CN118234564A - 高级多路复用反应容器、试剂点样装置和相关方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于促进高级多路复用的反应容器、盒、装置和方法。这样的反应容器可以包括平面框架、流体接口、孔室和预扩增室，所述平面框架限定第一平面基板和第二平面基板之间的流体路径，所述流体接口位于平面框架的一端，具有一对流体端口。本文还描述了用于在高级多路复用反应容器的孔中点样试剂的装置和改进的试剂溶液。

Description

高级多路复用反应容器、试剂点样装置和相关方法

相关申请的引用

本申请要求于2021年7月9日提交的美国临时申请号63/220,277的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

同时进行多种测定以提供变化的和大量的数据集可能是期望的。这样的方法通常被称为“多路复用测定”。因此，需要能够进行高级多路复用测定的反应容器、装置和方法。

发明内容

本发明的一些实施方案涉及反应容器，其具有平面框架，所述平面框架限定第一平面基板和第二平面基板之间的流体路径，流体接口位于平面框架的一端并且包括与流体路径流体连通的第一流体端口和第二流体端口。流体路径在流体接口的第一流体端口和第二流体端口之间延伸。流体路径进一步包括配置有多个孔的孔室和预扩增室。孔室的多个孔可以是各种类型的孔中的任一种，例如各种尺寸的孔(例如，纳米孔、微孔或任何期望的尺寸)和各种形状的孔(例如，圆形、方形、矩形、多边形等)。

在一些实施方案中，预扩增室沿着第二流体端口和孔室之间的流体路径布置，并且孔室沿着预扩增室和第一流体端口之间的流体路径布置。在其它实施方案中，预扩增室沿着第一流体端口和孔室之间的流体路径布置，并且孔室沿着预扩增室和第二流体端口之间的流体路径布置。

在一些实施方案中，预扩增室出口通过流体路径的蜿蜒通道与孔室隔开。在一些实施方案中，流体路径流体地连接到蜿蜒通道和孔室之间的集油室。在一些实施方案中，集油室经由集油阀结构偶联到流体路径。在一些实施方案中，流体路径包括另一个阀结构，其将蜿蜒路径流体地连接到孔室出口通道。在这里的任何实施方案中，阀可以是被动阀，如与流体路径一体形成的收缩部。在一些实施方案中，阀可以是主动阀结构，并且包括另外的可移动部件或膜。

在一些实施方案中，孔室包括孔室入口，当第一平面基板和第二平面基板垂直定向时，孔室入口位于孔室的最下部。在一些实施方案中，第一流体端口流体地偶联到基本上水平的入口通道，该入口通道连接到向上倾斜进入孔室的孔室入口。

在一些实施方案中，第二流体端口通过基本上垂直的预扩增通道(pre-amppassage)偶联到预扩增通道，所述预扩增通道偶联到基本上水平的预扩增入口，所述预扩增入口流体地连接到预扩增室的底部。

在一些实施方案中，孔基板可具有约100个至约1500个纳米孔中的多个。在一些实施方案中，孔基板包括多个直径为约50μm至约500μm的孔。在一些实施方案中，孔基板可具有多个纳米孔，每个纳米孔具有约100μm的深度。

在一些实施方案中，孔基板可以具有多个纳米孔，其中多个纳米孔中的每个孔的深度可以在约25μm至约1000μm的范围内。

在一些实施方案中，孔基板可以具有多个纳米孔，其中多个纳米孔中的每个孔具有约25um至约500um范围内的宽度。

在一些实施方案中，多个孔中的每个孔可具有约0.1nL至约500nL范围内的体积。在一些实施方案中，多个孔中的每个孔具有约0.5nL至约1.5nL范围内的体积。在一些实施方案中，多个孔中的每个孔具有在约1.2nL范围内的体积。

在一些实施方案中，流体路径包括预扩增室和孔室之间的蜿蜒通道。蜿蜒通道可以包括一系列区段，每个区段在区段之间弯曲至少180度。在一些实施方案中，蜿蜒通道包括三个或更多个这样的区段。

在一些实施方案中，流体路径连接到预扩增室和孔室之间的集油室，以便捕获从预扩增室流向孔室的任何油。

在一些实施方案中，平面框架可以经由流体接口流体地连接到样品容器。在一些实施方案中，平面框架可以是从基座部分延伸的支架。在一些实施方案中，基座部分包括用于机械地和流体地偶联到样品容器(如样品盒)的凸缘。

在一些实施方案中，第一平面基板和第二平面基板可具有流体地密封支架的第一膜和第二膜。在一些实施方案中，第一平面基板是密封在平面框架上的膜，而第二基板与平面框架一体地形成。

在一些实施方案中，多个孔可含有至少一种用于扩增和/或检测特定目标的核酸引物和/或探针。在一些实施方案中，多个孔可以含有用于检测特定蛋白目标的分子，例如抗体。

本发明的一些实施方案涉及用于向反应容器的流体界面提供样品流体的方法。反应容器可以具有平面框架，所述平面框架限定第一平面基板和第二平面基板之间的流体路径。预扩增室可以被填充，其中流体样品在填充孔室之前在预扩增室中经历扩增步骤。流体路径的孔室可以填充有样品流体，使得孔室中的多个孔填充有样品流体，所述样品流体包含待分析的样品材料，并且进一步可以包括一种或多种用于进行多路复用测定的化学品。然后可以将样品流体从孔室排出，使得多个孔保持至少部分地填充有样品流体。在一些实施方案中，加热和/或冷却循环被施加到第一平面基板和第二平面基板中的一个或两个。

本发明的一些实施方案涉及在反应容器中进行多路复用扩增反应。在一些实施方案中，多路复用反应涉及巢式PCR。在一些实施方案中，使用荧光指示剂监测多路复用反应以指示扩增子的存在。在一些实施方案中，使用熔解曲线分析检测扩增子的存在。在一些实施方案中，多路复用反应检测至少一种单核苷酸多态性(SNP)的存在或不存在。在一些实施方案中，用于多路复用反应的样品材料是体液或源自体液。在一些实施方案中，样品材料是组织样品，或衍生自组织样品。在一些实施方案中，多路复用反应检测蛋白目标的存在或不存在。在一些实施方案中，多路复用反应检测核酸的存在或不存在。核酸可以是DNA、RNA或微RNA。

在另一方面，本发明涉及用于在反应容器的孔中点样试剂的装置和方法。装置可以包括毛细管束，其被配置成用于点样阵列的各个孔。在一方面，毛细管可以是玻璃。毛细管可以被拉长，使得管的远端部分具有减小的直径，其小于孔的宽度。管可以固定在对应于反应容器的孔的布置的束的空间排列内。点样的方法包括通过毛细作用填充毛细管和通过表面接触张力将试剂溶液的点沉积在孔中。装置可以包括相对大量的毛细管，例如约25个至约100个管，以便通过将装置定位在阵列上的不同位置来促进孔的更有效点样。该方法可进一步用于将不同试剂的模式点样在阵列上的不同位置，从而允许检测多个目标分析物。

