方法也可用于此目的。例如，可以使用典型的且众所周知的测量电输出的方法。这些方法包括EKG、EMG、EEG、ECG和EOG。仅从这些测量中就可以看到失同步，并且将表现为晚电位、R波减弱、R/R比增大和其他异常。也可使用另外的方法，比如在Saminathan等人2021，“A DNA-based voltmeter for organelles”，Nature Nanotechnology,16,96-103中描述的那些，在此通过引用以其整体并入本文。也可使用氧或钙的功能性染色、高分辨率显微镜或体内钙测量来评估组织中的线粒体功能。具体而言，线粒体钙水平可通过线粒体钙选择性染料(比如Rhod-2AM)评估或通过NMR/IR扫描跟踪。一般来说，测量体内线粒体钙的方法可参见，例如Pozzan和Rudolf，2009年，“Measurement of mitochondrial calciumin vivo”，Biochim Biophys Acta.，11月；1787(11):1317-23，以及Serrat等人，2022年，“Imagingmitochondrial calcium dynamics in the central nervous system”，J.NeuroscienceMethods，第373卷，5月；209560，在本文中通过引用以其整体并入。通过比如原卟啉IX-三重态寿命技术、NMR或其他光学方法测量耗氧量以及通过比如EEG/EMG/ECG测量电活动的同步测量方法是已知的，并且可参见例如，Campbell和Marcinek,2017，“Evaluation of invivo mitochondrial bioenergetics in skeletal muscle using NMR and opticalmethods”，Biochim Biophys Acta,Apr；1862(4):716-724，通过引用以其整体并入本文。线粒体基因的遗传筛选和钙通道突变的发现可指示失同步。类似地，使用具有已知失同步作用的药物，比如产生心律失常(CTIA)的癌症治疗药物，是特征在于失同步的病症的另一种指示。

在一些实施方式中，确认/确定包括确定从受试者获得的样品中的线粒体钙浓度。在一些实施方式中，确定是测量。在一些实施方式中，样品是液体样品。在一些实施方式中，样品包括细胞。在一些实施方式中，细胞是心脏细胞。在一些实施方式中，细胞是疾病细胞。在一些实施方式中，样品是无细胞样品。在一些实施方式中，液体是体液。在一些实施方式中，体液选自血液、血清、血浆、肿瘤液、胃液、肠液、唾液、胆汁、肿瘤液、母乳、尿液、间质液、脑脊液和粪便。在一些实施方式中，液体是血液。在一些实施方式中，血液是外周血。在一些实施方式中，钙浓度超过预定阈值指示失同步。在一些实施方式中，预定阈值是未患有电-线粒体失同步的受试者中的钙浓度。在一些实施方式中，预定阈值是健康受试者中的钙浓度。在一些实施方式中，预定阈值是患有疾病或紊乱但不是特征在于电-线粒体失同步的受试者中的钙浓度。

在一些实施方式中，超出是高于。在一些实施方式中，超出是低于。技术人员可以理解，如果阈值是允许的最大值，则超出阈值将高于阈值，其中如果阈值是允许的最小值，超出阈值将低于阈值。在一些实施方式中，超出阈值是显著超出。在一些实施方式中，显著是统计意义上显著的。在一些实施方式中，超出是指至少超出阈值5、10、15、20、25、30、35、40、45或50％。每种可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，超出是超出至少10％。在一些实施方式中，超出是超出至少30％。

在一些实施方式中，确认/确定包括观察受试者中的心律失常或药物性心律失常症状。在一些实施方式中，症状是心律失常。在一些实施方式中，症状对抗心律失常治疗无反应。在一些实施方式中，症状的存在表明心律失常。在一些实施方式中，抗心律失常治疗通过膜通道靶向电活动。在一些实施方式中，膜通道不是钙通道。在一些实施方式中，膜通道不是钙通道，而是非二氢吡啶钙通道。在一些实施方式中，钙通道是非线粒体钙通道。在一些实施方式中，钙通道是线粒体钙通道。技术人员可以理解，如果钙通道阻滞剂无效，则需要按照本文提供的方法激活钙通道。在一些实施方式中，抗心律失常治疗是钠通道阻滞剂。钠通道阻滞剂可阻止钠进入细胞，并且因此可减缓心肌中的电脉冲。钠通道阻滞剂的实例包括但不限于：丙吡胺、氟卡尼、美西律、丙胺苯丙酮和奎尼丁。在一些实施方式中，抗心律失常治疗是β阻滞剂。β阻滞剂通常通过阻断激素比如肾上腺素来减慢心率。β阻滞剂的实例包括但不限于：醋丁洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔和普萘洛尔。在一些实施方式中，抗心律失常治疗是钾通道阻滞剂。钾通道阻滞剂阻止钾进入细胞，并且因此减缓心脏的电脉冲。钾通道阻滞剂的实例包括但不限于：胺碘酮、溴苄胺、多非利特、决奈达隆、依布利特和索他洛尔。在一些实施方式中，抗心律失常治疗是非二氢吡啶钙通道阻滞剂。非二氢吡啶钙通道阻滞剂阻止钙进入心脏细胞，其可降低心率和收缩。非二氢吡啶钙通道阻滞剂的实例包括但不限于地尔硫卓和维拉帕米。在一些实施方式中，抗心律失常治疗药物是腺苷。腺苷阻断/减缓房室结的电脉冲。在一些实施方式中，抗心律失常治疗药物是地高辛。地高辛减缓心率并增强心脏收缩能力。

在一些实施方式中，确认/确定包括执行选自EKG、EEG和EMG的电测试。在一些实施方式中，确认/确定包括执行心电图(EKG或ECG)。在一些实施方式中，确认/确定包括执行脑电图(EEG)。在一些实施方式中，确认/确定包括执行肌电图(EMG)。在一些实施方式中，确认/确定包括执行眼电图(EOG)。在一些实施方式中，异常电读数表明失同步。在一些实施方式中，异常读数是与来自健康受试者的读数进行比较。在一些实施方式中，异常读数是与来自患有疾病或紊乱的受试者的读数相比较的，该疾病或紊乱不是特征在于电-线粒体同步。在一些实施方式中，异常读数包括晚电位。在一些实施方式中，异常读数包括R波减弱。在一些实施方式中，异常读数包括R/R比增加。

在一些实施方式中，确认/确定包括确认暴露于已知会产生电-线粒体失同步的试剂。在一些实施方式中，试剂是药物。在一些实施方式中，试剂是化学品。在一些实施方式中，试剂是农用化学品。在一些实施方式中，化学品是溶剂。在一些实施方式中，化学品是农药。在一些实施方式中，试剂选自表1中提供的那些。在一些实施方式中，化学试剂选自甲苯、三氯乙烷、二甲苯、庚烷、己烷、乙醚、三氯乙烯和三氯三氟乙烷。试剂的其他实例包括但不限于一氧化碳、二硫化碳、杀虫剂、甲烷衍生的卤代烃、咖啡因、双酚A、有机硝酸盐、砷、镉、钴、有机溶剂和金属。

根据另一方面，提供了一种治疗受试者细胞增殖相关疾病的方法。

根据另一方面，提供了一种治疗受试者的疾病的方法，包括施用第一试剂和第二试剂，其中该疾病可由第一试剂治疗。

根据另一方面，提供了一种治疗受试者细胞增殖相关疾病的方法，包括施用第一试剂和第二试剂。

在一些实施方式中，第一试剂产生心脏副作用。在一些实施方式中，副作用是有害的副作用。在一些实施方式中，第一试剂被怀疑产生或可能产生心脏副作用。在一些实施方式中，疾病是癌症，并且第一试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方式中，疾病是炎症性疾病，第一试剂是抗炎试剂。在一些实施方式中，疾病是中枢神经系统(CNS)疾病，并且第一试剂为CNS试剂。在一些实施方式中，CNS疾病为脑部疾病。在一些实施方式中，CNS疾病为神经元疾病。在一些实施方式中，疾病为胃肠道疾病，并且第一试剂为胃肠试剂。在一些实施方式中，疾病为生殖器或泌尿系统疾病，并且第一试剂为泌尿生殖器试剂。在一些实施方式中，疾病为过敏反应，并且第一试剂为抗过敏试剂。在一些实施方式中，疾病为感染，并且第一试剂为抗感染试剂。在一些实施方式中，抗感染试剂为抗生素。在一些实施方式中，抗感染试剂为抗病毒剂。在一些实施方式中，抗感染试剂为疫苗。在一些实施方式中，疾病为心血管疾病，并且第一试剂为心血管试剂。在一些实施方式中，第一试剂选自表1中提供的试剂。

炎症性疾病的实例包括但不限于自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、炎症性肠道综合征(IBS)、炎症性肠病(IBD)、结肠炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、痛风、肌炎、硬皮病、狼疮、斯耶格伦氏(Sjogren's)综合征和血管炎等。CNS疾病的实例包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、肌肉萎缩症、麻痹、癫痫、多发性硬化症(MS)、神经纤维瘤病和坐骨神经痛等。胃肠道疾病的实例包括但不限于IBS、IBD、胃酸倒流、腰痛、痔疮、肠癌、结肠息肉和憩室疾病等。生殖器或泌尿系统疾病的实例包括但不限于尿路感染、睾丸癌、肾功能衰竭、子宫内膜消融术、勃起功能障碍、尿失禁、肾结石、前列腺癌、镰状细胞肾病和酵母菌感染等。过敏反应的实例包括但不限于食物过敏、哮喘、环境过敏和药物过敏等。感染的实例包括但不限于细菌感染、病毒感染和寄生虫感染。心血管疾病的实例包括但不限于心脏病发作、中风、心力衰竭、心律失常和心悸等。

在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的调节线粒体钙浓度的试剂。在一些实施方式中，治疗包括向受试者施用治疗有效量的调节线粒体钙浓度的试剂。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的调节线粒体钙通道活性的试剂。在一些实施方式中，治疗包括向受试者施用治疗有效量的调节线粒体钙通道活性的试剂。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的调节线粒体钙单向转运体(MCU)活性的试剂。在一些实施方式中，治疗包括向受试者施用治疗有效量的调节MCU活性的试剂。在一些实施方式中，线粒体钙通道是MCU。在一些实施方式中，线粒体钙通道是电压依赖性阴离子通道(VDAC)。在一些实施方式中，线粒体钙通道不是非二氢吡啶钙通道。线粒体钙通道的实例包括但不限于MCU和VDAC。其他线粒体钙通道的实例包括渗透性摄取模式(RaM)、雷诺索碱受体(mRyR或RyR1)、线粒体快速交换器(mHCX)、DAG激活的+转换孔(mPTP)、Na+/Ca²⁺交换器(mNCX)和H+/Ca²阳离子通道(DCC)，这些都在本领域是众所周知的。其他实例可参见Malli等人，2014，“Mitochondrial Ca2+channels:great unknowns withimportant functions”，FEBS Lett.May 17；584(10):1942-1947，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方式中，增加是在组织中。在一些实施方式中，组织是受试者的组织。在一些实施方式中，增加是在心脏组织中。在一些实施方式中，心脏组织是受试者的心脏组织。在一些实施方式中，调节是调节线粒体活性。在一些实施方式中，调节是组织中的活性。

在一些实施方式中，调节MCU活性包括抑制药物与MCU的相互作用。在一些实施方式中，相互作用是结合。在一些实施方式中，药物抑制MCU活性。在一些实施方式中，药物激活MCU活性。在一些实施方式中，药物与MCU的相互作用抑制或激活MCU的活性。在一些实施方式中，试剂抑制或诱导药物与MCU的相互作用。在一些实施方式中，抑制是阻断。在一些实施方式中，诱导是触发。在一些实施方式中，药剂与MCU竞争与药物结合。在一些实施方式中，试剂是与药物结合的肽。在一些实施方式中，药剂是与药物结合的小分子。在一些实施方式中，与MCU相互作用的试剂选自索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、凡德他尼(Vandetanib)、布比卡因、可卡因、氟西汀、氟哌啶醇、左美沙丁、丙氧芬、舍吲哚、硫利达嗪、文拉法辛、齐拉西酮、西沙必利、洛哌丁胺、特罗地林、阿司咪唑、苯海拉明、特非那定、阿奇霉素、米托蒽醌、克拉霉素、红霉素、格雷沙星、索非布韦、司帕沙星、喷他脒、丁咯地尔、多非利特、恩卡胺、利多氟嗪、咪拉地尔、奥西那林、普尼拉明、普罗布考和氯丁替诺。在一些实施方式中，试剂的施用治疗心律失常。在一些实施方式中，试剂是第二试剂。

