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CN118284701A - 用于转化从单子叶植物种子切除的胚外植体的组合物和方法 - Google Patents

用于转化从单子叶植物种子切除的胚外植体的组合物和方法 Download PDF

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CN118284701A
CN118284701A CN202280077272.4A CN202280077272A CN118284701A CN 118284701 A CN118284701 A CN 118284701A CN 202280077272 A CN202280077272 A CN 202280077272A CN 118284701 A CN118284701 A CN 118284701A
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cytokinin
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plant
explants
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CN202280077272.4A
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J·阿瑟诺
陈余荣
B-G·康
J·孔普弗
B·J·玛蒂内尔
L·B·莫勒
M·A·萨尔塔里克斯
A·什拉瓦特
S·苏巴劳
E·J·威廉斯
叶旭东
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Monsanto Technology LLC
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Monsanto Technology LLC
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
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Abstract

本发明提供了用于改善从单子叶植物种子切除的胚外植体的转化的新的组合物和方法，其可包括外植体制备、外植体再水合、根瘤菌目细菌接种和共培养、芽诱导、延长芽诱导、或基因修饰的植物或植物部分再生的一个或多个步骤。本文提供的方法可包括通过用包含异源多核苷酸的根瘤菌目细菌接种胚外植体来用所述异源多核苷酸转化所述胚外植体的至少一个植物细胞。本文提供的方法还包括由转化或编辑的植物细胞或外植体再生基因修饰的植物或植物部分的方法。

Description

用于转化从单子叶植物种子切除的胚外植体的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年9月27日提交的美国临时申请序列63/248,921的优先权，该临时申请的全部公开内容以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于改善从单子叶植物种子切除的胚外植体的基因修饰的组合物和方法。
背景技术
单子叶植物，诸如玉米、小麦、水稻、大麦和高粱，是重要的作物，并且是世界许多地区的主要食物来源。生物技术方法已用于通过植物的基因修饰产生新性状来改善这些作物，这通常依赖于将多核苷酸分子递送到植物细胞以产生具有改善性状或特征的基因修饰的植物或植物部分。然而，本领域持续需要对植物、特别是单子叶植物进行基因修饰的改善方法，这些方法不依赖于使用愈伤组织培养物，它们可以更高效地进行并且对植物种质依赖性较小。
本文所述的发明提供了用于改善从单子叶植物种子切除的胚外植体的转化以及在不使用愈伤组织培养物的情况下由其再生基因修饰的植物或植物部分的新的组合物和方法，其克服了本领域的许多挑战和限制。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种产生基因修饰的单子叶植物或植物部分的方法，所述方法包括：通过用包含根瘤菌目(Rhizobiales)细菌的接种培养基接种包含分生组织的单子叶植物种子胚外植体来将异源多核苷酸分子引入所述胚外植体的至少一个细胞中，所述根瘤菌目细菌能够用所述异源多核苷酸分子转化所述至少一个细胞，将所述胚外植体和所述根瘤菌目细菌与共培培养基进行接触共培养，将所述胚外植体与包含第一生长素和第一细胞分裂素的第一芽诱导培养基进行接触培养，将所述胚外植体与包含第一生长素或第二生长素和第一细胞分裂素或第二细胞分裂素的第二芽诱导培养基进行接触培养，以及由所述胚外植体再生所述基因修饰的单子叶植物或植物部分。在一个实施方案中，植物部分是芽(shoot)或根。在另一个实施方案中，基因修饰的单子叶植物是玉米植物、小麦植物、水稻植物、大麦植物、草坪草植物或高粱植物。在又一个实施方案中，基因修饰的单子叶植物是玉米植物。在再一个实施方案中，基因修饰的单子叶植物是小麦植物。在某些实施方案中，根瘤菌目细菌选自由以下组成的组：a)根瘤菌科(Rhizobiaceae)、叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)和黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)细菌；或b)农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和固氮根瘤菌属(Azorhizobium)细菌。在一个实施方案中，根瘤菌目细菌是农杆菌属，并且接种培养基中的农杆菌属的OD660为约0.5至约2.0。在某些实施方案中，根瘤菌目细菌是农杆菌属，并且接种培养基中的农杆菌属的OD660为约0.75至约1.25或为约1.0。在另一个实施方案中，基因修饰的单子叶植物或植物部分是非嵌合的。在又一个实施方案中，将胚外植体和基因修饰的单子叶植物或植物部分在不产生愈伤组织培养物的情况下培养和再生。在再一个实施方案中，异源多核苷酸分子包含目标基因或编码指导RNA或定点核酸酶的一个或多个表达盒。在具体的实施方案中，本公开提供了一种产生基因修饰的单子叶植物或植物部分的方法，所述方法还包括对接种培养基中的胚外植体施加力处理。
在另一个方面，本公开一种芽诱导培养基(或第一芽诱导培养基)，其包含第一生长素和第一细胞分裂素。在一个实施方案中，将胚外植体与第一芽诱导培养基接触培养约2天至约14天或约6天至约8天范围内的时间段。在另一个实施方案中，将胚外植体与第一芽诱导培养基在选自由约20℃至约40℃、约25℃至约30℃、约30℃至约40℃、约30℃至约37℃和约33℃至约35℃组成的组的范围内的温度下进行接触培养。在又一个实施方案中，第一芽诱导培养基包含高细胞分裂素与生长素比率。可用于第一芽诱导培养基的生长素的非限制性实例包括2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)、4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、4-氯苯氧基乙酸或对-氯-苯氧基乙酸(4-CPA或pCPA)、2,4,5-三氯-苯氧基乙酸(2,4,5-T)、2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)、苯乙酸(PAA)和3,6-二氯-2-甲氧基-苯甲酸(麦草畏)。在一个实施方案中，第一芽诱导培养基中的第一生长素的浓度为约0.02mg/L至约25mg/L或约1mg/L至约2mg/L。可用于第一芽诱导培养基的细胞分裂素的非限制性实例包括6-苄氨基嘌呤(BAP)、噻苯隆(TDZ)、激动素、玉米素、二苯脲(DPU)、6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)和间-拓扑林。在另一个实施方案中，第一芽诱导培养基中的第一细胞分裂素的浓度在约0.1mg/L至约50mg/L的范围内。在又一个实施方案中，第一细胞分裂素是BAP，并且第一芽诱导培养基中的BAP的浓度为约10mg/L。在再一个实施方案中，第一细胞分裂素是TDZ，并且第一芽诱导培养基中的TDZ的浓度为约2mg/L。在一个实施方案中，第一芽诱导培养基是固体培养基。
在又一个方面，本公开提供了一种第二芽诱导培养基(延长芽诱导培养基)，其包含第一生长素或第二生长素和第一细胞分裂素或第二细胞分裂素。在一个实施方案中，将胚外植体与第二芽诱导培养基接触培养约4天至约28天或约7天至约14天范围内的时间段。在另一个实施方案中，将胚外植体与第二芽诱导培养基在约20℃至约32℃、约25℃至约29℃、或约27℃至约28℃范围内的温度下进行接触培养。在又一个实施方案中，第二芽诱导培养基包含高细胞分裂素与生长素比率。在再一个实施方案中，第二芽诱导培养基包含：a)第一生长素和第一细胞分裂素；b)第一生长素和第二细胞分裂素；c)第二生长素和第一细胞分裂素；或d)第二生长素和第二细胞分裂素。可用作第二芽诱导培养基中的第一生长素或第二生长素的生长素的非限制性实例包括2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)、4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、4-氯苯氧基乙酸或对-氯-苯氧基乙酸(4-CPA或pCPA)、2,4,5-三氯-苯氧基乙酸(2,4,5-T)、2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)、苯乙酸(PAA)和3,6-二氯-2-甲氧基-苯甲酸(麦草畏)。在具体的实施方案中，第二芽诱导培养基中的第一生长素或第二生长素的浓度为约0.01mg/L至约25mg/L、约0.02mg/L至约10mg/L、或约1mg/L至约2mg/L。可用作第二芽诱导培养基中的第一细胞分裂素或第二细胞分裂素的细胞分裂素的非限制性实例包括6-苄氨基嘌呤(BAP)、噻苯隆(TDZ)、激动素、玉米素、二苯脲(DPU)、6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)和间-拓扑林。在一个实施方案中，第二芽诱导培养基中的第一细胞分裂素或第二细胞分裂素的浓度在约0.1mg/L至约50mg/L、约0.1mg/L至约25mg/L、或约2mg/L至约10mg/L的范围内。在再一个实施方案中，第二芽诱导培养基包含4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)和噻苯隆(TDZ)、或2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)和噻苯隆(TDZ)。在一个实施方案中，第一细胞分裂素或第二细胞分裂素是TDZ，并且第二芽诱导培养基中的TDZ的浓度为约2mg/L。在另一个实施方案中，第一细胞分裂素或第二细胞分裂素是BAP，并且第二芽诱导培养基中的BAP的浓度为约10mg/L。在又一个实施方案中，第二芽诱导培养基是固体培养基。在一个实施方案中，异源多核苷酸分子包含可选择标记基因，第二芽诱导培养基包含选择剂，并且可选择标记基因在植物中提供对选择剂的抗性。选择剂的非限制性实例包括卡那霉素、巴龙霉素、潮霉素B、大观霉素、链霉素、庆大霉素、草甘膦、草铵膦、膦丝菌素、溴苯腈、双丙氨膦、麦草畏、咪唑啉酮和磺酰脲。
在再一个方面，本公开提供了一种方法，所述方法包括将胚外植体与第一芽诱导培养基和第二芽诱导培养基进行接触培养，第一芽诱导培养基包含第一生长素和第一细胞分裂素，第二芽诱导培养基包含第一生长素或第二生长素和第一细胞分裂素或第二细胞分裂素。在一个实施方案中，第一芽诱导培养基包含第一生长素，第二芽诱导培养基包含第二生长素，并且第一生长素不同于第二生长素。在另一个实施方案中，第一芽诱导培养基包含第一细胞分裂素，第二芽诱导培养基包含第二细胞分裂素，并且第一细胞分裂素不同于第二细胞分裂素。在又一个实施方案中，第一芽诱导培养基中的第一细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤(BAP)并且第二芽诱导培养基中的第二细胞分裂素是噻苯隆(TDZ)。在再一个实施方案中，第一芽诱导培养基中的第一生长素是2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)并且第二芽诱导培养基中的第二生长素是4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)。在一个实施方案中，第二芽诱导培养基包含第二生长素和第二细胞分裂素，第二生长素是4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)，并且4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)的浓度在约0.1mg/L至约10.0mg/L或约0.5mg/L至约4mg/L的范围内，并且第二细胞分裂素是噻苯隆(TDZ)，并且第二芽诱导培养基中的噻苯隆(TDZ)的浓度在约0.5mg/L至约15mg/L或约1mg/L至约4mg/L的范围内。在另一个实施方案中，第一生长素是2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)，第一芽诱导培养基中的2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)的浓度在约0.1mg/L至约10mg/L或约0.1mg/L至约4mg/L的范围内，第一芽诱导培养基中的第一细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤(BAP)，并且第一芽诱导培养基中的6-苄氨基嘌呤(BAP)的浓度在约1mg/L至约25mg/L或约2mg/L至约20mg/L的范围内。
在一个方面，本公开提供了一种根据本文所述的组合物和方法使用的胚外植体。在一个实施方案中，胚外植体是在其中胚外植体不发芽并保持存活且能够进行遗传转化的条件下由单子叶植物种子制备的。在另一个实施方案中，制备胚外植体的单子叶植物种子的内部水分含量在约3％至约25％的范围内。在又一个实施方案中，胚外植体是干成熟玉米种子胚外植体。在再一个实施方案中，在引入异源多核苷酸分子之前，胚外植体的内部水分含量在约3％至约25％的范围内。在一个实施方案中，胚外植体由缺少根(radical)的胚轴的顶端部分组成，并且玉米种子的剩余部分已经基本上从胚外植体去除。
在另一个方面，本公开提供了一种共培养胚外植体和根瘤菌目细菌的方法。在一个实施方案中，将胚外植体在约15℃至约25℃或约20℃的温度下共培养。在另一个实施方案中，将胚外植体共培养约2天至约10天或约5天至约7天范围内的时间段。在又一个实施方案中，共培培养基不含生长素或细胞分裂素。在再一个实施方案中，共培培养基不含表面活性剂。在一个实施方案中，共培培养基与用共培培养基润湿的纸基质接触。在另一个实施方案中，共培培养基包含能够用异源多核苷酸分子转化至少一个细胞的第二根瘤菌目细菌。在又一个实施方案中，根瘤菌目细菌和第二根瘤菌目细菌是相同物种。在又一个实施方案中，第二根瘤菌目细菌是农杆菌属，并且共培培养基中的农杆菌属的OD660为约0.5至约2.0。在再一个实施方案中，第二根瘤菌目细菌是农杆菌属，并且共培培养基中的农杆菌属的OD660为约0.75至约1.25或为约1.0。
在又一个方面，本公开提供了一种再生培养基。在一个实施方案中，将基因修饰的单子叶植物或植物部分与再生培养基在约20℃至约32℃、约25℃至约29℃、或约27℃至约28℃范围内的温度下进行接触而再生。在另一个实施方案中，将基因修饰的单子叶植物或植物部分与再生培养基接触而再生约20天至约50天或约28天至约42天范围内的时间段。在又一个实施方案中，再生培养基具有低盐浓度。在再一个实施方案中，再生培养基不含生长素或细胞分裂素。在一个实施方案中，再生培养基不含表面活性剂。在另一个实施方案中，再生培养基包含如本文所述的选择剂。在又一个实施方案中，再生培养基是固体培养基。在再一个实施方案中，本文提供的方法还包括由基因修饰的植物制备基因修饰的植物部分。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括来进一步说明本发明的某些方面。可通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文提出的具体实施方案的详细描述更好地理解本发明。
图1示出了在农杆菌属接种之前或期间暴露于重力的转化玉米外植体的瞬时基因表达。
图2示出了在弄杆菌属接种期间在不同温度下暴露于重力的转化玉米外植体的瞬时基因表达。
图3示出了在弄杆菌属接种期间暴露于不同重力的转化小麦外植体的瞬时基因表达。
图4示出了在两个实验中在接种期间的不同重力(291g、1164g、2619g和4657g)对瞬时GUS表达的影响的图像。
图5示出了在农杆菌属接种和共培养后六天的瞬时GUS表达。图5A-1示出了用OD为0.25的弄杆菌属接种并在不添加弄杆菌属的情况下共培养的外植体中的GUS表达；图5B-1示出了用OD为0.25的弄杆菌属接种并在添加1.25mL的OD为0.25的农杆菌属的情况下共培养的外植体中的GUS表达；图5C-1示出了用OD为0.5的农杆菌属接种并在添加1.25mL的OD为0.5的农杆菌属的情况下共培养的外植体中的GUS表达；和图5D-1示出了用OD为1.0的农杆菌属接种并在添加1.25mL的OD为1.0的弄杆菌属的情况下共培养的外植体中的GUS表达。
图6示出了破碎狗尾草属(Setaria)种子的农杆菌属转化。图6A示出了在接种后8周的再生芽；图6B示出了在X-gluc溶液中1小时后具有GUS表达的再生芽的叶子，证实了转化；图6C示出了使用对CP4基因具有特异性的探针的从在温室中生长的再生植物(参见，图6D中的植物的实施例)中分离的DNA的Southern杂交，证实了转基因植物含有单拷贝的CP4转基因。
图7示出了用于从狗尾草属种子去除种皮的种子滚压(rolling)组件(图7A)；图7B示出了在去除种皮之前的狗尾草属种子；和图7C示出了在去除种皮之后的狗尾草属种子。
图8示出了从完整狗尾草属种子的农杆菌属介导转化、培养和植物再生的进展。图8A示出了在农杆菌属感染之后的狗尾草属种子；图8B示出了在X-gluc染色之后分生组织区域周围的GUS表达；图8C示出了靠近叶基部的分生组织区域周围新形成的芽，其中观察到GUS染色；和图8D示出了在选择和生根后的再生植物。
图9示出了转基因狗尾草(Setaria viridis)植物的繁殖组织和R1幼苗中的GUS表达。图9的顶部示出了花药和花粉柱头(左上)；小穗(顶部中间)；和未成熟种子(右上)中的GUS表达。图9的底部示出了三个不同转基因事件(事件1、3、4)的幼苗中的GUS表达。
具体实施方式
下面提供详细描述以帮助本领域技术人员实践本发明。在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本文所述的实施方案进行修改和变化。提供了用于改善从单子叶植物种子切除的胚外植体的转化的新的组合物和方法，其可以包括如本文所述的外植体制备、外植体再水合、农杆菌属接种和共培养、芽诱导、延长芽诱导、和/或基因修饰的植物或植物部分再生的一个或多个步骤。
A.外植体制备
根据本发明的实施方案，可以从单子叶植物种子产生一种或多种单子叶植物种子胚外植体，用于产生基因修饰的单子叶植物或植物部分。此类植物种子可从田地或温室中生长的植物获取或收获。此类单子叶植物种子可以是成熟或未成熟的单子叶植物种子，但是可优选地是成熟单子叶植物种子。单子叶植物的实例包括但不限于玉米植物、小麦植物、水稻植物、大麦植物、黑麦植物、谷子植物、燕麦植物、草坪草植物和高粱植物。单子叶植物种子的实例包括但不限于玉米(corn或maize)种子、小麦种子、水稻种子、大麦种子、黑麦种子、谷子种子、燕麦种子、草坪草种子和高粱种子。使用成熟单子叶植物种子可提供改善的种子储存、外植体制备和/或培养的益处或优点。可根据本发明的实施方案进行基因修饰或转化的单子叶植物或植物种子的实例包括单子叶植物或谷类植物和草的禾本科(Poaceae)或稻科(Gramineae)内的任何植物物种，其可包括任何玉蜀黍属玉米(corn或maize)物种，诸如玉米(Zea mays)；任何稻属水稻物种，诸如稻(Oryzasativa)；任何小麦属小麦物种，诸如普通小麦(Triticum aestivum)或硬粒小麦(Triticum turgidum var durum)；任何大麦属大麦物种，诸如大麦(Hordeum vulgare)；任何燕麦属燕麦物种，诸如燕麦(Avenasativa)；任何高粱属高粱物种，诸如二色高粱(Sorghum bicolor)或高粱(Sorghumvulgare)；任何黑麦属黑麦物种，诸如黑麦(Secale cereale)；任何甘蔗属甘蔗物种或任何狼尾草属、狼尾草属、穇属、稗属、或黍属谷子物种，诸如狗尾草、谷子(Setaria italica)、御谷、穇、湖南稗子、细柄黍、或稷(Panicum miliaceum)。
根据一些实施方案，提供了用于制备、培养、选择和使用外植体的方法和组合物以及由此产生的外植体或培养的外植体。如本文所用，术语“外植体”或“种子胚外植体”是指能够进行基因修饰并随后再生为基因修饰的植物或植物部分的植物部分或植物组织。“外植体”或“种子胚外植体”可以是指植物种子或植物种子的任何部分，其可包含至少一部分的植物种子胚。“外植体”或“种子胚外植体”可包括从植物种子切除的胚外植体，其可包含至少一部分的胚分生组织。可替代地，“外植体”或“种子胚外植体”可以是指整个或完整的植物种子，或可通过任何合适的机械过程产生的破碎、变形或部分打开的植物种子。如提及外植体或种子胚外植体中所用，“部分打开”是指植物种子的改变状态，其具有通过机械力(诸如挤压、破碎、滚压、压制、挤出等)在植物种子中引入的一个或多个开口或裂隙。外植体或种子胚外植体是整个或完整的植物种子或者破碎、变形或部分打开的植物种子，在许多情况下可去除其种皮。如本文所用，“基因修饰的”植物、植物部分、植物组织、外植体或植物细胞包含通过基因工程引入植物、植物部分、植物组织、外植体或植物细胞的基因组中的基因修饰或转基因，这可以通过遗传转化或基因组编辑技术。如本文所用，“转基因”植物、植物部分、植物组织、外植体或植物细胞具有整合到植物、植物部分、植物组织、外植体或植物细胞的基因组中的外源核酸序列、多核苷酸、表达盒和/或转基因。在某些实施方案中，根据本发明的外植体可手动或使用自动化过程产生。例如，可通过切割、研磨、磨损或任何其他类似的过程从种子中去除种子组织。还可进行用于去除不必要种子部分的手动或自动化方法。例如，在机械化处理种子期间，可以使用流体(包括压缩空气、其他气体和液体)来移动外植体并将所需的外植体与碎屑(debris)分离。可从干、干燥或湿的种子中切除胚外植体。作为种子正常成熟过程的一部分，成熟植物种子可变得更干，尽管可在切除之前进一步干燥种子和/或可在从种子中切除之后干燥外植体。可进行植物胚外植体的干切除或干燥切除以立即使用或储存时间段后供以后使用。外植体制备还可包括干燥种子和/或外植体以获得种子和/或外植体的所需水分含量用于改善的储存制备(例如，切除)或使用，这取决于未经干燥的种子或外植体的初始水分含量。切除后，可通过冲洗、浮选或本领域已知的其他方法将外植体纯化或与其他种子材料和碎屑分离。
在其他实施方案中，根据本发明的实施方案制备或使用的种子或外植体可被定义为内部水分为约3％至约25％、约3％至约20％、约3％至约15％、约3％至约10％、约5％至约10％，包括约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或约25％的内部水分，包括其间可推导出的所有范围。外植体可由具有本文所述的水分含量的成熟种子产生。在具体方面，可在外植体切除、外植体储存之前或之后，当外植体在储存时，在外植体再水合之前，和/或在基因修饰或转化之前测量种子或外植体的水分含量。
在一个方面，可根据本发明的实施方案制备或使用任何单子叶植物胚外植体。在具体实施方案中，单子叶植物胚外植体可以是成熟胚、未成熟胚、分生组织、愈伤组织或任何其他可转化和可再生的组织。在一些实施方案中，成熟胚外植体是干切除的外植体。干切除的外植体可从种子获取并几乎直接用作转化或基因修饰的靶标。在一个实施方案中，干切除的外植体可从成熟干种子获取并用作转化或基因修饰的靶标，可能仅需要最少的润湿、水合或预培养步骤。在其他实施方案中，湿的、干湿的或湿切除的胚外植体可用作转化或基因修饰的靶标。如本文所用，“湿”胚外植体是指在转化或基因修饰之前经受润湿、水合、吸涨或其他最低培养步骤的干切除的外植体。如本文所用，“干湿”胚外植体是指通过润湿而引发发芽并然后干燥以阻止发芽的胚外植体。如本文所用，“湿切除的”外植体是指从吸涨或水合的种子切除的外植体。湿胚外植体是在从种子中切除之后水合或吸涨，而湿切除的胚外植体是从已经水合或吸涨的种子中切除的。如本文所用，“愈伤组织”是指无组织的、未分化的和/或去分化的植物细胞或组织的增殖团。
根据本发明使用的外植体可在从成熟单子叶植物种子中分离、切除或去除后的各种时间进行基因修饰。在一个实施方案中，在使用前，外植体可已经从种子中去除少于一天，例如约1至约24小时，诸如约1、2、3、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在其他实施方案中，在使用前，外植体可储存更长时间，包括数天、数周、数月或数年。用于干燥、储存种子和使种子发芽的方法和参数是本领域已知的(例如，U.S.8,362,317,在此通过引用将其全部内容并入本文，Senaratna等人,1983年,Pl.Physiol.72:620-624,1983年；Vertucci和Roos,1990年,Pl.Physiol.90:1019-1023,1990年；Chai等人,1998年,Seed Science Research 8(增刊1):23-28,1998年)。根据需要，可使用任何条件，包括在例如约-80℃至约60℃的温度下孵育或储存。
在某些方面，本发明可涉及种子或外植体的灭菌。灭菌可包括使种子或外植体材料与多种液体或气体接触，用以减少或消除存活细菌或真菌污染物的存在，否则这些污染物可能干扰种子或胚的生存力。通过施加液体的灭菌还可使植物种子、外植体、胚或组织水合或部分水合，并且起到引发种子、外植体、胚或组织的目的。灭菌方法包括但不限于使用氯气、臭氧、漂白剂或酒精溶液、紫外光、-20℃或更低的温度以及暴露于高于40℃的温度。
在本发明的一个方面，可在转化或基因修饰之前使外植体再水合。再水合培养基或溶液是本领域已知的并且可包含例如水、基础盐、常量营养素、微量营养素和/或维生素。再水合培养基通常将不含任何植物激素，诸如生长素或细胞分裂素。在一个实施方案中，可在转化或基因修饰之前使单子叶植物种子胚外植体进行再水合在约30分钟至约24小时范围内的时间段，或在此范围内的任何时间长度，诸如约1小时、约1.5小时、约2小时或约2.5小时、或少于或等于约3小时、或少于或等于约2.5小时、或少于或等于约2小时、或在约1小时至约3小时范围内、或在约1小时至约2.5小时范围内、或在约1.5小时至约2.5小时范围内。与未再水合的外植体相比，在转化或基因修饰之前使胚外植体再水合可将转化或编辑频率或转化或编辑的植物的回收率提高至少约0.2倍、0.4倍、0.6倍、0.8倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、或40倍，包括其间可推导出的所有范围。在具体实施方案中，与再水合约1小时的外植体相比，在转化或基因修饰之前使单子叶植物种子胚外植体再水合至少约2小时可将转化或编辑频率或转化或编辑的植物的回收率提高至少约0.2倍、0.4倍、0.6倍、0.8倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍，包括其间可推导出的所有范围。
在本公开的一些实施方案中，植物的提高的转化或编辑可通过一个或多个不同步骤或植物拔出时的基因分型、瞬时表达、芽频率、正常芽百分比、正常芽频率、正常植物频率、生根芽百分比、和/或总体的转化频率、插植频率、低拷贝数植物频率和/或低拷贝数频率来测量。本文所述的方法可例如将植物的转化或编辑提高至少约0.1倍、0.2倍、0.4倍、0.6倍、0.8倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、7.5倍、10倍、15倍、20倍、30倍或40倍，包括其间可推导出的所有范围。
B.接种和力辅助转化
本文提供了用于遗传转化或修饰单子叶植物种子衍生的外植体或单子叶植物胚外植体的方法和组合物。在一个方面或实施方案中，这些外植体可被定义为包含分生组织或胚分生组织，其含有可以分化或发育以产生多种植物结构(包括但不限于茎、根、叶、种系组织和种子)的植物细胞。事实上，胚外植体可被定义为包含全部或部分的从其他非胚种子组织去除的种子胚并且还包含全部或部分的分生组织或胚分生组织。本发明的实施方案可包括通过用本领域已知的任何合适方法或技术(诸如电穿孔、微射弹轰击或粒子轰击、显微注射、PEG介导的转化、根瘤菌目或农杆菌属介导的转化以及其他直接DNA摄取的方式)将异源多核苷酸分子引入至少一个细胞中来遗传转化或修饰外植体的至少一个细胞。然后可以将全部或部分的异源多核苷酸转化或引入植物细胞的基因组中，表达成一种或多种编辑分子或工具(诸如指导RNA和/或位点特异性核酸酶)和/或提供用于编辑或定点整合的模板。根据许多实施方案，通过根瘤菌目或农杆菌属介导的转化将异源多核苷酸引入至少一个外植体细胞中。引入或接种步骤可在环境光照条件下进行并且可包括使胚外植体经受任何力处理。
根据本发明的实施方案，在用包含异源多核苷酸分子的根瘤菌目或农杆菌属细菌接种单子叶植物种子胚外植体之前、或期间、或之前和期间，对单子叶植物种子胚外植体施加力处理。根据一些实施方案，在单子叶植物种子胚外植体再水合期间和/或之后施加力处理。根据许多实施方案，可以在接种步骤期间在单子叶植物种子胚外植体与接种培养基接触同时施加力处理。在一个实施方案中，与培养基“接触”的外植体可完全或部分放置在培养基中或培养基上。外植体可接触的培养基的非限制性实例包括液体培养基、固体培养基和包含基质的培养基。当施加力处理时，单子叶植物种子胚外植体可浸没在一定体积的接种培养基中。可替代地，可在已经去除过量的接种培养基之后对单子叶植物种子胚外植体施加力处理。例如，可在施加力处理之前，从外植体倒出、倾倒或吸掉接种培养基。如果在接种步骤期间施加力处理，则即使在力处理之前从外植体去除一定量或体积的接种培养基，接种培养基也可能不会完全不接触单子叶植物种子胚外植体。