毛细管组(“帽组(cap-pack)”)的毛细管可以通过拉动加热玻璃毛细管以产生微量移液管，并且然后在毛细管组内组装成束来形成。可以简单地通过将毛细管放置成与溶液接触来填充毛细管组，并且然后可以通过类似地将毛细管接触到孔中并允许毛细管作用/表面张力使孔点样来分配毛细管组。在一些实施方案中，毛细管内的压力可以从近端控制，以便于将溶液装载到毛细管中和将溶液分配到孔中。在一些实施方案中，点样系统利用多个毛细管组，从而可以同时点样多个反应容器。

在另一方面，本发明涉及改进的试剂基质溶液，其被专门设计用于用本文所述的反应容器填充和进行PCR的方法。在一些实施方案中，试剂溶液包括基质材料，其具有延迟水溶解性，以便在填充孔期间保留试剂，并且便于在隔离孔之后释放试剂。这样的基质可以包括聚合物或纤维素材料。在一些实施方案中，基质材料在加热时交联，使得加热反应改善了基质的固体形式的完整性，并延长了填充孔期间的延迟的溶解性。这样的基质材料可以包括但不限于各种浓度的HEC(羟乙基纤维素)、NIPAM(正异丙基丙烯酰胺)和羟丙基纤维素(HPC)及其混合物。

附图说明

图1A-图1C示出了根据本发明的一些实施方案的反应容器的各种视图。

图1D和图1E示出了反应容器的另选实施方案的侧视图。

图2A-图2F示出了根据一些实施方案的反应容器的部分的横截面，以示出孔基板120的各种实施方案。

图3A示出了根据一些实施方案的用于向孔基板120提供引物材料的方法。

图3B示出了根据一些实施方案的在反应容器的孔中的点样试剂中使用的拉制玻璃毛细管。

图3C示出了根据一些实施方案的用拉制玻璃毛细管对试剂的手动点样。

图3D示出了根据一些实施方案的具有用于在反应容器的孔中点样试剂的拉制毛细管束的毛细管组装置。

图3E示出了根据一些实施方案的x-y-z机器人定位装置，其用于定位一个或多个毛细管组装置以同时点样多个反应容器。

图3F示出了根据一些实施方案的在具有毛细填充装置的反应容器的孔中点样试剂的方法。

图4A-图4E示出了根据一些实施方案的用样品流体填充孔基板的各种方法。

图5A-图5G示出了根据一些实施方案的各种传感器组件相对于反应容器的位置。

图6示出了根据一些实施方案的用于向反应容器提供样品流体的流体控制和处理系统。

图7示出了根据一些实施方案的具有多个模块的PCR测试系统，每个模块容纳具有反应容器的样品盒。

图8示出了根据一些实施方案的从系统罩壳(enclosure)取出的PCR测试模块。

图9A示出了根据一些实施方案的模块的仪器核心组件的分解视图。

图9B示出了根据一些实施方案的具有与仪器核心组件的部件连接的反应容器接口的样品盒。

图10A-图10B示出了根据一些实施方案的演示用反应容器的孔阵列进行测试的实验照片。

图11A-图11B描绘了根据一些实施方案的用于检测癌症小组(cancer panel)的多个目标的分析测试。

图12-图13示出了根据一些实施方案的散装填充阵列和点样阵列之间的多个目标的分析测试的比较。

图14示出了根据一些实施方案的用于分析测试癌症小组的多个目标的试剂点样模式的实例。

图15示出了根据一些实施方案的在流感小组的多个目标的分析测试中来自点样阵列的结果的实例。

图16示出了根据一些实施方案的来自未点样(散装)孔和点样孔的抑制测试结果的比较。

图17-图22示出根据一些实施方案的在各种条件下对试剂基质材料进行实验的性能结果。

具体实施方式

在一方面，本发明涉及促进高级多路复用测定的反应容器、装置、系统和相关的使用和制造方法。在利用样品制备盒的常规装置中，如来自Cepheid的系统，使用平面反应容器来进行PCR反应并检测目标分析物。然而，与使用具有高级多路复用的微阵列的分析系统相比，当前的反应容器使用单个反应室，这限制了可分析的目标分析物的数量。虽然已经开发了反应容器的一些多孔设计，如在美国专利9,914,968中所述的，但是在执行高级多路复用方面，特别是在PCR之前扩增样品以及在提供一致的、均匀的孔填充方面仍然存在许多挑战。因此，需要进一步改进关于填充和分析测试这些方面的反应容器，并因此改进相关的样品盒、处理模块和相关的填充和试剂点样技术以促进高级多路复用。

本发明的发展提供了完整的系统，通过所述系统可以进行高度空间多路复用的PCR CE/IVD分子诊断测定。系统包括至少一个样品测试盒，附带反应容器、仪器硬件和相关软件。用这样的系统开发的测定的应用可以包括高度多路复用感染疾病小组和肿瘤学的多基因测定。

改进的反应容器和相关方法是特别有利的，因为它们与现有的样品盒装置兼容，并且因此可以扩展现有系统中的测试能力。这允许在同一现有系统(对系统硬件/软件进行一定修改)中执行高级多路复用，从而可以通过同一仪器执行全部范围的可用测定。由于使用同一盒装置，样品制备过程可以保持与现有系统相同。较高级多路复用的优点包括用于检测目标分析物的较高置信水平，并且还允许通过同一反应容器检测更多的目标分析物，这打开了执行测试小组的门，例如流感小组，或更多的肿瘤学集中小组(例如，乳腺癌特征小组)。此外，高级多路复用反应容器利用较高密度的孔阵列，其受益于也可适用于各种微阵列设计的改进的试剂点样装置和技术。

I.反应容器构建

图1A至图1C描绘了示例性反应容器100。反应容器100包括平面框架102，其在一些实施方案中是由通常与PCR相容的聚合物(例如，聚丙烯/丙烯酸基材)或金属材料形成的桁架状结构。平面框架102可形成为开口桁架或支架，在开口侧由第一平面基板104和第二平面基板106界定。

如图1B至图1C所示，第二平面基板106与平面框架102一体地形成，并且第一平面基板104可以由粘附或以其它方式结合到平面框架102的相对薄的聚合物膜形成。在一些实施方案中，第一平面基板和第二平面基板可以是结合到平面框架的相对侧的聚合物膜。在一些实施方案中，第一平面基板104和第二平面基板106中的一个的全部或部分可以与平面框架102一体地形成(例如，通过将基板中的一个与平面框架102一起3-D打印、模制、共同模制，或加工)。在一些实施方案中，第一平面基板104和第二平面基板106以及整体框架由此处描绘的透明材料构成。在一些实施方案中，反应容器的至少一部分是透明的。第一平面基板104和第二平面基板106中的每一个都包括面向内部和外部的表面。这些面向内部的表面与平面框架102的内腔形成流体通道。