在一些实施方式中，调节包括施用选自下列的试剂：二甲双胍、山奈酚、精胺、A-769662、AICAR、IND 1316、PF 06409577、ZLN 024、Erastin、厚朴酚、依折麦布、双硫仑、Efsevin和亚精胺。在一些实施方式中，调节包括施用选自下列的试剂：二甲双胍，精胺，A-769662、AICAR、IND 1316、PF 06409577、ZLN 024和亚精胺。在一些实施方式中，试剂是二甲双胍。在一些实施方式中，试剂选自二甲双胍、亚精胺和精胺。

在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的能够调节受试者的心脏组织中的线粒体钙浓度的试剂，从而治疗特征在于电-线粒体失同步的心脏疾病或紊乱。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的能够调节受试者的神经元组织中的线粒体钙浓度的试剂，从而治疗特征在于电-线粒体失同步的神经疾病或紊乱。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的能够调节受试者的心脏组织中的线粒体钙浓度的试剂，从而治疗心律失常。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的能够调节受试者的心脏组织中的线粒体钙通道活性的试剂，从而治疗特征在于电-线粒体失同步的心脏疾病或紊乱。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的能够调节受试者的神经元组织中的线粒体钙通道活性的试剂，从而治疗特征在于电-线粒体失同步的神经疾病或紊乱。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的能够调节受试者的心脏组织中的线粒体钙通道活性的试剂，从而治疗心律失常。在一些实施方式中，试剂是第二试剂。

在一些实施方式中，调节是增加。在一些实施方式中，调节是减少。在一些实施方式中，增加是增加到预定阈值以上。在一些实施方式中，减少是减少到预定阈值以下。在一些实施方式中，增加是产生统计意义上的显著增加。在一些实施方式中，减少就是产生统计意义上的显著减少。在一些实施方式中，预定阈值是健康受试者的水平或活性。在一些实施方式中，失同步包括线粒体钙浓度降低，并且调节是增加。在一些实施方式中，失同步包括线粒体钙通道活性降低，并且调节是增加。在一些实施方式中，减少是显著减少。在一些实施方式中，减少是与健康对照相比。在一些实施方式中，减少是与患有疾病但不是特征在于失同步的受试者相比。在一些实施方式中，失同步包括线粒体钙浓度增加，并且调节是减少。在一些实施方式中，失同步包括线粒体钙通道活性增加，并且调节是减少。在一些实施方式中，增加是显著增加。在一些实施方式中，增加是与健康对照相比。在一些实施方式中，增加是与患有疾病但不是特征在于失同步的受试者相比。

在一些实施方式中，失同步包括增加的线粒体钙浓度或增加的线粒体钙通道活性，并且疾病或紊乱选自：线粒体脑肌病、矢状窦血栓形成、颅内窦血栓形成、斯托莫肯综合征、全身性癫痫伴发热性癫痫发作、视神经萎缩3、常染色体显性病、全身性癫痫伴发热性癫痫发作6型、掌跖角皮症、非表皮松解病、东方马脑炎和CTIA。在一些实施方式中，CTIA是多柔比星诱导的心律失常。在一些实施方式中，失同步包括降低的线粒体钙浓度或增加的线粒体钙通道活性，并且疾病或紊乱选自：心律失常、心肌病、癫痫发作、癫痫、运动神经元痉挛、肌无力、肌肉萎缩、通道病、CPVT、MPXPS、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、AML、遗传性痉挛性截瘫、缺血-再灌注损伤、缺血性心脏病、罕见病和CTIA。

在一些实施方式中，疾病或紊乱为遗传性疾病或紊乱。在一些实施方式中，遗传性疾病或紊乱诱导心律失常和/或心脏功能障碍。这种遗传性疾病的实例包括但不限于：CPTV和MPXPS。在一些实施方式中，疾病或紊乱是CPVT，并且调节包括施用选自精胺、亚精胺、二甲双胍、Erastin、A-769662、AICAR、IND 1316、PF 06409577和ZLN 024的试剂。在一些实施方式中，遗传性紊乱或疾病诱导神经节律紊乱。这种遗传性疾病的实例包括但不限于：罕见线粒体脑肌病、矢状窦血栓形成、颅内窦血栓形成、斯托莫肯综合征、全身性癫痫伴发热性癫痫发作、视神经萎缩3、常染色体显性病、全身性癫痫伴发热性癫痫发作6型、掌跖角皮症、非表皮松解病和东方马脑炎。

在一些实施方式中，疾病或紊乱是疾病或紊乱的症状。在一些实施方式中，疾病或紊乱是心脏疾病或紊乱。在一些实施方式中，心脏疾病或紊乱选自心律失常和心肌病。在一些实施方式中，疾病或紊乱是心律失常。在一些实施方式中，疾病或紊乱是神经系统疾病或紊乱。在一些实施方式中，疾病或紊乱是神经元疾病或紊乱。在一些实施方式中，神经系统是中枢神经系统(CNS)。在一些实施方式中，神经系统是外周神经系统(PNS)。在一些实施方式中，神经系统是CNS、PNS或二者。在一些实施方式中，CNS疾病或紊乱选自癫痫发作和癫痫。在一些实施方式中，癫痫发作选自中枢性和外周性癫痫发作。在一些实施方式中，PNS疾病或紊乱选自癫痫发作、运动神经元痉挛、肌无力和肌肉萎缩。在一些实施方式中，疾病或紊乱是药物诱发的疾病或紊乱。在一些实施方式中，疾病或紊乱是药物诱发的症状或副作用。在一些实施方式中，药物是抗癌药物。

在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的能够增加Ca²⁺信号传导的试剂。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的线粒体钙通道激活剂。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的MCU激活剂。如本文所使用的，术语“MCU激活剂”包括任何能够直接或间接调节MCU以控制或改变线粒体Ca²⁺摄取的化合物。在一些实施方式中，MCU激活剂增加线粒体基质中Ca²⁺的浓度或有效浓度。在一些实施方式中，MCU激活剂改变线粒体基质与线粒体膜间隙之间的Ca²⁺振荡的频率或速率。在一些实施方式中，能够增加Ca²⁺信号传导的试剂是二甲双胍。在一些实施方式中，MCU激活剂是或包括二甲双胍。

在一些实施方式中，细胞增殖相关疾病包括癌症。在一些实施方式中，细胞增殖相关疾病是癌症。如本文所使用的，术语“癌症”是指任何特征在于细胞异常生长的疾病。在一些实施方式中，癌症的进一步特征是除了异常细胞生长的起源部位外，癌症还有可能或有能力侵入身体的其他部位。在一些实施方式中，癌症选自乳腺癌、宫颈癌、宫颈内膜癌、结肠癌、淋巴瘤、食管癌、脑癌、头颈部癌、肾癌、脑膜癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、朗格汉斯细胞癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、肾癌、脑瘤、脑膜癌、脑胶质瘤、脑胶质母细胞瘤、朗格汉斯细胞癌、肺癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、神经内分泌癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、腱鞘癌、舌癌、甲状腺癌、子宫癌和睾丸癌。在一些实施方式中，癌症是肺癌。在一些实施方式中，癌症是实体癌。在一些实施方式中，癌症是血癌。在一些实施方式中，癌症是肿瘤。

在一些实施方式中，该方法包括施用抗癌剂。在一些实施方式中，抗癌剂是化疗剂。在一些实施方式中，抗癌剂是钙信号传导靶向剂。在一些实施方式中，抗癌剂是钙通道阻滞剂。在一些实施方式中，抗癌剂诱导CTIA。在一些实施方式中，抗癌剂导致CTIA。在一些实施方式中，抗癌剂是第一试剂。

在一些实施方式中，受试者是需要本发明的方法的受试者。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是人类。在一些实施方式中，受试者患有增殖相关疾病。在一些实施方式中，受试者患有心律失常。在一些实施方式中，受试者有发展为癌症的风险。在一些实施方式中，受试者被怀疑患有癌症。在一些实施方式中，受试者具有癌症遗传倾向。在一些实施方式中，受试者患有癌症。在一些实施方式中，受试者正在接受癌症治疗。在一些实施方式中，癌症治疗包括化疗。在一些实施方式中，受试者患有CTIA。

在一些实施方式中，受试者未患有代谢紊乱或与之相关的任何疾病或病症。在一些实施方式中，代谢紊乱或与之相关的任何疾病或病症是糖尿病、高血糖或两者。在一些实施方式中，受试者未患有糖尿病或与代谢综合征相关的任何疾病。在一些实施方式中，受试者没有用二甲双胍治疗，以治疗代谢综合征或与之相关的任何疾病或病症，比如，但不限于糖尿病。在一些实施方式中，受试者未患有可使用二甲双胍治疗的疾病或病症。在一些实施方式中，受试者未患有可通过增加线粒体钙浓度来治疗的疾病或病症。在一些实施方式中，受试者未患有可通过提高MCU活性来治疗的疾病或病症。在一些实施方式中，受试者未患有可用MCU激活剂治疗的疾病或病症。

在一些实施方式中，该方法进一步包括选择适合治疗的受试者。在一些实施方式中，治疗是通过本发明的方法进行治疗。在一些实施方式中，该方法进一步包括选择适合用二甲双胍治疗的受试者。在一些实施方式中，该方法进一步包括选择适合用选自下列的试剂治疗的受试者：二甲双胍、山奈酚、精胺、A-769662、AICAR、IND 1316、PF 06409577、ZLN024、Erastin、厚朴酚、依折麦布、双硫仑、Efsevin和亚精胺。在一些实施方式中，选择包括排除患有代谢综合征或与之相关的任何疾病或病症(比如糖尿病)或处于发展这些疾病的风险增加的受试者。

另一方面提供了一种选择适合用试剂治疗的受试者的方法，该试剂能够：

a.调节受试者组织中的线粒体钙浓度；

b.调节组织中的线粒体钙通道活性；或

c.其组合；

该方法包括确定受试者中电-线粒体失同步的存在，其中所述失同步的存在指示受试者适合被治疗。

在一些实施方式中，受试者患有疾病或紊乱。在一些实施方式中，疾病或紊乱是已知可能包括电-线粒体失同步或特征在于电-线粒体失同步的疾病或紊乱。在一些实施方式中，组织是病变组织。在一些实施方式中，组织是疾病或紊乱的组织。在一些实施方式中，组织是受试者中疾病或紊乱的组织。

阵列和系统

现在参考图8A，该图是现有技术感测系统和根据本发明某些实施方式的系统的图解。现有技术系统10可以包括照射源110，该照射源配置为以第一波长发光，例如，以532nm波长发光的LED激光器。系统10可进一步包括PMT传感器140，其配置为检测指示由嵌入组织或细胞聚集体5中的微粒以第二波长(例如，605nm)发射的信号。在一些实施方式中，微粒包括可被辅因子淬灭的可激发分子。在一些实施方式中，控制器(未图解)配置为基于第一信号和第二信号，例如，组织或细胞聚集体5中的氧水平，计算组织或细胞聚集体的时间性辅因子消耗。在一些实施方式中，辅因子是氧气。

根据本发明的一些实施方式，系统100可包括被配置为以第一波长发射光(光子束115)的照射源110，例如，以532nm发射光的LED激光器、第一PMT传感器120和控制器130。在一些实施方式中，第一PMT传感器120可配置为检测从组织或细胞聚集体5反射的第一波长的光子。在一些实施方式中，系统100可进一步包括第二PMT传感器140，其配置为检测指示由嵌入组织或细胞聚集体5中的微粒以第二波长发射的信号。在一些实施方式中，系统100可包括光学元件125，其配置为将反射的光子引导至第一PMT传感器120，并将发射的光子引导至第二PMT传感器140。

控制器130可配置为控制照射源110以第一波长发射光，并接收来自第一PMT传感器120和第二PMT传感器140的信号。控制器130可以是能够控制照射源110并接收来自PMT传感器120和140的信号的任何合适的计算设备。控制器130可以包括处理单元(例如，CPU)、存储器和任何输入/输出设备(一个或多个)。控制器130可配置为执行根据本发明的一些实施方式的方法，例如，图8E的方法。

参考图8E，该图是根据本发明的一些实施方式的测量组织或细胞聚集体特性的方法的流程图。在步骤810中，可以用具有第一波长的光子束照射嵌入组织或细胞聚集体5中的微粒。例如，控制器130可控制照射源110(例如，图8A中所图解的LED激光器)发射波长为532nm的光子束。

在步骤820，可以由第一传感器(例如，第一PMT传感器120)检测指示从微粒以第一波长反射的光子的第一信号。例如，如图8A中所图解，控制器130可从第一PMT传感器120接收指示从嵌入组织或细胞聚集体5中的微粒以605nm波长发射的第一信号155。

在步骤830，可以由第二传感器(例如，第二cPMT传感器140)检测指示从微粒以第二波长发射的第二信号，其中所述微粒包括可被辅因子淬灭的可激发分子。例如，波长为605nm的光子可从组织或细胞聚集体5中的微粒反射，并由第二PMT传感器140和控制器130检测到。