如本文所用，术语“异源多核苷酸分子”是指在没有人为干预的情况下在被转化的细胞中非天然存在或不以相同形式、结构等天然存在的多核苷酸分子。例如，异源多核苷酸分子可以不是天然存在于被转化的植物物种中，或可以不同于在被转化的物种中发现的天然表达模式或基因组环境(genomic context)的方式或基因组环境表达(例如，过表达)。在一个实施方案中，异源多核苷酸分子可以是两种或更多种多核苷酸分子的组合，其中这种组合通常在自然界中不存在。在某些实施方案中，两种多核苷酸分子可源自不同物种或可源自不同基因，诸如来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。在具体实施方案中，异源多核苷酸分子可包含在任何天然存在的多核苷酸分子中未发现并置或可操作连接的两种多核苷酸序列。在一个实施方案中，异源多核苷酸分子可包含与可转录多核苷酸序列可操作连接的启动子或其他调控序列，其中启动子和可转录多核苷酸序列在任何天然存在的多核苷酸分子中都不可操作连接。如本文所用，术语“多核苷酸分子”是指线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子或序列，其可衍生自任何来源。例如，多核苷酸分子可包含其中一种或多种核酸序列已经以功能性操作方式连接在一起的多核苷酸序列。如本文所用，术语“核酸序列”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列。
根据一些实施方案，多核苷酸分子或异源多核苷酸分子可以是重组多核苷酸分子。如本文所用，当提及多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体、载体等使用时，术语“重组”是指在没有人为干预的情况下非天然存在或不以相同形式、结构等天然存在的多核苷酸或蛋白质分子或序列。在一个实施方案中，重组多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体、载体等可包含例如不以相同方式一起天然存在的两种或更多种多核苷酸或蛋白质序列的组合，诸如包含可操作连接但彼此异源的至少两个多核苷酸或蛋白质序列的多核苷酸分子、蛋白质、构建体等。在另一个实施方案中，重组多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体、载体等可包含例如同一分子(例如，质粒、构建体、载体、染色体、蛋白质等)中的两种或更多种多核苷酸或蛋白质序列的任何组合，其中这种组合是人造的并且通常不存在于自然界中。如该定义所用，短语“通常不存在于自然界中”意指在没有人为干预的情况下不存在于自然界中。重组多核苷酸或蛋白质分子、构建体等可包含(i)与自然界中彼此邻近存在的其他多核苷酸或蛋白质序列分离，和/或(ii)与非天然地彼此邻近的其他多核苷酸或蛋白质序列相邻(或邻接)的多核苷酸或蛋白质序列。这种重组多核苷酸分子、蛋白质、构建体等还可以是指已经过基因工程改造和/或在细胞外构建的多核苷酸或蛋白质分子或序列。例如，重组DNA分子可包含任何工程改造的或人造的质粒、载体等，并且可包括线性或环状DNA分子。此类质粒、载体等可含有各种维持元件，包括例如原核复制起点和可选择标记以及可能除了植物可选择标记基因之外的一种或多种转基因或表达盒等。
可根据光密度(OD)来测量和/或定义接种培养基中的根瘤菌目细菌或农杆菌属的浓度。如实施例中所示，接种和/或共培培养基中更高浓度的农杆菌属可以提高或增加芽频率和插植(plugging)频率，因此提高或增加转化频率。接种培养基中的根瘤菌目细菌或农杆菌属的OD浓度可以在约0.1至约2.0、约0.1至约1.0、约0.1至约0.75、约0.1至约0.5、约0.2至约2.0、约0.2至约1.0、约0.2至约0.5、约0.25至约2.0、约0.5至约2.0、约0.5至约1.5、约0.75至约1.5、或约0.75至约1.25的范围内，或约0.1、0.2、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5或2.0，包括其间可推导出的所有范围。
为了提高植物的转化或编辑，可以在接种步骤之前和/或期间对单子叶植物种子胚外植体使用或施加多种不同的力处理，诸如离心力处理、重力处理、真空处理、超声处理、涡旋处理、剪切处理、机械力处理和/或压力处理、或其任何组合。根据一些实施方案，力处理可包括压力处理和/或重力(或离心力)处理。根据一些实施方案，力处理可包括压力处理。根据一些实施方案，力处理可包括重力(或离心力)处理。在具体实施方案中，除了压力处理和/或重力(或离心力)处理之外，本文所述的方法还可包括施加机械力处理、涡旋处理、摇动或剪切处理、超声处理和/或真空处理。不受理论的束缚，在接种之前或期间施加力处理可通过增加根瘤菌目细菌与单子叶植物种子胚外植体的接触和附着、通过损伤单子叶植物种子胚外植体和/或通过增加根瘤菌目细菌向分生组织或其他植物组织中的渗透来提高转化。
在一些实施方案中，力处理可包括对单子叶植物种子胚外植体施加在约100磅/平方英寸(psi)至约20,000psi、约100psi至约18,000psi、约100psi至约16,000psi、约100至约14,000psi、约100至约12,000psi、约100至约10,000psi、约100至约8,000psi、约100至约6,000psi、约100至约4,000psi、约100至约2,000psi、约100至约1,000psi、或约100psi至约500psi压力范围内，诸如约100psi、约150psi、约200psi、约250psi、约300psi、约350psi、约400psi、或约500psi压力的压力或处理，包括其间可推导出的所有范围。其他压力单位也是本领域已知的。用于将以psi计的压力转换成其他单位(例如标准大气压(atm)和牛顿(N)/平方米(N/m2))的方法是本领域已知的。可以使用以下公式准确计算以atm计的压力：atm＝压力(psi)/14.6959488，以及1psi等于约6894.76N/m2。因此，100psi等于约6.80atm，并且20,000psi等于约1360.9atm。当表面积已知或固定时，压力处理也可以被转换成力的量。例如，本文实施例中使用的French Press 40K压力单元(pressure cell)(IEC,FA-032)的活塞/单元腔的表面积为约0.88in2。因此，使用French Press 40K压力单元施加的3,334psi等于约13,000N[(3,334psi x 0.88in2)]/[0.225磅/N]。在一些实施方案中，压力处理可施加约10秒至约10分钟、约15秒至约8分钟、约30秒至约6分钟、约2分钟至约4分钟、或约3分钟，包括其间可推导出的所有范围。
本文所述的方法包括施加在约100xg至约10,000xg、约100xg至约5,000xg、约250xg至约5,000xg、约500xg至约5,000xg、约500xg至约3,000xg、约600xg至约2,700xg范围内，诸如约500xg、约550xg、约600xg、约650xg、约700xg、约750xg、约800xg、约850xg、约900xg、约950xg、约1000xg、约1500xg、约2000xg、约2500xg、约3000xg、约3500xg、或约4000xg的重力或离心力，可对单子叶植物种子胚外植体施加，包括其间可推导出的所有范围。可对单子叶植物种子胚外植体施加的重力处理的非限制性实例包括离心力或相对离心力，其可使用适当的离心机来施加。用于将重力或离心力(诸如由离心机产生的相对离心力(RCF))转换成其他单位(诸如转数/分钟(rpm)和牛顿(N))的方法是本领域已知的。相对离心力可以根据设备的rpm和已知尺寸使用以下公式来计算：rpm＝√[RCF/(r×1.118)×1×105]，其中r＝旋转半径(以厘米计)。对于本文所述的实施例中使用的SorvallTM RC3BP离心机(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)，旋转半径为约24.67cm。因此，2620xg等于约3,082rpm[√[2620/(24.67x 1.118)]x 1x 105]。类似地，可以使用以下公式准确估算以牛顿计的离心力：力(N)＝RCF x离心管内容物的质量(kg)x 9.82m/s2。在一个实施方案中，如果离心管内容物的质量可为约.05kg，则2620xg将等于约1286N[(2620xg)x.05kg x9.82m/s2]。在一些实施方案中，重力或离心力处理可施加约1分钟至约2小时、约2分钟至约110分钟、约5分钟至约90分钟、约10分钟至约90分钟、约10分钟至约80分钟、约10分钟至约70分钟、约10分钟至约60分钟、约10分钟至约50分钟、约15分钟至约45分钟、或约20分钟至约40分钟，诸如约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、或约60分钟(1小时)，包括其间可推导出的所有范围。
可在约0.5℃至约28℃、约2℃至约28℃、约4℃至约28℃、约10℃至约28℃、约10℃至约25℃、或约15℃至约23℃的温度下施加力处理，诸如重力(或离心力)和/或压力处理，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，如本文所述的施加力处理可将植物的转化或编辑提高至少约0.2倍、0.4倍、0.6倍、0.8倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、或5倍，包括其间可推导出的所有范围。
在本文提供的方法的一个方面，力处理可包括对单子叶植物种子胚外植体施加压力处理和重力处理二者。可在用根瘤菌目细菌接种单子叶植物种子胚外植体之前、期间、或之前和期间施加压力处理和/或重力处理，其中根瘤菌目细菌包含用于转化、编辑或基因修饰单子叶植物种子胚外植体的至少一个植物细胞的异源多核苷酸。在一些实施方案中，在施加重力处理之前施加压力处理。在其他实施方案中，在压力处理之前施加重力处理。根据提高的转化或编辑效率或频率或根据操作方便，可优选施加压力处理和重力处理的顺序。在一些实施方案中，当对单子叶植物种子胚外植体施加压力处理和重力处理的组合时，可在重力处理之前施加压力处理，这可能至少部分是由于在用重力或离心处理将外植体粒化(pelleting)之前更均匀地施加力处理的能力。然而，可以在后续压力处理之前潜在地将离心的或粒化的外植体重悬浮，或可以在不重悬浮的情况下对离心的或粒化的外植体施加压力处理。在本发明的一个方面，与施加仅压力处理或仅重力处理相比，在接种之前、期间、或之前和期间施加压力处理和重力处理可将植物的转化或编辑提高至少约0.2倍、0.4倍、0.6倍、0.8倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍，包括其间可推导出的所有范围。
在另一个方面，本文所述的方法还可包括对单子叶植物种子胚外植体施加真空处理。真空处理可包括例如将单子叶植物种子胚外植体浸没在包含根瘤菌目细菌的液体接种培养基中并使单子叶植物种子胚外植体经受减压，随后快速或逐渐再增压。可替代地，可对未浸没在液体接种培养基中的单子叶植物种子胚外植体施加真空处理。在一些实施方案中，可在施加力处理之前、在施加力处理之后、在施加重力处理之前、在施加重力处理之后、在施加压力处理之前和/或在施加压力处理之后施加真空处理。在具体实施方案中，当力处理包括施加压力处理和重力处理时，可在施加压力处理与施加重力处理之间施加真空处理，无论是重力处理还是压力处理首先施加。在一个实施方案中，单子叶植物种子胚外植体可经受约0.05atm至约0.50atm、约.05atm至约0.40atm、约.05atm至约0.30atm、约.05atm至约0.20atm、约.05atm至约0.10atm、约0.10atm至约0.50atm、约0.10atm至约0.40atm、约0.10至约0.30atm压力、或约0.10atm至约0.20atm压力的真空处理，包括其间可推导出的所有范围。
C.胚外植体的共培养
在用包含异源多核苷酸的根瘤菌目或农杆菌属接种单子叶植物种子胚外植体以将异源多核苷酸引入单子叶植物种子胚外植体的至少一个细胞中后，可将单子叶植物种子胚外植体与共培培养基进行接触共培养。共培培养基可包含例如水、基础盐、常量营养素、微量营养素和/或维生素。然而，根据本发明的实施方案，共培培养基可不含有任何植物激素(诸如生长素或细胞分裂素)和/或任何表面活性剂或润湿剂，尽管可替代地，植物激素或生长素和/或表面活性剂或润湿剂可存在于共培培养基中。在某些实施方案中，表面活性剂可包括本领域已知的任何表面活性剂或表面活性剂的组合，例如洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂或分散剂。在一个实施方案中，表面活性剂可以是或类似的表面活性剂。根据一些实施方案，单子叶植物种子胚外植体可在约15℃至约25℃、或约17℃至约23℃、或约18℃至约20℃范围内的温度下，或在约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃的温度下与共培培养基接触。根据一些实施方案，单子叶植物种子胚外植体可与共培培养基接触约1天至约10天、约2天至约10天、约2天至约8天、约3天至约8天、约4天至约8天、约5天至约7天范围的时间段，诸如约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天或约8天。根据许多实施方案，单子叶植物种子胚外植体可与共培培养基接触至少5天或至少6天。根据本发明的实施方案，与单子叶植物种子胚外植体接触的共培培养基可以是固体、液体或半固体培养基。根据本发明的实施方案，单子叶植物种子胚外植体可与用液体共培培养基润湿、填充或浸泡的基体、纸或网状材料或基质(诸如Whatman或其他滤纸)接触。根据本发明的实施方案，单子叶植物种子胚外植体可与共培培养基接触，但不浸没在共培培养基中。
共培养步骤还可在多种光照条件下进行。虽然通常可使用一定程度的光照，但是可替代地，全部或部分的共培养步骤可在黑暗中进行。光照处理可根据光照/黑暗循环和光强度来量化，其可表示为以μ/m2·s为单位的光合光子通量密度(PPFD)。根据一些实施方案，共培养步骤可在光合有效辐射(PAR)范围为约0μ/m2·s至约200μ/m2·s、20μ/m2·s至约200μ/m2·s、20μ/m2·s至约180μ/m2·s、30μ/m2·s至约180μ/m2·s、30μ/m2·s至约150μ/m2·s、30μ/m2·s至约120μ/m2·s、60μ/m2·s至约120μ/m2·s、70μ/m2·s至约110μ/m2·s、或80μ/m2·s至约100μ/m2·s的平均或设定光强度下进行。根据一些实施方案，共培养步骤可在光合有效辐射(PAR)为约0μ/m2·s、约10μ/m2·s、约20μ/m2·s、约30μ/m2·s、约40μ/m2·s、约50μ/m2·s、约60μ/m2·s、约70μ/m2·s、约80μ/m2·s、约90μ/m2·s、约100μ/m2·s、约110μ/m2·s、约120μ/m2·s、约130μ/m2·s、约140μ/m2·s、约150μ/m2·s、约160μ/m2·s、约170μ/m2·s、约180μ/m2·s、约190μ/m2·s、或约200μ/m2·s的平均或设定光强度下进行。根据一些实施方案，在共培养步骤期间可使用不同量的光照和黑暗循环，其可包括光照存在的时间长度在约0小时至约24小时的光照、约2小时至约22小时的光照、约4小时至约20小时的光照、约8小时至约20小时的光照、约12小时至约20小时的光照、约16小时至约20小时的光照之间，各自具有基于24小时日长的相应时间长度的相应的相对黑暗量。
根据一些实施方案，在共培养步骤期间光照和黑暗循环的量可为约0小时的光照和约24小时的黑暗、约1小时的光照和约23小时的黑暗、约2小时的光照和约22小时的黑暗、约3小时的光照和约21小时的黑暗、约4小时的光照和约20小时的黑暗、约5小时的光照和约19小时的黑暗、约6小时的光照和约18小时的黑暗、约7小时的光照和约17小时的黑暗、约8小时的光照和约16小时的黑暗、约9小时的光照和约15小时的黑暗、约10小时的光照和约14小时的黑暗、约11小时的光照和约13小时的黑暗、约12小时的光照和约12小时的黑暗、约13小时的光照和约11小时的黑暗、约14小时的光照和约10小时的黑暗、约15小时的光照和约9小时的黑暗、约16小时的光照和约8小时的黑暗、约17小时的光照和约7小时的黑暗、约18小时的光照和约6小时的黑暗、约19小时的光照和约5小时的黑暗、约20小时的光照和约4小时的黑暗、约21小时的光照和约3小时的黑暗、约22小时的光照和约2小时的黑暗、约23小时的光照和约1小时的黑暗、约24小时的光照和约0小时的黑暗。
根据一些实施方案，共培培养基可包含能够用异源多核苷酸分子转化外植体的至少一个细胞的根瘤菌目细菌或农杆菌属。如实施例中所示，接种和/或共培培养基中更高浓度的农杆菌属可以提高或增加芽频率和插植频率，因此提高或增加转化频率。共培培养基中的根瘤菌目细菌或农杆菌属的OD浓度可以在约0.1至约2.0、约0.1至约1.0、约0.1至约0.75、约0.1至约0.5、约0.2至约2.0、约0.2至约1.0、约0.2至约0.5、约0.25至约2.0、约0.5至约2.0、约0.5至约1.5、约0.75至约1.5、或约0.75至约1.25范围内，或约0.1、0.2、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5或2.0，包括其间可推导出的所有范围。
D.芽诱导和延长芽诱导
根据本发明的实施方案，可将通过将异源多核苷酸分子引入胚外植体的至少一个细胞中而已转化或编辑的单子叶植物种子胚外植体至少与包含生长素和细胞分裂素的第一芽诱导培养基进行接触培养。在芽诱导之前，单子叶植物种子胚外植体可已经用包含含有异源多核苷酸分子的根瘤菌目或农杆菌属的接种培养基接种，并且单子叶植物种子胚外植体还可已经与共培培养基接触共培养。
如本文所提供，可进一步将单子叶植物种子胚外植体与包含生长素和细胞分裂素的第二或延长芽诱导培养基进行接触培养，然后与再生培养基进行接触培养以产生基因修饰的植物或植物部分。在一些实施方案中，本文所述的方法包括在将单子叶植物种子胚外植体与芽诱导培养基(或第一芽诱导培养基)进行接触培养之后且在由培养的单子叶植物种子胚外植体与再生培养基接触而再生基因修饰的单子叶植物或植物部分之前，将单子叶植物种子胚外植体与第二芽诱导培养基进行接触培养。在另一个实施方案中，(第一)芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可各自包含高细胞分裂素与生长素比率。
根据本发明的实施方案，芽诱导培养基(或第一芽诱导培养基)和第二芽诱导培养基(或延长芽诱导培养基)可各自包含多种标准培养基或溶液成分或组分，例如诸如基础盐、常量营养素、微量营养素、糖、抗生素和/或维生素。芽诱导培养基(或第一芽诱导培养基)和第二芽诱导培养基(或延长芽诱导培养基)可各自包含生长素和细胞分裂素。芽诱导培养基(或第一芽诱导培养基)和第二芽诱导培养基(或延长芽诱导培养基)可各自包含一种或多种选择剂，尽管根据许多实施方案，第一芽诱导培养基中不存在选择剂。第一芽诱导培养基中不存在选择剂可使第一芽诱导培养基起到延迟培养基的作用。选择剂的特性将通常取决于引入单子叶植物种子胚外植体中的异源多核苷酸分子中存在的可选择标记基因。芽诱导培养基(或第一芽诱导培养基)和/或第二芽诱导培养基(或延长芽诱导培养基)可各自是固体、半固体或液体培养基，尽管这些培养基中的每一种通常可以是固体培养基。固体培养基可包含可以固化并形成固体培养基的胶凝剂或聚合剂或成分，诸如琼脂糖等。
如本文所用，“高细胞分裂素与生长素比率”通常是指其中与培养基中存在的生长素活性水平相比，细胞分裂素活性水平相对较高的条件，其通常可以是以重量/体积计至少约1:1或更高的细胞分裂素:生长素比率；然而，条件是确切的细胞分裂素:生长素比率将取决于生长素和细胞分裂素的确切化学特性，因为不同的生长素和细胞分裂素可以具有不同的活性和/或作用方式，如本领域已知的。具有高细胞分裂素与生长素比率的培养基中细胞分裂素和生长素的水平可例如以约1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、10.5:1、11:1、11.5:1、12:1、12.5:1、13:1、13.5:1、14:1、14.5:1或15:1的比率(包括其间可推导出的所有范围)存在于培养基中(根据重量/体积来测量)。
具有高细胞分裂素与生长素比率的培养基中细胞分裂素和生长素的水平可例如大于或等于约1:1或至少约1:1或更高、大于或等于约1.5:1或至少约1.5:1或更高、大于或等于约2:1或至少约2:1或更高、大于或等于约2.5:1或至少约2.5:1或更高、大于或等于约3:1或至少约3:1或更高、大于或等于约3.5:1或至少约3.5:1或更高、大于或等于约4:1或至少约4:1或更高、大于或等于约4.5:1或至少约4.5:1或更高、大于或等于约5:1或至少约5:1或更高、大于或等于约5.5:1或至少约5.5:1或更高、大于或等于约6:1或至少约6:1或更高、大于或等于约6.5:1或至少约6.5:1或更高、大于或等于约7:1或至少约7:1或更高、大于或等于约7.5:1或至少约7.5:1或更高、大于或等于约8:1或至少约8:1或更高、大于或等于约8.5:1或至少约8.5:1或更高、大于或等于约9:1或至少约9:1或更高、大于或等于约9.5:1或至少约9.5:1或更高、大于或等于约10:1或至少约10:1或更高、大于或等于约10.5:1或至少约10.5:1或更高、大于或等于约11:1或至少约11:1或更高、大于或等于约11.5:1或至少约11.5:1或更高、或者大于或等于约12:1或至少约12:1或更高，包括其间可推导出的所有范围。
具有高细胞分裂素与生长素比率的培养基中细胞分裂素和生长素的水平可例如在约1:1至约12:1、约2:1至约12:1、约4:1至约12:1、约6:1至约12:1、约8:1至约12:1、约1:1至约10:1、约2:1至约10:1、约4:1至约10:1、约6:1至约10:1、约8:1至约10:1、约1:1至约8:1、约2:1至约8:1、约4:1至约8:1、约6:1至约8:1、约1:1至约6:1、约2:1至约6:1、约4:1至约6:1、约1:1至约5:1、约2:1至约5:1、约3:1至约5:1、约1:1至约4:1、约2:1至约4:1、约3:1至约4:1、约1:1至约3:1、或约1:1至约2:1之间的范围内，包括其间可推导出的所有范围。
根据本发明可使用的细胞分裂素的非限制性实例可包括但不限于6-苄氨基嘌呤(BAP)、噻苯隆(TDZ)、(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲(4-CPPU)、激动素、玉米素、二苯脲(DPU)、6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)和6-(3-羟基苄氨基)嘌呤(间-拓扑林)。根据本发明可使用的生长素可包括但不限于：2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)、4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、4-氯苯氧基乙酸或对-氯-苯氧基乙酸(4-CPA或pCPA)、2,4,5-三氯-苯氧基乙酸(2,4,5-T)、2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)、苯乙酸(PAA)和3,6-二氯-2-甲氧基-苯甲酸(麦草畏)。
根据本发明的实施方案，芽诱导培养基(或第一芽诱导培养基)可包含与第二芽诱导培养基(或延长芽诱导培养基)相同或不同的生长素和/或相同或不同的细胞分裂素。芽诱导培养基(或第一芽诱导培养基)可包含第一生长素和第一细胞分裂素，并且第二芽诱导培养基或延长芽诱导培养基可包含第一生长素或第二生长素和第一细胞分裂素或第二细胞分裂素。根据一些实施方案，第二芽诱导培养基(或延长芽诱导培养基)可包含与芽诱导培养基(或第一芽诱导培养基)相同的生长素或不同的生长素。根据一些实施方案，第二芽诱导培养基(或延长芽诱导培养基)可包含与芽诱导培养基(或第一芽诱导培养基)相同的细胞分裂素或不同的细胞分裂素。
根据本发明的实施方案，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中细胞分裂素(或两种或更多种细胞分裂素)的浓度在约0.1mg/L至约100.0mg/L、1mg/L至约90.0mg/L、1mg/L至约80.0mg/L、1mg/L至约75.0mg/L、2mg/L至约90.0mg/L、2mg/L至约80.0mg/L、2mg/L至约75.0mg/L、5mg/L至约90.0mg/L、5mg/L至约80.0mg/L、5mg/L至约75.0mg/L、5mg/L至约70.0mg/L、10mg/L至约90.0mg/L、10mg/L至约80.0mg/L、10mg/L至约75.0mg/L、10mg/L至约70.0mg/L、15mg/L至约90.0mg/L、15mg/L至约80.0mg/L、15mg/L至约75.0mg/L、15mg/L至约70.0mg/L、20mg/L至约90.0mg/L、20mg/L至约80.0mg/L、20mg/L至约75.0mg/L、20mg/L至约70.0mg/L、20mg/L至约60.0mg/L、30mg/L至约90.0mg/L、30mg/L至约80.0mg/L、30mg/L至约75.0mg/L、30mg/L至约70.0mg/L、30mg/L至约60.0mg/L、40mg/L至约90.0mg/L、40mg/L至约80.0mg/L、40mg/L至约75.0mg/L、40mg/L至约70.0mg/L、40mg/L至约60.0mg/L、约0.1mg/L至约25.0mg/L、约0.1mg/L至约20.0mg/L、约0.1mg/L至约15.0mg/L、约0.2mg/L至约25.0mg/L、约0.2mg/L至约20.0mg/L、约0.2mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约25.0mg/L、约0.5mg/L至约20.0mg/L、约0.5mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约12.5mg/L、约1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约5.0mg/L至约25.0mg/L、约5.0mg/L至约20.0mg/L、约5.0mg/L至约15.0mg/L、约5.0mg/L至约12.5mg/L、约7.5mg/L至约25.0mg/L、约7.5mg/L至约20.0mg/L、约7.5mg/L至约15.0mg/L、约7.5mg/L至约12.5mg/L、约0.1mg/L至约15.0mg/L、约0.1mg/L至约12.5mg/L、约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约15.0mg/L、约0.2mg/L至约12.5mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约12.5mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约4.0mg/L、或约1.0mg/L至约3.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基或第二芽诱导培养基中细胞分裂素的浓度可为例如约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、约20.0mg/L、约21.0mg/L、约22.0mg/L、约23.0mg/L、约24.0mg/L、约25.0mg/L、约30mg/L、约40mg/L、约50mg/L、约60mg/L、约70mg/L、约75mg/L、约80mg/L、约90mg/L、或约100mg/L，包括其间可推导出的所有范围。第一芽诱导培养基和第二芽诱导培养基中的细胞分裂素可相同或不同，并且这些芽诱导培养基中的每一种都可包含一种或多种细胞分裂素。