平面框架102的一部分形成流体接口108。流体接口108是结构构件，平面框架102的大部分将起作为悬臂。流体接口108可以与平面框架102一体地形成。流体接口108还例如通过与凸缘109接合用作与盒装置的机械连接。流体接口108包括第一流体端口110和第二流体端口112，它们提供到盒装置或样品容器的流体接口，用于使流体通过。在平面框架102中于第一平面基板104和第二平面基板106之间形成的流体路径111在第一流体端口和第二流体端口之间延伸。应当理解，术语“流体路径”是指流体端口之间的整个流体路径，并且流体路径可以包括其中限定的一个或多个特征(例如，阀、室、通道)。应当理解，术语“第一流体端口”和“第二流体端口”的使用不限制相应端口的功能，并且流体可以从两个端口或任一端口引入和排出。

流体路径111包括用于处理或测试引入其中的流体样品的一个或多个室。在一些实施方案中，流体路径111可以包括一个或多个阀，所述阀可以是收缩部分，使得空气仍然可以相对自由地移动，同时流体的通道可以通过阀被更大地受限制，使得可以通过外部系统经由流体入口端口110和流体出口端口112施加外部压力增加或减小，以使流体在流体路径111内移动，所述流体路径111从流体入口(110)延伸到流体出口(112)。在其它实施方案中，流体路径111是无阀的。

在一方面，流体路径111包括孔室119。孔室119容纳具有多个孔(本文中也称为微孔、纳米孔或纳米孔阵列)的孔基板120。孔基板120与第一平面基板104和平面框架102一体地形成。在一些实施方案中，可以单独形成孔基板并将其放置在孔室内。在其它实施方案中，孔基板120可由金属(例如金、铂或镍合金)、陶瓷或其它PCR兼容聚合物材料或复合材料构成。在一些实施方案中，孔基板120可以包括任何数量的孔，例如，50个至1500个孔，或更多。如此处所示，孔基板被定义为在32×32阵列中具有1024个单独孔的孔阵列。

在一些实施方案中，孔与第二平面基板106和平面框架102一体地形成(例如，通过模制)。在其它实施方案中，可以通过在模制的第二基板内形成凹陷来形成孔。在其它实施方案中，孔可以形成在孔基板120中作为盲孔或通孔。可以在孔基板120内形成孔，例如，通过激光钻孔(例如，激基复合物或固态激光)、超声压印、热压印光刻、电铸镍模、注射成型和注射压缩成型。

在一些实施方案中，单个的孔体积可以在约0.1nL至约1500nL，约0.5nL至约200nL，约0.5nL至约50nL，约0.8nL，约1.6nL，或更优选约1.2nL的范围内。孔尺寸可以具有任何形状，例如圆形、椭圆形、方形、矩形、卵形、六边形、八边形和本领域技术人员熟知的其它形状。在该实施方案中，孔是正方形的，其宽度大于深度。在此，孔大约为175μm×175μm×85μm深。在其它实施方案中，孔直径和深度可以相等，或者深度可以大于宽度。孔尺寸可以从孔基板120的总体积容量导出。在一些实施方案中，孔深度可以在约25μm至约1000μm的范围内。在一些实施方案中，孔直径可以在约25μm至约500μm的范围内。

孔基板120的孔可以被图案化以具有对齐的行和列的简单几何图案，或对角或六边形排列的图案。在一些实施方案中，孔基板120的孔可以被图案化以具有复杂的几何图案，例如混沌图案或等几何设计图案，如Schillinger等人,Computer Methods in AppliedMechanics and Engineering,2012年1月22日所述的。孔可以在几何上彼此分开和/或具有大的深度与宽度比的特征，以有助于防止在填充过程期间试剂的交叉污染。

在另一方面，流体路径可以包括预扩增室116，其尺寸适于容纳流体样品。在该实施方案中，预扩增室(也称为“预PCR室”)的体积为约30uL。该体积可以容纳流体样品以及在流体样品之前引入的油帽(例如轻质油、矿物油)，以在预扩增期间隔离流体样品。预扩增室通过预扩增通道113和预扩增入口通道114流体地偶联到第二流体端口112，从而通过第二流体端口112引入流体样品来填充预扩增室。在预扩增室116之外的是蜿蜒通道117，其包括以蜿蜒方式沿不同方向缠绕的多个区段。在该实施方案中，蜿蜒通道包括一系列在区段之间具有180度或更大的弯曲的区段。蜿蜒流动路径减轻蒸汽传输并减轻轻质油沿流体路径的芯吸作用。最小油体积由流体路径的横截面积决定。当扩增的流体样品填充孔室时，使用预扩增(预PCR)以确保在每个孔中沉积≥1条目标DNA链。当目标浓度小于约10个拷贝/孔时，统计学上有显著数量的孔含有零个目标拷贝。为了稳健性，推荐每孔25个至50个拷贝。在一些实施方案中，预PCR体积必须考虑以下：标准洗脱体积(40μL至60μL)和洗脱效率，磁珠目标体积(80μL)，扩增子污染限值(≤25个循环)，产物从1:5稀释至1:20以去除预扩增酶和引物，基于上述因素，50μL预PCR是理想的。

如图1B和图2A所示，第一平面基板104可以是密封在第二平面基板106上的薄膜，从而在第二平面基板和第一平面基板之间形成间隙(以便允许流体通过)，从而形成流体通道以及孔室和预扩增室。预扩增室116包括位于预扩增室116最底部的预扩增室入口和位于预扩增室116最上部的出口(在所示的垂直方向)。在预扩增室出口之外是蜿蜒通道，其通向向下倾斜的中间通道118，所述中间通道118流体地偶联到在孔室顶部的孔室出口。中间通道118包括流体路径阀130，并且经由集油阀131与集油器132流体连通。在该实施方案中，阀被构造成允许空气自由流过的结构，然而，应当理解，可以使用任何合适的阀构造。预扩增室的这种布置允许扩增足够体积的流体样品，以便在流体样品填充孔室的孔之前获得足够的DNA拷贝，以确保每个孔接收拷贝。通过沿着流体接口的两个流体开口之间的同一流体路径纳入预扩增室和孔室，流体样品可以被输送到预扩增室中并被回收到样品盒中，然后随后被输送到孔室中并可以回收过量的流体样品。所有这种流体输送可以通过在流体接口的一个或两个流体端口处改变压力的施加来影响。在预扩增期间，流体样品可以被热循环，在此期间流体样品内的DNA拷贝倍增。蜿蜒通道发挥抑制过量的流体样品和/或相关的水分从流体样品流出预扩增室进入孔室的作用。在该实施方案中，在引入流体样品之前可以另外注入轻质油帽，使得油帽在扩增过程期间漂浮在流体样品上。集油器发挥容纳可能流过蜿蜒通道并进入中间通道的任何过量的油的作用，以便防止孔室内任何孔的污染。