在步骤840，测量所述第一信号的频率与所述光子束的频率之间的偏移，并基于所测量到的偏移确定背景噪声，从所述第二信号减少背景噪声。例如，第二信号160可用于减少信号噪声，以产生干净平滑的信号150。在一些实施方式中，原始信号可以是信号155，并且信号150是过滤后的信号。在一些实施方式中，过滤可包括测量第二信号160的频率与第一信号155的频率之间的偏移；基于测量的偏移确定背景噪声；以及从第二信号减少背景噪声以接收过滤的信号160。

在步骤850，可以基于所述背景噪声减少的第二信号计算所述组织或细胞聚集体的时间性辅因子消耗量。在一些实施方式中，时间性辅因子消耗量可以是组织或细胞聚集体5中的氧水平。

在一些实施方式中，可检测所述第一信号的强度的时间变化。在一些实施方式中，可基于所述检测到的变化计算所述微粒的相对位移。在一些实施方式中，检测到的信号强度变化与微粒的相对位移成正比，例如，当显微镜镜头的焦点因位移而远离组织或细胞聚集体5中的微粒时，可以通过测量x-y台(例如，机械台)、保持系统100的移动(例如，以微米计)来测量焦点的距离。为了将镜头重新聚焦在微粒上，移动x-y台，并测量移动的长度。例如，信号160中两个连续最大值之间的距离与相对位移成比例。在一些实施方式中，位移是在垂直于光子束115的轴线上测量的。在一些实施方式中，位移是类器官的收缩。在一些实施方式中，位移是类器官的搏动。技术人员可以理解，位移可以衡量收缩的任何指标，包括但不限于收缩频率和收缩幅度。

在一些实施方式中，该方法可进一步包括从微电极阵列(未图解)感测组织或细胞聚集体的场电位(如图3G中的实例所图解)，用于在检测第一信号的同时测量组织或细胞聚集体的电活动。在一些实施方式中，该方法可进一步包括比较第一信号、第二信号和组织的场电位的频率。图3F(当位移指示心跳时)、图3G(当电活动指示心脏的电活动时)和图3H(当氧水平指示呼吸时)图解了组织模拟心脏搏动时进行这种比较的非限制性实例。在一些实施方式中，如果频率之间的比较产生低于阈值的偏差，则该比较指示健康组织或细胞聚集体，例如健康的心脏。

另一方面提供了一种包括照射源、第一光电倍增管(PMT)传感器和控制器的系统。

在一些实施方式中，控制器配置为控制照射源用光子束照射嵌入组织或细胞聚集体中的微粒。在一些实施方式中，光子束具有第一波长。在一些实施方式中，控制器配置为控制照射源用光子束照射组织或细胞聚集体。在一些实施方式中，控制器配置为检测指示从微粒反射的光子的第一信号。在一些实施方式中，通过第一PMT传感器检测第一信号。在一些实施方式中，第一信号处于第一波长。在一些实施方式中，从微粒反射的光子处于第一波长。在一些实施方式中，控制器配置为检测第一信号的强度变化。在一些实施方式中，控制器配置为计算微粒的位移。在一些实施方式中，位移是相对位移。在一些实施方式中，计算基于检测到的变化。在一些实施方式中，检测到的第一信号的强度变化指示微粒的相对位移。在一些实施方式中，位移是在垂直于光子束的轴线上测量的。在一些实施方式中，位移是组织或细胞聚集体移动的量度。在一些实施方式中，移动是收缩。

在一些实施方式中，系统是感测系统。在一些实施方式中，感测是感测组织或细胞聚集体中的参数。在一些实施方式中，系统包括用于组织或细胞聚集体的容器。在一些实施方式中，细胞聚集体是类器官。在一些实施方式中，类器官是心脏类器官。在一些实施方式中，类器官是大脑类器官。在一些实施方式中，类器官是本发明的心脏类器官。制备大脑类器官的方法在本领域中是众所周知的，并且任何这种方法都可用于生产要感测的类器官。

在一些实施方式中，系统进一步包括第二PMT传感器。在一些实施方式中，控制器配置为检测第二信号。在一些实施方式中，通过第二PMT传感器检测第二信号。在一些实施方式中，第二信号指示由嵌入组织或细胞聚集体中的微粒发射。在一些实施方式中，第二信号处于第二波长。在一些实施方式中，第二波长与第一波长不同。在一些实施方式中，第一信号和第二信号相差足够大而不会重叠。在一些实施方式中，第一信号和第二信号处于不同的带通。在一些实施方式中，第一信号包括约532nm的波长。在一些实施方式中，光子束包括约532nm的波长。在一些实施方式中，光子束和第一信号包括相同的波长。在一些实施方式中，第二信号包括约605nm的波长。在一些实施方式中，微粒包括可被辅因子淬灭的可激发分子或部分。在一些实施方式中，控制器配置为计算细胞聚集体的组织中的时间性辅因子消耗量。在一些实施方式中，计算基于第二信号。在一些实施方式中，计算基于第二信号和第一信号。

在一些实施方式中，辅因子是生物化合物。在一些实施方式中，化合物在组织或细胞聚集体中产生。在一些实施方式中，辅因子是氧气(O₂)。在一些实施方式中，可激发分子或部分可被光子束激发。在一些实施方式中，在激发后可激发分子或部分以第二波长发射。在一些实施方式中，可激发分子或部分是磷光的。在一些实施方式中，微粒是氧传感器。可淬灭并发出可检测信号的氧传感器在本领域是众所周知的，并且任何这种传感器均可使用。在一些实施方式中，可淬灭传感器包括氧气可淬灭的发光染料。这种染料在本领域是众所周知的。在一些实施方式中，可淬灭传感器包括钌。此类的实例可参见McEvoy等人，1996，“Dissolved oxygen sensor based on fluorescence quenching of oxygen-sensitiveruthenium complexes immobilized in sol-gel-derived porous silica coatings”，doi.org/10.1039/AN9962100785、Wang等人，2014，“Optical methods for sensing andimaging oxygen:materials,spectroscopies and applications”，hem.Soc.Rev.,2014,43,3666-3761和Achatz等人，2010，“Luminescent Sensing of Oxygen Using aQuenchable Probe and Upconverting Nanoparticles”，Angew Chem Int EdEngl.2011Jan 3；50(1):260-3，在本文中通过引用以其整体并入。在一些实施方式中，时间性辅因子消耗量是组织或细胞聚集体中的辅因子水平。在一些实施方式中，时间性辅因子消耗量与组织或细胞聚集体中的辅因子水平成比例。

在一些实施方式中，控制器配置为过滤第二信号。在一些实施方式中，过滤使用光子束参数。在一些实施方式中，过滤使用第一信号。在一些实施方式中，过滤使用光子束与第一信号之间的差值。在一些实施方式中，差值是光子束与第一信号之间的偏移。在一些实施方式中，偏移是频率的偏移。在一些实施方式中，偏移是波长的偏移。在一些实施方式中，过滤包括测量第一信号的频率与光子束的频率之间的偏移。在一些实施方式中，过滤包括测量第一信号的波长与光子束的波长之间的偏移。在一些实施方式中，过滤包括基于测量到的偏移确定背景。在一些实施方式中，背景是背景噪声。在一些实施方式中，过滤包括从第二信号减少背景。在一些实施方式中，过滤包括从第二信号过滤背景。在一些实施方式中，过滤包括清洁第二信号。

在一些实施方式中，控制器进一步配置为感测组织或细胞聚集体的场电位。在一些实施方式中，场电位来自微电极阵列。在一些实施方式中，阵列在组织或细胞聚集体中。在一些实施方式中，阵列在容纳组织或细胞聚集体的容器中。在一些实施方式中，微电极用于测量组织或细胞聚集体中的电活动。在一些实施方式中，组织或细胞聚集体中是组织或细胞聚集体的。在一些实施方式中，感测场电位与检测第一信号同时进行。在一些实施方式中，感测场电位与检测第二信号同时进行。在一些实施方式中，感测场电位与检测第一信号和第二信号同时进行。在一些实施方式中，控制器配置为比较第一信号和第二信号的频率。在一些实施方式中，控制器配置为比较第一信号和场电位的频率。在一些实施方式中，控制器配置为比较第二信号和场电位的频率。在一些实施方式中，如果频率之间的比较产生低于预定阈值的偏差，则低偏差指示健康组织或细胞聚集体。在一些实施方式中，如果频率之间的比较产生高于预定阈值的偏差，则高偏差指示患有疾病或紊乱的组织或细胞聚集体。在一些实施方式中，疾病或紊乱包括电-线粒体失同步。在一些实施方式中，高偏差指示电-线粒体失同步。

另一方面提供了本发明的系统在组织或细胞集合体中进行测量的用途。

另一方面提供了一种评估细胞功能的方法，该方法包括：

a.将组织、类器官或细胞聚集体置于本发明的系统中；

b.施加条件至组织、类器官或细胞聚集体；和

c.测量组织、类器官或细胞聚集体中的至少辅因子消耗量；

从而评估细胞功能。

在一些实施方式中，该方法包括将组织或细胞聚集体置于系统中。在一些实施方式中，组织或细胞聚集体为类器官。在一些实施方式中，类器官为心脏类器官。在一些实施方式中，心脏类器官能够搏动。在一些实施方式中，心脏类器官是多腔的。在一些实施方式中，心脏类器官为本发明的心脏类器官。

在一些实施方式中，测量包括测量辅因子消耗量、位移和电场电位。在一些实施方式中，在施加条件后位移、辅因子消耗量和电场电位中的至少一个的显著偏差指示电-线粒体失同步。在一些实施方式中，在施加条件后位移、辅因子消耗量和电场电位中至少两项的显著偏差指示电-线粒体失同步。在一些实施方式中，在施加条件后位移、辅因子消耗量和电场电位的全部的显著偏差指示电-线粒体失同步。在一些实施方式中，偏差是与对照的偏差。在一些实施方式中，对照是在施加条件前的位移、辅因子消耗量和/或电场电位。在一些实施方式中，对照是对照组织、类器官或细胞聚集体中的位移、辅因子消耗量和/或电场。在一些实施方式中，对照是健康对照。在一些实施方式中，对照组是未经处理的对照。在一些实施方式中，对照是不具有电-线粒体失同步的对照。

另一方面提供了测试治疗剂的心脏副作用的方法，该方法包括将心脏类器官置于系统中并添加治疗剂，从而测试治疗剂的心脏副作用。

另一方面提供了测试心血管试剂的方法，该方法包括将心脏类器官置于系统中和添加心血管试剂，从而测试心血管试剂。

在一些实施方式中，试剂不是心血管药物。在一些实施方式中，试剂是心血管药物。在一些实施方式中，心血管药物是心脏病药物。在一些实施方式中，该方法进一步包括测量所述心脏类器官中的位移、辅因子消耗量和电场电位中的至少一项。在一些实施方式中，测量位移、辅因子消耗量和电场电位中的至少两项。在一些实施方式中，测量所有的位移、辅因子消耗量和电场电位。在一些实施方式中，位移是心脏类器官的收缩。在一些实施方式中，辅因子消耗量是心脏类器官中的代谢。在一些实施方式中，辅因子是氧气。在一些实施方式中，代谢是呼吸。在一些实施方式中，代谢包括线粒体功能。在一些实施方式中，场电位是场电位持续时间。在一些实施方式中，场电位是场电位振幅。在一些实施方式中，场电位是自发场电位。在一些实施方式中，场电位包括类器官中的电活动。

在一些实施方式中，位移、辅因子消耗量和电场电位中的任何一项的偏差都指示心脏副作用。在一些实施方式中，偏差是位移、辅因子消耗量和电场电位之间的失衡。在一些实施方式中，偏差是其他条件无法弥补的变化。可以理解的是，治疗剂可以等比例地增加位移、消耗和电位。这并不构成偏差，因为所有测量值仍然成比例，只是增加了而已。因此，偏差是三种测量值之间的失衡。在一些实施方式中，位移、辅因子消耗量和电场电位中任何一项的偏差都指示药剂的作用。在一些实施方式中，偏差是显著偏差。在一些实施方式中，显著是统计意义上显著的。在一些实施方式中，显著是指高于预定阈值的偏差。在一些实施方式中，偏差是施药后与施药前的偏差。在一些实施方式中，偏差是施药后与未施药的对照相比的偏差。在一些实施方式中，对照是未经处理的对照。在一些实施方式中，偏差在位移、辅因子消耗量和电场电位中的任两项中。在一些实施方式中，偏差在位移、辅因子消耗量和电场电位的全部中。可以理解的是，位移、辅因子消耗量和电场电位中任一项的变化都指示药物对心脏类器官产生了影响，并且因此也会对受试者的心脏产生影响。在一些实施方式中，偏差是位移、辅因子消耗量和电场电位之间的失衡。在一些实施方式中，偏差是收缩与线粒体功能之间的失衡。在一些实施方式中，失衡指示心律失常。在一些实施方式中，失衡指示对收缩节律的治疗作用。