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中生长素(或两种或更多种生长素)的浓度在约0.01mg/L至约25.0mg/L、约0.05mg/L至约25mg/L、约0.1mg/L至约25.0mg/L、约0.1mg/L至约20.0mg/L、约0.1mg/L至约15.0mg/L、约0.2mg/L至约25.0mg/L、约0.2mg/L至约20.0mg/L、约0.2mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约25.0mg/L、约0.5mg/L至约20.0mg/L、约0.5mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约12.5mg/L、约1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约5.0mg/L至约25.0mg/L、约5.0mg/L至约20.0mg/L、约5.0mg/L至约15.0mg/L、约5.0mg/L至约12.5mg/L、约7.5mg/L至约25.0mg/L、约7.5mg/L至约20.0mg/L、约7.5mg/L至约15.0mg/L、约7.5mg/L至约12.5mg/L、约8.0mg/L至约12.0mg/L、约9.0mg/L至约11.0mg/L、约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约7.0mg/L、约1.0mg/L至约6.0mg/L、约2.0mg/L至约10.0mg/L、约2.0mg/L至约7.5mg/L、约2.0mg/L至约7.0mg/L、约2.0mg/L至约6.0mg/L、约3.0mg/L至约10.0mg/L、约3.0mg/L至约7.5mg/L、约3.0mg/L至约7.0mg/L、约3.0mg/L至约6.0mg/L、约4.0mg/L至约10.0mg/L、约4.0mg/L至约7.5mg/L、约4.0mg/L至约7.0mg/L、约4.0mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约15.0mg/L、约0.1mg/L至约12.5mg/L、约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约15.0mg/L、约0.2mg/L至约12.5mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约12.5mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约4.0mg/L、约1.0mg/L至约3.0mg/L、约1.5mg/L至约2.5mg/L、约0.1mg/L至约2.0mg/L、约0.1mg/L至约1.5mg/L、约0.1mg/L至约1.25mg/L、约0.1mg/L至约1.2mg/L、约0.1mg/L至约1.1mg/L、约0.2mg/L至约2.0mg/L、约0.2mg/L至约1.5mg/L、约0.2mg/L至约1.25mg/L、约0.2mg/L至约1.2mg/L、约0.2mg/L至约1.1mg/L、约0.5mg/L至约2.0mg/L、约0.5mg/L至约1.5mg/L、约0.5mg/L至约1.25mg/L、约0.5mg/L至约1.2mg/L、约0.5mg/L至约1.1mg/L、约0.75mg/L至约2.0mg/L、约0.75mg/L至约1.5mg/L、约0.75mg/L至约1.25mg/L、约0.75mg/L至约1.2mg/L、约0.75mg/L至约1.1mg/L、约0.8mg/L至约2.0mg/L、约0.8mg/L至约1.5mg/L、约0.8mg/L至约1.25mg/L、约0.8mg/L至约1.2mg/L、约0.8mg/L至约1.1mg/L、约0.9mg/L至约2.0mg/L、约0.9mg/L至约1.5mg/L、约0.9mg/L至约1.25mg/L、约0.9mg/L至约1.2mg/L、约0.9mg/L至约1.1mg/L、约0.1mg/L至约1.0mg/L、约0.1mg/L至约0.75mg/L、约0.1mg/L至约0.7mg/L、约0.1mg/L至约0.6mg/L、约0.2mg/L至约1.0mg/L、约0.2mg/L至约0.75mg/L、约0.2mg/L至约0.7mg/L、约0.2mg/L至约0.6mg/L、约0.3mg/L至约1.0mg/L、约0.3mg/L至约0.75mg/L、约0.3mg/L至约0.7mg/L、约0.3mg/L至约0.6mg/L、约0.4mg/L至约1.0mg/L、约0.4mg/L至约0.75mg/L、约0.4mg/L至约0.7mg/L、约0.4mg/L至约0.6mg/L、约0.05mg/L至约7.5mg/L、约0.02mg/L至约5mg/L、或约0.75mg/L至约2.5mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基或第二芽诱导培养基中生长素的浓度可为例如约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、约20.0mg/L、约21.0mg/L、约22.0mg/L、约23.0mg/L、约24.0mg/L、或约25.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。第一芽诱导培养基和第二芽诱导培养基中的生长素可以相同或不同，并且这些培养基中的每一种都可包含一种或多种生长素。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含细胞分裂素，其中细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤(BAP)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中的BAP的浓度可在约1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约5.0mg/L至约25.0mg/L、约5.0mg/L至约20.0mg/L、约5.0mg/L至约15.0mg/L、约5.0mg/L至约12.5mg/L、约7.5mg/L至约25.0mg/L、约7.5mg/L至约20.0mg/L、约7.5mg/L至约15.0mg/L、约7.5mg/L至约12.5mg/L、约8.0mg/L至约12.0mg/L、或约9.0mg/L至约11.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中的BAP的浓度可为约1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、约20.0mg/L、约21.0mg/L、约22.0mg/L、约23.0mg/L、约24.0mg/L、或约25.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含细胞分裂素，其中细胞分裂素是噻苯隆(TDZ)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中的TDZ的浓度可在约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约7.0mg/L、约1.0mg/L至约6.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约4.0mg/L、约1.0mg/L至约3.0mg/L、或约1.5mg/L至约2.5mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中的TDZ的浓度可为约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、或约10.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含细胞分裂素，其中细胞分裂素是N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲(4-CPPU)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中4-CPPU的浓度可在约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约7.0mg/L、约1.0mg/L至约6.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约4.0mg/L、约1.0mg/L至约3.0mg/L、或约1.5mg/L至约2.5mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中4-CPPU的浓度可为约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、或约10.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含细胞分裂素，其中细胞分裂素是激动素。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中激动素的浓度可在约1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约5.0mg/L至约25.0mg/L、约5.0mg/L至约20.0mg/L、约5.0mg/L至约15.0mg/L、约5.0mg/L至约12.5mg/L、约7.5mg/L至约25.0mg/L、约7.5mg/L至约20.0mg/L、约7.5mg/L至约15.0mg/L、约7.5mg/L至约12.5mg/L、约8.0mg/L至约12.0mg/L、或约9.0mg/L至约11.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中激动素的浓度可为约1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、约20.0mg/L、约21.0mg/L、约22.0mg/L、约23.0mg/L、约24.0mg/L、或约25.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含细胞分裂素，其中细胞分裂素是玉米素。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中玉米素的浓度可在约1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约5.0mg/L至约25.0mg/L、约5.0mg/L至约20.0mg/L、约5.0mg/L至约15.0mg/L、约5.0mg/L至约12.5mg/L、约7.5mg/L至约25.0mg/L、约7.5mg/L至约20.0mg/L、约7.5mg/L至约15.0mg/L、约7.5mg/L至约12.5mg/L、约8.0mg/L至约12.0mg/L、或约9.0mg/L至约11.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中玉米素的浓度可为约1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、约20.0mg/L、约21.0mg/L、约22.0mg/L、约23.0mg/L、约24.0mg/L、或约25.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含细胞分裂素，其中细胞分裂素是6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中的2iP的浓度可在5mg/L至约100.0mg/L、5mg/L至约90.0mg/L、5mg/L至约80.0mg/L、5mg/L至约75.0mg/L、5mg/L至约70.0mg/L、10mg/L至约100.0mg/L、10mg/L至约90.0mg/L、10mg/L至约80.0mg/L、10mg/L至约75.0mg/L、10mg/L至约70.0mg/L、15mg/L至约100.0mg/L、15mg/L至约90.0mg/L、15mg/L至约80.0mg/L、15mg/L至约75.0mg/L、15mg/L至约70.0mg/L、20mg/L至约100.0mg/L、20mg/L至约90.0mg/L、20mg/L至约80.0mg/L、20mg/L至约75.0mg/L、20mg/L至约70.0mg/L、20mg/L至约60.0mg/L、30mg/L至约100.0mg/L、30mg/L至约90.0mg/L、30mg/L至约80.0mg/L、30mg/L至约75.0mg/L、30mg/L至约70.0mg/L、30mg/L至约60.0mg/L、40mg/L至约100.0mg/L、40mg/L至约90.0mg/L、40mg/L至约80.0mg/L、40mg/L至约75.0mg/L、40mg/L至约70.0mg/L、40mg/L至约60.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中的2iP的浓度可为约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、约20.0mg/L、约21.0mg/L、约22.0mg/L、约23.0mg/L、约24.0mg/L、或约25.0mg/L、约30mg/L、约40mg/L、约50mg/L、约60mg/L、约70mg/L、约75mg/L、约80mg/L、约90mg/L、或约100mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含细胞分裂素，其中细胞分裂素是6-(3-羟基苄氨基)嘌呤(间-拓扑林)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中间-拓扑林的浓度可在约1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约5.0mg/L至约25.0mg/L、约5.0mg/L至约20.0mg/L、约5.0mg/L至约15.0mg/L、约5.0mg/L至约12.5mg/L、约7.5mg/L至约25.0mg/L、约7.5mg/L至约20.0mg/L、约7.5mg/L至约15.0mg/L、约7.5mg/L至约12.5mg/L、约8.0mg/L至约12.0mg/L、或约9.0mg/L至约11.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中间-拓扑林的浓度可为约1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、约20.0mg/L、约21.0mg/L、约22.0mg/L、约23.0mg/L、约24.0mg/L、或约25.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含生长素，其中生长素是2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中的2,4-D的浓度可在约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.1mg/L至约2.0mg/L、约0.1mg/L至约1.5mg/L、约0.1mg/L至约1.25mg/L、约0.1mg/L至约1.2mg/L、约0.1mg/L至约1.1mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约2.0mg/L、约0.2mg/L至约1.5mg/L、约0.2mg/L至约1.25mg/L、约0.2mg/L至约1.2mg/L、约0.2mg/L至约1.1mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约2.0mg/L、约0.5mg/L至约1.5mg/L、约0.5mg/L至约1.25mg/L、约0.5mg/L至约1.2mg/L、约0.5mg/L至约1.1mg/L、约0.75mg/L至约2.0mg/L、约0.75mg/L至约1.5mg/L、约0.75mg/L至约1.25mg/L、约0.75mg/L至约1.2mg/L、约0.75mg/L至约1.1mg/L、约0.8mg/L至约2.0mg/L、约0.8mg/L至约1.5mg/L、约0.8mg/L至约1.25mg/L、约0.8mg/L至约1.2mg/L、约0.8mg/L至约1.1mg/L、约0.9mg/L至约2.0mg/L、约0.9mg/L至约1.5mg/L、约0.9mg/L至约1.25mg/L、约0.9mg/L至约1.2mg/L、约0.9mg/L至约1.1mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中的2,4-D的浓度可为约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、或约10.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含生长素，其中生长素是2,4,5-三氯-苯氧基乙酸(2,4,5-T)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中的2,4,5-T的浓度可在约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.1mg/L至约2.0mg/L、约0.1mg/L至约1.5mg/L、约0.1mg/L至约1.25mg/L、约0.1mg/L至约1.2mg/L、约0.1mg/L至约1.1mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约2.0mg/L、约0.2mg/L至约1.5mg/L、约0.2mg/L至约1.25mg/L、约0.2mg/L至约1.2mg/L、约0.2mg/L至约1.1mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约2.0mg/L、约0.5mg/L至约1.5mg/L、约0.5mg/L至约1.25mg/L、约0.5mg/L至约1.2mg/L、约0.5mg/L至约1.1mg/L、约0.75mg/L至约2.0mg/L、约0.75mg/L至约1.5mg/L、约0.75mg/L至约1.25mg/L、约0.75mg/L至约1.2mg/L、约0.75mg/L至约1.1mg/L、约0.8mg/L至约2.0mg/L、约0.8mg/L至约1.5mg/L、约0.8mg/L至约1.25mg/L、约0.8mg/L至约1.2mg/L、约0.8mg/L至约1.1mg/L、约0.9mg/L至约2.0mg/L、约0.9mg/L至约1.5mg/L、约0.9mg/L至约1.25mg/L、约0.9mg/L至约1.2mg/L、约0.9mg/L至约1.1mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中的2,4,5-T的浓度可为约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、或约10.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含生长素，其中生长素是4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中毒莠定的浓度可在约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约7.0mg/L、约1.0mg/L至约6.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约4.0mg/L、约1.0mg/L至约3.0mg/L、或约1.5mg/L至约2.5mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中毒莠定的浓度可为约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、或约10.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含生长素，其中生长素是吲哚-3-乙酸(IAA)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中IAA的浓度可在约0.1mg/L至约25.0mg/L、约0.1mg/L至约20.0mg/L、约0.1mg/L至约15.0mg/L、约0.2mg/L至约25.0mg/L、约0.2mg/L至约20.0mg/L、约0.2mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约25.0mg/L、约0.5mg/L至约20.0mg/L、约0.5mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约12.5mg/L、1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约5.0mg/L至约25.0mg/L、约5.0mg/L至约20.0mg/L、约5.0mg/L至约15.0mg/L、约5.0mg/L至约12.5mg/L、约7.5mg/L至约25.0mg/L、约7.5mg/L至约20.0mg/L、约7.5mg/L至约15.0mg/L、约7.5mg/L至约12.5mg/L、约8.0mg/L至约12.0mg/L、或约9.0mg/L至约11.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中IAA的浓度可为约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、约1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、约20.0mg/L、约21.0mg/L、约22.0mg/L、约23.0mg/L、约24.0mg/L、或约25.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含生长素，其中生长素是吲哚-3-丁酸(IBA)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中IBA的浓度可在约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约7.0mg/L、约1.0mg/L至约6.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约4.0mg/L、约1.0mg/L至约3.0mg/L、或约1.5mg/L至约2.5mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中IBA的浓度可为约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、或约10.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含生长素，其中生长素是萘乙酸(NAA)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中NAA的浓度可在约0.1mg/L至约25.0mg/L、约0.1mg/L至约20.0mg/L、约0.1mg/L至约15.0mg/L、约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约25.0mg/L、约0.2mg/L至约20.0mg/L、约0.2mg/L至约15.0mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约25.0mg/L、约0.5mg/L至约20.0mg/L、约0.5mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约12.5mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约7.0mg/L、约1.0mg/L至约6.0mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约10.0mg/L、约2.0mg/L至约7.5mg/L、约2.0mg/L至约7.0mg/L、约2.0mg/L至约6.0mg/L、约3.0mg/L至约25.0mg/L、约3.0mg/L至约20.0mg/L、约3.0mg/L至约15.0mg/L、约3.0mg/L至约12.5mg/L、约3.0mg/L至约10.0mg/L、约3.0mg/L至约7.5mg/L、约3.0mg/L至约7.0mg/L、约3.0mg/L至约6.0mg/L、约4.0mg/L至约25.0mg/L、约4.0mg/L至约20.0mg/L、约4.0mg/L至约15.0mg/L、约4.0mg/L至约12.5mg/L、约4.0mg/L至约10.0mg/L、约4.0mg/L至约7.5mg/L、约4.0mg/L至约7.0mg/L、约4.0mg/L至约6.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中NAA的浓度可为0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、约1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、或约20.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含生长素，其中生长素是2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中TIBA的浓度可在约0.1mg/L至约25.0mg/L、约0.1mg/L至约20.0mg/L、约0.1mg/L至约15.0mg/L、约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约25.0mg/L、约0.2mg/L至约20.0mg/L、约0.2mg/L至约15.0mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约25.0mg/L、约0.5mg/L至约20.0mg/L、约0.5mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约12.5mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约7.0mg/L、约1.0mg/L至约6.0mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约10.0mg/L、约2.0mg/L至约7.5mg/L、约2.0mg/L至约7.0mg/L、约2.0mg/L至约6.0mg/L、约3.0mg/L至约25.0mg/L、约3.0mg/L至约20.0mg/L、约3.0mg/L至约15.0mg/L、约3.0mg/L至约12.5mg/L、约3.0mg/L至约10.0mg/L、约3.0mg/L至约7.5mg/L、约3.0mg/L至约7.0mg/L、约3.0mg/L至约6.0mg/L、约4.0mg/L至约25.0mg/L、约4.0mg/L至约20.0mg/L、约4.0mg/L至约15.0mg/L、约4.0mg/L至约12.5mg/L、约4.0mg/L至约10.0mg/L、约4.0mg/L至约7.5mg/L、约4.0mg/L至约7.0mg/L、约4.0mg/L至约6.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中TIBA的浓度可为0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、约1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、或约20.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含生长素，其中生长素是苯乙酸(PAA)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中PAA的浓度可在约0.1mg/L至约25.0mg/L、约0.1mg/L至约20.0mg/L、约0.1mg/L至约15.0mg/L、约0.2mg/L至约25.0mg/L、约0.2mg/L至约20.0mg/L、约0.2mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约25.0mg/L、约0.5mg/L至约20.0mg/L、约0.5mg/L至约15.0mg/L、约0.5mg/L至约12.5mg/L、1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约5.0mg/L至约25.0mg/L、约5.0mg/L至约20.0mg/L、约5.0mg/L至约15.0mg/L、约5.0mg/L至约12.5mg/L、约7.5mg/L至约25.0mg/L、约7.5mg/L至约20.0mg/L、约7.5mg/L至约15.0mg/L、约7.5mg/L至约12.5mg/L、约8.0mg/L至约12.0mg/L、或约9.0mg/L至约11.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中PAA的浓度可为约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、约1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、约10.0mg/L、约11.0mg/L、约12.0mg/L、约13.0mg/L、约14.0mg/L、约15.0mg/L、约16.0mg/L、约17.0mg/L、约18.0mg/L、约19.0mg/L、约20.0mg/L、约21.0mg/L、约22.0mg/L、约23.0mg/L、约24.0mg/L、或约25.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基可包含生长素，其中生长素是3,6-二氯-2-甲氧基-苯甲酸(麦草畏)。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中麦草畏的浓度可在约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约7.0mg/L、约1.0mg/L至约6.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约4.0mg/L、约1.0mg/L至约3.0mg/L、或约1.5mg/L至约2.5mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，第一芽诱导培养基和/或第二(或延长的)芽诱导培养基中麦草畏的浓度可为约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L、约3.0mg/L、约3.5mg/L、约4.0mg/L、约4.5mg/L、约5.0mg/L、约6.0mg/L、约7.0mg/L、约8.0mg/L、约9.0mg/L、或约10.0mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