关于孔阵列的孔的数量和尺寸，假定10个拷贝的输入DNA、1:10稀释的预PCR产物、80μL的磁珠尺寸、100％的PCR效率和>25个拷贝的最终PCR目标/孔，能确定：0.5nL孔体积需要22个预PCR循环以实现>25个拷贝的PCR目标；1nL孔需要21个循环；2nL孔需要20个循环；并且5nL孔需要19个循环。在一些实施方案中，10nL孔非常适于减少PCR循环，然而，预PCR体积+(10nL×1000)孔不适于反应容器的缩减区域内。约1nL(特别是1.2nL)的孔仅需要多3个预PCR循环，因此1.2nL体积的32×32方形阵列(1024个孔)是有利的，因为孔阵列可以适于在反应容器的缩减区域的范围内。

图1D和图1E示出了反应容器的另选设计。除了没有蜿蜒通道之外，图1D中的设计基本上类似于图1A中的设计。除了没有集油器和集油阀之外，图1E中的设计基本上类似于图1A中的设计。应当理解，可以实现各种其它的反应容器设计和修改。

图2A至图2F示出了反应容器部分的横截面，以示出孔基板120的各种实施方案。

图2A示出了其中孔基板120的孔被构造成制成于第二平面基板106中的凹陷的实施方案。在该实施方案中，第二平面基板106与平面框架102一体地形成，使得它们基本上是一块材料。通常，室和通道(channels/passages)是模具内的特征部，使得注模形成整个框架，并且第一基板一体形成。在一些实施方案中，孔制成模具内的特征部。在一些实施方案中，通过孔室内制成的凹陷来形成孔。随后通过试剂点样技术将引物/探针材料134放入孔室的每个孔中。引物材料134包括引物、探针和/或基质材料。应当理解，反应容器的制造不限于这种制造方法，例如，在图2B至图2C中的另选实施方案中描绘了各种其它的孔形成方法。

图2B示出了其中孔基板120的孔通过制成于基板(例如聚合物膜)中的通孔来构造的实施方案，所述基板结合到平面框架102上。例如，可以钻出单独的基板以形成通孔的孔基板，并且随后粘附或焊接到平面框架102上。在该实施方案中，第二平面基板106与平面框架102一体地形成，使得它们基本上是一块材料。另选地，可在第二平面基板106内形成盲孔，其可结合到平面框架102上。

图2C示出了其中孔基板120的孔通过在平面框架102的一部分内形成的通孔来构造的实施方案。在该实施方案中，第二平面基板106与平面框架102成一体，并且孔基板120是粘附或焊接到平面框架102内的袋(pocket)的单独部件。

图2D示出了其中孔基板120的孔通过如图2C所示的形成在平面框架102的一部分内的通孔来构造的实施方案。然而，在该实施方案中，可透气膜136位于平面框架102和第二平面基板106之间。膜136使气体能够通过膜从孔中排出，而不允许流体通过。可透气膜可以通过可透气粘合剂粘附到孔基板。

图2E示出了其中孔基板120的孔通过形成在平面框架102的一部分内的盲孔来构造的实施方案。在该实施方案中，第二平面基板106与平面框架102成一体，并且孔基板120是粘附或焊接到平面框架102内的袋的单独部件。

孔基板120的全部或部分可以包括传导性金属部分(例如金)以使得能够从金属向孔进行热传递。例如，抵靠第二平面基板106放置的孔基板120的部分可以是金属板或涂层。另选地，孔的内表面可涂覆有金属以实现热传递。

图2F示出了与图2D的实施方案类似地构造的实施方案。然而，这里孔基板定位于第一基板和第二基板之间的中点。可透气膜136可以通过可透气粘合剂粘附到孔基板。如图2D所示的实施方案，在液体填充期间，空气可以通过可透气膜排出到孔的背侧。在PCR缓冲液填充到单独的孔并使孔中的干燥引物组再水合之后，隔离油或导热液体可填充孔的两侧以防止串扰。

图3A示出了为孔基板120提供试剂溶液(如引物材料)的方法。如图所示，商购可得的打印针(printing pin)可用于用液体引物填充孔，液体引物可在孔中干燥，或者液体填充的孔可在填充后封闭。在一些实施方案中，在孔基板120提供有液体形式的引物之后，可将引物材料干燥，使得仅引物残余物保持粘附到每个孔，用于随后的液化。这样的针(和相关系统)的实例包括946MP(x)系列针，来自ArrayItCorporation，位于524East WeddellDrive,Sunnyvale,CA 94089,美国。Hasan等人的美国公布号2009/0054266和Hess等人的美国专利号6,716,629公开的方法也可用于提供引物材料。在应用过程期间，打印针可被配置成与孔基板120接触。另选地，可以使用利用打印针的非接触方法，例如基于液滴的方法，例如喷墨打印，或本领域技术人员已知的其它合适的非接触方法。应当理解，这仅仅是孔内点样引物/试剂的一个实例，并且可以使用或开发各种其它技术，这些技术可以更好地适用于具有大量孔的阵列，特别是具有500个或更多个孔的阵列。然而，随着孔变得越来越小，常规的点样方法不能再简单地缩放以适应更小的孔和更密集的阵列，例如本文所述的反应容器中的那些。因此，必须设计新的解决方案以便于将试剂点样到这样的阵列的孔中。

在一种方法中，可以通过拉伸玻璃管直到玻璃管的远端部分的直径小于孔的宽度尺寸来形成较小的点样管。例如，如图3B所示，可以加热和拉制外径为1.5mm的玻璃毛细管，直到远端部分具有0.10mm的经缩减的外径。这些直径缩减的毛细管足够小，以允许通过单个毛细管对各个孔进行点样，如图3C中的手动点样所示。

然而，即使上述方法是自动化的，用单根拉制的玻璃管对超过1,000个孔进行点样仍然是耗时的努力，因此，需要另外的开发以促进更有效的点样。一种这样的开发包括将大量毛细管捆绑在一起，从而可以同时点样多个孔。上述拉制玻璃管可以以规则的空间排列和间距固定，其对应于孔室的至少一部分内的孔的排列和间距。在一些实施方案中，相邻玻璃管之间的间距对应于相邻的孔。在另一种实施方案中，相邻玻璃管之间的间距对应于不相邻的孔，从而可以利用整个束增量移动小于管之间间距的距离来填充任何未填充的孔。在一些实施方案中，束中的玻璃管通过将端部固定在期望排列内的框架固定。