一般描述

在整篇申请中，本发明的各种实施方式可以以范围格式呈现。应当理解的是，以范围格式进行描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被理解为对本发明的范围的僵化限制。因此，对范围的描述应被视为已具体公开了该范围内所有可能的子范围以及单个数值。例如，描述范围，比如1到6，应视为已具体公开了子范围，比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围有多大，这都适用。

在讨论中，除非另有说明，否则修饰本发明的实施方式的一个或多个特征的条件或关系特性的形容词比如“基本上”和“约”等，应理解为该条件或特性被定义为在旨在使本申请的实施方式的操作所能接受的容差范围内。除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中的“或”被认为是包容性的“或”，而不是排他性的“或”，并表示其连接的项目中的至少一项或任何组合。

在本申请的说明书和权利要求书中，动词“包括(comprise)”、“包括(include)”和“具有(have)”及其缀合词用于表示动词的宾语(一个或多个)不一定是动词的主语(一个或多个)的组成部分、要素或部件的完整列表。

本文中使用的其他术语应通过其在本领域中众所周知的含义来定义。

在提供数值范围时，除非上下文另有明确规定，否则应理解为在该范围的上限和下限之间的每个间隔值(单位为下限的十分之一)以及规定范围内的任何其他规定值或间隔值均包括在本发明中。这些更小的范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围内，并且也包括在本发明内，受所述范围中任何明确排除的限值的限制。当规定范围包括其中一个或两个限值时，排除其中一个或两个限值的范围也包括在本发明中。

如本文所使用的，术语“约(about)”在与数值结合时指参考值加减10％。例如，约1,000纳米(nm)的长度是指1,000nm±100nm的长度。

需要注意的是，除非上下文另有明确规定，否则本文及所附权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指代。因此，例如，提及“多核苷酸(polynucleotide)”包括多个这样的多核苷酸，并且提及“多肽(polypeptide)”包括本领域技术人员已知的一个或多个多肽及其等价物，等等。需要进一步指出的是，权利要求的起草可以排除任何任选的要素。因此，本声明旨在作为与权利要求要素的叙述结合或使用“否定(negative)”限制时使用排他性术语比如“仅(solely)”、“唯一(only)”等先行依据。

在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定的情况下，一般来说，这种解释是在本领域技术人员能够理解该约定的意义上进行的(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、A和B一起具有、A和C一起具有、B和C一起具有和/或A、B和C一起具有等的系统)。本领域技术人员还可以进一步理解，无论是在说明书、权利要求书或附图中，几乎任何呈现两个或更多个可选术语的非连接词和/或短语，都应理解为包括其中一个术语、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”应理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

可以理解的是，为了清楚起见，在单独实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。反之，为简明起见，在单个实施方式中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。与本发明有关的实施方式的所有组合都具体包括在本发明中并在本文中公开，就如同每个组合都是单独且明确地公开。此外，本发明还具体包括各种实施方式及其要素的所有子组合并在本文中公开，就如同每个这样的子组合在本文中单独和明确地公开。

在研究以下实施例后，本发明的其他目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见，实施例无意限制本发明。此外，如上文所描绘和权利要求部分所要求保护的本发明的各个实施方式和方面中的每一个均可在以下实施例中找到实验支持。

如上文所描绘和权利要求部分所要求保护的本发明的各个实施方式和方面均可在以下实施例中找到实验支持。

实施例

一般来说，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和DNA重组技术。这些技术在文献中有详尽的解释。例如，参见“MolecularCloning:Alaboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols inMolecular Biology”，第I-III卷，Ausubel,R.M.编(1994)；Ausubel等人，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley和Sons，Baltimore,Maryland(1989)；Perbal，“APractical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons，纽约(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，纽约；Birren等人(编)，“Genome Analysis：ALaboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，纽约(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中阐述的方法；“Cell Biology:ALaboratory Handbook”，第I-III卷，Cellis,J.E.编(1994)；“Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique”，Freshney,Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第三版；“Current Protocols in Immunology”，第I-III卷，Coligan J.E.编(1994)；Stites等人(编)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编)，“Strategies for ProteinPurification and Characterization-ALaboratory Course Manual”，CSHL Press(1996)；其全部通过引用并入。本文还提供了其他一般参考文献。

材料和方法

细胞培养

将人体诱导多能干细胞系：UN-1、ACS-1021和ACS-1028在mTeSR-1培养基(StemCell Technologies，加拿大)中的生长因子减少的基质胶(BD Biosciences，SanJose，CA)上培养，每天更换培养基。获得细胞并使用PCR测试支原体污染。使用补充有0.5mMEDTA(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)的0.5X TrypLE Enzyme(Thermo FisherScientific，Waltham，MA，美国)对细胞进行连续传代。

将HEK 293T细胞(ATCC，美国)以4×10^6个细胞/板的密度接种于10cm细胞培养板中。细胞维持在293T培养基中，该培养基由补充有10％ FBS(BI，以色列)的DMEM高葡萄糖(4.5g/l；Merck，美国)、1x NEAA(BI，以色列)和2mM L-丙氨酸-L-谷氨酰胺(BI，以色列)组成。

按照生产商的说明，使用内皮细胞生长培养基-2MV(Lonza，瑞士)在涂有明胶的烧瓶上培养大鼠原代心脏微血管内皮细胞(CEC；Vec Technologies，美国)。

所有细胞均在37℃下，5％ CO₂的潮湿培养箱中的标准条件下培养。

有限元分析

使用2018的多物理(Multiphysics)静态结构模型创建有限元模型。在几种条件下进行了数值模拟和研究：低附着板表面的自由心脏质量、嵌入软基质的同质几何限制心脏质量以及嵌入软基质并由刚性微血管结构图案化的异质几何限制心脏质量。初始质量模拟为直径500μm的球体，组织参数定义为泊松比0.4、密度1.06g/ml和各向同性弹簧常数1Pa/m²。在心肌细胞的1.25kPa和成人组织的10-20kPa之间选择4kPa的生理杨氏模量。在其下表面施加1Pa/m²的各向同性弹簧基础，模拟玻璃板底部。

使用直径为1.5mm的硅胶井(由800kPa的杨氏模量、0.45的泊松比、0.965g/ml的密度和1Pa/m²的各向同性弹簧常数限定)和由1kPa的杨氏模量、0.5的泊松比、1.03g/ml的密度、1Pa/m²的各向同性弹簧常数限定的周围基质模拟限制。微血管结构是在由0.4的泊松比，1.03g/ml的密度和1Pa/m²的各向同性弹簧常数限定的30μm直径的微血管样结构上通过随机图案模拟的。在估算的毛细血管的10kPa和动脉的300kPa之间选择生理杨氏模量为50kPa。使用350μN的各向同性收缩施加静态载荷模型，导致与测量曲率相拟合的高斯位移，产生5-15μm的径向位移(图7B)。网格使用的最小和最大元素尺寸分别为150和165μm。

人iPSC的心脏分化

将人诱导多能干细胞(hiPSC)接种在mTeSR-1培养基中的基质胶上，并使其达到80-90％的汇合度。按照之前的描述进行心脏分化。简而言之，使用名为CDM3的基础培养基(RPMI-1640、500μg/mL重组人血清白蛋白、213μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸和1％青霉素/链霉素)。在分化第0天，将培养基更换为补充有6μmol/L CHIR99021(Stemgent)的CDM3，持续两天。在分化第二天，将培养基换成补充有2μM Wnt-C59(Selleckchem)的CDM3培养基，再持续两天。从第四天开始，将细胞用补充有不含胰岛素的B27的RPMI培养(Gibco，美国)。

生成GFP报告的CEC

在最小CMV启动子上游编码GFP报告子的质粒购自System Biosciences，并在内部进行了验证。质粒以细菌LB-琼脂刺针获得，并按照供应商的说明使用。简而言之，首先将每种刺针接种到10cm板中的琼脂LB(Bacto Agar；BD，美国)中。然后，将单个菌落接种到含有LB(BD Difco LB Broth，Lennox；BD，美国)和100μg/ml青霉素(BI，以色列)的烧瓶中。根据制造商的说明，使用ZymoPURE II质粒大量提取试剂盒(Plasmid Maxiprep Kit)(ZymoResearch，美国)从每个烧瓶中分离转染级质粒DNA。

按照供应商的说明，使用TransIT-LT1转染试剂(Mirus Bio，美国)用表达GFP的质粒和包装质粒转染HEK 293T细胞。简而言之，将6.65μg GFP慢病毒载体质粒、3.3μg pVSV-G和5μg psPAX2与45μl TransIT-LT1混合在Opti-MEM减少的血清培养基(Gibco，美国)中，保持在室温下至复合，并且然后添加到每个平板。在温育18小时后，将转染培养基更换为293T培养基，并在48小时和96小时后收获富含病毒的上清液。上清液通过离心(500x g，5min)澄清并过滤(0.45μm，Millex-HV，MerckMillipore)。包装质粒是以色列耶路撒冷HUJI的Nissim Benvenisti实验室的友好礼物。

类器官培养

将hiPS衍生的心肌细胞和微血管心脏内皮细胞(VEC Technologies，美国)计数并以每μl6.8×10⁴个细胞的细胞密度以2:1的比例混合在生长因子减少的基质胶(BDBiosciences，加州圣何塞)中。将体积1.1μl的凝胶包埋混合物(7.48×10^4个细胞)注入每个微孔中，并让其在补充有B27减胰岛素(minus insulin)和5ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF-A，Peprotech)的RPMI-1640中自发形成，直到6-10天后重新获得自发搏动。

心脏类器官的免疫染色

用4％多聚甲醛(PFA)在冰上固定心脏类器官1小时，并用含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Sigma-Aldrich，美国)清洗3次。将样品在室温下与100mM甘氨酸一起温育1小时，并用DPBS清洗30分钟。用DPBS中的0.5％ Triton X-100在4℃下过夜进行透化。阻断缓冲液由50ml蒸馏水中的3.8g NaCl、0.94g NaHPO₄、0.2g NaH₂PO₄、5克牛血清白蛋白馏分V(MP Biomedicals，美国)、0.5％ Triton X-100和0.25ml Tween-20组成。将样品在4℃下在阻断缓冲液中温育48小时，清洗并在4℃下用在阻断缓冲液中稀释的一抗温育48小时。在加入在阻断缓冲液稀释的二抗之前，将样品在室温下清洗24小时，并在4℃下温育48小时。用浓度为1:1,000的Hoechst 33258(Sigma-Aldrich，美国)对细胞核进行反染。在显微镜检查前将样品清洗24小时。共聚焦显微镜检查在LSM-700蔡司显微镜上进行。

抗体

兔抗-cTNT Abcam：ab45932浓度1:100；小鼠抗-α-辅肌动蛋白thermofisher：A7811浓度1:100；兔抗-MLC2v Abcam：ab79935浓度1:100；兔抗-WT1 Abcam：ab89901浓度1:100；大鼠抗-HCN4 Abcam：ab32675浓度1:100；小鼠抗-SHOX2 Abcam：ab55740浓度1:100；兔抗-心脏肌钙蛋白I Abcam：ab52862浓度1:100；兔抗-骨膜蛋白Abcam：ab215199浓度1:100；小鼠抗-CD31 Abcam：ab215199浓度1:100；兔抗-TBX18 Abcam：ab115262浓度1:100；驴抗-兔Alexa Fluor 594Jackson ImmunoResearch：711-585-152浓度1:100；驴抗-小鼠AlexaFluor 488Jackson ImmunoResearch：715-546-150浓度1:100；驴抗-大鼠Alexa Fluor647Jackson ImmunoResearch：712-605-150浓度1:100；和驴抗-小鼠Alexa Fluor647Abcam：ab150111浓度1:100。

RNA序列分析

成人和胎儿人体心肌细胞的RNA-序列数据连同相关元数据从GSEA系列GSE126573下载。根据制造商的说明，使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen，美国)从细胞培养物中提取RNA。文库制备和RNA测序由希伯来大学基因组技术中心(Hebrew University Center forGenomic Technologies)完成。简而言之，文库构建是使用Illumina TruSeq RNALibraryPrep V2 Kit(Illumina，美国)进行的，并使用High Output V2 Kit在IlluminaNextSeq500上以单端86bp读数进行测序。测序读数使用Bowtie2映射到UCSC人体转录组(基因组构建hg19)。使用RSEM对所有基因的表达水平进行量化，得出推断基因数量的表达矩阵。使用R软件包DESeq2(使用默认参数)进行差异表达分析。报告的是来自负二项Wald测试的p值。