根据一些实施方案，第一芽诱导培养基包含第一生长素和第一细胞分裂素，其中第一生长素是2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)并且第一细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤(BAP)。根据这些实施方案，第一芽诱导培养基中的2,4-D的浓度可在约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.1mg/L至约2.0mg/L、约0.1mg/L至约1.5mg/L、约0.1mg/L至约1.25mg/L、约0.1mg/L至约1.2mg/L、约0.1mg/L至约1.1mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约2.0mg/L、约0.2mg/L至约1.5mg/L、约0.2mg/L至约1.25mg/L、约0.2mg/L至约1.2mg/L、约0.2mg/L至约1.1mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约2.0mg/L、约0.5mg/L至约1.5mg/L、约0.5mg/L至约1.25mg/L、约0.5mg/L至约1.2mg/L、约0.5mg/L至约1.1mg/L、约0.75mg/L至约2.0mg/L、约0.75mg/L至约1.5mg/L、约0.75mg/L至约1.25mg/L、约0.75mg/L至约1.2mg/L、约0.75mg/L至约1.1mg/L、约0.8mg/L至约2.0mg/L、约0.8mg/L至约1.5mg/L、约0.8mg/L至约1.25mg/L、约0.8mg/L至约1.2mg/L、约0.8mg/L至约1.1mg/L、约0.9mg/L至约2.0mg/L、约0.9mg/L至约1.5mg/L、约0.9mg/L至约1.25mg/L、约0.9mg/L至约1.2mg/L、约0.9mg/L至约1.1mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。根据这些实施方案，第一芽诱导培养基中的6-苄氨基嘌呤(BAP)的浓度可在约1.0mg/L至约25.0mg/L、约1.0mg/L至约20.0mg/L、约1.0mg/L至约15.0mg/L、约1.0mg/L至约12.5mg/L、约2.0mg/L至约25.0mg/L、约2.0mg/L至约20.0mg/L、约2.0mg/L至约15.0mg/L、约2.0mg/L至约12.5mg/L、约5.0mg/L至约25.0mg/L、约5.0mg/L至约20.0mg/L、约5.0mg/L至约15.0mg/L、约5.0mg/L至约12.5mg/L、约7.5mg/L至约25.0mg/L、约7.5mg/L至约20.0mg/L、约7.5mg/L至约15.0mg/L、约7.5mg/L至约12.5mg/L、约8.0mg/L至约12.0mg/L、或约9.0mg/L至约11.0mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。
根据一些实施方案，第二(或延长的)芽诱导培养基包含第二生长素和第二细胞分裂素，其中第二生长素是4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)并且第二细胞分裂素是噻苯隆(TDZ)。根据这些实施方案，第二(或延长的)芽诱导培养基中毒莠定的浓度可在约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约7.0mg/L、约1.0mg/L至约6.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约4.0mg/L、约1.0mg/L至约3.0mg/L、或约1.5mg/L至约2.5mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。根据这些实施方案，第二(或延长的)芽诱导培养基中的TDZ的浓度可在约0.1mg/L至约10.0mg/L、约0.1mg/L至约7.5mg/L、约0.1mg/L至约7.0mg/L、约0.1mg/L至约6.0mg/L、约0.1mg/L至约5.0mg/L、约0.1mg/L至约4.0mg/L、约0.1mg/L至约3.0mg/L、约0.2mg/L至约10.0mg/L、约0.2mg/L至约7.5mg/L、约0.2mg/L至约7.0mg/L、约0.2mg/L至约6.0mg/L、约0.2mg/L至约5.0mg/L、约0.2mg/L至约4.0mg/L、约0.2mg/L至约3.0mg/L、约0.5mg/L至约10.0mg/L、约0.5mg/L至约7.5mg/L、约0.5mg/L至约7.0mg/L、约0.5mg/L至约6.0mg/L、约0.5mg/L至约5.0mg/L、约0.5mg/L至约4.0mg/L、约0.5mg/L至约3.0mg/L、约1.0mg/L至约10.0mg/L、约1.0mg/L至约7.5mg/L、约1.0mg/L至约7.0mg/L、约1.0mg/L至约6.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约5.0mg/L、约1.0mg/L至约4.0mg/L、约1.0mg/L至约3.0mg/L、或约1.5mg/L至约2.5mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。
根据本发明的实施方案，单子叶植物种子胚外植体可与第一芽诱导培养基接触培养约2天至约14天、约4天至约12天、约5天至约10天、或约6天至约8天，包括其间可推导出的所有范围。根据一些实施方案，单子叶植物种子胚外植体与第一芽诱导培养基接触培养约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天(或约1周)、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、或约14天(或约2周)，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，可将单子叶植物种子胚外植体与第一芽诱导培养基在约20℃至约30℃、约22℃至约28℃、约25℃至约30℃、约25℃至约29℃、或约25℃至约28℃范围内(包括其间可推导出的所有范围)的温度下进行接触培养。根据一些实施方案，可将单子叶植物种子胚外植体与第一芽诱导培养基在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、或约30℃(包括其间可推导出的所有范围)的温度下进行接触培养。根据本公开的一个方面，单子叶植物种子胚外植体在高温下与第一芽诱导培养基接触，该高温可在约30℃至约40℃、约30℃至约38℃、约30℃至约36℃、约30℃至约35℃、约31℃至约40℃、约31℃至约38℃、约31℃至约36℃、约31℃至约35℃、约32℃至约40℃、约32℃至约38℃、约32℃至约36℃、约32℃至约35℃、约33℃至约40℃、约33℃至约38℃、约33℃至约36℃、或约33℃至约35℃的范围内，包括其间可推导出的所有范围。根据一些实施方案，可将单子叶植物种子胚外植体与第一芽诱导培养基在约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、或约40℃(包括其间可推导出的所有范围)的高温下进行接触培养。第一芽诱导培养基中通常可以不存在选择剂，但是可替代地，第一芽诱导培养基可包含选择剂。
在另一个方面，在第一芽诱导步骤期间，与将外植体在较低温度下(例如在约20℃至约30℃范围内的温度下)与第一芽诱导培养基进行接触培养相比，将单子叶植物种子胚外植体在高温(例如约30℃至约40℃范围内的温度)下与第一芽诱导培养基接触培养约一周可将转化提高至少约0.2倍、0.4倍、0.6倍、0.8倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或40倍，包括其间可推导出的所有范围。
第一芽诱导步骤还可在多种光照条件下进行。虽然通常可使用一定程度的光照，但是可替代地，全部或部分的第一芽诱导步骤可在黑暗中进行。根据一些实施方案，第一芽诱导步骤可在光合有效辐射(PAR)范围为约0μ/m2·s至约200μ/m2·s、20μ/m2·s至约200μ/m2·s、20μ/m2·s至约180μ/m2·s、30μ/m2·s至约180μ/m2·s、50μ/m2·s至约180μ/m2·s、50μ/m2·s至约150μ/m2·s、60μ/m2·s至约150μ/m2·s、70μ/m2·s至约140μ/m2·s、80μ/m2·s至约130μ/m2·s、或90μ/m2·s至约120μ/m2·s的平均或设定光强度下进行。根据一些实施方案，第一芽诱导步骤可在光合有效辐射(PAR)为约0μ/m2·s、约10μ/m2·s、约20μ/m2·s、约30μ/m2·s、约40μ/m2·s、约50μ/m2·s、约60μ/m2·s、约70μ/m2·s、约80μ/m2·s、约90μ/m2·s、约100μ/m2·s、约110μ/m2·s、约120μ/m2·s、约130μ/m2·s、约140μ/m2·s、约150μ/m2·s、约160μ/m2·s、约170μ/m2·s、约180μ/m2·s、约190μ/m2·s、或约200μ/m2·s的平均或设定光强度下进行。根据一些实施方案，在第一芽诱导步骤期间可使用不同量的光照和黑暗循环，其可包括光照存在的时间长度在约0小时至约24小时的光照、约2小时至约22小时的光照、约4小时至约20小时的光照、约8小时至约20小时的光照、约12小时至约20小时的光照、约16小时至约20小时的光照之间，各自具有基于24小时日长的相应时间长度的相应的相对黑暗量。
根据一些实施方案，在第一芽诱导步骤期间光照和黑暗循环的量可为约0小时的光照和约24小时的黑暗、约1小时的光照和约23小时的黑暗、约2小时的光照和约22小时的黑暗、约3小时的光照和约21小时的黑暗、约4小时的光照和约20小时的黑暗、约5小时的光照和约19小时的黑暗、约6小时的光照和约18小时的黑暗、约7小时的光照和约17小时的黑暗、约8小时的光照和约16小时的黑暗、约9小时的光照和约15小时的黑暗、约10小时的光照和约14小时的黑暗、约11小时的光照和约13小时的黑暗、约12小时的光照和约12小时的黑暗、约13小时的光照和约11小时的黑暗、约14小时的光照和约10小时的黑暗、约15小时的光照和约9小时的黑暗、约16小时的光照和约8小时的黑暗、约17小时的光照和约7小时的黑暗、约18小时的光照和约6小时的黑暗、约19小时的光照和约5小时的黑暗、约20小时的光照和约4小时的黑暗、约21小时的光照和约3小时的黑暗、约22小时的光照和约2小时的黑暗、约23小时的光照和约1小时的黑暗、约24小时的光照和约0小时的黑暗。
根据本发明的实施方案，可将单子叶植物种子胚外植体与第二(或延长的)芽诱导培养基接触培养约4天至约28天、约4天至约25天、约4天至约21天、约5天至约25天、约5天至约23天、约7天至约21天、约5天至约15天、约7天至约14天、约12天至约23天、或约14天至约21天，包括其间可推导出的所有范围。根据一些实施方案，可将单子叶植物种子胚外植体与第二(或延长的)芽诱导培养基接触培养约4天、约5天、约6天、约7天(或约1周)、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天(或约2周)、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天(或约3周)、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、或约28天(或约4周)，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，可将单子叶植物种子胚外植体与第二(或延长的)芽诱导培养基在约20℃至约32℃、约20℃至约30℃、约22℃至约28℃、约25℃至约30℃、约25℃至约29℃、约26℃至约29℃、约25℃至约28℃、或约27℃至约28℃范围内(包括其间可推导出的所有范围)的温度下进行接触培养。根据一些实施方案，可将单子叶植物种子胚外植体与第二(或延长的)芽诱导培养基在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、或约30℃(包括其间可推导出的所有范围)的温度下进行接触培养。在具体实施方案中，可将单子叶植物种子胚外植体与第一芽诱导培养基在约20℃至约30℃范围内的温度下或在约30℃至约40℃范围内的高温下接触培养约2天至约14天范围内的时间段，并然后接着与第二(或延长的)芽诱导培养基在约20℃至约32℃范围内的温度下接触培养约4天至约28天范围内的时间段。第二(或延长的)芽诱导培养基还可包含选择剂。在另一个实施方案中，将外植体与第二芽诱导培养基进行接触培养可将转化提高至少约0.2倍、0.4倍、0.6倍、0.8倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或40倍。
第二(或延长的)芽诱导步骤还可在多种光照条件下进行。在第二(或延长的)芽诱导步骤期间通常可使用一定程度的光照。根据一些实施方案，第二(或延长的)芽诱导步骤可在光合有效辐射(PAR)范围为约30μ/m2·s至约200μ/m2·s、30μ/m2·s至约180μ/m2·s、50μ/m2·s至约180μ/m2·s、50μ/m2·s至约150μ/m2·s、60μ/m2·s至约150μ/m2·s、70μ/m2·s至约140μ/m2·s、80μ/m2·s至约130μ/m2·s、或90μ/m2·s至约120μ/m2·s的平均或设定光强度下进行。根据一些实施方案，第二(或延长的)芽诱导步骤可在光合有效辐射(PAR)为约10μ/m2·s、约20μ/m2·s、约30μ/m2·s、约40μ/m2·s、约50μ/m2·s、约60μ/m2·s、约70μ/m2·s、约80μ/m2·s、约90μ/m2·s、约100μ/m2·s、约110μ/m2·s、约120μ/m2·s、约130μ/m2·s、约140μ/m2·s、约150μ/m2·s、约160μ/m2·s、约170μ/m2·s、约180μ/m2·s、约190μ/m2·s、或约200μ/m2·s的平均或设定光强度下进行。根据一些实施方案，在第二(或延长的)芽诱导骤期间可使用不同量的光照和暗循环，其可包括光照存在的时间长度在约2小时至约24小时的光照、约2小时至约22小时的光照、约4小时至约20小时的光照、约8小时至约20小时的光照、约12小时至约20小时的光照、约16小时至约20小时的光照之间，各自具有基于24小时日长的相应时间长度的相应的相对黑暗量。
根据一些实施方案，在第二(或延长的)芽诱导步骤期间光照和黑暗循环的量可为约2小时的光照和约22小时的黑暗、约3小时的光照和约21小时的黑暗、约4小时的光照和约20小时的黑暗、约5小时的光照和约19小时的黑暗、约6小时的光照和约18小时的黑暗、约7小时的光照和约17小时的黑暗、约8小时的光照和约16小时的黑暗、约9小时的光照和约15小时的黑暗、约10小时的光照和约14小时的黑暗、约11小时的光照和约13小时的黑暗、约12小时的光照和约12小时的黑暗、约13小时的光照和约11小时的黑暗、约14小时的光照和约10小时的黑暗、约15小时的光照和约9小时的黑暗、约16小时的光照和约8小时的黑暗、约17小时的光照和约7小时的黑暗、约18小时的光照和约6小时的黑暗、约19小时的光照和约5小时的黑暗、约20小时的光照和约4小时的黑暗、约21小时的光照和约3小时的黑暗、约22小时的光照和约2小时的黑暗、约23小时的光照和约1小时的黑暗、约24小时的光照和约0小时的黑暗。
不受理论的束缚，芽诱导步骤可引起外植体细胞的分化和/或增殖以在外植体上形成丛生芽(multiple buds)，然后其可再生为植物。根据一些优选的实施方案，第一生长素和细胞分裂素与第二生长素和细胞分裂素不同，以通过有些活性和/或作用方式影响丛生芽的形成。不受理论的束缚，第一芽诱导步骤可引起外植体细胞分化成丛生芽，而第二(或延长的)芽诱导步骤可使丛生芽更大地增殖或扩增以产生更紧凑或固体的丛生芽外植体，用于进一步培养和再生为植物，这可具有减少所得基因修饰的植物或植物部分的嵌合性的进一步益处。根据一些实施方案，在再生之前，与在第一芽诱导培养基中培养单子叶植物种子胚外植体而没有在第二(或延长的)芽诱导培养基中培养相比，在第一芽诱导培养基中培养单子叶植物种子胚外植体，随后在第二(或延长的)芽诱导培养基中培养可将再生植物的嵌合性减少至少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
E.转化植物的再生
在本公开的另一个方面，由培养的单子叶植物种子胚外植体与再生培养基接触来再生基因修饰的单子叶植物或植物部分。根据本发明的实施方案，再生培养基可包含多种标准培养基或溶液成分或组分，例如诸如基础盐、常量营养素、微量营养素、糖、抗生素和/或维生素。再生培养基通常可不包含生长素或细胞分裂素，尽管可替代地，可存在生长素和/或细胞分裂素。再生培养基通常可包含一种或多种选择剂。再生培养基可以是固体、半固体或液体培养基，尽管再生培养基通常可以是固体培养基。固体培养基可包含可以固化并形成固体培养基的胶凝剂或聚合剂或成分，诸如琼脂糖等。如本文所用，术语“再生”是指由外植体的一个或多个植物细胞或组织生长出植物的过程，并且术语“再生培养基”是指配制用于由外植体再生植物的植物组织培养基。在一些实施方案中，再生或再生步骤可以是指可涉及在两种或更多种再生培养基(这些再生培养基可以是相同或不同的再生培养基)中培养外植体或培养的外植体的一个或多个再生步骤，诸如通过传代培养或将外植体从第一再生培养基转移到第二再生培养基，并且可能转移到第三再生培养基，等等。
根据许多实施方案，再生培养基包含低盐浓度。如本文所用，“低盐浓度”是指包含小于或等于约2800mg/L的总盐浓度的培养基。如本文所用，“盐”具有化学领域中通常理解的含义并且是指离子化合物或溶解的化合物(如果存在于溶液中的话)，其包含至少一种阳离子(或碱)和至少一种阴离子(或酸)。在一些实施方案中，再生培养基可包含小于或等于约3000mg/L,2800mg/L、约2700mg/L、约2600mg/L、约2500mg/L、约2400mg/L、约2300mg/L、约2200mg/L、约2100mg/L、或约2000mg/L的总盐浓度。在另一个实施方案中，再生培养基可包含约1200mg/L至约3000mg/L、约1200mg/L至约2800mg/L、约1300mg/L至约2700mg/L、约1400mg/L至约2600mg/L、约1500mg/L至约2500mg/L、约1600mg/L至约2400mg/L、约1700mg/L至约2400mg/L、约1800mg/L至约2400mg/L、约1900mg/L至约2400mg/L、约2000mg/L至约2400mg/L、约2100mg/L至约2400mg/L、约2200mg/L至约2400mg/L、或约2300mg/L的盐浓度，包括其间可推导出的所有范围。在一些实施方案中，再生培养基的总氮浓度可在约0.5mM至约20mM、约0.5mM至约10mM、约1mM至约20mM、约5mM至约20mM、约1mM至约15mM、约5mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约7.5mM、约2.5mM至约7.5mM、约5mM至约10mM、约10mM至约15mM、约10mM至约20mM或约15mM至约20mM的范围内，包括其间可推导出的所有范围。如本文所用，术语“总氮浓度”是指含氮离子(诸如硝酸根离子和铵离子)的总浓度。
在一些实施方案中，根据本文所述的方法使用的再生培养基可根据其硝酸根、铵、钾或硫酸根离子浓度来描述。硝酸根离子浓度可为例如约0.5mM至约20mM、约5mM至约20mM、约5mM至约15mM、约5mM至约10mM、约10mM至约15mM、约10mM至约20mM、或约15mM至约20mM，包括其间可推导出的所有范围。铵离子浓度可为例如约0.5mM至约15mM、约2.5mM至约15mM、约2.5mM至约10mM、约2.5mM至约5mM、约5mM至约15mM、约5mM至约10mM、或约10mM至约15mM，包括其间可推导出的所有范围。钾离子浓度可为例如约0.5mM至约15mM、约2.5mM至约15mM、约2.5mM至约10mM、约2.5mM至约5mM、约5mM至约15mM、约5mM至约10mM、或约10mM至约15mM，包括其间可推导出的所有范围。硫酸根离子浓度可为例如约0.5mM至约20mM、约5mM至约20mM、约5mM至约15mM、约5mM至约10mM、约10mM至约15mM、约10mM至约20mM、或约15mM至约20mM，包括其间可推导出的所有范围。
在一些实施方案中，再生培养基可通过其硝酸铵、氯化钙、硝酸钙或硫酸钾浓度来描述。硝酸铵的浓度可在例如约100mg/L至约1000mg/L、约100mg/L至约750mg/L、约100mg/L至约500mg/L、约100mg/L至约250mg/L、或约250mg/L至约500mg/L的范围内，包括其间可推导出的所有范围。氯化钙的浓度可例如小于或等于约100mg/L、大于或等于约50mg/L、约50mg/L至约100mg/L、或约50mg/L至约75mg/L，包括其间可推导出的所有范围。硝酸钙的浓度可例如小于或等于约500mg/L、约100mg/L至约500mg/L、约100mg/L至约300mg/L、约300mg/L至约400mg/L、或约100mg/L至约200mg/L，包括其间可推导出的所有范围。硫酸钾的浓度可例如大于约500mg/L、约500mg/L至约750mg/L、约500mg/L至约1000mg/L、约500mg/L至约1500mg/L、约500mg/L至约2000mg/L、约750mg/L至约1000mg/L、或约1000mg/L，包括其间可推导出的所有范围。
在一个方面，将单子叶植物种子胚外植体与再生培养基在约20℃至约32℃、25℃至约29℃、或约27℃至约28℃(包括其间可推导出的所有范围)下进行接触而再生。在一些实施方案中，单子叶植物种子胚外植体可再生约20天至约50天或约28天至约42天，包括其间可推导出的所有范围。
在另一个方面，与在包含较高盐浓度的再生培养基上再生的基因修饰的单子叶植物或植物部分相比，在包含低盐浓度的再生培养基上再生基因修饰的单子叶植物或植物部分可将转化提高至少约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍。另外，与在包含较高盐浓度的再生培养基上再生的基因修饰的单子叶植物或植物部分相比，在包含低盐浓度的培养基上再生基因修饰的单子叶植物或植物部分可将生根频率提高至少约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍。
再生步骤还可在多种光照条件下进行。在第二(或延长的)芽诱导步骤期间通常可使用一定程度的光照。根据一些实施方案，再生步骤可在光合有效辐射(PAR)范围为约30μ/m2·s至约250μ/m2·s、约30μ/m2·s至约225μ/m2·s、约30μ/m2·s至约200μ/m2·s、约40μ/m2·s至约200μ/m2·s、约50μ/m2·s至约200μ/m2·s、50μ/m2·s至约180μ/m2·s、60μ/m2·s至约180μ/m2·s、70μ/m2·s至约180μ/m2·s、80μ/m2·s至约180μ/m2·s、90μ/m2·s至约180μ/m2·s、100μ/m2·s至约170μ/m2·s、110μ/m2·s至约160μ/m2·s、或约120μ/m2·s至约150μ/m2·s的平均或设定光强度下进行。根据一些实施方案，第二(或延长的)芽诱导步骤可在光合有效辐射(PAR)为约20μ/m2·s、约30μ/m2·s、约40μ/m2·s、约50μ/m2·s、约60μ/m2·s、约70μ/m2·s、约80μ/m2·s、约90μ/m2·s、约100μ/m2·s、约110μ/m2·s、约120μ/m2·s、约130μ/m2·s、约140μ/m2·s、约150μ/m2·s、约160μ/m2·s、约170μ/m2·s、约180μ/m2·s、约190μ/m2·s、约200μ/m2·s、约210μ/m2·s、约220μ/m2·s、约230μ/m2·s、约240μ/m2·s、或约250μ/m2·s的平均或设定光强度下进行。根据一些实施方案，在第二(或延长的)芽诱导骤期间可使用不同量的光照和暗循环，其可包括光照存在的时间长度在约2小时至约24小时的光照、约2小时至约22小时的光照、约4小时至约20小时的光照、约8小时至约20小时的光照、约12小时至约20小时的光照、约16小时至约20小时的光照之间，各自具有基于24小时日长的相应时间长度的相应的相对黑暗量。
根据一些实施方案，在再生步骤期间光照和黑暗循环的量可为约2小时的光照和约22小时的黑暗、约3小时的光照和约21小时的黑暗、约4小时的光照和约20小时的黑暗、约5小时的光照和约19小时的黑暗、约6小时的光照和约18小时的黑暗、约7小时的光照和约17小时的黑暗、约8小时的光照和约16小时的黑暗、约9小时的光照和约15小时的黑暗、约10小时的光照和约14小时的黑暗、约11小时的光照和约13小时的黑暗、约12小时的光照和约12小时的黑暗、约13小时的光照和约11小时的黑暗、约14小时的光照和约10小时的黑暗、约15小时的光照和约9小时的黑暗、约16小时的光照和约8小时的黑暗、约17小时的光照和约7小时的黑暗、约18小时的光照和约6小时的黑暗、约19小时的光照和约5小时的黑暗、约20小时的光照和约4小时的黑暗、约21小时的光照和约3小时的黑暗、约22小时的光照和约2小时的黑暗、约23小时的光照和约1小时的黑暗、约24小时的光照和约0小时的黑暗。
在本发明的再一个方面，将单子叶植物种子胚外植体和基因修饰的单子叶植物或植物部分在不产生愈伤组织培养物的情况下培养和再生。
在本发明的一个方面，再生的基因修饰的单子叶植物或植物部分是非嵌合的或具有减少的嵌合性。如本文所用，术语“嵌合的”或“嵌合性”是指就基因修饰而言由两种不同遗传类型的组织或细胞组成的植物、植物组织、外植体等。
F.通过基因工程的基因修饰植物
已经开发了各种基因工程技术并且可被本领域技术人员使用来将转基因或编辑的性状引入植物中。该方法通常涉及将多核苷酸序列递送到植物细胞中，该多核苷酸序列通常可以是异源和/或重组DNA分子，其可包含至少一种转基因或表达盒或RNA分子，诸如指导RNA(gRNA)或核糖核蛋白(RNP)的一部分，诸如用于基因组编辑的gRNA/定点核酸酶复合物。在本发明的实施方案的某些方面，通过改变单个遗传基因座或转基因或将其引入植物基因组中来将性状引入单子叶植物中。用于将转基因、编辑、突变和多核苷酸序列修饰、删除或插入到植物基因组DNA中的基因工程方法是本领域已知的。使用基因组编辑技术来编辑植物细胞基因组或内源植物基因的分子方法是本领域已知的。根据本发明的实施方案，可使用本文所述的方法将包含和/或编码基因组编辑工具或机器(诸如指导RNA、定点核酸酶和/或模板DNA分子)的多核苷酸或DNA分子引入植物细胞中。
在一些实施方案中，转化的单子叶植物可以通过植物基因组的位点特异性修饰来产生。定点整合转基因或多核苷酸序列的方法包括例如利用序列特异性核酸酶，诸如锌指核酸酶(参见，例如美国专利申请公开2011/0203012)；工程改造的或天然的归巢核酸内切酶；TALE-内切酶(参见，例如美国专利8,586,363和9,181,535)；RNA引导的内切酶，诸如CRISPR/Cas系统的那些酶(参见，例如美国专利8,697,359、8,771,945和9,790,490以及美国专利申请公开2014/0068797)和CRISPR相关转座酶或CAST(参见，例如美国专利申请公开2020/0190487)，其全部内容和公开内容以引用方式并入本文。因此，一些实施方案涉及利用核酸酶或任何相关蛋白来进行基因组修饰。这种核酸酶可以在用于模板基因组编辑的供体模板DNA内或在单独的分子或载体中异源地提供。重组DNA构建体还可包含编码一个或多个指导RNA的序列，以便将核酸酶引导至待修饰的植物基因组内的位点处。用于改变或引入单个遗传基因座的另外方法包括例如利用单链寡核苷酸来在植物基因组中引入碱基对修饰(参见，例如Sauer等人,Plant Physiol,170(4):1917-1928,2016年，其全部内容和公开内容以引用方式并入本文)。用于改变遗传基因座的其他方法包括例如利用CRISPR/Cas碱基编辑器或Prime编辑器来在植物基因组中引入单个或多个碱基对修饰(参见，例如Komor等人,Nature 533,420-424(2016年)；Gaudelli等人,Nature 551,464-471(2017年)；Komor等人,Science Advances 3:(8)(2017年)；以及Rees等人,Nat Rev Genet.2018年12月,19(12):770-788；PCT专利申请公开WO 2020/191248，其全部内容和公开内容以引用方式并入本文)。
用于定点改变或引入/整合异源和/或重组遗传序列或转基因的方法是本领域已知的，并且包括利用序列特异性核酸酶(诸如前述的)或蛋白质和指导RNA的复合物(其切割基因组DNA以在遗传基因座产生双链断裂(DSB)或切口)的那些方法。如本领域所熟知的，在修复由核酸酶引入的DSB或切口的过程中，供体模板、转基因或表达盒多核苷酸可通过非同源末端连接(NHEJ)或通过所需序列的同源臂与靶序列之间的同源重组(HR)在DSB或切口位点处整合到基因组中。这可以导致全部或部分的供体模板、转基因或表达盒多核苷酸定点整合到基因组中核酸酶的靶位点中，以产生靶向插入事件。待整合的DNA中同源臂的存在可促进在修复过程中通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)将插入序列或部分插入序列适用和靶向到植物基因组中。
在其他实施方案中，植物的基因修饰可包括转化植物、植物部分、植物组织或植物细胞，以将多核苷酸或DNA序列或转基因插入植物、植物部分、植物组织或植物细胞的基因组中。本领域已知且适用于许多作物物种的植物转化方法包括但不限于电穿孔、微射弹轰击或粒子轰击、显微注射、PEG介导的转化、农杆菌属介导的转化和其他直接DNA摄取的方式。已知的介导植物细胞转化的细菌包括可归属于根瘤菌目的除了农杆菌属之外的许多细菌属、菌种和菌株的物种，包括但不限于来自分类科根瘤菌科(例如，根廇菌属某些种、中华根瘤菌属某些种)、叶杆菌科(例如，中间根廇菌属某些种、叶杆菌属某些种)、布鲁氏菌科(例如，苍白杆菌属某些种)、慢生根瘤菌科(例如，慢生根瘤菌属某些种)和黄色杆菌科(例如，固氮根瘤菌属某些种)等的菌种和菌株。根据一些实施方案，农杆菌属介导的转化是由根癌农杆菌属(Agrobacterium tumefaciens)介导的。这种转化的靶标通常是未分化的愈伤组织，尽管分化的组织也已用于瞬时和稳定的植物转化。如本领域所熟知的，可利用其他植物转化方法，例如如Miki等人,(1993年,“Procedures for Introducing Foreign DNAinto Plants,”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,GlickB.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC Press,Inc.,Boca Raton,第67-88页)所述的。
在具体实施方案中，可采用微射弹轰击来将多核苷酸或DNA分子、载体、序列或片段递送转化到植物外植体的至少一个细胞中。在该方法中，粒子被多核苷酸或多核苷酸/蛋白质复合物包被并通过推进力递送到细胞中。示例性的粒子可包括由钨、铂或金组成的那些粒子。对于轰击，可将外植体或其他靶细胞布置在固体培养基上。待轰击的细胞放置在射弹阻挡板下方适当的距离处。多核苷酸可通过使用生物射弹粒子递送系统加速而递送到植物细胞中，该系统可推动包被有DNA或多核苷酸分子的粒子穿过筛网(诸如不锈钢或Nytex筛网)并朝向放置在表面上的外植体。筛网可分散粒子，使得它们不会以大聚集体的形式递送到受体细胞。微射弹轰击技术广泛应用并且可用于转化多种植物物种。