这样的毛细管束的一个实例在图3D中示出，图3D描绘了毛细管组(“帽组”)装置300。帽组装置包括玻璃毛细管束301，其以规则的空间排列保持紧密接近，以便在与孔接触时同时点样多个相邻的孔。每个管包括从装置延伸的直径缩减的远端部分302，每个远端部分具有小于相应孔的宽度的直径。在一些实施方案中，束包括五个或更多个管，10个或更多个管，20个或更多个管，50个或更多个管，或100个或更多个管。管以空间排列固定以便填充一个或多行或多组孔，例如，管可以以线性排列布置，以便部分地或全部地填充一行或多行，或者以直线排列(例如方形或矩形阵列)布置以便填充相应塑形的孔的区块。毛细管被封装在保护外壳304内，并且帽组还可以包括基座303，以便于手动地或优选地自动地操纵和定位装置，从而允许高通量自动化。以这种方式，微阵列的孔可以通过在阵列的不同部分顺序地放置相同的帽组而被填充，直到所有的孔被填充。在一些实施方案中，装置可以是点样系统的一部分，所述点样系统包括由自动化定位x-y-z机器人在阵列中支撑的多个帽组，例如如图3E所示的，以允许对布置在相应阵列中的托盘中的相同反应容器进行点样，从而允许多个反应容器的高通量试剂点样。系统还可以包括加热器，用于干燥或烘烤试剂容器，以便于将液体溶液干燥成固体形式。另选地，可以将点样试剂取出并置于控制湿度的环境中，并允许在升高的温度(通常地，70℃至100℃的温度)干燥一段设定的时间(从几小时至几天)。通过参考图17至图22中的实验结果，可以进一步理解与干燥点样试剂的各种方法相关的性能。

在另一方面，可以通过将玻璃管的远端插入到装载孔或储存器中并依靠毛细作用将溶液回收到管中，同时用一种或多种试剂溶液(例如，引物/探针)填充玻璃管。另选地，装置可以依靠大气压力来在浸没时将流体推入毛细管，并且毛细管的近端可以被封住以将溶液保留在其中。在一些实施方案中，填充可包括在管的近端施加负压以将溶液抽入管中。在其它实施方案中，可以通过从玻璃管的近端注射一种或多种引物/试剂来填充玻璃管。

一旦装载有一种或多种试剂的试剂溶液，玻璃管就定位在阵列上方的期望位置(手动或通过定位机器人)，以接触相应组的孔的底部。在一些实施方案中，管的远端对孔的底部的接触压力足以从管中抽取至少小滴的引物或试剂，以将引物或试剂沉积在孔的底部。在一些实施方案中，可以在玻璃管的近端处施加轻微的正压，以便于在与孔的底部接触时从远端释放引物或试剂，并且便于远端尖端用布置在管内更近端处的引物或试剂重新填充。以这种方式，相同的管束可以重新定位在另一组孔上，用于以相同的装载管束进行点样。在一些实施方案中，通过x-y-z定位机器人工具在各个孔组之间定位管束进行点样。

图3F示出了用于具有上述帽组的高体积点样自动化的工作流程。将期望的试剂递送到孔板中(例如通过寡核苷酸合成系统)，并且将模板特异性试剂(TSR)寡核苷酸与合适的基质材料(例如具有延迟水溶性的聚合物、某些纤维素种类、HEC-(羟乙基纤维素)；和/或NIPAM-(正异丙基丙烯酰胺))和/或羟丙基纤维素(HPC)在液体混合和处理系统(例如基于孔板的)中混合，并且然后用试剂溶液填充帽组毛细管。

在另一种方法中，自动化点样系统，例如由BioDot制造的那些，可以用来对孔进行点样。在一些实施方案中，这些点样系统使用非接触式压电分配器，并且可以分配100μL至1000μL,CV<10％。如图3F所示，这些系统可以一次将多个反应容器点样，嵌套在托盘内。在该实例中，30个反应容器可以由自动化机器人点样器点样。这些点样器利用液滴优化照相机和视觉系统来确保精确的点样。这样的系统与常规的孔板(例如由Dr.Oligo制造的96孔板)是相容的。然而，这些点样系统仍然通常被认为是小体积的点样，并且不能仅仅放大以适应本文所述的反应容器的高密度孔。因此，这样的系统的工作流程必须被修改以提供高体积点样自动化。

II.样品装载到反应容器

反应容器内的流体样品的示例性填充的概述如下：1)用TSR试剂预点样孔；2)预扩增室用轻质油(例如硅油)填充，其可以漂浮在样品流体上方以捕集水分，随后是预扩增流体样品，3)取出预扩增样品并回收到盒中并且拾取最终的扩增试剂珠(例如EZR2珠)，4)孔室和孔用混合了试剂珠的扩增流体样品填充，以及5)孔室用油填充，以移除过量的流体样品，并且覆盖孔。在一些实施方案中，孔室填充有较重的油(例如GPL)以从孔中刮去任何过量的流体样品，并且随后填充有较轻的油(例如矿物油)以用于覆盖孔。通过参考下面的实例，可以进一步理解关于填充孔的另外细节。

图4A和图4B示出了用样品流体填充孔基板120的方法。在图4A中，样品流体在孔基板120和第一平面基板104之间前进(例如，通过压力)。当流体通过孔基板120时，每个孔都变得填充有流体，流体主要通过表面张力保留在孔内。如上所述，孔基板120的部分，例如限定孔的壁，可以用亲水物质涂覆或处理以变得相对更亲水，并因此当样品流体流过时促进孔的完全和均匀填充。在一些实施方案中，孔基板120的其它表面，例如围绕孔表面的顶表面，可以用疏水物质涂覆或处理以变得相对更疏水，使得流体样品仅保留在孔中而不是保留在相邻表面上，流体样品保留在相邻表面上可能导致不一致的测试结果。在一些实施方案中，第一平面基板120的内表面可以被涂覆或处理以获得疏水效果。在图4B中，可以看出，在样品流体被再处理之后，只有孔被填充。在一些实施方案中，流体样品可以如图4B’所示前进，接着是空气袋，从而消除如图4B所示的示例性实施方案中所图示的回收样品的需要。如Jackman等人,Anal Chem.,1998,70,2280-2287和Hatch等人,MULTILAYER HIGH-DENSITY3DNANOWELL ARRAYS FOR DIGITAL BIOLOGY,关于化学与生命科学小型化系统的第15届国际会议(15th Int’l.Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and LifeSciences),2011年10月2日-6日,269-271所公开的，也可以使用填充方法，例如“间断润湿”。通常，孔基板120应该尽可能快地去湿，以避免孔内不同引物的交叉污染。