视觉收缩分析

使用LSM-700蔡司显微镜以适当的放大倍率进行快速相位对比成像(每秒17帧)。使用定制的代码分析延时显微照片。简而言之，在心脏组织边界上选择多个感兴趣的区域(ROI)，产生代表心脏收缩变化的独特(distinct)区域。测量ROI强度随时间的动态变化，并使用快速傅立叶变换(FFT)转换为搏动速率。基于频率振幅大小计算收缩能力。

光学允许受限制的微电极阵列(MEA)的制作

制作过程在耶路撒冷希伯来大学Hervey M.Krueger家族纳米科学和纳米技术中心的100级洁净室环境中进行。使用CleWin和(SolidWorks，美国)进行微电极阵列和一次性PDMS微孔插入物的设计。通过异丙醇、食人鱼溶液(硫酸、水和过氧化氢的混合物)和去离子水依次清洗标准商品化75×50×1mm显微载玻片使用直接激光写入法(LE405-A)在双正色调光刻胶(AZ1505和LOR 5b)中蚀刻电极图案，然后在AZ 726MIF中显影2分钟。使用薄膜沉积系统真空镀膜机(VST)用10nm钛层和150nm金溅射图案。然后在100％ AR级丙酮中进行2分钟剥离(lift-off)工艺形成电极。使用激光切割法制造PDMS微孔插入件。简而言之，使用电动涂膜器(Erichsen)将PDMS(DowCorning)薄片浇铸到0.7mm高，并在70℃下固化1小时。使用355nm脉冲Nd-YAG激光器(3D-Micromac)将微孔切割成直径1.5mm，并且中心到中心距离3mm。用70％(体积/体积)乙醇(EtOH)清洗PDMS插入物，氮气烘干，并且然后使用氧等离子激活法将其共价结合到干净的0.5mm厚的玻璃盖玻片(Schott)或干净的光学允许的微电极阵列。

心脏微生理平台的三维打印

使用进行微电极连接器和外壳的设计。使用Connex33D打印机根据设计的图案沉积和在2％氢氧化钠和4％偏硅酸钠溶液中过夜清洗来自支撑材料的三维打印部件。打印出的部件装上连接器，并组装成微流变平台，并用金属连接器组装。使用前，将整个平台在70％乙醇中清洁过夜，并在UV下灭菌3小时。

电生理学记录

MEA的设计和印刷连接实现了经由兼容的传感器电路间歇性地接入平台内的45个不同电极(图9A-9B)。使用集成信号调理电路记录来自心脏类器官的自发心脏场电位(FP)，该电路具有2极可调高通滤波器、3极可调低通滤波器、可调增益和医用仪器放大器，以远程提取、放大和过滤受限制的孔内的类器官的胞外场电位。定制设计电路与充当集成控制系统的模数转换器(ADC)的Arduino MEGA微控制器连接。在每个微孔中以100Hz的采样率测量自发心脏场电位。使用定制的软件对不断变化的动力学数据进行傅立叶变换(FFT)，实时计算场电位节律频率(图9C-9D)。

实时氧气和收缩速率测量

实时氧气测量基于之前描述的要素进行。简而言之，磷光钌微探针(CPOx-50-RuP)显示磷光衰减时间随氧浓度的变化而减少，允许测量氧气含量。受控正弦调制的532nm LED信号激发嵌入式氧传感器，并在605nm处发射正弦调幅光，由于氧气淬火，该光的相位发生了偏移。在经过发射硬件滤波的第一检测器(PMT)和第二激发检测器(cPMT)之间测量相移。2-PMT系统允许将测量分辨率提高40倍，并实时测量组织收缩(图8)。使用53.5千赫兹和31.3千赫兹双频相位调制过滤背景干扰。测量以10Hz采样率进行。使用定制的软件对不断变化的动力学数据进行傅立叶变换(FFT)，实时计算收缩速率和氧节律频率。使用定制的MATLAB代码，我们基于来自氧气珠的峰-峰电压测量到的发射强度和使用第二PMT系统测量到的位移，直接从我们的氧气读取器计算心脏类器官的收缩速率。心脏位移是在收缩期间通过嵌入心脏类器官内的氧气珠测量的。当珠子移动到离焦点不同的距离时，峰-峰电压会发生变化，导致检测到收缩行为。通过相同的代码，使用快速傅立叶变换(FFT)将这些数据转换为频率数据。

线粒体膜电位分析(MMP)

根据制造商的说明(Invitrogen，美国)，使用JC-1和TMRE染料估算线粒体膜电位(MMP/Δψm)。在37℃下在补充有B27-I的RPMI中用2μM JC-1或2nM TMRE染料装载细胞，持续30分钟，用PBS清洗，并在5％ CO₂和37℃下使用温育的LSM-700蔡司显微镜在补充有B27-I的RPMI中连续测量。JC1测量是在488nm和570nm下以5Hz采样率连续激发进行的。由每次测量中绿色(530nm)和红色(590nm)平均发射强度的比值计算线粒体膜电位。TMRE测量是通过在549nm处以10Hz采样率激发进行的。由574nm处的平均发射强度计算线粒体膜电位。使用代表线粒体网络的多个感兴趣的区域(ROI)进行动力学分析。荧光强度的变化用于确定振荡率和振幅。使用定制的MATLAB代码完成线粒体膜电位振荡的空间分析。简而言之，将每张连续的线粒体膜电位(MMP)荧光时间序列显微照片划分为10μm²的体素，并通过FFT确定每个体素的主导频率。生成的频率矩阵用于产生表示线粒体膜电位振荡的空间分析的热图。使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)生成热图。

MCU抑制研究

为了进行线粒体钙活体成像，将不同hiPSC衍生的心肌细胞培养在补充有B27减胰岛素和0.1％ DMSO(对照)或10μM KB-R7943甲磺酸盐的RPMI中(Tocris Bioscience，美国)。在暴露于DMSO(对照组)或10μM MCU抑制剂KB-R7943甲磺酸盐0、30和90秒后，使用Rhod-2AM染料实时成像测量线粒体钙平均值。

为了同时进行实时氧、收缩速率和场电位测量，在补充有B27减胰岛素、5ng/mlVEGF和0.1％ DMSO(对照组)或10μM KB-R7943甲磺酸盐的RPMI中培养心脏类器官。在暴露于DMSO(对照组)或10μM KB-R7943甲磺酸盐0、15和25分钟后，测量实时氧、收缩速率和场电位。

MCU-KO和对照(NT)CRISPR/Cas9质粒的生成

对于MCU-KO，将GeCKO v.2人体CRISPR基因敲除文库(Addgene#1000000048)中的两种不同sgRNA寡核苷酸-MCU HGLibA_28660和HGLibB_28619-克隆到lentiCRISPR v2质粒(Addgene#52961)中。对于对照(NT)，将NT1和NT2非靶向/对照sgRNA寡核苷酸克隆到lentiCRISPR v2质粒中。

sgRNA克隆是根据人体GeCKO v.2系统说明书进行的。简而言之，每条sgRNA插入的两个寡核苷酸都是用BsmBI兼容的末端合成的，并且然后一次完成磷酸化和退火：通过T4PNK(NEB-M0201S)磷酸化，然后加热至95℃，持续5分钟并控制冷却以进行退火。载体质粒用BsmBI(FastDigest Esp3I，FD0454，Thermo)消化，去磷酸化(FastAP热敏碱性磷酸酶，EF0651，Thermo)，并凝胶提取(QiaQuick gel extraction，Qiagen)。将载体和插入片段连接(T4 DNA连接酶，EL0011)并转化到有化学能力的Stbl3细胞中(Mix&Go！大肠杆菌转化试剂盒，T3001，Zymo)。通过使用LKO.1引物进行Sanger测序验证插入是否正确。

质粒被命名为MCU-KO.A(MCU HGLibA_28660)、MCU-KO.B(HGLibB_28619)、Control-NT1和Control-NT2 lentiCRISPR v2。根据制造商的说明，使用ZymoPURE质粒小量提取试剂盒(D4209，Zymo Research)分离转染级质粒DNA。lentiCRISPR v2质粒是以色列耶路撒冷HUJI的Nissim Benvenisti实验室的友好礼物。

MCUKO hiPSC-衍生的心肌细胞的生成

MCU基因敲除(KO)是通过MCU-KO.A和MCU-KO.B lentiCRISPR v2质粒的双慢病毒转导产生的。对照转导同样通过Control-NT1和Control-NT2非靶向lentiCRISPR v2质粒的双慢病毒转导完成。慢病毒原液按先前所描述的产生。

转导原液由相应的慢病毒原液(分别为MCU-KO.A/B和NT1/2)按1:1的比例混合制备。以50％的病毒原液稀释度感染hiPSC-CM，连续两次，每次12小时。转导中细胞活力不变。

线粒体钙成像

根据制造商的说明(Abcam，美国)，使用Rhod-2AM染料测量人体iPSC衍生的心肌细胞内线粒体的钙吸收。在37℃下在补充有B27-I的RPMI中用2μM Rhod-2AM装载细胞，持续30分钟，用PBS清洗，并用补充有10μM KB-R7943或0.1％ DMSO和B27-I的RPMI温育。在5％ CO₂和37℃下，使用温育的LSM-700蔡司显微镜连续测量。通过以10Hz的采样率在552nm处激发进行Rhod-2AM测量。通过在581nm处平均发射强度的变化来计算线粒体钙摄取量。使用多个感兴趣的区域(ROI)分析延时显微照片，并基于Mitotracker染色选择，从而产生代表线粒体网络变化的独特区域。荧光强度的变化用于确定振荡速率和振幅。

猪体内外研究

组织是从70kg的家养雌性猪身上采集的，猪接受腹腔镜肝脏手术(伦理批准号MD-21-16533-3)，并使用致死剂量的氯化钾进行安乐死。一旦ECG跟踪显示平线且ETCO2为零，猪被宣布死亡，并在胸骨外侧打开左胸。肺被牵开(retract)，心包被切开。分割升主动脉、下腔静脉和上腔静脉以及肺静脉，并将心脏从胸部分离出来并置于冰上。

从心底到心尖切开左心室前壁，并使用10号手术刀刀片获得几个测量长2-3mm和厚1-2mm的切片。将心脏组织进一步切成500±200μm厚的切片，并用37℃预热的体外培养基彻底清洗，该培养基由补充有1x胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、10％胎牛血清(FBS)和5ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)和10mM的2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)的M199培养基组成。

然后用氧传感器包埋心脏外植体，置于MEA芯片上，并转移到37℃的温控温育室中，如前所述，该温育室含有补充有1X ITS、10％ FBS、5ng/mL VEGF和10mM HEPES的M199培养基来支持长期功能。以2Hz的周期长度持续点刺激外植体。使用集成代谢-机电传感器芯片评估收缩、场电位和氧。

使用定制设计的Arduino控制的点刺激器使心脏外植体以2Hz起搏(pace)。定制设计电路由Arduino MEGA2560微控制器、脉宽调制(PWM)至电压和数模转换模块组成。定制代码提供在相关可用性部分。

在验证试验中，如上所述，同时实时氧量、收缩速率和场电位是起搏心脏外植体中的测量值，进一步补充有0.1％ DMSO(对照)、10μM布比他汀、10μM米托蒽醌或10μM米托蒽醌和100μM二甲双胍(米托蒽醌+二甲双胍)。

代谢功能的定量

根据制造商的说明，使用Seahorse XF Cell线粒体应激测试试剂盒来测定线粒体的功能(Agilent，Santa Clara，CA)。简而言之，将心脏类器官或人体iPSC衍生的心肌细胞以每孔1个类器官或3,000个心肌细胞的密度接种在涂有1％基质胶的Seahorse XFp微型板上。使细胞适应24小时。然后在无CO₂保温箱中在37℃下在补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10mM葡萄糖(pH 7.4)补充的无缓冲XF基础培养基中温育1小时。发明人测量了30分钟的基础耗氧率(OCR)，并且然后注射1μM寡霉素，其为阻断氧化磷酸化的线粒体复合物V抑制剂。由于寡霉素处理导致的OCR下降被定义为氧化磷酸化率。在60分钟时加入0.5μM 4-(三氟甲氧基)苯基腙羰基氰(FCCP)(一种解耦合剂)以测量线粒体的最大活性，并在90分钟时使用0.5μM抗霉素A和鱼藤酮(线粒体复合物III和线粒体复合物I抑制剂)的混合物诱导完全抑制。结果标准为每孔细胞总数。如通过线粒体应激检测后的Hoechst染色确定的，2DhiPSC-CM在检测时保持近似为接种数。简而言之，在Olympus X81显微镜上对每孔的两个单独场进行成像，导出原始图像，并在Cell Profiler上将细胞核作为主要对象进行计数。