农杆菌属介导或根瘤菌目介导的外植体转化是另一种广泛应用的用于将异源和/或重组DNA分子引入植物细胞中的系统。现代农杆菌属转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌属中复制允许方便的操作(参见，例如Klee等人,Nat.Biotechnol.,3(7):637-642,1985年)。此外，用于农杆菌属-介导的基因转移的载体的最新技术进步已经改善了基因和限制位点在载体中的排列，以促进能够表达各种多肽编码基因的载体的构建。所描述的载体具有侧接有启动子和多腺苷酸化位点的便利的多接头区域，以用于直接表达插入的多肽编码基因。另外，含有武装和解除武装的Ti质粒的农杆菌属可用于转化。农杆菌属介导转化通常是许多植物物种所选择的方法。使用农杆菌属介导的植物整合载体来将DNA引入植物细胞中是本领域已知的(参见，例如Fraley等人,Nat.Biotechnol.,3:629-635,1985年；美国专利号5,563,055)。
许多启动子和表达元件可用于任何可选择标记、可评分标记、转基因或任何其他具有农艺利益的基因的植物基因表达。启动子可包括任何组成型启动子、组织特异性启动子、器官特异性启动子、诱导型启动子、繁殖组织启动子、发育阶段启动子、病毒启动子等。各种类型的启动子和表达元件的实例是本领域已知的。可用于植物基因表达的表达元件可包括例如如本领域已知的各种启动子、增强子、前导序列、5’和3’非翻译区、内含子、终止子等。可选择标记或可筛选标记或目标基因也可与传递肽或其他靶向序列融合。将转基因产生的蛋白质转运到亚细胞区室(诸如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸体、细胞壁、细胞核或线粒体)或进行分泌到质外体中，可通过将编码信号序列或靶向序列的核苷酸序列与编码目标蛋白质的基因的5'和/或3’区域可操作连接来完成。结构基因的5'和/或3’端的靶向序列可在蛋白质合成和加工期间确定，其中所编码的蛋白质最终被区室化。信号序列的存在将多肽引导到细胞内细胞器或亚细胞区室或进行分泌到质外体。许多信号序列是本领域已知的。参见，例如Becker等人(Plant Mol.Biol.,20:49,1992年)；Knox等人(PlantMol.Biol.,9:3-17,1987年)；Lerner等人(Plant Physiol.,91:124-129,1989年)；Fontes等人(Plant Cell,3:483-496,1991年)；Matsuoka等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:834,1991年)；Gould等人(J.Cell.Biol.,108:1657,1989年)；Creissen等人(Plant J.,2:129,1991年)；Kalderon等人(Cell,39:499-509,1984年)；Steifel等人(Plant Cell,2:785-793,1990年)。
组成型启动子的实例可包括例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，其在大多数植物组织中赋予组成型、高水平表达(参见，例如，Odel等人,Nature,313:810,1985年)，包括单子叶植物(参见，例如，Dekeyser等人,Plant Cell,2:591,1990年；Terada和Shimamoto,Mol.Gen.Genet.,220:389,1990年)；CaMV 35S启动子的串联重复形式、增强35S启动子(e35S)、胭脂碱合成酶启动子(An等人,Plant Physiol.,88:547,1988年)、章鱼碱合酶启动子(Fromm等人,Plant Cell,1:977,1989年)；以及如美国专利号5,378,619中所述的玄参花叶病毒(FMV)启动子和FMV启动子的增强形式(eFMV)(其中FMV的启动子序列串联重复)、花椰菜花叶病毒19S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子和已知在植物细胞中表达的其他植物DNA病毒启动子。
使用诱导型启动子，转录速率响应诱导剂而增加。任何诱导型启动子都可用于本发明。响应环境、激素、化学和/或发育信号而被调节的多种植物基因启动子可用于在植物细胞中表达可操作连接的基因，包括受到以下信号调节的启动子：(1)热(Callis等人,Plant Physiol.,88:965,1988年)；(2)光(例如，豌豆rbcS-3A启动子，Kuhlemeier等人,Plant Cell,1:471,1989年；玉米rbcS启动子，Schaffner和Sheen,Plant Cell,3:997,1991年；或叶绿素a/b-结合蛋白启动子，Simpson等人,EMBO J.,4:2723,1985年)；(3)激素，诸如脱落酸(Marcotte等人,Plant Cell,1:969,1989年)；(4)创伤(例如，wunl，Siebertz等人,Plant Cell,1:961,1989年)；或(5)化学品，诸如茉莉酮酸甲酯、水杨酸或安全剂。采用本领域已知的器官特异性或组织特异性启动子也可以是有利的(例如，Roshal等人,EMBO J.,6:1155,1987年；Schernthaner等人,EMBO J.,7:1249,1988年；Bustos等人,Plant Cell,1:839,1989年)。
可引入单子叶植物的示例性多核苷酸或DNA分子包括例如来自另一种物种的DNA序列或基因，或甚至源自或存在于同一物种中但通过基因工程方法而不是经典的繁殖或育种技术并入受体细胞中的基因或序列。然而，术语“外源”还旨在是指通常不存在于被转化的细胞中的基因，或可能不以该形式、结构、位置等存在的基因。多核苷酸可包括已经存在于植物细胞中、来自另一种植物、来自不同生物体、外源的或外部产生的DNA分子或序列。转基因或表达盒可编码用于抑制的mRNA和蛋白质或RNA分子，诸如miRNA、siRNA、dsRNA、反义RNA、反向重复RNA等。多核苷酸可以是外源的、异源的和/或重组的多核苷酸或DNA分子或序列。
数百甚至数千种不同的基因是已知的并且可以潜在地被引入根据本发明的植物中。可选择引入单子叶植物中的具体基因和相应表型的非限制性实例包括用于以下的一种或多种基因：昆虫耐受性，诸如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(B.t.)基因；害虫耐受性，诸如真菌性病害控制基因；除草剂耐受性，诸如赋予草甘膦耐受性的基因；以及用于质量改善的基因，诸如产量、营养增强、环境或压力耐受性，或植物生理学、生长、发育、形态或植物产物的任何所需改变。例如，结构基因将包括赋予昆虫耐受性的任何基因，包括但不限于如WO 99/31248(其全文以引用方式并入本文)、美国专利号5,689,052(其全文以引用方式并入本文)、美国专利号5,500,365和5,880,275(其全文以引用方式并入本文)中所述的芽孢杆菌(Bacillus)昆虫控制蛋白基因。在另一个实施方案中，结构基因可以赋予对除草剂草甘膦的耐受性，如由以下基因赋予的，包括但不限于农杆菌属菌株CP4草甘膦抗性EPSPS基因(aroA:CP4)，如美国专利号5,633,435中所述的，其全文以引用方式并入本文；或草甘膦氧化还原酶基因(GOX)，如美国专利号5,463,175中所述的，其全文以引用方式并入本文。
多种测定法是本领域已知的并且可用于确认外源DNA序列或转基因在转化的、编辑的或基因修饰的植物中的存在。此类测定包括但不限于DNA印迹、RNA印迹、测序、PCR、原位杂交、ELISA、蛋白质印迹、酶功能测定、植物部分测定或通过分析再生植物的表型。
G.培养基
已知多种组织培养基，当适当补充时，它们支持植物组织生长和发育，包括从切除的植物组织形成成熟的植物。如本文所用，术语“组织培养基”是指用于在非土壤环境中支持植物生长和发育的液体、半固体或固体培养基。这些组织培养基可以作为商业制备剂购买或由本领域技术人员定制制备和修改。这种培养基的实例包括但不限于由Murashige和Skoog,(1962年)；Chu等人,(1975年)；Linsmaier和Skoog,(1965年)；Uchimiya和Murashige,(1962年)；Gamborg等人,(1968年)；Duncan等人,(1985年)；McCown和Lloyd,(1981年)；Nitsch和Nitsch(1969年)；以及Schenk和Hildebrandt,(1972年)描述的那些培养基，或这些培养基相应补充的衍生物。本领域技术人员知道，用于转化和再生的培养基和培养基补充剂(诸如营养物和植物生长调节剂)通常针对特定靶标作物或目标品种进行优化。组织培养基可补充有碳水化合物，诸如但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、果糖、乳糖、半乳糖和/或葡萄糖，或各比率的碳水化合物。试剂是可商购获得的，并且可购自许多供应商(参见，例如Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO；和PhytoTechnology Laboratories,Shawnee Mission,KS)。这些组织培养基可用于制备接种培养基、共培养培养基、芽诱导培养基、第二诱导培养基或再生培养基，并且在具体实施方案中可包含选择剂。
H.可选择标记
在具体实施方案中，根据本发明使用的培养基可包含一种或多种选择剂，并且本发明使用的异源多核苷酸分子可包含可选择标记基因，其中可选择标记基因提供对选择剂的抗性。如本文所用，“可选择标记”或“可筛选标记”或“可评分标记”是指其表达赋予有利于鉴定含有核酸序列的细胞的表型的核酸序列。各种可选择标记和提供对它们的抗性的基因的实例在Miki和McHugh,2004年中公开。可使用的可选择标记基因包括但不限于aroA、EPSPS、aadA、pat、bar、hph(潮霉素B磷酸转移酶)、DMO(麦草畏单加氧酶)和NPT II。根据本发明可使用的选择剂的非限制性实例包括草甘膦、草铵膦、膦丝菌素、溴苯腈、双丙氨膦、麦草畏、咪唑啉酮、磺酰脲、乙酰乳酸合酶抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂、羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂、抗生素抑制剂、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、G418、氨基糖苷类、大观霉素、链霉素、潮霉素B、博来霉素、腐草霉素、磺胺类、庆大霉素、链丝菌素、氯霉素、甲氨蝶呤、2-脱氧葡萄糖、甜菜碱醛、S-氨乙基L-半胱氨酸、4-甲基色氨酸、D-木糖、D-甘露糖和苄基腺嘌呤-N-3-葡糖醛酸酶。在一些实施方案中，用于本发明的异源多核苷酸分子可包含两种或更多种可选择标记基因。在一些实施方案中，用于本发明的选择剂可单独或作为两种或更多种选择剂的组合使用。在一个实施方案中，本发明的实施方案可在不存在任何选择剂的情况下进行。
根据本发明的实施方案，用于转化或基因组编辑的外源多核苷酸或DNA分子的插入序列可包含植物可选择标记基因，以允许成功选择和产生转化或转基因的R0植物。植物可选择标记基因或转基因可包括赋予对对应选择剂的耐受性的任何基因，使得用植物可选择标记转基因转化的植物细胞可耐受并承受通过选择剂所施加的选择压力。结果，在选择下外植体的转化植物细胞有利于生长、增殖、发育等。尽管植物可选择标记基因通常用于赋予对选择剂的耐受性，但是除了可选择标记之外，还可使用另外的可筛选标记基因，还可能与农艺目标基因一起使用。此类可筛选标记基因可包括例如β-葡糖醛酸酶的uidA(GUS；例如如美国专利5,599,670中所述的，其以引用方式并入本文)或绿色荧光蛋白及其变体的gfp(GFP，美国专利5,491,084和6,146,826中所述的，二者均以引用方式并入本文)或八氢番茄红素合酶的crtB(例如，如美国专利8,237,016和10,240,165中所述的，二者均以引用方式并入本文)。可筛选标记的另外实例可包括可分泌标记，其表达引起分子的分泌，该分子可以被检测作为用于鉴定转化细胞的手段。
植物选择标记基因可包含编码以下蛋白的基因，所述蛋白提供或赋予对除草剂诸如草甘膦和草铵膦的耐受性或抗性。有用的植物可选择标记基因为本领域中已知的，并且可包括编码赋予对以下的抗性或耐受性的蛋白质的植物可选择标记基因：链霉素或大观霉素(例如，aadA或spec/strep)、卡那霉素(例如，nptII)、潮霉素B(例如，aph IV)、庆大霉素(例如，aac3和aacC4)和氯霉素(例如，CAT)。编码赋予除草剂抗性或耐受性的蛋白质的已知植物可选择标记基因的另外实例包括例如，编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的可转录DNA分子(用于草甘膦耐受性的EPSPS；例如，如美国专利5,627,061；5,633,435；6,040,497；和5,094,945中所述的，所有这些专利以引用方式并入本文)；编码草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰基转移酶的可转录DNA分子(GOX；例如，如美国专利5,463,175中所述的；GAT，美国专利公开20030083480中所述的)；编码八氢番茄红素去饱和酶的可转录DNA分子(crtI；例如，如Misawa等人,Plant Journal,4:833-840(1993年)和Misawa等人,PlantJournal,6:481-489(1994年)中关于达草灭耐受性所述的，以引用方式并入本文)；以及bar基因(例如，如DeBlock等人,EMBO Journal,6:2513-2519(1987年)中关于草铵膦和双丙氨膦耐受性所述的，以引用方式并入本文)。
外源DNA分子的插入序列还可包含用于在成功产生和/或确认转化植物后(特别是在不再需要转基因或表达盒后)去除一种或多种转基因或表达盒(诸如植物可选择标记转基因或其任何部分或序列)的序列。在一些实施方案中，这可通过使待去除的转基因序列侧翼有已知或以后开发的重组位点(例如，LoxP位点、FRT位点等)来实现，这些重组位点可以被内源或外源提供的重组酶(例如，Cre、Flp等)识别并去除。重组酶可反式引入和表达，诸如通过将转化植物与具有重组酶转基因的另一种植物杂交，以实现转基因的切除。因此，一旦不需要的序列元件或转基因的用途或目的到期，就可以将其去除，从而防止其在种系中进一步表达或传播。
实施例
本领域技术人员将理解本发明提供的方法和组合物的许多优点。以下实施例被包括以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，在随后的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被认为构成其实践的优选方式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。本文所引用的所有参考文献都以引用方式并入本文，达到这种程度它们补充、解释、提供背景或教导本文所采用的方法、技术或组合物。
实施例1
从玉米切除的外植体的转化
该实施例描述了一种农杆菌属介导转化从干成熟玉米种子切除的胚外植体的方法，包括外植体制备、农杆菌属接种和共培养、芽诱导、延长芽诱导和转基因植物再生的步骤。
外植体制备
从干成熟01DKD2玉米种子中切除外植体并在-20℃下储存在密封袋中。在外植体制备前，将外植体从冰箱中取出并使其平衡至室温至少30分钟。在适当大小的滚瓶中用含有100g/L的分子量(MW)为800的聚乙二醇(PEG)的70％乙醇对外植体进行表面灭菌，通过缓慢滚动搅动约3.5分钟。对于至多约15,000个玉米外植体，使用约300mL的灭菌溶液，并且于对于约15,000至约30,000个玉米外植体，使用约500mL的灭菌溶液。在灭菌后，将玉米外植体和灭菌溶液倒在大钢过滤器上。将保留在过滤器上的外植体用约2.5至约3.0L的无菌水冲洗以去除任何显著剩余的灭菌溶液，并然后转移到无菌玻璃烧杯中。
在灭菌后，对玉米外植体进行浮选富集以去除碎屑。简而言之，将500mL无菌水倒入包含外植体的无菌玻璃烧杯中，并通过倒入大的过滤器来收集漂浮到表面的外植体。重复浮选数次，直到没有剩余的存活外植体漂浮到表面。
将浮选富集后收集的玉米外植体转移到新的无菌玻璃烧杯中用于进行再水合。简而言之，向烧杯中添加400mL的再水合培养基，该再水合培养基包含2/5浓度的B5常量盐(除了CaCl2之外，其为1/2浓度)、1/10浓度的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖、2.8mg/L西奎斯特林、3.9g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)和0.03g/L Clearys 3336WP，pH5.4。然后将烧杯用铝箔覆盖并孵育约1至约2小时。MS、Gamborg B5(B5)和木本植物培养基(WPM)盐和维生素中的每一种的组分是本领域已知的并且在表1中一起提供。参见，例如Murashige和Skoog(1962年)Plant Physiology,15:473-497；O LGamborg,等人(1968年)Exp Cell Res.,50(1):151-8；和McCown和Lloyd(1981年)HortScience,16:453-453，这些文献中每一个的全部内容和公开内容以引用方式并入本文。
表1.MS、B5、WPM和低氮MS盐和维生素的组分。
在表1中，主要盐或常量营养素以粗体显示，次要盐或微量营养素以正常字体显示，维生素以斜体显示。这些盐和维生素混合物中的每一种都可商购获得，诸如从PhytoTechnology Laboratories(例如，MS盐混合物目录号是M519，B5盐混合物目录号是G398，WPM盐混合物目录号是L449，以及低氮MS混合物目录号是M529和G249的组合)。基础盐混合物包括常量营养素和微量营养素二者。浓度在溶液中提供，或在每1L总体积水添加指定量时提供，其可针对任何其他体积进行调整。稀释是相对于这些全浓度进行的，并且可指定为分数。表1中盐或维生素的全浓度被包含在本文所述的溶液中，除非指定稀释度。
农杆菌属制备
从-80℃冰箱中取出农杆菌属甘油储备液AB32，并在层流罩中在环境温度下解冻。在通过涡旋充分混合之后，将250mL解冻的农杆菌属甘油储备液接种到1L无菌烧瓶中的250mL含有用于转化构建体的适当抗生素的液体LB培养基中。适当抗生素可包括例如50mg/L大观霉素或30mg/L庆大霉素。将烧瓶放入设定为200rpm的定轨摇床/孵育箱中，并在27.5±2℃下在黑暗中培养16-24小时，或直到接种物在660nm处的光密度(OD660)测量在0.6-1.2范围内。在将过夜农杆菌属培养物在4℃下以约3000rpm或2620xg(3B，6000A转子)离心25分钟后，将沉淀物重悬浮于50mL接种培养基中，该接种培养基包含2/5浓度的B5常量盐、1/10的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖和3.9g/L MES。在重悬浮后，将所有管中的农杆菌属合并并充分混合，并对农杆菌属悬浮液进行1:20稀释用于OD660测量。然后将浓缩的农杆菌属悬浮液在接种培养基中稀释至最终OD660为0.25。
接种和共培养
在如上所述的再水合后，通过将外植体/再水合混合物倒入无菌不锈钢网过滤器中收集外植体。将保留的外植体在无菌毛巾上快速吸干以去除过量液体。将约2,500个玉米外植体和40ml农杆菌属悬浮液添加到50mL通风锥形管中。农杆菌属悬浮液覆盖管中的所有外植体。然后将管放置在真空室中，在其中施加约300psi的压力约3分钟。在缓慢释放压力之后，将管在4℃下以2,620xg离心30分钟。在采用压力和离心接种后，通过将外植体转移到无菌不锈钢过滤器中去除农杆菌属悬浮液。通过在无菌纸巾上轻拍过滤器去除过量液体。
将接种的玉米外植体转移到共培养板(25mm x 100mm)，该共培养板含有一张用1.25mL再水合培养基润湿的无菌Whatman#1滤纸(82mm)。每个板包含约500-600个以单层均匀分布在板上的玉米外植体。将共培养板在20℃和约65％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下孵育5-6天。目标光强度为约90μ/m2·s的光合有效辐射(PAR)。
芽诱导
在共培养步骤后，将玉米外植体转移到固体芽诱导培养基中，该固体芽诱导培养基例如包含MS盐、B5维生素、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、1g/L NZ胺-A(酪蛋白酶促水解产物；Millipore Sigma)、2mg/L甘氨酸、1g/L MES、1mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、10mg/L 6-苄氨基嘌呤(BAP)、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀和3.5g/L低EEO琼脂糖，pH 5.8。将来自每个共培养板的外植体均匀铺板到含有芽诱导培养基的五个板上。将板在室中在33℃(35℃实际板温度)以及16小时光照/8小时黑暗的光周期、约90μ/m2·s的PAR的光强度下孵育6-8天。
延长芽诱导在芽诱导步骤后，将玉米外植体转移到固体延长芽诱导培养基，该固体延长芽诱导培养基包含MS盐、B5维生素、60g/L蔗糖、0.5g/L谷氨酰胺、0.69g/L脯氨酸、1g/L NZ胺-A、2mg/L甘氨酸、1.95g/L MES、1.25mg/L硫酸铜、2mg/L噻苯隆、2mg/L毒莠定、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀、25μM草甘膦和3.5g/L低EEO琼脂糖，pH 5.8。将来自每个芽诱导板的外植体均匀分到含有延长芽诱导培养基的两个板上。将这些板在28℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期、约150μ/m2·s的PAR的光强度下培养5-18天。
再生
将来自延长芽诱导板的外植体转移到9cm托盘(荷兰)中的固体再生培养基用于进行芽发育和生根，该固体再生培养基包含LM木本植物培养基(WPM)盐和维生素、0.03g/L Cleary 3336WP(甲基托布津)、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、2mg/L甘氨酸、1g/L MES、3.5g/L低EEO琼脂糖、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀和20μM草甘膦，pH 5.8。在将外植体均匀分布在再生培养基上之后，使用手持式薄膜烙铁(sealing iron)将托盘用塑料膜密封，并在28℃和环境湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期、约160μ/m2·s的PAR的光强度下培养28-42天。在再生步骤后，通常在接种步骤后约10-11周，将具有可见根且没有嵌合迹象的推定转基因植物移植到土块(soil plug)(2”直径x 3”高度(Gro-Tech,Rough and Ready,CA 95975)中用于进行进一步生长和发育。
实施例2
从小麦切除的外植体的转化
该实施例描述了一种农杆菌属介导转化从干成熟小麦种子切除的胚外植体的方法，包括外植体制备、农杆菌属接种和共培养、芽诱导、延长芽诱导和转基因植物再生的步骤。
外植体制备
从干成熟小麦种子中切除外植体并在-20℃下储存在密封袋中。在外植体制备前，将外植体从冰箱中取出并使其平衡至室温至少30分钟。通过将外植体放入具有约500mL的70％乙醇的1L无菌瓶中对约10,000个外植体进行表面灭菌。通过用手轻轻滚动或摇动将瓶搅动约5分钟。在表面灭菌和去除70％乙醇溶液后，将小麦外植体用无菌水冲洗以去除任何显著剩余的灭菌介质。
对小麦外植体进行浮选富集以去除碎屑。简而言之，将在无菌水中的外植体倒入包括外部容器和内部筛容器的无菌筛/收集容器设备中。内部筛容器安装在外部容器内，底部上熔有26x 26不锈钢网。在将外植体转移到设备中之后，添加无菌水。重复地将内部筛容器从水中提出和降低到水中以引起小麦外植体的浮选。使用真空收集器收集漂浮的外植体。重复该浮选步骤数次，直到约50％的漂浮材料是碎屑。在浮选步骤后，丢弃碎屑。然后使用无菌刮刀将收集的小麦外植体添加到50mL离心管中用于进行农杆菌属接种。每管添加约5,000个小麦外植体。
农杆菌属制备
从-80℃冰箱中取出农杆菌属甘油储备液，并在层流罩中在环境温度下解冻。在通过涡旋充分混合之后，将500mL解冻的农杆菌属甘油储备液接种到在170rpm的摇床上的1L无菌烧瓶中的250mL含有用于转化构建体的适当抗生素的液体LB培养基中，并在27℃-28℃下在黑暗中培养约16-18小时，或直到OD660在0.6-1.6范围内。适当抗生素可包括例如50mg/L大观霉素或30mg/L庆大霉素。在将过夜农杆菌属培养物在20℃下以约3500-3700rpm离心20分钟后，将沉淀物重悬浮于25mL的接种培养基中，该接种培养基包含1/10的MS盐、MS维生素、0.5g/L谷氨酰胺、0.1g/L酪蛋白水解产物、0.75g/L氯化镁、1.95g/L MES、40g/L麦芽糖和100mg/L抗坏血酸，pH 5.8。在重悬浮后，将所有离心管中的农杆菌属合并并充分混合，并对农杆菌属悬浮液进行1:20稀释用于OD660测量。然后将浓缩的农杆菌属悬浮液在接种培养基中稀释至最终OD660为0.5。将制备的农杆菌属悬浮液在4℃下储存至多8小时，直到用于转化。
接种和共培养
将约40至50mL如上所述制备的农杆菌属悬浮液添加到每个50mL含有制备的小麦外植体的离心管中。将含有农杆菌属和外植体的管在4℃下以1400xg离心30分钟。在离心后，通过摇动将外植体和农杆菌属重悬浮，并使外植体沉降到管的底部。通过倾析去除农杆菌属悬浮液。然后使用无菌刮刀或环将接种的小麦外植体转移到100mm x 25mm陪替氏平皿中，并使用无菌移液管去除剩余的农杆菌属悬浮液。可替代地，可使用无菌不锈钢筛来收集外植体并去除过量农杆菌属悬浮液，如实施例1中所述。
然后将接种的外植体转移到共培养板(25mm x 100mm)，该共培养板包含一张用1.25mL接种培养基润湿的无菌Ahlstrom滤纸。每个共培养板包含约500-600个以单层均匀分布在板上的小麦外植体。将共培养板在23℃和约70％相对湿度下在黑暗中孵育约70％3-4天。
延迟
在共培养步骤之后，使用无菌钳子将具有外植体的滤纸从共培养板中提起，并直接转移到含有固体延迟培养基的板，该固体延迟培养基包含0.78g/L不含氮的MS基础盐、MS维生素、1.64g/L硫酸钾、4.95g/L硝酸铵、60g/L麦芽糖、0.5g/L谷氨酰胺、1g/L NZ胺-A、0.75g/L六水氯化镁、1.95g/L MES、1.25mg/L硫酸铜、3mg/L噻苯隆、2mg/L毒莠定、200mg/L羧苄西林、100mg/L头孢噻肟和3.5g/L低EEO琼脂糖，pH 5.8。然后将板在25℃和约35％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养12-16天。
选择
在延迟步骤后，使用液体培养基进行选择。简而言之，将延迟培养基上的小麦外植体转移到包含2张毛毡、1张滤纸(具有穿透纸张的孔以辅助抽吸)和25mL选择培养基的选择板，该选择培养基包含0.78g/L不含氮的MS基础盐、MS维生素、1.64g/L硫酸钾、4.95g/L硝酸铵、30g/L麦芽糖、0.5g/L谷氨酰胺、1g/L NZ胺-A、0.75g/L氯化镁、1.95g/L MES、1.25mg/L硫酸铜、3mg/L噻苯隆、2mg/L毒莠定、200mg/L羧苄西林、100mg/L头孢噻肟和30μM草甘膦，pH5.8。将约80-100个小麦外植体放入每个选择板中。将板在25℃和约35％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养12-16天。
再生
在选择步骤后，吸出选择培养基，并添加20mL液体再生培养基，该液体再生培养基包含MS基础盐、MS维生素、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、1g/L MES、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀和30μM草甘膦，pH 5.8。将板在25℃和约35％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养12-16天(再生步骤1)。然后吸出再生培养基并用15mL新鲜再生培养基更换。然后将板在25℃和约35％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下再孵育5-9天(再生步骤2)。
在再生步骤2后，向每个板中添加10mL新鲜再生培养基。然后将板在25℃和约35％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养，直到再生芽准备好被移植。
通常，在接种后约60-70天，将再生芽转移到固体生根培养基，该固体生根培养基包含MS基础盐、MS维生素、1.95g/L MES、40g/L麦芽糖、0.5mg/L硫酸铜、100mg/L抗坏血酸、1mg/L IBA、3g/L Gelzan CM、400mg/L羧苄西林、500mg/L头孢噻肟和30μM草甘膦，pH 5.8，并在25℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养2周。将具有发育根的推定转基因小麦植物移植到土块(2”直径x3”高度(Gro-Tech,Rough and Ready,CA 95975)中用于进行进一步生长和发育。
实施例3
在芽诱导期间的高温提高玉米种子外植体的转化
该实施例提供了被设计以评价在丛生芽诱导期间的高温对从玉米种子切除的外植体的转化的影响的实验。
在28℃下芽诱导两周与在35℃下一周随后在28℃下一周的比较。
在农杆菌属接种和共培养后，可以将从玉米种子切除的外植体与芽诱导培养基接触并在28℃下培养两周。
为了评价在初始芽诱导步骤期间的高温对转化的影响，使用草甘膦以进行选择来评价两种温度处理：1)在28℃下芽诱导两周；2)在35℃的高温下芽诱导一周，随后在28℃下芽诱导一周。该实验中用于转化玉米外植体的继续和后续步骤通常如实施例1中所述的进行。