图4C和图4D示出了用样品流体填充孔基板120的另一种方法。在图4C中，根据图4A和图4B中所示的技术的组合来填充孔基板120。然而，样品流体后面是油袋。在一些实施方案中，该油是较重的油，例如GPL油或氟化油(例如，全氟聚醚(PFPE)，也称为全氟烷基醚(PFAE)或全氟聚烷基醚(PFPAE)，GPL 103)，其起到从孔基板的表面刮去过量的流体样品并且迫使过量的流体流出孔室的作用；尽管示出图4C中的油直接接触样品流体，但是如果孔室预先排出流体样品，则可以在油帽和样品流体之间提供空气间隙。

如图4D所示，在每个孔填充有样品流体后，并且过量的流体样品通过重质油从孔室中移除，可以将另一种较轻的油，例如矿物油，引入并填充孔室，以便用较轻的油“覆盖”每个孔，这可以在孔基板120进行热循环时帮助减少蒸发。如所示，可以在较重的油之后直接引入较轻的油。在一些实施方案中，可以在排出较重的油之后引入较轻的油。较重的油可以从任一端口排出。在一些实施方案中，集油器被配置成阻止油从预扩增室油性迁移或渗入孔室中。在一些实施方案中，在孔被填充之后，油可以从室的顶部引入并从室入口124回收，如图4D’所示。在图4D和图4D’所示的两种实施方案中，在孔已经用油覆盖之后，水溶液可以填充室118以提高热导性。在一些实施方案中，静止的水溶液可以在室118内被调压以使流体和任何气泡的移动停止。另选地，孔上方的孔室可保持为空的，具有空气间隙。

在其它实施方案中，在孔被填充之后，油可以在热循环期间保持在室内静止，如图4D"所示。在一些实施方案中，静止的油可以在室118内被调压以使流体和任何气泡的移动停止。

诸如矿物油的油可用于隔离每个孔并提供热导性。然而，本发明的实施方案不限于“油”。可以使用任何导热液体，例如氟化液体(例如，3M FC-40)。因此，本公开内容中提及的“油”应理解为包括这样的替代物。

在一些实施方案中，如图4C所示，在孔填充有样品流体之后，油可以跟随样品流体以移除过量的流体油，并且可以用相同的油或不同的油覆盖孔。详细描述该实施方案的实验如实施例3所述并如图4E所示进行。

图5A和图5B示出了用于检测孔基板120处的反应的示例性传感器组件定位。在该实施方案中，加热器224直接邻近或抵靠第二平面基板106定位，以便实现预扩增室内流体样品的热循环。光学检测器240直接邻近或抵靠透明的第一平面基板104定位，以便于对任何孔内发生的反应进行光学检测。可以通过光学激发手段，例如图5C所示的那些，通过框架的侧面进行光学激发。

图5C示出了可以与图5A和图5B的配置组合使用的示例性传感器组件配置。这里，光学激发装置230包括LED组件A和第二LED组件B，LED组件A沿着反应容器100的上前边缘定位，第二LED组件B沿着反应容器100的下前边缘定位的。通过利用以不同波长(例如，红色和绿色)发射的两个不同的LED组件，系统可以在同一反应容器内提供不同的目标分析物的激发和检测。应当理解，系统可以仅利用在单一波长范围内发射的单个激发手段，或者能够在不同波长范围内以快速相继的方式顺序地发射的单个激发手段。

图5D示出了示例性传感器组件配置。在一些实施方案中，该传感器组件配置可以与图5A至图5C所示的配置结合使用。传感器组件包括偶联到光纤面板(FOFP)的CCD/CMOS检测器。滤光片层叠在FOFP上方，并抵靠或邻近目标放置，所述目标在此处是孔基板120。另选地，如图5E所示，滤光片可以直接层叠(结合)在CCD上方，而FOFP放置在顶部。

图5F至图5G示出了另一示例性传感器组件配置。在一些实施方案中，该配置可以与图5A至图5D所示的一个或多个配置结合使用。在此，CCD/CMOS检测器偶联到滤光片置于其间的双透镜配置。在一些实施方案中，滤光片可以结合到CCD/CMOS检测器。在一些实施方案中，滤光片可以放置在目标和用于将图像聚焦到检测器上的单个透镜组件之间(参见图5F)。在一些实施方案中，滤光片可以放置在目标和单个透镜组件之间以及在透镜组件和检测器之间(参见图5G)。

III.使用方法

在一些实施方案中，首先将样品流体引入第二流体端口112且通过预扩增入口通道113并引入预扩增室116，预扩增室116填充有样品流体。在一些实施方案中，预扩增室内的流体样品可以通过邻近第二基板的外部加热器进行热循环，直到流体样品被充分扩增。在一些实施方案中，预扩增室116可包括一种或多种化学物质以引起期望的化学反应，并且从而进一步扩增其中的流体。在一些实施方案中，流体可保持在预扩增室116内，最多但不超过预扩增室的顶部的预扩增室出口，直到发生期望的反应。优选地，预扩增室的尺寸设置成当扩增时容纳全部流体样品。在一方面，在引入流体样品之前，将轻质油引入预扩增室中。这种轻质油在扩增期间保持在流体样品上方，这有助于将流体样品保持在预扩增室内并防止来自流体样品的水分沿着预扩增室下游的流体路径移动。轻质油可以储存在样品盒的室内。延伸超过预扩增室出口的蜿蜒通道防止来自扩增的流体样品的水分和/或过量流体(例如，油或流体样品)移动穿过流体路径并进入孔室中，在孔室中任何水分或流体将污染空孔。任何确实移动进入蜿蜒通道中的水分或流体都会蜿蜒地穿过蜿蜒通道。如果任何水分或流体确实完全移动通过流体通道，它会遇到流体路径阀，这将进一步限制流动，导致流体积聚并抑制流入孔室。如果过量的流体确实继续进一步超出流体通道阀，则流体移动穿过集油阀并积聚在集油室中。以这种方式，可以防止在预扩增期间任何过量的流体或水分流入孔室中。

一旦流体样品被扩增，扩增的流体样品通过同一预扩增通道113被排出，并通过逆转流体流动方向回到样品盒中。然后将扩增的流体样品从样品盒引入，并通过第一流体端口110引入回反应容器，并进入入口通道128，并且然后通过孔室入口124，并进入孔室119。然后可以例如根据图4A至图4D"所示的方法填充孔基板120的孔。一旦孔基板120的孔被填充，过量的扩增流体样品可以从孔室119排出，或是通过在上方的孔室出口并且通过中间通道和蜿蜒通道进入预扩增室，或是通过孔室入口和入口通道128回去并且回到样品盒。在一些实施方案中，然后可以将油(例如矿物油)引入到孔室中并覆盖在填充的孔上，以隔离孔并防止在热循环期间蒸发。通过将空气通过孔室入口引入孔室中，或者通过将过量的油通过孔室入口排出并回到样品盒中，过量的油可以沿着流体样品进一步前进。