为了对心脏类器官进行细胞计数，根据制造商的说明，使用Quick-DNAminiprepplus试剂盒(D3024，Zymo Research)从单个类器官或已知数量的2D hiPSC-CM细胞中提取基因组DNA(gDNA)。使用Nanodrop 1000测量每个样品的gDNA浓度和提取的gDNA总量。为了确定每个类器官的心肌细胞数量，我们利用人类特异性引物进行qPCR，扩增EDEM1基因的156bp区域。qPCR如前所述进行。来自多个单个类器官和10⁵个iPSC-CM 2D细胞的模板在每次反应中稀释两倍，从10ng到0.625ng，并且所有样品/稀释液均一式四份进行评估。绘制每个模板数量的平均Ct值，并进一步评估具有相似斜率/效率的样品。考虑到后者的qPCR效率相似，类器官和2D心脏细胞之间的ΔCt被用来计算每个类器官中人体心脏细胞的百分比。通过比较从10⁵个iPSC-CM 2D细胞中提取的gDNA总量和从每个类器官中提取的gDNA总量，并应用qPCR估算的心脏细胞百分比，估算每个类器官中的心脏细胞数量。每个类器官中的人体心肌细胞的氧化能力显著强于大鼠内皮细胞，因此它们被认为是检测结果的唯一贡献者。

代谢测量和ATP产生

测量电流的4-传感器(B.LV5)购自Innovative Sensor Technology(IST，瑞士)。通过片上恒电位仪(IST，瑞士)进行测量并校准灵敏度下降。氧气、葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺通量是通过计算代谢物浓度随时间的变化来测量的。谷氨酰胺的测量使我们能够计算脂质代谢通量。通过将摄氧率除以6来计算氧化磷酸化通量。发明人估算通过葡萄糖完全氧化会产生32个ATP分子。通过将乳酸产生率除以二来计算糖酵解通量，最大速率定义为葡萄糖摄取率减去氧化磷酸化通量。糖酵解产生的ATP估算为每分子葡萄糖产生两分子ATP。谷氨酰胺酵解直接通过谷氨酰胺摄取量计算。谷氨酰胺酵解产生的ATP估算为每生成一分子乳酸产生三分子ATP。

RT-PCR的定量

根据制造商的说明，使用NucleoSpin RNAII试剂盒(Macherey-Nagel，德国)从hiPS衍生的CM或心脏类器官中分离总的RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(ThermoFisher Scientific，美国)测定RNA浓度和纯度。根据制造商的说明，使用qScript^TM cDNASynthesis(Quanta BioSciences)进行cDNA合成。每个反应使用1μg纯化的RNA。

在Applied Biosystems^TM QuantStudio^TM 5 Real-Time PCR系统上使用KAPASYBR FAST(Kapa Biosystems)进行qRT-PCR。通过将目标基因的Ct值与RPL32基因的Ct值进行归一化来完成数据分析，并将数据表示为相对定量(RQ)值。使用的引物为(5’至3’)：EDEM1-F-GGCCCCCGCGCTTTAAAATA(SEQ ID NO：1)；EDEM1-R-GGAAAGCGCTGGT AGAAGCC(SEQ IDNO：2)；MCU-F-CACACAGTTTGGCATTTTGG(SEQ ID NO：3)；和MCU-R-CGTGACTTTTTGGCTCCTTT(SEQ ID NO：4)。

基因组数据的处理、分析和图形显示

使用R studio(www.rstudio.com/)进行主成分分析(PCA；prcomp软件包)、散点图和火山图(ggplot软件包)。

在Morpheus中创建了层次聚类、热图、相关图和相似性矩阵。使用DAVIDInformatics Resources 6.7和PANTHER分类系统进行基因本体富集分析和聚类。使用KEGG数据库，使用麦吉尔网络分析工具(McGill’s Network Analyst Tool)绘制代谢网络图。

扫描电子显微镜检查

使用SC7640 Sputter用Au-Pd纳米层预涂类器官样品。使用FEI Sirion高分辨率扫描电子显微镜(HR SEM，荷兰)进行SEM成像。使用高分辨率模式，加速电压为5kV，光斑大小为4.0，并且工作距离为5.3mm，在二次电子(SE)检测下拍摄图像。安装TSL-EDAX(EDAX，美国)系统用于电子背散射衍射(EBSD)。

定量和统计分析

所有实验至少进行3次生物重复。以技术一式三份或一式四份进行测量，用5个或更多个视场分析图像；图表显示平均值±SEM。使用学生t检验进行配对比较；当无法确定分布是否正常时，使用Mann-Whitney U检验；使用错误发现率(FDR)校正来调整多重比较和RNA seq比较。除非另有说明，否则*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

软件资源

可在github.com/mohammadghosheh95/Heart-on-a-Chip获取定制分析软件。

统计分析

除非另有说明，否则每个实验条件均重复3次，每次三份样品。呈现了代表性实验的数据，并且在多次试验中均可见类似的趋势。参数双尾学生t检验用于计算各组间的显著差异。除非另有说明，否则所有误差条代表±SE。

实施例1

通过各向异性应力生成血管化多腔心脏类器官

发育研究表明，复杂的心脏分区只发生在心脏血管发育之后。为了模拟这一发育步骤，本发明人将基底膜基质中的hiPSC-衍生的心肌细胞(hiPSC-CM)和心脏微血管内皮细胞的混合物接种到微孔中(图1A-1B)。组织在4天后收缩成单个团体(single mass)，并在10天后开始搏动。在接下来的几周培养心脏类器官，经过25天培养后获得平滑的外表和同步行为(图1B)。GFP表达的内皮细胞显示，在第10天后形成网络，随后在25天后发展成复杂的周向排列的血管网络(图1B、1L)。心脏类器官的共聚焦显微镜显示，在UN-1和ACS-1021二者衍生的类器官中有支撑2-3个腔室的复杂结构(图1M-1N)。TUNEL和碳酸酐酶IX(CAIX)(一种缺氧的内源性标志物)的免疫染色表明，腔室的形成并不是类器官形成期间缺氧或细胞凋亡的结果(图1O)。

为了更好地理解这种复杂的组织，本发明人对不同条件下收缩的心脏类器官的冯·米塞斯应力分布和高斯位移进行了建模(图1C-1D，以及“材料与方法”)。没有几何限制或血管结构的无应力心脏类器官产生与实心球体的形成有关的均匀的应力分布。没有血管结构(即，不添加内皮细胞)的几何限制会产生各向同性的应力梯度，这会产生单个腔室(图1C-1D和7A-7B)。然而，由于包括内皮细胞导致在团体内形成血管样结构，产生各向异性的应力梯度，导致多个低应力区域，在此处组织分离成多个腔室(图1C-1D、1M-1N和7A-7B)。

为了验证有限元模型的结果，本发明人使用共聚焦显微镜分析了不同条件下机械传导标志物核纤层蛋白A/C(LMNA)和YAP1的分布情况(图1E)。游离类器官显示标志应力分布均匀的LMNA和YAP1的均匀表达。几何限制导致由LMNA标记的高应力的圆周环(围绕中心腔室的YAP1梯度)。由于在团体中加入了类似血管的结构，产生了各向异性的应力梯度，导致由LMNA标记的高应力区域，将多个腔室分开。机械传感器的表达模式与建模的应力模式相对应(图1D-E、图7C)。

共聚焦显微镜显示多腔心脏类器官的稳健形成(图7C)，由包围多个中空腔室的周向排列的心肌细胞组成(图1E、1M)。α-辅肌动蛋白和心脏肌钙蛋白的免疫染色显示，类器官是由具有有组织肌节模式的伸长心肌细胞组成的(图1G)。共聚焦和扫描电子显微镜显示，开放的(patent)内皮毛细血管贯穿腔室壁(图1F)。结构分析表明，POSTN+心脏成纤维细胞样细胞与心肌细胞层交织，并由HCN4和SHOX2阳性的起搏器样细胞簇修饰(图1H)。共聚焦显微镜显示，心外膜样细胞的外壳对WT1和TBX18呈阳性(图1I)。心腔看起来被PECAM-1阳性的心内膜样细胞部分分层(图1J)。通过对心脏类器官、对比人体组织和二维培养的hiPSC-CM进行RNA测序，进一步验证了这些结构发现。心脏类器官显示出与起搏器(窦房结和房室结)、心内膜和心外膜细胞以及心脏成纤维细胞相关的表达特征(图1K)。

实施例2

多腔心脏类器官的功能表征

为了评估模型的心脏成熟度，对多腔心脏类器官进行了RNA-Seq分析，与二维生长的hiPSC-CM以及成人和胎儿心脏组织进行比较(图2A-B)。多腔心脏类器官的转录组分析显示功能基因表达与成人而非胎儿心肌相关(图2A)。与hiPSC-CM(2D培养)和胎儿心肌相比，参与心脏传导(KCNJ2、KCNJ8)、超微结构(TMNI3、MYH7、AKAP6)、能量(PPKAA2、PGC1A)和钙处理(RAR2、CASQ2、CAV3)的基因在心脏类器官中有不同程度的上调(图2A)。对心脏类器官和hiPSC-CM(2D)之间差异表达的513个基因进行了主成分分析(PCA)，区分了成人和胎儿心脏之间的表达，将心脏类器官与成人组织聚类(图2B)。

血管化的心脏类器官表现出每分钟66±5次搏动(bpm)的自发同步搏动以及对药物的生理反应。肾上腺素刺激使搏动速率从基线值增加到88±7bpm(n＝6，p<0.001)，并且收缩幅度增加18％(n＝6，p<0.01)。相比之下，抗心律失常药物胺碘酮使收缩速率从基线值下降到52±4bpm(n＝6，p<0.01)，收缩幅度下降28％(n＝6，p<0.01；图2C)。重要的是，与hiPSC-CM相比，本文所公开的心脏类器官的基础呼吸和氧化磷酸化分别高出35％和85％(n＝3，p<0.05；图2D)。作为代谢成熟度指标的线粒体最大容量高出基础呼吸2倍(图2D)。

在类器官中使用嵌入式氧传感珠跟踪心脏类器官收缩和松弛的代谢动态(图2E-F和3A)以及电化学传感器监测葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺。代谢通量平衡分析(参见“材料与方法”)表明与其他代谢途径相比，脂肪酸氧化更占主导，这是成熟心肌的特征(图2F)。这种代谢分析表明，在心动周期中发生间隙氧的变化，分辨率为亚秒级(图2F)。

实施例3

嵌入式传感器将呼吸与心脏机电节律关联

心脏节律以亚秒级分辨率发生，对于大多数代谢传感器记录变化来说太快。为了解决这个问题，本发明人设计了一种能够实时主动降低背景噪声的双光电倍增管(PMT)传感平台，从而以低于100毫秒的分辨率对嵌入心脏类器官中的氧传感器进行磷光测量(图3A-3E；和图8A)。相移测量用于跟踪氧气消耗，而传感器对激发波长的反射允许精确测量组织位移(图3B；和图8A-B)。将这一新系统与纳米制造的光学透明的微孔封闭的微电极阵列集成(MEA，图3C-3E和图8C-D)独特地允许同时实时测量心脏收缩(图3F)、场电位(图3G)和耗氧量(图3H)。对嵌入式光学传感器的跟踪显示，在搏动周期中，类器官沿其轴线收缩了9.3±1.1％(图3F和图9A)。通过快速傅立叶变换(FFT)分析类器官收缩显示，主频为0.94±0.03Hz，表示58±2bpm(n＝9；图3F和图9B)。对每个类器官记录的电场电位进行过滤和实时扩增显示类似的主频为0.99±0.03Hz(n＝9；图3G和图9A-9D)。

虽然代谢通量被认为在几分钟至几小时的时间尺度内变化，但本文公开的心脏类器官中间隙氧浓度的实时光学测量显示出快速振荡，主频为0.92±0.03Hz(n＝9；图3H和图9A-9D)，表明呼吸和类器官机电周期之间的关联。在ACS-1021和ACS-1028心脏类器官中也记录到了类似的振荡(图9A)。

实施例4

阐明人体心脏组织的电-代谢耦合

在生理性“战或逃”反应中释放的肾上腺素可迅速增加收缩速率和收缩能力，并在较长时间尺度内增加心肌葡萄糖代谢。为了研究这种代谢反应在突发应力下的动态变化，本发明人将心脏器官暴露于100μM肾上腺素，并实时跟踪其机械代谢反应。正如预期的，类器官的收缩频率从0.95Hz倍增到1.95Hz(n＝3，p<0.001；图3I)，同时在刺激15分钟内其收缩增加了33％(n＝3，p<0.001)。间隙氧浓度再次显示出匹配的振荡，频率同样在刺激15分钟内从1.11Hz倍增到1.83Hz(n＝3，p<0.001；图3J)。有趣的是，类器官收缩的增加与间隙氧振荡的振幅相关，这表明心脏功能与耗氧量之间的协调(图10A-F)。