在农杆菌属接种和共培养后，将玉米外植体转移到补充有2mg/LTDZ、1mg/L 2,4-D和不同浓度草甘膦的含有MS盐和B5维生素的芽诱导培养基中，并在上述的温度条件下培养。如表2中所示，对于芽诱导的第一周，在35℃下培养外植体似乎抑制外植体发芽，然而，在于28℃下芽诱导的第二周之后，具有绿芽形成的外植体的百分比增加。此外，对于芽诱导的第一周，在高温下培养外植体导致再生4周后产生正常绿芽的外植体频率显著增加。这导致芽频率增加和嵌合芽频率减少(表2)。另外，结果还表明了随着选择培养基中草甘膦浓度从12.5μM增加到50μM，正常芽的百分比通常增加。
表2.在芽诱导的第一周期间的高温增加转基因芽再生。
芽总数计算为由接种的外植体再生的芽总数，包括正常芽和嵌合芽。芽频率计算为产生芽的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。正常芽数量计算为不显示嵌合组织表型的再生的正常芽总数。正常芽百分比计算为正常芽数量除以芽总数。正常芽频率计算为正常芽数量除以接种的外植体总数。
在另一个实验中，评价了在芽诱导步骤期间的不同温度条件以进行比较：1)对于芽诱导的第一周35℃，随后对于芽诱导的第二周28℃；以及2)在28℃下芽诱导两周。该实验包括两个不同批次的玉米外植体和芽诱导培养基中植物生长调节剂的不同组合。评价了以下植物生长调节剂组合：1)2mg/L TDZ和1mg/L 2,4-D；以及2)10mg/L BAP和1mg/L 2,4-D。如上所述，芽诱导培养基含有MS盐和B5维生素，补充有2mg/L TDZ、1mg/L 2,4-D或10mg/LBAP和1mg/L 2,4-D以及作为选择剂的5μM草甘膦。在如前所述的农杆菌属接种和共培养后，根据上述条件培养外植体。在共培养后，两批外植体之间的瞬时表达没有明显差异。该实验的结果证明了与对于整个两周的芽诱导在28℃下培养的外植体相比，在35℃下进行第一周的芽诱导似乎初始减慢了玉米外植体的生长并使它们更紧凑且更绿。结果与外植体批次或芽诱导培养基中的植物生长调节剂组合无关。初始在35℃下培养的外植体的生长在于28℃下后续的芽诱导期间恢复。在将外植体转移到再生和选择培养基并生长2、3或4周之后，与在28℃下培养两周的那些外植体相比，这些外植体产生了更高百分比的绿色外植体。此外，如表3中所示，初始在35℃下培养的外植体显示出增加的芽频率和正常芽百分比，与外植体批次或芽诱导培养基中的植物生长调节剂组合无关。
表3.在第一周的芽诱导期间的高温增加转基因芽再生，与外植体批次或植物生长调节剂组合无关。
芽总数计算为由接种的外植体再生的芽总数，包括正常芽和嵌合芽。芽频率计算为产生芽的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。正常芽数量计算为不显示嵌合组织表型的再生的正常芽总数。正常芽百分比计算为正常芽数量除以芽总数。正常芽频率计算为正常芽数量除以接种的外植体总数。
在28℃与35℃下芽诱导随后延长芽诱导的比较
使用三个不同批次的玉米外植体进行三次独立实验，以评价在如上所述的另外的延长芽诱导、选择和再生步骤前与在28℃下芽诱导两周相比，第一周在35℃下芽诱导，随后第二周在28℃下芽诱导。每个实验包括表4中提供的四种温度条件。
表4.在芽诱导期间在高温下培养外植体显著增加转基因芽再生。
如表4中所示，在全部三个实验中与在28℃下芽诱导两周相比，对于第1周的芽诱导在35℃下培养外植体，随后对于第二周的芽诱导在28℃下培养显著增加转基因芽再生。正常植物频率(NPF)计算为正常植物数量除以接种的外植体总数。
与在28℃下芽诱导2周相比，在35℃下芽诱导4天，随后在28℃下芽诱导剩余的芽 诱导时间足以增加转基因芽再生。
进一步评价在35℃下不同芽诱导持续时间对转化的影响。进行四次独立实验，在28℃下芽诱导2周(即在35℃下0天)用作对照。处理条件包括在35℃下芽诱导2、4或7天，然后转移到28℃芽诱导剩余的两周时间(即，2天+12天；4天+10天；或7天+7天)。如表5中所示，与整个芽诱导步骤在28℃下培养的外植体相比，在第一周的芽诱导期间在35℃下培养4天的外植体的转基因芽再生显著增加。另外，在35℃下芽诱导处理4天的平均芽再生频率和平均正常芽频率与在35℃下芽诱导处理7天的相当，表明在35℃的高温下芽诱导4天足以提高转化。
表5. 35℃芽诱导不同持续时间对转基因芽再生频率的影响。
芽频率计算为相应处理的芽诱导培养基上的产生芽的外植体数量除以外植体总数，对每种处理的四次重复进行平均。正常芽频率计算为相应处理的芽诱导培养基上的正常芽数量除以外植体总数，对每种处理的四次重复进行平均。
实施例4
含有低盐水平的再生培养基提高玉米种子外植体转化
该实施例描述了由从玉米切除的外植体与含有低盐水平的培养基接触再生的转基因植物的转化和生根频率的提高。
在产生转基因植物期间，需要将与再生培养基接触的生根转基因芽直接从陪替氏培养皿转移到土壤中，该过程被称为直接插植，以消除在PhytatrayTM或PlantConTM容器中生长植物或芽的中间步骤。直接插植需要较少的资源，加速了转基因植物产生过程，并且提高了转基因植物质量。玉米外植体可以通过在接种、共培养、芽诱导和延长芽诱导步骤后将外植体与MS再生培养基接触来再生。然而，当使用MS再生培养基时，芽的生根频率通常较低且可变，这阻碍了直接插植的有效实施。基于MS的培养基含有高盐水平，因此实验被设计以评价含有较低盐水平的其他再生培养基是否提高转化和/或生根频率。评价的再生培养基是MS再生培养基、B5再生培养基、木本植物培养基(WPM)再生培养基和低氮MS再生培养基。
如实施例1中所述，制备包含转化载体的农杆菌属，该转化载体含有叶绿体靶向的农杆菌属aroA基因、uidA基因和侧翼T-DNA边界。aroA基因是赋予对草甘膦的抗性的可选择标记并且uidA基因编码β-葡糖醛酸酶(GUS)。在农杆菌属接种和共培养后，将玉米外植体放置在芽诱导培养基上并在35℃下培养一周，随后在28℃下再芽诱导一周。然后将外植体转移到延长芽诱导培养基并再培养两周，然后放置在MS、B5、WPM或低氮MS再生培养基上。MS培养基、B5培养基、WPM培养基和低氮MS培养基的组分是本领域已知的并且在表1中一起提供。如表6中所示，与与MS再生培养基接触而再生的外植体相比，与WPM再生培养基接触而再生的外植体显示出提高的转化，如通过正常植物频率(NPF)测量的。
表6.WPM再生培养基提高转基因玉米植物的正常植物频率。
芽总数计算为由接种的外植体再生的芽总数，包括正常芽和嵌合芽。芽频率计算为产生芽的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。正常芽数量计算为不显示嵌合组织表型的再生的正常芽总数。正常芽频率计算为正常芽数量除以接种的外植体总数。正常植物频率(NPF)计算为正常植物数量除以接种的外植体总数。
在另一个实验中，使用不同批次的从玉米切除的外植体和含有不同转化载体构建体的农杆菌属来评价与MS再生培养基相比，与WPM再生培养基接触而再生的芽的转化和/或生根频率。该实验中使用的转化载体构建体包含上述的aroA表达盒、编码目标基因的另一种盒以及侧翼T-DNA边界。该表达盒不包含uidA基因。在农杆菌属接种和共培养之后，将玉米外植体放置在芽诱导培养基上并在35℃下培养一周，随后在28℃下再芽诱导一周。然后将外植体转移到延长芽诱导培养基并培养两周，然后放置在MS再生培养基或WPM再生培养基上。然后，将再生的转基因芽在PhytatrayTM中生长，然后转移到土壤中或直接从陪替氏平皿移植到土壤(直接插植(DTP))。如表7中所示，如通过NPF测量的，WPM再生培养基显示出提高的转化。如表8中所示，与在PhytatraysTM中生长并与MS再生培养基接触而再生的那些转基因芽相比，在PhytatraysTM中生长并与WPM再生培养基接触而再生的转基因芽具有双倍的生根频率。与MS再生培养基接触而再生的那些转基因芽相比，与WPM再生培养基接触而再生的转基因芽还更快地产生生根植物，如通过第1次拔出时生根芽(％)增加所示。
表7.WPM再生培养基提高转基因玉米植物的正常植物频率。
芽频率计算为产生芽的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。正常芽频率计算为正常芽数量除以接种的外植体总数。正常植物频率(NPF)计算为正常植物数量除以接种的外植体总数。
表8.WPM再生培养基提高转基因玉米植物的生根频率。
第1次拔出时生根芽计算为第一次拔出时有根的芽数量除以芽总数。第2次拔出时生根芽(％)计算为第2次拔出时有根的芽数量除以芽总数。总体生根芽计算为来自第1次和第2次拔出的有根的芽总数除以芽总数。
对MS、B5、WPM和低氮MS再生培养基中常量营养素的仔细检查表明与其他评价的再生培养基相比，WPM再生培养基含有低水平的氮和其他盐(表9)。WPM再生培养基含有与MS再生培养基相比约1/5的总氮、与B5再生培养基相比约1/2的总盐以及与低氮MS再生培养基相比约1/3的总盐。另外，WPM再生培养基包含与MS再生培养基和B5再生培养基相比约1/3的钾以及与低氮MS再生培养基相比约1/4的钾。因此，本文提供的结果表明WPM再生培养基中存在的较低盐水平可能导致观察到的与其接触而再生的转基因玉米植物的转化和生根频率提高。
表9.MS、B5、WPM和低氮MS再生培养基中的常量营养素浓度。
实施例5
再生培养基中不同硝酸盐水平对玉米种子外植体转化的比较
该实施例描述了进一步研究再生培养基中不同氮水平对玉米外植体转化和再生的影响的实验和结果。
如实施例4中所示，WPM再生培养基中的较低盐水平似乎有助于提高玉米的转化和生根频率。由于WPM盐基再生培养基含有与MS盐基再生培养基相比显著更低的总氮，故进行另外的实验来检查改良MS盐基再生培养基中不同氮组分水平对生根频率和再生的影响。
表10.盐基再生培养基中的氮水平。
氮源 1x氮 1/2x氮 1/4x氮 类似WPM的氮
NH4NO3(g/L) 1.65 0.825 0.413 0.413
KNO3(g/L) 1.9 0.95 0.475
测试了四种含有不同量的含氮组分的MS盐基再生培养基，以及WPM作为对照。再生培养基含有如Murashige和Skoog(1962)所述的常量营养素和微量营养素，但不含盐混合物中的硝酸铵和硝酸钾，以允许单独添加这些组分的量。将硝酸铵和硝酸钾以表10中所示的量添加到培养基中，这些量表示相对于MS盐混合物中的标准量的全浓度(1x)、半浓度(1/2x)和四分之一浓度(1/4x)，或与WPM盐相同的量(类似WPM)。其余的培养基成分与标准MS盐混合物中的相同。还使用WPM作为对照。
在第一个实验中，如实施例1中所述，用两种光密度(OD为0.25或1)的农杆菌属接种从优良种质切除的玉米外植体。农杆菌属具有在Ti质粒上的侧翼为T-DNA边界的两种表达盒。第一表达盒包含在组成型启动子控制下的叶绿体靶向的CP4 EPSPS基因作为转基因事件的选择标记。第二表达盒包含在不同组成型启动子控制下的uidA基因作为用于目视鉴定转化体的可筛选标记。将接种的玉米外植体转移到共培养板(25mm x 100mm)，该板含有一张用1.25mL再水合培养基润湿的无菌Whatman#1滤纸(82mm)，该再水合培养基不含农杆菌属(接种处理OD 0.25)或含1.25mL的OD为1.0的农杆菌属(接种处理OD 1.0)。将共培养板在20℃和约65％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下孵育6天。
在接种和共培养之后，接种的外植体经历如实施例1中所述的芽诱导和延长芽诱导(EBI)步骤。在EBI后，将外植体以每个陪替氏平皿约30个外植体转移到不同的再生培养基中。将板在28℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期和160PAR的光强度目标下孵育。在2-3周后，将响应外植体转移到具有相同培养基的PlantConsTM中，并再孵育2-3周，然后获得数据。
实验结果在表11中总结。生根频率(％)被定义为生根芽数量除以产生芽的外植体数量x 100。转化(TFN)频率(％)被定义为生根芽数量除以接种的外植体数量x 100，这是转化和再生频率的测量。平均生根频率是特定氮水平的平均值，包括OD为0.25和1.0的接种处理。类似地，平均转化频率是每个培养基的平均值。如表11中所示，对于MS盐基再生培养基，随着氮水平从1x降低到1/4x，平均生根频率增加。类似WPM的再生培养基含有相似但较低氮水平，并产生相似或稍微更高的平均生根频率。含有较低氮水平的培养基还提高了平均转化频率。
按照与上述第一个实验相同的方案进行另外两个实验(实验2和3)，不同之处在于(1)玉米外植体来自不同的优良玉米种质；(2)仅使用OD为0.25的接种；(3)一个实验使用具有仅包含CP4 EPSPS表达盒的不同构建体的农杆菌属，以及(4)仅随机选择来自延长芽诱导培养基的响应绿化外植体的子集并转移到陪替氏平皿中的再生培养基，然后转移到PlantConsTM。
这两个实验的结果在表12中显示。如上一段所述，对再生板响应的外植体数量仅代表响应绿化外植体的子集，这些外植体是在延长芽诱导后从所有外植体中随机挑选并转移到再生培养基中用于进一步测试的。调整后的再生频率(％)表示为生根芽数量除以转移到再生板的响应外植体数量x 100。虽然这些特定实验的结果没有显示出生根频率的明显变化，但是在两个实验中，采用1/4x氮处理的调整后的再生频率似乎始终更高。
实施例6
力辅助转化提高玉米外植体转化
该实施例证明力辅助转化提高从干种子切除的玉米胚外植体的转化。在该实施例中，力辅助转化可包括在用农杆菌属接种之前或期间使外植体经受高压、离心、或高压和离心。
实验被设计以评价在用农杆菌属接种之前或期间经受离心的来自干种子的成熟玉米胚外植体的转化。在接种之前，用95％乙醇和200ppm活性氯对外植体进行表面消毒，冲洗3次，在20％ PEG4000 INO培养基中再水合3小时，冲洗并浮选富集，该培养基包含2/5浓度的B5常量盐、1/10浓度的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖、3.9g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)和20％ PEG4000，pH 5.4。然后使干胚外植体经受以下处理之一：1)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在室温下孵育30分钟；2)在农杆菌属接种之前以291xg离心30分钟，随后在农杆菌属接种物的存在下在45kHz下超声处理1min并在室温下孵育30分钟；3)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在室温下以291xg离心30分钟；4)在农杆菌属接种物的存在下在室温下孵育30分钟；5)在农杆菌属接种之前以291xg离心30分钟，随后在农杆菌属接种物的存在下在室温下孵育30分钟；或6)在农杆菌属接种物的存在下在室温下以291xg离心30分钟。该实验中用于接种的农杆菌属包含植物转化载体，该植物转化载体包含三种表达盒，第一表达盒编码β-葡糖醛酸酶(GUS)，第二表达盒编码GFP，并且第三表达盒编码aadA。uidA(GUS)基因在水稻肌动蛋白1启动子、来自CaMV的重复35SA1-B3结构域的增强子、小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列、来自水稻肌动蛋白1基因的内含子和马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的3’UTR(其功能是指导mRNA的多腺苷酸化)的控制下。gfp基因在来自CaMV的增强35S RNA启动子、小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列、来自水稻肌动蛋白1基因的内含子和小麦低分子量热休克蛋白基因的3’UTR的控制下。aadA基因在增强35SRNA启动子、与来自水稻肌动蛋白1的第一内含子融合的小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列和根癌农杆菌属Ti质粒的胭脂碱合酶基因的3’UTR的控制下。使用SorvallTM RC3BP离心机和H6000A转子(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)进行离心。
在接种后，将外植体在1.25ml INO培养基中在23℃和70％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下共培养5天，该培养基包含2/5浓度、1/10浓度的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖、3.9g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，pH 5.4，加上50ppm制霉菌素、10ppm噻苯唑(TBZ)和50ppm五氯硝基苯(PCNB)。然后对外植体进行取样并使用定量MUG测定分析GUS活性。如表13中所示，在接种之前或期间离心的外植体显示出总体瞬时GUS表达显著增加。在该实验中，超声处理对瞬时GUS表达没有统计学上显著的影响。在农杆菌属接种之前离心的外植体与在农杆菌属接种期间离心的那些外植体之间观察到的瞬时GUS表达也没有统计学上显著的差异。在这些实验中，阴性GUS表达测量结果被解释为没有GUS染色。
表13.在接种之前或期间离心的外植体的提高的瞬时表达。
另外，将每个处理组的五个外植体一分为二并成像用于GFP和GUS表达。如图1所示，在接种之前或期间离心的外植体的胚芽鞘和叶基部中的瞬时表达较高。图1示出了经受以下处理的外植体的明视野图像、荧光图像和X-gal染色：a)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在室温下孵育30分钟；b)在农杆菌属接种之前以291xg离心30分钟，随后在农杆菌属接种物的存在下在45kHz下超声处理1min并在室温下孵育30分钟；c)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在室温下以291xg离心30分钟；d)在农杆菌属接种物的存在下在室温下孵育30分钟；e)在农杆菌属接种之前以291xg离心30分钟，随后在农杆菌属接种物的存在下在室温下孵育30分钟；或f)在农杆菌属接种物的存在下在室温下以291xg离心30分钟。
实验被设计以评价在农杆菌属接种期间在4℃或23℃下经受离心的从干种子切除的成熟玉米胚外植体的转化。在接种之前，用95％乙醇和200ppm活性氯对外植体进行表面消毒，冲洗3次，在INO培养基中用20％ PEG4000再水合3小时，冲洗并浮选富集，该培养基包含2/5浓度的B5常量盐、1/10浓度的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖、3.9g/L2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、20％PEG4000，pH 5.4。然后使干胚外植体经受以下处理之一：1)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在23℃下孵育30分钟；2)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在4℃下孵育30分钟；3)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在23℃下以291xg离心30分钟；4)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在4℃下以291xg离心30分钟；5)在农杆菌属接种物的存在下在23℃下孵育30分钟；6)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下孵育30分钟；7)在农杆菌属接种物的存在下在23℃下以291xg离心30分钟；或8)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下以291xg离心30分钟。该实验中用于接种的农杆菌属包含植物转化载体，该植物转化载体包含三种表达盒，第一表达盒编码β-葡糖醛酸酶(GUS)，第二表达盒编码GFP，并且第三表达盒编码aadA。uidA(GUS)基因在水稻肌动蛋白1启动子、来自CaMV的重复35S A1-B3结构域的增强子、小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列、来自水稻肌动蛋白1基因的内含子和马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的3’UTR(其功能是指导mRNA的多腺苷酸化)的控制下。gfp基因在来自CaMV的增强35S RNA启动子、小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列、来自水稻肌动蛋白1基因的内含子和小麦低分子量热休克蛋白基因的3’UTR的控制下。aadA基因在增强35S RNA启动子、与来自水稻肌动蛋白1的第一内含子融合的小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列和根癌农杆菌属Ti质粒的胭脂碱合酶基因的3’UTR的控制下。使用SorvallTM RC3BP离心机和H6000A转子(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)进行离心。
在接种后，将外植体在1.25ml INO培养基中在23℃和70％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下共培养6天，该培养基包含2/5浓度、1/10浓度的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖、3.9g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，pH 5.4，加上50ppm制霉菌素、10ppm噻苯唑(TBZ)和50ppm五氯硝基苯(PCNB)。然后使用定量MUG测定分析外植体的GUS活性。如表14中所示，在接种期间离心的外植体显示出总体瞬时GUS表达的显著增加，与进行接种时的温度无关。在该实验中，孵育温度和超声处理对瞬时GUS表达均没有统计学上显著的影响。至于上表30，阴性GUS表达测量结果被解释为没有GUS染色。
表14.在接种期间在不同温度下离心的外植体的提高的瞬时表达。
另外，将每个处理组的五个外植体一分为二并成像用于GFP和GUS表达。如图2所示，在接种期间离心的外植体的叶基部中的瞬时表达更高。图2示出了经受以下处理的外植体的明视野图像、荧光图像和X-gal染色：a)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在23℃下孵育30分钟；b)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在4℃下孵育30分钟；c)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在23℃下以291xg离心30分钟；d)在45kHz下超声处理1min，随后在农杆菌属接种物的存在下在4℃下以291xg离心30分钟；e)在农杆菌属接种物的存在下在23℃下孵育30分钟；f)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下孵育30分钟；g)在农杆菌属接种物的存在下在23℃下以291xg离心30分钟；或h)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下以291xg离心30分钟。
实验被设计以评价在用农杆菌属接种之前暴露于离心或高压的从干种子切除的成熟玉米胚外植体的转化。在暴露于高压或离心之前，依次用70％乙醇和10％对外植体进行消毒5分钟，冲洗3次，并在接种培养基中再水合1小时，该接种培养基包含2/5浓度的B5常量盐、1/10浓度的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖、3.9g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，pH 5.4，以及30ppm杀真菌剂。在暴露于高压或离心后，用包含植物转化载体的农杆菌属接种干胚外植体，该植物转化载体包含两种表达盒。一种盒包含uidA基因，其编码β-葡糖醛酸酶(GUS)，该基因在水稻肌动蛋白1启动子、来自CaMV的重复35S A1-B3结构域的增强子、小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列、来自水稻肌动蛋白1基因的内含子和马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的3’UTR(其功能是指导mRNA的多腺苷酸化)的控制下。另一种盒包含aroA基因，其编码II类EPSPS酶(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)并通过拟南芥EPSPS的转运肽靶向叶绿体，该基因在水稻肌动蛋白1启动子、前导序列和内含子以及根癌农杆菌属Ti质粒的胭脂碱合酶基因的3’UTR(其功能是指导mRNA的多腺苷酸化)的控制下。在暴露后的不同时间点在室温下1小时。如上所述，通过将外植体放入具有约50ml接种培养基的50ml聚丙烯离心管(BluemaxTM,Becton Dickinson 4-2098-11)中进行离心，并使用SorvallTM RC3BP离心机和H6000A转子(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)离心。通过将上述的20ml接种培养基中的干胚外植体装入French Press 40K压力单元(IEC,FA-032)中并将外植体在高比率下暴露于200psig 5分钟来施加高压，这对应于压力单元内的压力为3334psi(227atm)。
在接种后，使外植体经受共培养、芽诱导、延长芽诱导和再生。简而言之，通过铺板在具有1.25ml如上所述的接种培养基(包含30ppm和5ppm 2,4-D)的PlantConTM(MP Biomedicals,LLC目录号26-720-02)生长室中的滤纸上将外植体在23℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下与农杆菌属共培养5天。将共培养的外植体转移到固体芽诱导培养基，该固体芽诱导培养基包含MS盐、B5维生素、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、1g/L NZ胺-A(酪蛋白酶促水解产物；Millipore Sigma)、2mg/L甘氨酸、1g/L MES、1mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、10mg/L 6-苄氨基嘌呤(BAP)、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀和3.5g/L低EEO琼脂糖，pH5.8，并在28℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下孵育两周。然后将外植体转移到滤纸三明治中，用于在28℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下进行液体选择。在液体选择期间，初始向每个板中添加10ml选择培养基，该选择培养基包含MS盐、B5维生素、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、2mg/L甘氨酸、1g/L MES、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀和20μM草甘膦，pH5.8，并每周另外添加5ml。在接种后8至10周，将芽转移到芽诱导和选择培养基中，该培养基包含MS盐、B5维生素、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、2mg/L甘氨酸、1g/L MES、1mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、10mg/L 6-苄氨基嘌呤(BAP)、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀、20μM草甘膦和3.5g/L低EEO琼脂糖，pH 5.8。将生根的R0事件送去温室用于进行表型分析和拷贝数分析。
如表15中所示，在用农杆菌属接种之前暴露于高压或离心显著增加了玉米干胚外植体的转化频率。此外，随着暴露于高压或离心与接种之间经过的时间增加，转化频率下降。转化频率计算为R0植物数量除以转移到芽诱导培养基的外植体总数。
实验被设计以评价在用农杆菌属接种之前或期间暴露于高压的成熟玉米胚外植体的转化。在该实验中，没有对玉米干胚外植体进行表面消毒。通过将以下中的干胚外植体装入French Press 40K压力单元(IEC，FA-032)中并将外植体暴露于范围为14.7psi至30,000psi的压力来施加高压：1)20ml接种培养基，其包含2/5浓度的B5常量盐、1/10的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖和3.9g/L MES；或2)20ml接种培养基中的农杆菌属接种物。然后用包含植物转化载体的农杆菌属接种干胚外植体30分钟，该植物转化载体包含两种表达盒。一种盒包含uidA基因，其编码β-葡糖醛酸酶(GUS)，该基因在水稻肌动蛋白1启动子、来自CaMV的重复35S A1-B3结构域的增强子、小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列、来自水稻肌动蛋白1基因的内含子和马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的3’UTR(其功能是指导mRNA的多腺苷酸化)的控制下。另一种盒包含aroA基因，其编码II类EPSPS酶(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)并通过拟南芥EPSPS的转运肽靶向叶绿体，该基因在水稻肌动蛋白1启动子、前导序列和内含子以及根癌农杆菌属Ti质粒的胭脂碱合酶基因的3’UTR(其功能是指导mRNA的多腺苷酸化)的控制下。