通过经由流体接口施加压力来促进流体样品、油或空气通过流体端口中的任一个引入反应容器中。在一些实施方案中，对孔室119施加范围为5psi至20psi的压力。因此，PCR缓冲液以及任何导热液体(油)都处于压缩状态，以保持PCR液体和任何小气泡——其可能在干燥引物的再水合期间产生。这种压力施加可以导致任何产生的气泡的固定化，从而不会发生来自正移动的气泡和液体的光学干涉。在其它实施方案中，诸如蒸馏水的水合流体可在预扩增室116或辅助室132中的一个内被加热，使得孔室119具有100％的湿度或足够的湿度以防止在热循环期间过度蒸发。在填充完成后，可以通过与反应容器100热接触的外部装置加热孔基板120，以进行PCR的热循环。在一些实施方案中，可以采用非接触式加热方法，例如RFID、居里点、感应或微波加热。这些和其它非接触式加热方法是本领域普通技术人员熟知的，并且可以容易地应用于本文公开的反应容器。在热循环期间，可以通过图5A至图5G中描述的传感器排列监测反应容器的反应。

可使用反应容器100进行多种生物测定，通常用于指示测试样品中至少一种感兴趣的分析物的存在。这些测定包括但不限于基于预选的分子对(例如抗体-抗原结合对或具有足够互补性的两个多核苷酸序列)之间的特异性结合亲和力的结合测定、依赖于某些预定的基于核苷酸序列的标准的核酸扩增反应，和指示存在具有预定义活性的分子(例如酶)的化学反应。

在一些实施方案中，以预定排列沉积在反应容器中的分析剂或探针，例如“诱饵”蛋白或核酸，直接固定在固体基板的表面上，对基板表面的结构改变或修饰最小。换句话说，剂或探针基本上“点样”在表面上，并排列和限制在2维空间内。在一些实施方案中，可以制造基板以形成预定尺寸的多个孔或凹陷的排列，从而容纳剂或探针，所述剂或探针可以永久地固定在孔或凹陷内，或者在测定持续时间暂时地限制在孔或凹陷内。换句话说，分析探针将被限制在3维空间内。

适合用作反应容器的分析探针的材料包括选择的蛋白质(例如全长蛋白质，例如抗体，蛋白质片段或短肽)、核酸(例如DNA、RNA、微RNA)、碳水化合物、脂质、组织、细胞或几乎任何和所有化学性质的分子。换句话说，已知用于制备用于多路复用测定的微阵列的任何材料/分子都可用于本发明的反应容器中。

IV.感兴趣的分析物的检测

本发明的一个方面涉及监测光信号(使用图5A至图5G的传感器配置)，其指示测试样品中至少一种感兴趣的分析物，例如，目标蛋白(例如，特定抗原性的抗体)、目标细胞、目标基因、目标基因序列、目标mRNA转录或目标核酸的存在。这样的目标分析物可以是任何来源的：病毒、细菌、真菌、寄生虫(例如，来自原生动物)、动物或人类来源。例如，病毒蛋白、针对病毒抗原的抗体，或衍生自细菌或病毒基因组的DNA/RNA序列可以是测试样品中用于检测的感兴趣的分析物。示例性非限制性目标分析物可包括核酸序列，例如微RNA，哺乳动物基因，哺乳动物基因的遗传变体，例如癌基因、肿瘤抑制基因或与某些疾病和病症相关的任何其它基因中的各种遗传突变体、等位基因变体或表观遗传变体(在甲基化状态中表现出不同的谱)，可成为本发明的反应容器应用中的检测焦点。其基因和/或蛋白可以是感兴趣的目标的示例性病毒可以包括但不限于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、人类巨细胞病毒(CMV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、肠道病毒、水痘-带状疱疹病毒；黄病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、诺如病毒、正粘病毒、细小病毒、乳多空病毒、副粘病毒、瘟病毒、微小RNA病毒和流感。其基因和/或蛋白可以是检测目标的示例性细菌可以包括但不限于结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,TB)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、嗜肺军团菌(legionella pneumophilia)、单核细胞增多性李斯特菌(listeria monocytogenes)、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitides)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)和粪肠球菌(enterococcus faecalis)。潜在感兴趣的示例性人类基因可以包括但不限于p53、BRCA1和BRCA2、Her2/Neu和其它EGFR家族成员、BCR-ABL、PTEN、RAS、RAF、Src、RB、Myc、VEGF、拓扑异构酶和APOEε4等位基因。

检测和/或定量各种感兴趣的分析物的基本技术可以在例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(2001年第3版)；Kriegler,Gene Transfer andExpression:A Laboratory Manual(1990)；Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology(1994)；以及Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988)中找到。

为了检测任何特定身份的蛋白质的存在，人们可以使用许多种基于结合亲和力的测定，例如免疫测定。在一些实施方案中，可以通过用对多肽具有特异性结合亲和力的抗体(其以孔阵列形式固定到预定点或限制在反应容器的预定孔内)从测试样品捕获目标蛋白来进行夹心测定形式。然后可以用附着于可检测标记(如荧光产生分子)的二级抗体来指示蛋白质的存在。

为了检测感兴趣的核酸的存在，通常使用探针或含有基本上与目标核酸序列互补并能够基于沃森-克里克碱基配对与目标序列杂交的多核苷酸序列的分子。再次，探针可以在预定位置处固定或点样到固体基板的表面，或者在一些实施方案中，探针可以被限制在基板上预定图案内的预定位置处的孔中。根据被检测的目标多核苷酸的性质，例如，它是双链还是单链的，检测探针可以在序列上与目标序列基本相同，或者在序列上与目标序列的互补序列基本相同。换句话说，探针能够与目标核苷酸序列特异性结合。在一些情况下，探针可以含有一个与目标核苷酸结合的结合区段以及非结合区段，只要非结合区段的存在不干扰结合区段和目标核酸之间的特异性结合即可。通常，结合区段具有至少8个，通常至少10个、12个、15个、20个、25个、30个或甚至更多个与目标多核苷酸序列的任一链互补的连续核苷酸，以确保目标序列的特异性识别。在一些实施方案中，探针可包括发光部分以易于检测，例如荧光或发光分子，如荧光素、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、羟基香豆素、氨基香豆素、级联蓝、太平洋橙、荧光黄，别藻蓝蛋白、TruRed、FluorX，或镧系元素。

在一些实施方案中，使用不同的荧光指示剂来指示不同的多核苷酸序列的存在。在一些实施方案中，当使用共同的荧光指示剂时，基于熔点的检测方法可以有效地用于检测不同的目标多核苷酸序列的存在。