为了确定呼吸周期是由机械力还是去极化驱动的，本发明人用布比他汀(一种兴奋-收缩解耦化合物)和河豚毒素(TTX)(一种Na_v通道抑制剂)处理心脏类器官。布比他汀抑制肌球蛋白II，从而阻止肌球蛋白收缩而不影响心脏细胞的动作电位。布比他汀处理阻止心脏收缩和传感器运动，但是不影响场电位或氧振荡频率和强度(图3K和图10G)。河豚毒素处理可在起效后几秒内消除心脏类器官中的场电位产生、机械收缩和氧振荡(图3L)。这些结果表明，氧振荡与细胞的电活动而不是机械活动有关。

实施例5

搏动的hiPSC-衍生的心肌细胞中线粒体功能的动态变化

毫秒级的快速代谢变化更有可能由离子通量而不是酶级联控制。线粒体膜电位(MMP/ΔΨm)是线粒体钙([Ca²⁺]_m)依赖的呼吸功能指标。通过使用TMRE进行活细胞成像，测量了2D培养的搏动的hiPSC-衍生的心肌细胞和非搏动的细胞的线粒体膜电位(图4A)。搏动细胞显示出与心肌细胞收缩精确相关的MMP振荡(图4A和图11A-H)。同一视野中的非搏动细胞未显示线粒体膜电位振荡，并且其平均MMP比自发收缩细胞低3倍(n＝5，p<0.001；图4A和图11A-H)。Rhod-2AM是一种线粒体特异性染料，其荧光依赖于Ca⁺²结合。2D培养中hiPSC-衍生的心肌细胞的实时成像(参见材料和方法)显示，搏动细胞中线粒体钙[Ca²⁺]_m的快速振荡与细胞的收缩频率精确相关(图4B和图11I)，这些数据有力地表明，收缩周期中[Ca²⁺]_m的变化产生了耗氧量的快速振荡。

为了研究[Ca²⁺]_m对心肌细胞节律性功能的作用，发明人将细胞暴露于KB-R7943，线粒体钙单向转运体的药理抑制剂中(MCU；图4B和图11J)。短期暴露于MCU抑制剂不会显著影响心肌细胞的收缩频率(图4B)，但收缩幅度在30秒和90秒内分别大幅减少了45％和70％(n＝4，p<0.01；图4B和图11J-L)。在暴露于KB-R7943后对线粒体钙进行的平行测定显示，[Ca²⁺]_m浓度无显著差异，但是[Ca²⁺]_m振荡幅度在30秒和90秒内分别降低了60％和78％(n＝4，p<0.001；图11L)。这些数据表明，心肌细胞收缩的幅度取决于线粒体钙的有效振荡。

实施例6

MCU抑制对血管化心脏类器官的实时影响

目前的结果表明，线粒体钙的节律导致自发搏动的心肌细胞中的线粒体活动振荡。为了在生理模型中研究这种行为，发明人将在本文公开的传感器集成平台上培养的心脏类器官暴露于MCU抑制剂KB-R7943中(图4C)。MCU抑制诱导心脏类器官的摄氧量逐渐减少(图4D)。代谢通量平衡分析显示，在暴露于MCU抑制剂20分钟内，呼吸和脂肪酸氧化逐渐减少，导致ATP生成减少(图4D)。

心脏类器官代谢活性的分析显示，从暴露于KB-R7943那一刻起，氧振荡的幅度显著并且逐渐减小(n＝9；图4E)。同时，在MCU抑制后，心脏类器官收缩及其去极化的幅度也显示出相当的且平行的下降(图4E)。这些数据表明，通过观察到的线粒体破坏导致了功能丧失。然而，虽然心脏类器官的代谢活性降低，但心脏收缩频率、氧振荡速率和场电位振荡频率在MCU抑制后显著增加(图4F)。在暴露35分钟内，所有三种频率显示都增加了2.5倍，指示心律失常行为(n＝9；图4F)。这种致心律失常行为与氧振荡偏离收缩周期的同步性丧失有关(图4G)。综上所述，本文公开的数据表明，MCU抑制会切断电-线粒体联系，导致致心律失常行为。

实施例7

MCU的CRISPR/Cas9敲除破坏电-线粒体耦合并诱导心律失常行为

为了进一步验证所提出的机制，在2D培养的hiPSC-CM中产生了MCU的CRISPR/Cas9敲除(参见材料和方法)。由于抗生素选择会干扰心脏成熟度和存活率，因此分析依赖于混合培养物。hiPSC-CM的活体成像(2D)显示，在用非靶向sgRNA转染的细胞中，线粒体钙[Ca^{2 +}]_m的常规振荡展现0.8Hz的主频(n＝7；图5A和图12A)。相比之下，MCU敲除(MCU^KO)细胞显示[Ca²⁺]_m降低了50％，而振荡速率增加到1.3Hz(n＝7，p<0.01；图5A和图12A)。

接下来，使用非同源的MCU^KO心肌细胞形成嵌合心脏类器官(图5B)。RT-qPCR和共聚焦显微镜显示MCU在mRNA和蛋白水平上的表达明显减少(图5B和图12B-C)。在这些心脏类器官中使用集成的代谢-机电-传感器芯片测量了收缩、场电位和间隙氧。由MCU^KO细胞组成的心脏类器官具有较低的收缩能力和较低的氧振荡幅度(n＝9，p<0.001；图5D)。MCU^KO类器官显示出更高的搏动频率和不规则场电位，指示致心律失常行为(图5C)。综上所述，这些发现表明，心肌细胞中的[Ca²⁺]_m振荡驱动了电-线粒体耦合(图5D)。这种协调可使肌肉为机械收缩所需的能量需求峰值做好准备(图5D)。

实施例8

二甲双胍逆转米托蒽醌诱导的心律失常

米托蒽醌是用于治疗前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤和多发性硬化症的一种人类拓扑异构酶II抑制剂。米托蒽醌是被认为与癌症治疗诱发的心律失常(CTIA)有关的几种化疗药物之一。类似的心血管风险也限制了它在多发性硬化症中的应用。最近的研究发现，米托蒽醌是MCU的选择性抑制剂(图6C-6D)。

据报道，二甲双胍会增加线粒体钙和MCU活性，这表明它可以逆转这种效应。事实上，暴露于二甲双胍使米托蒽醌处理细胞的线粒体钙浓度增加了3.4倍(n＝4，p<0.001；图6A-6D)。

为了在生理模型中证明这种行为，发明人将在本文公开的传感器集成平台上培养的心脏类器官暴露于米托蒽醌或米托蒽醌与二甲双胍的组合(图6E-6F)。由于米托蒽醌暴露导致机械收缩、电去极化和氧浓度明显下降(图6E)。收缩不规则和场电位异常与电-线粒体节律的破坏有关(图6F)。收缩速率从53BPM增加到79BPM(图6E-6F)，共同指示致心律失常行为。米托蒽醌与二甲双胍的组合逆转这种效应(图6E-6F)。类器官收缩变得有规律，并且主电场电位频率得到恢复。此外，耗氧量增加，并且电节律与线粒体节律之间的相关性恢复(图6E-6F)。搏动速率从82BPM降至61BPM，恢复了正常的心脏类器官活动(图6E)。

实施例9

在体外猪模型中验证电-线粒体耦合

先前的工作表明，使用成年猪模型的心脏组织切片是一种与人类体外验证相关的生理模型，因为它与人体心脏具有相同的生理和电学特征。从70千克重的雌性猪心脏左心室手术制备500±200μm厚的猪心肌组织，嵌入氧传感器，并将其放置在MEA芯片上(图13A-C)。在2Hz点刺激期间，使用集成代谢-机电传感器芯片测量心肌切片的收缩、场电位和间隙氧(参见“材料和方法”)。

猪体外心肌组织显示出与人体心脏类器官中记录的相同的氧振荡和反应(图13D)。暴露于肌球蛋白II抑制剂布比他汀会阻断机械收缩而不影响场电位或氧振荡。而暴露于MCU抑制剂米托蒽醌会降低耗氧量，并使心脏节律从1Hz增加到2Hz(图13D)。米托蒽醌和二甲双胍的同时处理使搏动频率(到1.4赫兹)、场电位和氧振荡恢复(图13D)。

此外，在暴露于米托蒽醌50分钟后加入二甲双胍，可在1小时内逐渐恢复耗氧量(图13E)。这些发现验证了我们在人体心脏类器官中的早期结果，将电-线粒体失同步与致心律失常行为联系起来(图6A-F)。

讨论

微生理系统模拟了人体生理的关键方面，但其真正的潜力在于能够在受控环境中发现新的生理机制。在这项工作中，我们开发了一种可以将人体心脏类器官中的机械-电和代谢活动关联起来的基于传感器的平台。使用这一平台，发明人显示电-线粒体轴与人体心脏节律相关。这种电-线粒体节律的破坏会导致心律失常，通过能量干扰物二甲双胍可以部分纠正该心律失常。

早期的小动物模型工作显示，耗氧量与心脏机械活动相关，而其他研究显示，心脏电活动和机械活动是耦合的。电生理学方法的进一步改进使几组能够将线粒体钙的振荡与机电节律联系起来，这表明动物体内存在心脏代谢-机电轴。目前的理解是，肌动球蛋白力学会产生有节奏的ATP和钙消耗，驱动代谢循环。成像技术的进步允许在豚鼠心室细胞中检测到线粒体膜电位波，这表明在心动周期中糖酵解和线粒体活动的缓慢振荡。其他也在大鼠心肌细胞中证实了类似的振荡。这些研究有力地表明，人体心肌细胞的代谢可能被心脏收缩类似地驱动至振荡。

遗憾的是，小动物模型和人类之间的离子通道动力学、收缩速率和脂质代谢的根本性差异导致在分子和代谢水平上对病理事件的反应具有物种特异性。在该背景下，与hiPSC衍生的心肌细胞相比，心脏类器官技术可为人类相关的代谢提供更成熟的功能。

本发明人将hiPSC衍生的心肌细胞接种在几何限制的微孔中，之前的研究表明，微孔通过WNT/β-catenin信号传导促进心内膜包被的微室的形成。在这项工作中，发明人使用了心脏内皮细胞，产生了驱动多腔类器官形成的各向异性应力。起搏器样细胞簇、心内膜样细胞和心外膜样外壳增加了这些多腔心脏类器官的复杂性(图1)。

将类器官限制在单个微孔中的一个优点是能够最大限度地减少电干扰(图3C)。类似地，同时测量背景荧光使得本发明人能够降低环境噪声，允许以10Hz的分辨率实时检测耗氧量(图8A)。比较两种信号还允许发明人精确监测类器官的机械运动，导致对心脏功能进行协调测量。利用这种方法，发明人展现了线粒体功能的1Hz振荡，这是迄今为止记录的最快的代谢通量切换。代谢通量平衡分析显示，ATP主要在心脏松弛期间产生(图2F)。

然而，与啮齿类动物不同，人体心脏类器官的肌动球蛋白力学似乎并不驱动这种代谢振荡，因为即使在没有机械活动的情况下，电和代谢节律也会循环(图3A-L)。相反，这种电-代谢耦合是由人体心肌细胞中的[Ca]m振荡驱动的(图4A-G)，因为肌肉去极化导致线粒体活动增加，为机械收缩的能量需求峰值做准备。通过线粒体钙单向转运体(MCU)促进了这种电-线粒体耦合。线粒体钙单向转运体(MCU)在啮齿类动物的心脏稳态中发挥作用。MCU^-/-敲除小鼠在应激期间无法提高心率，并且更容易受到缺血性损伤。目前的发现支持了早期的观察结果，其显示即使轻度抑制人体心脏类器官中的MCU活性，导致电-线粒体同步性丧失和致心律失常行为(图5A-E和6A-F)。事实上，电-代谢同步性的丧失可能是缺血性损伤、病毒感染或癌症治疗诱发心律失常后发生灾难性心律失常的一些病例的起因。

米托蒽醌是被认为与癌症治疗诱发心律失常(CTIA)有关的几种化疗药物之一。事实上，除了癌症治疗外，已知许多药物都会诱发心律失常和其他心脏副作用(参见表1)。最近的研究确认米托蒽醌是MCU的选择性抑制剂。将人体心脏类器官暴露于米托蒽醌会导致电-线粒体节律的破坏，导致不规则收缩、场电位异常和心率增加(图6A-F和7A-D)。二甲双胍是一种最近显示可增加线粒体钙和MCU活性的能量干扰物。添加二甲双胍可部分恢复电-线粒体耦合，解决人体类器官和猪心肌体外模型中的心律失常(图6A-F和7A-D)。