在接种后，使外植体经受共培养、芽诱导、延长芽诱导和再生。简而言之，通过铺板在具有1.25ml如上所述的接种培养基(包含30ppm和5ppm 2,4-D)的PlantConTM(MP Biomedicals,LLC目录号26-720-02)生长室中的滤纸上将外植体在23℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下与农杆菌属共培养5天。将共培养的外植体转移到固体芽诱导培养基，该固体芽诱导培养基包含MS盐、B5维生素、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、1g/L NZ胺-A(酪蛋白酶促水解产物；Millipore Sigma)、2mg/L甘氨酸、1g/L MES、1mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、10mg/L 6-苄氨基嘌呤(BAP)、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀和3.5g/L低EEO琼脂糖，pH5.8，并在28℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下孵育两周。然后将外植体转移到滤纸三明治中，用于在28℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下进行液体选择。在液体选择期间，初始向每个板中添加10ml选择培养基，该选择培养基包含MS盐、B5维生素、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、2mg/L甘氨酸、1g/L MES、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀和20μM草甘膦，pH5.8，并每周另外添加5ml。在接种后8至10周，将芽转移到芽诱导和选择培养基中，该培养基包含MS盐、B5维生素、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、2mg/L甘氨酸、1g/L MES、1mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、10mg/L 6-苄氨基嘌呤(BAP)、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀、20μM草甘膦和3.5g/L低EEO琼脂糖，pH 5.8。将生根的R0事件送去温室用于进行表型分析和拷贝数分析。如表16中所示，暴露于1667psi、3334psi、10,000psi和20,000psi压力的外植体的转化频率显著增加。在该实验中，暴露于30,000psi似乎是致命的。转化频率计算为R0植物数量除以转移到芽诱导培养基的外植体总数。
表16.在接种之前或期间暴露于高压的外植体的提高的瞬时表达。
实验被设计以评价在农杆菌属接种期间经受离心、高压、或离心和高压组合的来自干种子的成熟玉米胚外植体的转化频率。如实施例1中所述的制备两批外植体。使每个外植体批次经受以下处理之一：(1)在农杆菌属接种物的存在下以2,620xg离心30分钟；(2)在农杆菌属接种物的存在下以300psi高压3分钟；(3)在接种之前以300psi高压3分钟，随后在农杆菌属接种物的存在下以2,620xg离心30分钟；或(4)在农杆菌属接种物的存在下以300psi高压3分钟，随后在农杆菌属接种物的存在下以2,620xg离心30分钟。第三种处理，在接种之前高压随后在农杆菌属接种物的存在下离心，允许评价高压组分在第四个处理组的组合步骤中的贡献。将两个外植体批次中的每一个都分到四个处理组之一。每种处理完成三次重复，使用每次重复1,140个外植体。使用600-EXP压力室(PMS Instrument Company,Albany,OR,USA)施加高压，该压力室通过外部端口与更大的外部压力室连接。使用氮气来给室增压。使用SorvallTM RC3BP离心机(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)施加离心。
用聚乙二醇(PEG)和乙醇溶液对玉米干胚外植体进行灭菌4分钟，然后用40ml再水合培养基再水合两小时。然后用农杆菌属接种外植体，同时暴露于离心、高压、或离心和高压组合，如上所述。用于接种的农杆菌属包含具有两种表达盒的二元植物转化载体，第一表达盒编码β-葡糖醛酸酶(GUS)，并且第二表达盒编码EPSPS-CP4。使用带有通风盖的50ml迷你生物反应器管(目录号CLS431720，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)进行初始再水合以及后续的高压和离心处理。
在接种后，使外植体经受共培养、芽诱导、延长芽诱导和再生，如本文所述。简而言之，将外植体在生长室中在20℃和70％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下共培养5天。每个共培养托盘容纳至多约570个外植体，因此每次处理重复使用两个托盘(或至多约1,140个外植体)。然后将来自每个托盘的共培养外植体转移到含有芽诱导培养基的5个托盘中，并在33℃和70％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下孵育一周。然后将来自每个芽诱导托盘的外植体转移到具有25μM草甘膦的延长芽诱导培养基的两个托盘中用于进行选择，并在33℃和70％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下孵育一周。将外植体转移到托盘(VIVI Green Innovators,-Gravendeel,The Netherlands)中含20μM草甘膦选择的再生培养基，并孵育4至6周以使转基因植物发育。在再生后，将表型正常的植物插入插植培养基(产品号72-R，Gro-Tech.com Falmouth,ME,USA)中并在托盘(商品号PL-O36-STAR-HW-VH-BK-50，Clearwater,MN,USA)中孵育。从每个插植植物中获得用于分子测定的叶组织样品。然后将插植植物移到生长室中用于进行锻炼(hardening)。
根据分子数据，将转化植物推进到温室用于进行观察。GUS表达用作可见标记来检测共培养后的瞬时表达并检测其他时间点(诸如在芽诱导和R0芽发育期间)的稳定表达。R0叶组织的GUS表达测定和插植时植物的目视观察也用于鉴定嵌合植物。嵌合植物在插植期间通常具有带绿色和白色扇区的条纹叶的表型。使用实时PCR对R0叶组织进行分子测定以确定CP4 EPSPS和uidA基因的存在和拷贝数。根据这些测定，每种处理的非嵌合转化植物(也称为正常转基因植物或正常植物)的百分比通过非嵌合且CP4 EPSPS和uidA阳性的转基因植物数量除以插植后取样的植物总数来确定。表17示出了插植频率、低拷贝数植物频率(即，对低拷贝数的EPSPS CP4基因和uidA基因呈阳性的非嵌合植物的百分比)以及具有低拷贝数转基因的转化体频率。插植频率计算为插植的转基因R0植物数量除以接种的外植体总数。低拷贝数植物频率计算为低拷贝数转基因阳性植物(即，仅具有每种转基因的一个或两个拷贝的植物)且非嵌合的植物数量除以插植的R0植物总数。具有低拷贝数转基因的转化体频率计算为具有低拷贝数转基因的转化体数量除以接种的外植体总数。这些频率计算中的每一个进一步乘以100％以将频率表示为百分比。计算是根据从随机数量的插植后植物中提取的样品进行的。
表17.暴露于高压和离心组合的玉米外植体的提高的转化频率。
如表17中所示，当在农杆菌属接种物的存在下使用300psi的高压3分钟和2,620xg的离心30分钟进行接种时，低拷贝数植物频率和具有低拷贝转基因的转化体频率最高。当在农杆菌属接种物的存在下使用300psi的高压3分钟进行接种时，低拷贝转化频率是第二高的。因此，与单独使用高压或离心的接种相比，在接种期间的离心和高压组合显示出转化和低拷贝数频率的额外增加。
实施例7
力辅助转化提高小麦外植体转化
该实施例描述了使用力辅助转化的从干种子切除的小麦胚外植体的转化的提高。在该实施例中，力辅助转化可包括在用农杆菌属接种期间使外植体经受离心。
用70％乙醇对外植体进行表面消毒1分钟，冲洗，浮选富集，在20％ PEG4000中再水合1.5小时并在接种之前冲洗。使干胚外植体经受以下处理之一：1)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下孵育30分钟；2)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下以72xg离心30分钟；3)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下以291xg离心30分钟；或4)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下以654xg离心30分钟。该实验中用于接种的农杆菌属包含植物转化载体，该植物转化载体包含三种表达盒，第一表达盒编码β-葡糖醛酸酶(GUS)，第二表达盒编码GFP，并且第三表达盒编码aadA。uidA(GUS)基因在水稻肌动蛋白1启动子、来自CaMV的重复35S A1-B3结构域的增强子、小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列、来自水稻肌动蛋白1基因的内含子和马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的3’UTR(其功能是指导mRNA的多腺苷酸化)的控制下。gfp基因在来自CaMV的增强35S RNA启动子、小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列、来自水稻肌动蛋白1基因的内含子和小麦低分子量热休克蛋白基因的3’UTR的控制下。aadA基因在增强35S RNA启动子、与来自水稻肌动蛋白1的第一内含子融合的小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列和根癌农杆菌属Ti质粒的胭脂碱合酶基因的3’UTR的控制下。使用SorvallTM RC3BP离心机和H6000A转子(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)进行离心。
在接种后，将外植体在包含50ppm制霉菌素、10ppm噻苯唑(TBZ)和50ppm五氯硝基苯(PCNB)的1.0ml或1.25ml INO培养基中在23℃和70％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下共培养4天。将每个处理组的五个外植体一分为二并成像用于GFP和GUS表达。如图3所示，在接种期间以大于72xg离心的外植体的瞬时表达增加。图3示出了经受以下处理的外植体的明视野图像、荧光图像和X-gal染色：a)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下孵育30分钟；b)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下以72xg离心30分钟；c)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下以291xg离心30分钟；或d)在农杆菌属接种物的存在下在4℃下以654xg离心30分钟。
实施例8
重力和离心容器对玉米外植体转化的影响
已经使用291xg或654xg的重力来产生转基因玉米植物。进行了多个实验(实验1、2和3)以确定在接种期间的重力是否对转化频率(TF)有积极影响。如图4所示，对于两个实验(实验1和3)，随着重力从291xg(或该实验中的1000rpm)增加到4657xg(或该实验中的4000rpm)，瞬时表达增加。另外，当重力从291xg增加到2619xg(或该实验中的3000rpm)时，最终转化频率增加，但是当重力进一步增加到4657xg时，最终转化频率稍微下降，可能是由于重力对组织培养物响应的影响(参见表18)。
表18.在接种期间的重力对稳定转化的影响。
使用Falcon离心管(50ml)用于在玉米转化期间的离心，但是考虑到大规模生产实施，也使用Corning锥形瓶(500ml)代替50ml Falcon离心管来培养农杆菌属。然而，随着转化频率的提高，更大的离心容器可能不是必需的。进行了多个实验(实验1、2、3和4)以研究离心容器对转化频率(TF)的影响。如表19中所示，与500ml Corning锥形瓶相比，用50mlFalcon管得到更高的TF。
表19.离心容器对稳定转化的影响。
实施例9
在农杆菌属接种之前玉米外植体的再水合提高玉米外植体转化
进行了两个实验以评价在农杆菌属接种之前玉米外植体再水合对玉米外植体转化的影响。除非另有说明，否则转化通常如实施例1中所述的进行。将每个实验中的外植体再水合0、1或2小时，每个处理组含有3,333个玉米外植体。
简而言之，使用70％乙醇对外植体进行表面灭菌4min，然后用无菌水冲洗3次，然后在培养基中再水合0、1或2小时，该培养基含有2/5浓度的B5常量盐(除了CaCl2之外，其为1/2浓度)、1/10浓度的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖、2.8mg/L西奎斯特林、3.9g/L MES、0.03g/L Clearys 3336WP、pH 5.4和5mg/L2,4-D。在该实验中，用于再水合的相同培养基也用于农杆菌属接种和共培养。用OD600为0.35的农杆菌属接种外植体，在4℃下以600xg离心30分钟。农杆菌属包含在Ti质粒上的侧翼为T-DNA边界的两种表达盒。第一表达盒包含在组成型启动子控制下的叶绿体靶向的CP4 EPSPS基因。第二表达盒包含在不同组成型启动子控制下的uidA基因。在共培养后，将外植体在暖房中在22小时光照/2小时黑暗的光周期(光周期1)下，或在暖房中在16小时光照/8小时黑暗的光周期(光周期2)下培养。
如表20中所示，在两种光周期下培养后，再水合步骤的并入持续提高了芽频率和转化频率。此外，与再水合1小时相比，再水合2小时提高了芽频率和转化频率。
表20.再水合提高玉米种子外植体芽频率和转化频率。
芽频率计算为产生芽的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。转化频率或TF(％)计算为插植的再生植物数量除以接种的玉米外植体总数。
实施例10
在接种和共培养期间较高浓度的农杆菌属提高玉米外植体转化
该实施例描述了实验和结果，表明在接种期间不同浓度的农杆菌属和在共培养期间添加农杆菌属对玉米外植体转化的影响。
进行了三个初始实验以评价农杆菌属浓度对玉米外植体转化的影响。实验包括在接种和共培养期间不同浓度的农杆菌属(通过光密度测量)，如表21中所示。简而言之，如实施例1中所述的制备外植体和农杆菌属并接种，不同之处在于改变接种培养基中的农杆菌属的浓度(OD660)，如表21中所示。在实验1和2中，农杆菌属包含在Ti质粒上的侧翼为T-DNA边界的两种表达盒。第一表达盒包含在组成型启动子控制下的叶绿体靶向的CP4 EPSPS基因作为转基因事件的选择标记。第二表达盒包含在不同组成型启动子控制下的uidA基因作为用于目视鉴定转化体的可筛选标记。在实验3中，农杆菌属包含在Ti质粒上的侧翼为T-DNA边界的一种编码CP4 EPSPS的表达盒。
如表21中所示，将接种的玉米外植体转移到共培养板(25mm x100mm)，该板含有一张用1.25mL再水合培养基润湿的无菌Whatman#1滤纸(82mm)，该再水合培养基不含农杆菌属(实验1-3的处理1)或在实验1中含不同OD浓度的农杆菌属(0.25、0.5或1.0)或在实验2和3中含OD浓度为1.0的农杆菌属。将共培养板在20℃和约65％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下孵育6天。
在共培养结束时，将外植体转移到芽诱导(BI)培养基并培养7天，随后转移到延长芽诱导(EBI)培养基并培养14天。BI和EBI培养基以及培养条件与实施例1中所述的相同。然后将来自EBI的外植体转移到陪替氏平皿中的固体再生培养基(如实施例1中所述)中10天，然后移到含有相同再生培养基的9cm托盘(The Netherlands)中用于进行芽发育和生根。使用手持式薄膜烙铁将托盘用塑料膜密封，并在28℃和环境湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养32天。在再生步骤后，将具有可见根且没有嵌合迹象的推定绿色转基因植物移植到土块(2”直径x 3”高度(Gro-TechTM,Rough and Ready,CA95975)中用于进行进一步生长和发育以及分子表征。
表21.在接种和共培养期间的农杆菌属浓度对插植频率的影响。
如图5所示，在实验1中随着农杆菌属浓度的增加，瞬时GUS表达增加。表21中所示的结果还表明在实验1中这种瞬时表达的增加与较高的平均插植频率相关。当在接种和共培养步骤期间农杆菌属以OD 1.0存在时，获得了最高插植频率，尽管与对照相比，高农杆菌属浓度处理似乎减慢了在芽诱导期间和延长芽诱导开始时的外植体生长。在实验2中对于瞬时表达和平均插植频率，获得了相似的结果(参见表21)。在实验3中，与对照(2.04％)相比，在接种和共培养中用OD 1.0的农杆菌属观察到插植频率略微增加(2.33％)(参见表21)。
对于该实施例中描述的实验，芽频率被定义为再生芽(包括嵌合芽和非嵌合芽)数量除以接种的外植体总数x 100。嵌合芽频率被定义为嵌合芽数量除以芽总数x 100。平均芽频率和平均嵌合芽频率分别简单地是对多次重复进行平均的芽频率和嵌合芽频率。插植频率被定义为转移到土壤中的非嵌合事件数量除以接种的外植体总数x 100。优质插植频率被定义为单拷贝插植事件数量除以接种的外植体总数x 100。单拷贝频率被定义为单拷贝事件数量除以再生事件总数x 100。
在实验2中，测量并比较嵌合芽频率和平均芽频率，以评价在接种和共培养期间较高的农杆菌属浓度是否影响嵌合芽形成频率。如表22中所示，与对照相比，在接种和共培养期间用较高的农杆菌属OD1.0浓度获得了较高的平均芽频率，而平均嵌合芽频率在较高OD浓度与对照组之间相似。因此，使用较高OD浓度产生的较高芽频率与嵌合性增加无关。
表22.在接种和共培养期间的农杆菌属浓度对芽频率和嵌合芽频率的影响。
处理 平均芽频率(％) 平均嵌合芽频率(％)
l(对照) 10.32 56.04
2 18.42 54.51
在实验2和3中为了评价在接种和共培养期间较高的农杆菌属浓度是否影响单拷贝事件频率，对转移到土壤的事件进行CP4 EPSPS拷贝数测定。如表23中所示，单拷贝事件％在较低标准OD与较高OD处理之间相似。
表23.在接种和共培养期间的农杆菌属浓度对单拷贝事件频率的影响。
在三个初始实验后，进行了数次大规模实验，涉及16种不同构建体。所有16种构建体都含有相同的CP4 EPSPS盒作为选择标记，并且根据那些构建体中携带的附加目标基因表达盒将实验分为三组。在所有实验组中用较高的农杆菌属浓度观察到芽频率增加，其中组1和组3具有统计上显著的增加(用“*”表示)(参见表24)。观察到用较高OD浓度的组1的插植频率显著增加，而组2和组3的插植频率结果与对照相当。还观察到在较高OD浓度下的组3的嵌合芽频率略微增加。另外，表24中的结果进一步表明在这些实验中转基因单拷贝频率与农杆菌属浓度无关。在表24中，加下划线的数字表示uidA拷贝数，没有下划线的数字表示CP4拷贝数。结果表明在较低与较高OD浓度之间的单拷贝频率没有显著差异。CP4和uidA单拷贝频率测量的变化在统计学上不显著。类似地，在这些实验中，发现对照组与高OD处理组之间的优质插植频率相当。
实施例11
在芽诱导期间的温度和光强度对玉米外植体转化的影响
进行了两个实验以评价在芽诱导期间的温度和光强度的影响。如实施例9中所述，对外植体进行表面灭菌，纯化，再水合并用农杆菌属接种。然后如实施例1中所述，将外植体共培养并经受芽诱导、延长芽诱导和再生，除非另有说明。
第一个实验评价了两种培养温度(32℃和35℃)以及两种PAR 90μ/m2·s和140-150μ/m2·s的光强度下的芽诱导。每个处理组包含约2,500个玉米外植体。将培养物在室中在指定温度和光强度下孵育。如表25中所示，与在35℃下进行芽诱导相比，在32℃下进行芽诱导提高了芽频率、正常芽频率、正常芽到土块的数量和正常植物频率。在该实验中，光强度对正常植物频率没有统计学上显著的影响，然而，与在140-150μ/m2·s的PAR下进行芽诱导相比，在90μ/m2·s的PAR下进行芽诱导产生略微更高的正常植物频率。
表25.在芽诱导期间的温度和光强度对玉米外植体转化的影响。
芽频率计算为产生芽的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。正常芽频率计算为正常芽数量除以接种的外植体总数。正常植物频率(NPF)计算为正常植物数量除以接种的外植体总数。
第二个实验评价了四种不同光强度下的芽诱导：90μ/m2·s的PAR、150μ/m2·s的PAR、180μ/m2·s的PAR和190μ/m2·s的PAR。在180PAR处理组中在28℃下进行芽诱导，在90μ/m2·s的PAR、150μ/m2·s的PAR和190μ/m2·s的PAR处理组中在33℃下进行芽诱导。每个处理包含2,500个玉米外植体。在农杆菌属接种之后，将外植体转移到共培培养基，该共培培养基包含2/5的B5常量盐、1/10的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖、3.9g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、0.03g/L Clearys 3336WP和5mg/L 2,4-D，pH 5.4。然后将外植体转移到芽诱导培养基并在室中培养，除了180μ/m2·s的PAR处理组之外，其在延长芽诱导和再生之前在室中在指定的温度和光强度下培养。
如表26中所示，与在28℃下的芽诱导相比，在33℃下的芽诱导通常提高了芽频率、正常芽频率、正常芽到土块的数量和正常植物频率。另外，在90μ/m2·s的PAR下的芽诱导产生最高的正常植物频率(NPF)。在该实验中，在150μ/m2·s的PAR下的芽诱导与在190μ/m2·s的PAR下的芽诱导之间没有显著差异。
表26.在芽诱导期间的温度和光强度对玉米外植体转化的影响。
芽频率计算为产生芽的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。正常芽频率计算为正常芽数量除以接种的外植体总数。正常植物频率(NPF)计算为正常植物数量除以接种的外植体总数。
实施例12
在再生期间的光密度和温度对转化频率的影响
为了测试光密度是否对液体培养系统中的转化效率具有显著影响，进行了实验以评价在再生步骤期间的光密度对成熟玉米胚外植体转化的影响。在该实验中，将液体培养的四个陪替氏培养皿(每个培养皿约30个外植体)堆叠起来并放置在塑料盒子中。将一半盒子在第一光室中在约60μmol/m2s的光密度下培养，将另一半在第二光室中在约100μmol/m2s的光密度下培养。结果表明与约60μmol/m2s的较低光密度相比，在约100μmol/m2s的较高光密度存在下再生的转化频率更高。在每个光室中，盒子和堆叠顶部的陪替氏培养皿的转化频率最大，并且随着光密度逐渐降低，从顶层到底层逐渐降低(表27)。附带地，顶层的板的温度也是最高的，并且从板的顶层到底层逐渐降低(表28)。因此，更高的光密度和板温度的组合可有助于更高的转化频率。毛衣(sweater)盒子外部的温度为约29℃。较高的光密度还显示出液体和固体培养方案的转化频率增加，但是液体培养方案的增加幅度比固体培养方案更大。另外，在这些实验中较高的光密度显示出转基因植物的生根频率增加(表29)。
表27.采用液体培养方案的光密度对稳定转化的影响。
表28.实际板光密度与板温度之间的相关性。
表29.光密度对液体培养与固体培养以及转基因植物的生根频率的影响。
实施例13
在芽诱导期间的不同细胞分裂素对玉米外植体转化的影响
进行了实验以评价在芽诱导期间使用不同细胞分裂素对玉米外植体转化的影响。如实施例1中所述，对玉米外植体进行表面灭菌，纯化，再水合，用农杆菌属接种，共培养并经受芽诱导(没有第二延长芽诱导步骤)和再生步骤，除非另有说明。使用草甘膦作为选择剂。
在该实验中，评价了使用以下四种细胞分裂素的芽诱导：6-苄氨基嘌呤(BAP)、玉米素、噻苯隆(TDZ)和6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)。如表30中所示，与使用10mg/L的2iP或2mg/L的玉米素的芽诱导相比，使用10mg/L的BAP或2mg/L的TDZ的芽诱导显示出显著更高的正常芽频率。在该实验中，与使用BAP的芽诱导相比，使用TDZ的芽诱导产生略微更高的正常芽频率。在其他利用例如1-8mg/L BAP的研究中，也观察到芽诱导。
表30.在芽诱导期间的不同细胞分裂素对玉米外植体转化的影响。
芽频率计算为产生芽的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。正常芽频率计算为正常芽数量除以接种的外植体总数。
实施例14
不含2,4-D和的共培养提高从小麦种子切除的外植体的农杆菌属介导转化
在该实验中，评价了共培培养基中的2,4-D和表面活性剂对从小麦种子切除的外植体的农杆菌属介导转化的影响。如实施例2中所述，对小麦外植体进行表面灭菌，纯化，用农杆菌属接种，共培养并经受延迟、选择和再生，除非另有说明。
在该实验中，添加2,4-D和对转化频率或正常植物频率没有统计学上显著的影响。然而，如表31中所示，与既不含有2,4-D也不含有的共培培养基相比，当使用含有2,4-D和的共培培养基时，转化频率和正常植物频率降低。与既不包含也不包含2,4-D的共培培养基相比，仅包含的共培培养基产生更高的正常植物频率，然而，在不存在和2,4-D的情况下转化频率最高。
表31.共培培养基中的2,4-D和对小麦外植体转化的影响。
转化频率计算为产生转基因植物的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。正常植物频率计算为正常植物数量除以再生的植物总数。
实施例15
不含2,4-D的共培养提高从玉米种子切除的外植体的农杆菌属介导转化
进行了十七个独立实验以评价共培培养基中的2,4-D对玉米外植体转化的影响。如实施例1中所述，对玉米外植体进行表面灭菌，纯化，再水合，用农杆菌属接种，共培养并经受芽诱导、延长芽诱导和再生，除非另有说明。对于所有实验，使用包含与实施例9中所述相同的Ti质粒的农杆菌属，除了实验13-17之外，其中在共培培养基中存在或不存在2,4-D的情况下评价了Ti质粒的两个不同细菌复制起点。在这些情况下，Ti质粒携带相同的侧翼为T-DNA边界的两种表达盒，一种包含在组成型启动子控制下的叶绿体靶向的CP4 EPSPS基因，另一种包含在相似组成型启动子控制下的uidA基因。
表32提供了来自17个实验的在共培培养基中含和不含2,4-D的处理结果总结。虽然这些实验除了存在或不存在2,4-D之外还包括另外变量，但是结果表明在不同的地点和不同的实验室研究人员的17个实验中的16个实验中从共培培养基中去除2,4-D始终导致更高的正常植物频率，与任何另外参数无关。正常植株频率的增加范围为1.1至3.0倍，平均增加1.8倍。
表32.从共培培养基中去除2,4-D提高玉米外植体转化。
正常植物频率计算为正常植物数量除以接种的外植体总数。
实施例16
共培养持续时间对玉米外植体转化的影响
为了评价共培养持续时间对玉米外植体转化的影响，将玉米种子切除的外植体在70％乙醇中进行表面灭菌4分钟。在100rpm的摇床上在再水合培养基中(该培养基包含2/5浓度的B5常量盐(除了CaCl2之外，其为1/2浓度)、1/10的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖、2.8mg/L西奎斯特林、3.9g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)和0.03g/L Clearys3336WP，pH 5.4)在室温下孵育2小时后，如实施例1中所述的用农杆菌属接种外植体。然后将接种的外植体转移到共培养板并共培养5或7天，然后使它们经受芽诱导、延长芽诱导和再生，如实施例1中所述，不同之处在于在该实验中再生培养基含有MS盐、B5维生素、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、2mg/L甘氨酸、1g/LMES、400mg/L羧苄西林、200mg/L头孢噻肟、100mg/L特美汀和20μM草甘膦，pH 5.8。再生芽在生根培养基上生根，该生根培养基含有MS盐、B5维生素、30g/L蔗糖、0.69g/L脯氨酸、2mg/L甘氨酸、1g/L MES、3g/L Gelzan CM、0.25mg/LIBA、250mg/L羧苄西林和50μM草甘膦，pH 5.8。
如表33中所示，与共培养5天相比，共培养7天产生了更高的转基因芽总数，然而，所产生的更高百分比的芽是嵌合的。结果，共培养5天产生了更高的正常植物频率。
表33.共培养持续时间(5与7天)对玉米外植体转化的比较。
芽频率计算为产生芽的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。正常植物频率计算为正常植物数量除以接种的外植体总数。
在单独的实验中，结合共培培养基中存在或不存在5mg/L 2,4-D来评价4天和5天的共培养持续时间。对从玉米种子切除的外植体进行表面灭菌，再水合并用农杆菌属悬浮液接种，如前述实验中所述。农杆菌属含有在Ti质粒上的侧翼为T-DNA边界的在组成型启动子控制下的叶绿体靶向的CP4 EPSPS基因。将接种的外植体转移到含或不含5mg/L 2,4-D的共培养板并共培养4或5天，然后芽诱导、延长芽诱导和再生，如前述实验中所述。
如表34中所示，与当存在2,4-D时0.73％相比，当共培培养基中不存在2,4-D时获得2.47％的平均正常植物频率。该数据与实施例15中描述的结果一致。此外，与共培养5天相比，共培养4天产生了更高的正常植物频率。表35提供了根据表34中提供的数据的平均计算结果。
表34.共培养中的2,4-D和共培养持续时间对玉米外植体转化的影响。
芽频率计算为产生芽的接种的外植体数量除以接种的外植体总数。正常植物频率计算为正常植物数量除以接种的外植体总数。
表35.从共培培养基中去除2,4-D提高玉米外植体转化，如通过平均正常植物频率(％)所示。
正常植物频率计算为正常植物数量除以接种的外植体总数。