目前的工作公开了一种可为开发抗心律失常疗法提供新的靶标的新的生理机制。要阐明电-线粒体耦合的精确分子机制并证明其在成年人体组织中的作用还需要进一步的研究。事实上，还需要通过观察性研究来描述二甲双胍和抗癌药物之间的相互作用，以及进一步的安慰剂对照研究来阐明这种干预措施在不同情况下的确切作用。目前的发现强调了微观生理学系统在人类生理学研究中的实用性，并表明新型超材料细胞和传感器可以突破(go beyond)动物模型的实用性。

尽管本发明已结合其具体实施方式进行了描述，但对于本领域技术人员来说，许多替代方案、修改和变化显然是显而易见的。因此，本发明旨在包含属于所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这种替代方案、修改和变型。

Claims (36)

1.一种治疗有需要的受试者中的特征在于电-线粒体失同步的疾病或紊乱的方法，所述方法包括确认所述受试者中的所述疾病或紊乱的特征在于电-线粒体失同步和向所述受试者施用治疗有效量的试剂，所述试剂能够：

a.调节所述受试者中的所述疾病或紊乱的组织中的线粒体钙浓度；

b.调节所述组织中的线粒体钙通道活性；或

c.其组合；

从而治疗特征在于电-线粒体失同步的疾病或紊乱。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述失同步包括与健康对照相比降低的线粒体钙浓度或线粒体钙通道活性并且所述调节是增加，或者其中所述失同步包括与健康对照相比增加的线粒体钙浓度或线粒体钙通道活性并且所述调节是降低。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述调节线粒体钙浓度和/或线粒体钙通道活性包括调节线粒体钙单向转运体(MCU)活性。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述调节包括施用选自二甲双胍、山奈酚、精胺、A-769662、AICAR、IND 1316、PF 06409577、ZLN 024、Erastin、厚朴酚、依折麦布、双硫仑、Efsevin和亚精胺的试剂。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述疾病或紊乱选自：心律失常、心肌病、癫痫发作、癫痫、运动神经元痉挛、肌无力、肌肉萎缩、通道病、儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)、肌病伴锥体外系征(MPXPS)、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(AML)、遗传性痉挛性截瘫、缺血-再灌注损伤、缺血性心脏病、罕见线粒体脑肌病、矢状窦血栓形成、颅内窦血栓形成、斯托莫肯综合征、全身性癫痫伴发热性癫痫发作、视神经萎缩3、常染色体显性病、全身性癫痫伴发热性癫痫发作6型、掌跖角皮症、非表皮松解病和东方马脑炎；任选地，其中所述心律失常为癌症治疗诱发的心律失常(CTIA)。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述失同步包括增加的线粒体钙浓度或线粒体钙通道活性，并且所述疾病或紊乱选自线粒体脑肌病、矢状窦血栓形成、颅内窦血栓形成、斯托莫肯综合征、全身性癫痫伴发热性癫痫发作、视神经萎缩3、常染色体显性病、全身性癫痫伴发热性癫痫发作6型、掌跖角皮症、非表皮松解病、东方马脑炎和CTIA，任选地，其中所述癌症治疗是多柔比星。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述失同步包括降低的线粒体钙浓度或线粒体钙通道活性，并且所述疾病或紊乱选自心律失常、心肌病、癫痫发作、癫痫、运动神经元痉挛、肌无力、肌肉萎缩、通道病、CPVT、MPXPS、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、AML、遗传性痉挛性截瘫、缺血-再灌注损伤、缺血性心脏病、罕见病和CTIA。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述疾病是CPVT，并且所述调节包括施用选自精胺、亚精胺、二甲双胍、Erastin、A-769662、AICAR、IND 1316、PF 06409577和ZLN 024的试剂。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述疾病或紊乱是由施用引起心脏副作用的试剂造成的，并且其中所述试剂选自钙信号传导靶向剂、钙通道阻滞剂和抗肿瘤剂，任选地，其中所述试剂选自表1中提供的试剂。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述确认包括以下至少一项：

a.确定从所述受试者获得的样品中的线粒体钙浓度，并且其中浓度超过预定阈值指示失同步，任选地，其中所述预定阈值是健康受试者中或患有不是特征在于电-线粒体失同步的所述疾病或紊乱的受试者中的钙浓度；

b.在所述患者中观察对通过膜通道靶向电活动的抗心律失常治疗没有反应的心律失常或药物性心律失常症状，因此指示失同步，任选地，其中所述抗心律失常治疗选自：钠通道阻滞剂、β阻滞剂、钾通道阻滞剂、非二氢吡啶钙通道阻滞剂、腺苷和地高辛；

c.EKG、EEG或EMG，其中异常读数指示失同步，任选地，其中异常读数包括晚电位、R波减弱和R/R比增加中的至少一种；

d.确认暴露于已知会产生电-线粒体失同步的试剂，任选地，其中所述试剂为选自表1中提供的那些试剂以及甲苯、三氯乙烷、二甲苯、庚烷、己烷、乙醚、三氯乙烯、三氯三氟乙烷、一氧化碳、二硫化碳、杀虫剂、双酚A(BPA)、甲烷衍生的卤代烃、有机硝酸盐、砷、镉、钴、有机溶剂和金属；和

e.确认含有指示电-线粒体失同步的症状诊断的病史。

11.一种多腔心脏类器官，其包括心肌细胞和内皮细胞和至少两个同步搏动的腔室。

12.根据权利要求11所述的类器官，其中所有腔室同步搏动或其中所述类器官产生双相搏动。

13.根据权利要求11或12所述的类器官，其包括起搏器样细胞簇，任选地，其中所述起搏器样细胞簇是钾/钠超极化激活的环核苷酸门控通道4(HCN4)和矮小同源盒2(SHOX2)阳性。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的类器官，其包括外部心外膜，任选地，其中所述心外膜包括对维尔姆斯氏肿瘤-1(WT1)和T-盒转录因子18(TBX18)阳性的细胞。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的类器官，其包括内部心内膜，任选地，其中所述心内膜包括对血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)阳性的细胞。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的类器官，其中所述同步搏动包括在每分钟50和90次搏动(bpm)之间的基础搏动频率。

17.根据权利要求11至16中任一项所述的类器官，其中所述类器官包括血管结构、围绕中空腔室的周向排列的心肌细胞、以肌节模式组织的细长的心肌细胞、所述腔室壁内的毛细血管和心脏成纤维细胞样细胞，任选地，其中所述成纤维细胞样细胞是骨膜蛋白(POSTN)和/或波形蛋白阳性。

18.根据权利要求11至17中任一项所述的类器官，其中所述类器官包括至少一个与培养中的离体心肌细胞或培养中的胎儿心脏组织相比增加的参数，其中所述参数选自基础呼吸、氧化磷酸化、线粒体最大容量和至少选自下列的因子的表达：TNNT2、TNNI3、Cx43、MYH7、AKAP6、GJA5、JPH2、SLC8A1、ATP2A2、CACNA1C、RYR2、CASQ2、PLN、CAMK2B、TRDN、CAV3、BIN1、AMP2、SCN5A、KIR2.1、ITPR3、HCN2、SCN1B、HCN1、KCNJ8、KCNH2、PRKAA1、CPT1A、TFAM、PPARGC1A、PPA1、PPP2R4、SLC2A4、MAPK1、PRKACA、α1A、α1B、SCN4B、KCNE1。

19.一种产生包括至少两个同步搏动的腔室的多腔心脏类器官的方法，所述方法包括在几何限制的培养空间中共同培养心肌细胞和内皮细胞团体，使得在所述细胞团体中产生各向异性应力梯度，从而产生多腔心脏类器官。

20.根据权利要求19所述的方法，其包括在包括直径在1-1.2mm之间的微孔中培养约6.8×10^4个细胞。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述共同培养包括心肌细胞与内皮细胞的比在1.5:1和2.5:1之间。

22.一种多腔心脏类器官，其包括通过权利要求19至21中任一项所述的方法产生的至少两个同步搏动的腔室。

23.一种评估心脏细胞功能的方法，所述方法包括将权利要求11至18和22中任一项所述的多腔心脏类器官暴露于条件并测量所述多腔心脏类器官的至少一个参数。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述条件选自：施用药物或化学品、缺氧条件、循环条件、代谢物暴露变化、激素暴露变化和所述类器官中细胞的基因突变。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述至少一个参数是电-线粒体同步。

26.一种感测系统，其包括：

照射源；

第一光电倍增管(PMT)传感器；

第二PMT传感器，和

控制器，其配置为：

控制所述照射源以用具有第一波长的光子束照射嵌入组织或细胞聚集体中的微粒；

通过所述第一PMT传感器检测指示从所述微粒在所述第一波长反射的光子的第一信号；

通过所述第二PMT传感器检测指示从所述微粒以第二波长发射的第二信号，其中所述微粒包括可被辅因子淬灭的可激发分子；

测量所述第一信号的频率和所述光子束的频率之间的偏移，基于所述测量到的偏移确定背景噪声并从所述第二信号减少背景噪声；和

基于所述背景噪声减少的第二信号计算所述组织或细胞聚集体的时间性辅因子消耗量。

27.根据权利要求26所述的系统，其中所述时间性辅因子消耗量指示所述组织或细胞聚集体中的氧水平。

28.根据权利要求26或27所述的系统，其中所述控制器进一步配置为检测所述第一信号的强度变化，并基于所述检测到的变化计算所述微粒的相对位移。

29.根据权利要求28所述的系统，其中所述检测到的信号强度的变化指示所述微粒的相对位移，任选地，其中所述位移是在垂直于所述光子束的轴线上测量的。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的系统，其中所述控制器进一步配置为从微电极阵列感测所述组织或细胞聚集体的场电位，用于在检测所述第一信号和所述第二信号的同时测量所述组织或细胞聚集体的电活动。

31.一种评估细胞功能的方法，所述方法包括：

a.将组织、类器官或细胞聚集体置于权利要求26至30中任一项所述的感测系统中，

b.施加条件至所述组织、类器官或细胞聚集体；和

c.测量所述组织、类器官或细胞聚集体中的至少辅因子消耗量，

从而评估细胞功能。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述感测系统是权利要求30所述的感测系统，所述测量包括测量所述组织、类器官或细胞聚集体中的辅因子消耗量、位移和电场电位，并且其中施加所述条件之后的位移、辅因子消耗量和电场电位与施加所述条件之前的位移、辅因子消耗量和电场电位相比或与对照未处理的组织、类器官或细胞聚集体相比的显著偏差指示电-线粒体失同步。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中将心脏或大脑类器官置于所述感测系统中。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述施加条件选自：施用药物或化学品、施加缺氧条件、施加循环条件、改变代谢物暴露、改变激素暴露和所述组织、类器官或聚集体中细胞的基因突变。

35.一种选择患有疾病或紊乱的受试者的方法，所述受试者适合用以下试剂治疗，所述试剂能够：

a.调节所述受试者中的所述疾病或紊乱的组织中的线粒体钙浓度；

b.调节所述组织中的线粒体钙通道活性；或

c.其组合；

所述方法包括确定所述受试者中电-线粒体失同步的存在，其中所述失同步的存在指示所述受试者适合被治疗。

36.根据权利要求35所述的方法，所述确定包括以下至少一项：

a.确定从所述受试者获得的样品中的线粒体钙浓度，并且其中浓度超过预定阈值指示失同步，任选地，其中所述预定阈值是健康受试者中或患有不是特征在于电-线粒体失同步的所述疾病或紊乱的受试者中的钙浓度；

b.在所述患者中观察对通过膜通道靶向电活动的抗心律失常治疗没有反应的心律失常或药物性心律失常症状，因此指示失同步，任选地，其中所述抗心律失常治疗选自：钠通道阻滞剂、β阻滞剂、钾通道阻滞剂、非二氢吡啶钙通道阻滞剂、腺苷和地高辛；

c.EKG、EEG或EMG，其中异常读数指示失同步，任选地，其中异常读数包括晚电位、R波减弱和R/R比增加中的至少一种；

d.确认暴露于已知会产生电-线粒体失同步的试剂，任选地，其中所述试剂为选自表1中提供的那些试剂以及甲苯、三氯乙烷、二甲苯、庚烷、己烷、乙醚、三氯乙烯、三氯三氟乙烷、一氧化碳、二硫化碳、杀虫剂、甲烷衍生的卤代烃、有机硝酸盐、砷、镉、钴、有机溶剂和金属；和

e.确认包含指示电-线粒体失同步的症状诊断的病史。