实施例17
狗尾草破碎种子的农杆菌属介导转化
狗尾草(绿谷子)由于数种特性，诸如身材小(10-30cm)、生命周期快(6-9周)、丰硕的种子产量(每个植物约13,000个种子)、自交亲和性、基因组大小小(约395Mb)、二倍体遗传学(2n＝18)和简单的生长要求，可以成为用于研究C4草生物学和其他农艺性状的有吸引力的模型植物系统。已经报道了针对狗尾草的农杆菌属介导转化方法包括基于组织培养的方法和植物花浸方法。参见，例如，Nguyen等人,“Robust and reproducibleAgrobacterium transformation system of C4 genetic model species Setariavirdis”,Front.Plant Sci.13:281(2020年)；和Van Eck,J.,“The Status of Setariavirdis Transfor mation:Agrobacterium-mediated to Floral Dip”,Front.PlantSci.9:652(2018年)。然而，现有的基于组织培养的方法涉及对种子来源的愈伤组织培养物进行农杆菌属转化，这是劳动密集型的并且易于在植物中产生体细胞克隆变异和异型。基于非组织培养的花浸方法涉及将狗尾草植物的未成熟花序暴露于农杆菌属，随后回收成熟种子并鉴定由那些收获的种子生长出的转基因植物。然而，在植物中花浸方法需要生长室或温室空间来在农杆菌属感染之前和之后生长和维持植物。
本文描述了一种用于农杆菌属介导转化狗尾草属种子的新的方法。进行初步尝试使用来自狗尾草种子的干切除的种子胚外植体来开发v介导转化系统，类似于以上实施例中描述的切除的玉米和小麦胚外植体系统。然而，虽然潜在地能够转化并再生为植物，但是切除的狗尾草属种子胚非常小且难以处理。因此，开发了替代方法，使用整个或破碎的狗尾草种子用于进行农杆菌属介导转化，而不是切除的种子胚外植体。使用与本文所述的用于玉米和小麦种子胚外植体培养和再生的系统和方法类似的芽诱导和再生方案，培养转化的狗尾草属植物并由接种的整个或破碎的种子再生成植物。
狗尾草属破碎种子制备
将至多10ml狗尾草属种子(约5-10克)放入含有30ml 70％乙醇的50ml Falcon管中用于进行灭菌。在摇动后，将种子倒入200ml至400ml一次性塑料烧杯中并孵育2min。然后用35ml移液管去除乙醇。对于狗尾草属种子，总乙醇接触时间可优选被控制小于4分钟。然后将种子用约200ml无菌水冲洗3次。可替代地，用10％漂白剂加0.1％ Tween 20对种子进行灭菌3分钟，随后用无菌水冲洗3次。在滚压和破碎步骤之前，将灭菌的种子浸泡在无菌水中至少3小时以再水合和软化种子。然后将灭菌并再水合的种子转移到干净的塑料片上，铺成单层并用第二塑料片覆盖。然后通过滚动1L瓶或擀面杖来破碎两个片层之间的种子，直到大部分种皮被破碎或打开。然后将破碎种子转移到一个或多个50ml Falcon管中。
农杆菌属接种物制备
将约0.5mL解冻的农杆菌属甘油储备液接种到1L无菌烧瓶中的200ml的含有50mg/L大观霉素和30mg/L庆大霉素选择的液体LB培养基中。将烧瓶放入设定为200rpm的定轨摇床/孵育箱中，并在28℃下在黑暗中培养16-24小时，或直到接种物在660nm(OD660)处的吸光度在0.6-1.0范围内。在将过夜的农杆菌属培养物在4℃下以约3,000rpm或2,620xg(3B,6000A转子)离心25分钟，将沉淀物重悬浮于接种培养基中，该接种培养基包含2/5浓度的B5常量盐、1/10的B5微量盐和维生素、1g/L硝酸钾、30g/L葡萄糖和3.9g/LMES、5mg/L 2,4-D和0.05％ Silwet，至最终OD660为约0.5。尽管在接种培养基中使用了生长素(2,4-D)和表面活性剂，但是可替代地，接种培养基中可不存在这些组分中的一种或两种。
农杆菌属接种和共培养
将来自农杆菌属接种物制备步骤的约30ml农杆菌属悬浮液添加到具有来自狗尾草属破碎种子制备步骤的破碎种子的Falcon管中。然后将农杆菌属/破碎种子混合物在Sorvall 5B中在4℃下以约690-1500xg离心30分钟。在离心后，将管搅动以使破碎种子重悬浮，将重悬浮的破碎种子倒入容器中，并通过移液去除大部分的农杆菌属悬浮液。
将接种的破碎种子(约200-300个起始种子)转移到深陪替氏培养皿中，该培养皿含有一张用1.25ml以上家杆菌属接种物制备步骤中所述的接种培养基润湿的无菌Whatman#1滤纸(82mm)，并均匀地铺成单层。将共培养板在23℃和约70％相对湿度以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下孵育3-8天。
选择和芽/根再生
在共培养后，将具有破碎种子的滤纸转移到含或不含10μM草甘膦选择的芽(shoot)/芽(bud)诱导培养基上，该诱导培养基包含MS基础盐、B5维生素、2mg/L甘氨酸、690mg/L脯氨酸、1g/L酪蛋白水解产物、30g/L蔗糖、1g/L MES、1mg/L 2,4-D、10mg/L BAP、200mg/L羧苄西林、100mg/L替卡西林、200mg/L头孢噻肟和3.5g/L琼脂糖，pH 5.8。尽管在这些实验中芽/芽诱导培养基中没有使用生长素，但是可替代地，可以使用少量的生长素。将培养板在Percival孵育箱中设置在28℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期下孵育。将膨胀和伸长的种子外植体转移到第一再生培养基，该第一再生培养基包含MS基础盐、B5维生素、2mg/L甘氨酸、690mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、1g/L MES、400mg/L羧苄西林、100mg/L替卡西林、200mg/L头孢噻肟、30μM草甘膦和3.5g/L琼脂糖，pH 5.8；或转移到第二再生培养基，该第二再生培养基包含MS基础盐、MS维生素、690mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、1g/L MES、400mg/L羧苄西林、100mg/L替卡西林、200mg/L头孢噻肟、30μM草甘膦和3.5g/L琼脂糖，pH 5.8。在实验3中，在第一再生培养基上4周后，将绿色丛生芽传代培养到含50μM草甘膦的相同再生培养基上。在传代培养后2-3周，在该培养基上观察到深绿色芽，并将其转移到生根培养基(相同的培养基或具有低生长素水平，诸如约0.1-0.2mg/L IAA)。尽管在这些实验的一些实验中可已经在生根培养基中使用生长素，但是生根培养基可不含有任何生长素或细胞分裂素。
在第一个转化实验(实验1)中，用含有第一Ti质粒构建体的根癌农杆菌属细胞接种破碎种子，该第一Ti质粒构建体包含两种表达盒，第一表达盒编码β-葡糖醛酸酶(GUS)作为可评分标记，第二表达盒编码CP4 EPSPS作为选择标记。uidA(GUS)基因含有马铃薯LS1(光诱导基因)的第二内含子并且在水稻肌动蛋白1启动子、来自CaMV的重复35S A1-B3结构域的增强子、小麦主要叶绿素a/b结合蛋白的5’非翻译前导序列、来自水稻肌动蛋白1基因的内含子和马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的3'UTR(其功能是指导mRNA的多腺苷酸化)的控制下。编码CP4 EPSPS蛋白的aroA基因在水稻肌动蛋白1基因的启动子、前导序列和内含子以及根癌家杆菌属Ti质粒的胭脂碱合酶基因3’UTR(其功能是指导mRNA的多腺苷酸化)的控制下。EPSPS蛋白通过来自拟南芥EPSPS基因的融合转运肽靶向叶绿体。使用携带第二Ti质粒构建体的根癌家杆菌属细胞进行另外两个实验(实验2和3)，该第二Ti质粒构建体包含与第一Ti质粒构建体相同的两种GUS和EPSPS表达盒。每个实验使用约5克狗尾草属种子。
表36总结了使用破碎种子的所有三个转化实验的实验细节和结果。在实验1中，使破碎种子在接种步骤期间经受1,500xg的离心力，共培养8天，转移到不含选择的芽/芽诱导培养基约21天，然后在含30μM草甘膦选择的第二再生培养基中再生约6周。在实验2中，使破碎种子在接种步骤期间经受800xg的离心力，共培养4天，转移到含10μM草甘膦选择的芽/芽诱导培养基约17天，然后在含30μM草甘膦选择的第一再生培养基中再生约5周。在实验3中，使破碎种子在接种步骤期间经受800xg的离心力，共培养8天，转移到含10μM草甘膦选择的的芽/芽诱导培养基约23天，并然后在含30μM草甘膦选择的第一再生培养基中经受第一再生步骤约4周，随后在含50μM草甘膦选择的第一再生培养基中经受第二再生步骤约3周。从实验1获得一个转基因(GUS+)植物，从实验2和3获得三个转基因(GUS+)植物。
来自实验1的具有转基因插入的外植体和再生植物的图像在图6中显示。在接种后八周，获得浓密的芽丛并通过GUS染色确认(图6A和图6B)。将再生植物在温室中生长(图6D)并收获种子。DNA印迹杂交表明当用CP4探测时，该事件含有单拷贝转基因(图6C)。
实施例18
狗尾草整个种子的农杆菌属介导直接转化
转化整个或完整种子而不需要破碎种子或切除胚外植体是有优势的。为了测试这种可能性，使用整个或完整种子用于进行转化，仅去除其种皮。使用自制抛光工具去除狗尾草属种子的种皮，该工具包括放置在托盘底部的塑料抽屉衬垫和包裹着另一片隆起塑料衬垫的纸板芯。将狗尾草属种子放置在托盘中的衬垫上并用衬垫覆盖的纸板芯滚压以机械地松开种皮(参见图7A)。图7B示出了在去除种皮之前的狗尾草属种子，图7C示出了在去除或分离种皮之后的狗尾草属种子。然后将种子倒入另一个容器中并用空气吹以去除种皮，或将种子转移到水浴中以使种子与种皮分离，结果是种皮浮到水的顶部。然后收集种子用于转化。
在种皮去除之后，用10％漂白剂加0.1％ Tween 20对种子进行灭菌3分钟，随后用无菌水冲洗3次，如以上实施例17中所述。如以上实施例17中关于破碎种子所述，用具有第二Ti质粒构建体的根癌农杆菌属细胞接种完整种子并培养，不同之处在于芽/芽诱导培养基中的BAP浓度为4mg/L。尽管在这些实验中芽/芽诱导培养基中没有使用生长素，但是可替代地，可以使用少量的生长素。每个实验使用约5克狗尾草属种子。然后由接种并培养的种子再生植物。
图8示出了在农杆菌属感染整个或完整种子之后转化和芽再生的一般转化进展。表37总结了使用完整种子的所有三个这些转化实验(实验4、5和6)的实验细节和结果。在实验4中，使种子在接种步骤期间经受800xg的离心力，共培养约4天，转移到含10μM草甘膦选择的芽/芽诱导培养基约8天，然后在含30μM草甘膦选择的第一再生培养基中再生约6周。在实验5中，使种子在接种步骤期间经受1,500xg的离心力，共培养4天，转移到含10μM草甘膦选择的芽/芽诱导培养基约10天，然后在含30μM草甘膦选择的第一再生培养基中再生约5周。在实验6中，使种子在接种步骤期间经受1,500xg的离心力，共培养8天，转移到含10μM草甘膦选择的的芽/芽诱导培养基约10天，并然后在含30μM草甘膦选择的第一再生培养基中经受第一再生步骤约3周，随后在含50μM草甘膦选择的第一再生培养基中经受第二再生步骤约3周。从实验4获得两个转基因(GUS+)植物，从实验5获得转基因(GUS+)植物，从实验5和6各获得一个转基因(GUS+)植物。
为了确认转基因的传递，对转化植物的R0繁殖组织和R1幼苗进行染色用于GUS表达。染色结果在图9中显示。在转化植物的花药、花粉柱头、小穗和未成熟种子以及发芽的R1幼苗中观察到GUS表达。分析来自两个GUS阳性狗尾草属植物事件的R1种子的分离：事件1来自根据本实施例18的完整种子的转化，事件4来自根据实施例17的破碎种子的转化。对由这些R1种子发芽的幼苗进行染色用于GUS表达。如表38中所示，两个事件均显示约3:1的分离，表明转基因整合到单个基因座中。
表38.转基因狗尾草属植物的R1后代的转基因传递。
实施例17和18中提供的结果支持使用整个或完整单子叶植物种子或者破碎或部分打开的单子叶植物种子用于通过多个芽/芽诱导和再生过程转化和生成基因修饰的单子叶植物。本文证明了转基因狗尾草植物可以通过使用农杆菌属介导转化直接转化整个种子或破碎种子来获得。使用整个、完整、破碎或部分打开的种子可以通过避免需要胚外植体切除来极大地促进单子叶植物的转化。

Claims (71)

1.一种产生基因修饰的单子叶植物或植物部分的方法，所述方法包括：
通过用接种培养基接种包含分生组织的单子叶植物种子胚外植体来将异源多核苷酸分子引入所述胚外植体的至少一个细胞中，所述接种培养基包含能够用所述异源多核苷酸分子转化所述至少一个细胞的根瘤菌目细菌，
将所述胚外植体和所述根瘤菌目细菌与共培培养基进行接触共培养，
将所述胚外植体与包含第一生长素和第一细胞分裂素的第一芽诱导培养基进行接触培养，
将所述胚外植体与包含所述第一生长素或第二生长素和所述第一细胞分裂素或第二细胞分裂素的第二芽诱导培养基进行接触培养，以及
由所述胚外植体再生所述基因修饰的单子叶植物或植物部分。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述植物部分是芽或根。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中将所述胚外植体与所述第一芽诱导培养基接触培养约2天至约14天或约6天至约8天范围内的时间段。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将所述胚外植体与所述第一芽诱导培养基在选自由约20℃至约40℃、约25℃至约30℃、约30℃至约40℃、约30℃至约37℃和约33℃至约35℃组成的组的范围内的温度下进行接触培养。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基包含高细胞分裂素与生长素比率。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一生长素选自由以下组成的组：2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)、4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、4-氯苯氧基乙酸或对-氯-苯氧基乙酸(4-CPA或pCPA)、2,4,5-三氯-苯氧基乙酸(2,4,5-T)、2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)、苯乙酸(PAA)和3,6-二氯-2-甲氧基-苯甲酸(麦草畏)。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一生长素是2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一生长素是4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一生长素的浓度为约0.02mg/L至约25mg/L或为约1mg/L至约2mg/L。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一细胞分裂素选自由以下组成的组：6-苄氨基嘌呤(BAP)、噻苯隆(TDZ)、激动素、玉米素、二苯脲(DPU)、6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)和间-拓扑林。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤(BAP)。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一细胞分裂素是噻苯隆(TDZ)。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一细胞分裂素的浓度在约0.1mg/L至约50mg/L的范围内。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述第一细胞分裂素是BAP，并且所述第一芽诱导培养基中的所述BAP的浓度为约10mg/L。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述第一细胞分裂素是TDZ，并且所述第一芽诱导培养基中的所述TDZ的浓度为约2mg/L。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基是固体培养基。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中将所述胚外植体与所述第二芽诱导培养基接触培养约4天至约28天或约7天至约14天范围内的时间段。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中将所述胚外植体与所述第二芽诱导培养基在约20℃至约32℃、约25℃至约29℃、或约27℃至约28℃范围内的温度下进行接触培养。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基包含高细胞分裂素与生长素比率。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基包含：
a)所述第一生长素和所述第一细胞分裂素；
b)所述第一生长素和所述第二细胞分裂素；
c)所述第二生长素和所述第一细胞分裂素；或
d)所述第二生长素和所述第二细胞分裂素。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基中的所述第一生长素或所述第二生长素选自由以下组成的组：2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)、4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、4-氯苯氧基乙酸或对-氯-苯氧基乙酸(4-CPA或pCPA)、2,4,5-三氯-苯氧基乙酸(2,4,5-T)、2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)、苯乙酸(PAA)和3,6-二氯-2-甲氧基-苯甲酸(麦草畏)。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基中的所述第一生长素或所述第二生长素是2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基中的所述第一生长素或所述第二生长素是4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基中的所述第一细胞分裂素或所述第二细胞分裂素选自由以下组成的组：6-苄氨基嘌呤(BAP)、噻苯隆(TDZ)、激动素、玉米素、二苯脲(DPU)、6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)和间-拓扑林。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基中的所述第一细胞分裂素或所述第二细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤(BAP)。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基中的所述第一细胞分裂素或所述第二细胞分裂素是噻苯隆(TDZ)。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基包含4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)和噻苯隆(TDZ)、或2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)和噻苯隆(TDZ)。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基中的所述第一细胞分裂素或所述第二细胞分裂素的浓度在约0.1mg/L至约50mg/L、约0.1mg/L至约25mg/L、或约2mg/L至约10mg/L的范围内。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述第一细胞分裂素或所述第二细胞分裂素是TDZ，并且所述第二芽诱导培养基中的TDZ的浓度为约2mg/L；或所述第一细胞分裂素或所述第二细胞分裂素是BAP，并且所述第二芽诱导培养基中的BAP的浓度为约10mg/L。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基中的所述第一生长素或所述第二生长素的浓度为约0.01mg/L至约25mg/L、约0.02mg/L至约10mg/L、或约1mg/L至约2mg/L。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基是固体培养基。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸分子包含可选择标记基因，其中所述第二芽诱导培养基包含选择剂，并且其中所述可选择标记基因在植物中提供对所述选择剂的抗性。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述选择剂选自由以下组成的组：卡那霉素、巴龙霉素、潮霉素B、大观霉素、链霉素、庆大霉素、草甘膦、草铵膦、膦丝菌素、溴苯腈、双丙氨膦、麦草畏、咪唑啉酮和磺酰脲。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基包含所述第一生长素，所述第二芽诱导培养基包含所述第二生长素，并且其中所述第一生长素不同于所述第二生长素。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基包含所述第一细胞分裂素，所述第二芽诱导培养基包含所述第二细胞分裂素，并且其中所述第一细胞分裂素不同于所述第二细胞分裂素。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤(BAP)并且所述第二芽诱导培养基中的所述第二细胞分裂素是噻苯隆(TDZ)。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一生长素是2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)，并且所述第二芽诱导培养基中的所述第二生长素是4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述第二芽诱导培养基包含所述第二生长素和所述第二细胞分裂素，其中所述第二生长素是4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)，其中4-氨基-3,5,6-三氯-吡啶甲酸(毒莠定)的浓度在约0.1mg/L至约10.0mg/L或约0.5mg/L至约4mg/L的范围内，并且其中所述第二细胞分裂素是噻苯隆(TDZ)，其中所述第二芽诱导培养基中的噻苯隆(TDZ)的浓度在约0.5mg/L至约15mg/L或约1mg/L至约4mg/L的范围内。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述第一生长素是2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)，其中所述第一芽诱导培养基中的2,4-二氯苯氧基-乙酸(2,4-D)的浓度在约0.1mg/L至约10mg/L或约0.1mg/L至约4mg/L的范围内，其中所述第一芽诱导培养基中的所述第一细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤(BAP)，并且其中所述第一芽诱导培养基中的6-苄氨基嘌呤(BAP)的浓度在约1mg/L至约25mg/L或约2mg/L至约20mg/L的范围内。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述基因修饰的单子叶植物是玉米植物、小麦植物、水稻植物、大麦植物、草坪草植物或高粱植物。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述基因修饰的单子叶植物是玉米植物。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述基因修饰的单子叶植物是小麦植物。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述胚外植体是在其中所述胚外植体不发芽并保持存活且能够进行遗传转化的条件下由单子叶植物种子制备的。
44.如权利要求43所述的方法，其中制备所述胚外植体的所述单子叶植物种子的内部水分含量在约3％至约25％的范围内。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述胚外植体是干成熟玉米种子胚外植体，或其中在引入所述异源多核苷酸分子之前，所述胚外植体的内部水分含量在约3％至约25％的范围内。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述胚外植体由缺少根的胚轴的顶端部分组成，并且其中玉米种子的剩余部分已经基本上从所述胚外植体去除。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述根瘤菌目细菌选自由以下组成的组：
a)根瘤菌科、叶杆菌科、布鲁氏菌科、慢生根瘤菌科和黄色杆菌科细菌；或
b)农杆菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、中间根瘤菌属、叶杆菌属、苍白杆菌属、慢生根瘤菌属和固氮根瘤菌属细菌。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述根瘤菌目细菌是农杆菌属，并且其中所述接种培养基中的农杆菌属的OD660在约0.5至约2.0的范围内。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述接种培养基中的农杆菌属的OD660在约0.75至约1.25的范围内或为约1.0。
50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中将所述胚外植体在约15℃至约25℃或约20℃的温度下共培养。
51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中将所述胚外植体共培养约2天至约10天或约5天至约7天范围内的时间段。
52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述共培培养基不含生长素或细胞分裂素。
53.如权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述共培培养基不含表面活性剂。
54.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述共培培养基与用所述共培培养基润湿的纸基质接触。
55.如权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述共培培养基包含能够用所述异源多核苷酸分子转化所述至少一个细胞的第二根瘤菌目细菌。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述根瘤菌目细菌和所述第二根瘤菌目细菌是相同物种。
57.如权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述第二根瘤菌目细菌是农杆菌属，并且其中所述共培培养基中的农杆菌属的OD660在约0.5至约2.0的范围内。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述共培培养基中的农杆菌属的OD660在约0.75至约1.25的范围内或为约1.0。
59.如权利要求1-58中任一项所述的方法，其中将所述基因修饰的单子叶植物或植物部分与所述再生培养基在约20℃至约32℃、约25℃至约29℃、或约27℃至约28℃范围内的温度下进行接触而再生。
60.如权利要求1-59中任一项所述的方法，其中将所述基因修饰的单子叶植物或植物部分与所述再生培养基接触而再生约20天至约50天或约28天至约42天范围内的时间段。
61.如权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述再生培养基具有低盐浓度。
62.如权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述再生培养基不含生长素或细胞分裂素。
63.如权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述再生培养基不含表面活性剂。
64.如权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸分子包含可选择标记基因，其中所述再生培养基包含选择剂，并且其中所述可选择标记基因在植物中提供对所述选择剂的抗性。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述选择剂选自由以下组成的组：卡那霉素、巴龙霉素、潮霉素B、大观霉素、链霉素、庆大霉素、草甘膦、草铵膦、膦丝菌素、溴苯腈、双丙氨膦、麦草畏、咪唑啉酮和磺酰脲。
66.如权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述再生培养基是固体培养基。
67.如权利要求1-66中任一项所述的方法，其中所述基因修饰的单子叶植物或植物部分是非嵌合的。
68.如权利要求1-67中任一项所述的方法，其中将所述胚外植体和所述基因修饰的单子叶植物或植物部分在不产生愈伤组织培养物的情况下培养和再生。
69.如权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸分子包含目标基因或编码指导RNA或定点核酸酶的一个或多个表达盒。
70.如权利要求1-69中任一项所述的方法，其还包括：
对所述接种培养基中的所述胚外植体施加力处理。
71.如权利要求1-70中任一项所述的方法，其还包括：
由基因修饰的植物制备基因修饰的植物部分。
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