除了基于分析物与反应容器中提供的分析剂的结合亲和力直接进行感兴趣的分析物的检测的结合测定形式之外，用于检测和/或定量感兴趣的核酸的基于扩增的测定系统提供了广泛的应用。在该基于扩增的系统中，在完成序列特异性扩增反应后检测和/或定量一种或多种目的核酸。此外，为了通过基于扩增的方法检测目标核酸，可以在每个孔中包括多组引物，以允许以巢式PCR形式进行检测，例如，第一组引物可以限定目标序列的一部分并生成扩增子，所述扩增子允许通过后续的一组或多组引物进一步扩增。

如本文所用，术语阵列、微阵列和纳米阵列描述了在预先指定的位置处设置在固体基板表面中的多个孔。在一些实施方案中，反应容器含有至少约100个或约200个孔。在一些实施方案中，反应容器可包括约100个至约300个、约400个、约500个、约600个、约700个、约800个、约900个、约1000个、约1100个、约1200个、约1300个、约1400个、约1500个或更多个孔中的任何数目的孔。孔可以是任何形状并且它们的位置虽然是预先确定的，但可以以任何形式或图案排列在基板上。如本文所用，术语“反应容器”可与“多孔反应室”或“多孔反应管”互换使用。

在一些实施方案中，感兴趣的核酸是DNA分子。通过在反应容器形式的每个孔中提供至少一组引物、游离核苷酸和适当的DNA或RNA聚合酶，并且然后使反应容器经受适当的温度和持续时间以实现任何目标多核苷酸序列的合成和扩增，来进行序列特异性扩增。

每个引物通常是寡核苷酸(其可以是天然的或合成的)，当通过碱基配对与多核苷酸模板形成双链体时，能够充当核酸合成的起始点，并从其3’末端沿着模板延伸，从而形成延伸的双链体。引物的延伸通常用核酸聚合酶例如DNA或RNA聚合酶进行。在延伸过程中加入的核苷酸序列由模板多核苷酸的序列决定。在大多数实施方案中，引物由DNA聚合酶延伸。通常，引物的长度为约14个至约40个核苷酸，或约15个至约20个核苷酸。引物用于许多种核酸扩增反应，例如使用单一引物的线性扩增反应，或使用两种或多种引物的聚合酶链式反应(PCR)。选择用于特定应用的引物的长度和序列的指导是本领域普通技术人员熟知的，参见，例如，Dieffenbach编辑,PCR Primer:A Laboratory Manual,第2版(Cold SpringHarbor Press,New York,2003)。

在核酸扩增反应(如PCR)的背景下，目标多核苷酸序列的扩增产物被称为“扩增子”。扩增子是由引物延伸产生的多核苷酸群体，通常是双链多核苷酸的形式。扩增子可以通过多种扩增反应产生，这些反应的产物是一个或多个目标核酸的多轮扩增之后的复制。通常，产生扩增子的扩增反应在反应物的碱基配对中是模板驱动的：核苷酸和寡核苷酸引物两者在模板多核苷酸或目标多核苷酸序列中都具有互补性。这样的互补性是产生反应产物或扩增子所需要的。在一些情况下，模板驱动的反应是用核酸聚合酶进行的引物延伸或用核酸连接酶进行的寡核苷酸连接。这样的反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、线性聚合酶反应、连接酶链式反应(LCR)、链置换反应(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)，滚环扩增等，参见例如Mullis等人，美国专利号4,683,195；4,965,188；4,683,202和4,800,159(PCR)；Gelfand等人，美国专利号5,210,015(使用TaqMan探针的实时PCR)；Wittwer等人，美国专利号6,174,670；Landegren等人，美国专利号4,988,617(LCR)；Birkenmeyer等人，美国专利号5,427,930(间隙LCR)；Kacian等人，美国专利号5,399,491(NASBA)；Walker，美国专利号5,648,211和5,712,124(SDA)；Lizardi，美国专利号5,854,033；Aono等人,日本专利申请公布号JP 4-262799(滚环扩增)；等等。在一些实施方案中，一个或多个目标核酸的扩增子通过在本发明的反应容器中进行的一轮或多轮PCR，例如巢式PCR产生。

聚合酶链式反应，或PCR，是酶介导的反应，用于通过DNA的互补链的同时多轮引物延伸体外扩增特定DNA序列。换句话说，PCR是制作侧翼为引物结合位点的目标核酸的多个拷贝或复制的反应，这样的反应包括以下步骤中的一次或多次重复：(i)使目标核酸变性；(ii)将引物退火至引物结合位点；以及(iii)在核苷三磷酸存在的情况下，通过核酸聚合酶延伸引物。反应通常循环通过为变性、退火和延伸步骤中的每一项优化的不同温度。特定的温度、每个步骤的持续时间和步骤之间的变化速率取决于本领域普通技术人员熟知的许多因素，参见例如McPherson等人编辑,PCR:A Practical Approach and PCR2:A PracticalApproach(IRL Press,Oxford，分别于1991年和1995年)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，双链目标核酸可以在>90℃的温度变性，引物在50℃至75℃范围的温度退火，并且引物在72℃至78℃范围的温度延伸。

术语“PCR”包括反应的衍生形式，包括但不限于反转录(RT)-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR和其它类似变体。对于这些不同的PCR测定，典型的反应体积可以在纳升(例如约0.1nL至约500nL)至微升(例如约1μL至约5μL)的范围内，并且可以容易地容纳在本发明的反应容器的孔内，从而允许快速多路复用分析。在一些非限制性示例性实施方案中，反应容器的每个孔内的反应体积为约0.1nL、0.2nL、0.3nL、0.4nL、0.5nL、0.6nL、0.7nL、0.8nL、0.9nL、1nL、1.5nL、2nL、2.5nL、3nL、3.5nL、4nL、4.5nL、5nL、5.5nL、6nL、6.5nL、7nL、7.5nL、8nL、8.5nL、9nL、9.5nL、10nL、12nL、14nL、16nL、18nL、20nL、25nL、30nL、35nL、40nL、45nL、50nL、55nL、60nL、65nL、70nL、75nL、80nL、85nL、90nL、95nL和100nL。

反转录PCR或RT-PCR是用于检测和分析样品中RNA的特别有力的工具。RT-PCR是反转录反应在之前的PCR，将目标RNA转化为互补的单链DNA，然后在常规PCR过程中进行扩增，参见例如Tecott等人，美国专利号5,168,038。

实时PCR是在其期间在反应进行的同时监测反应产物(即扩增子)的量的PCR方法。存在许多形式的实时PCR，其主要区别在于用于监测反应产物的检测手段，参见例如Gelfand等人，美国专利号5,210,015(TaqMan探针)；Wittwer等人，美国专利号6,174,670和6,569,627(嵌入染料)；Tyagi等人，美国专利号5,925,517(分子信标)。实时PCR的检测化学在Mackay等人,Nucleic Acids Research,30:1292-1305(2002)中进行了综述。

巢式PCR是涉及至少两个扩增阶段的PCR方法，其中使用第一组引物的第一阶段PCR的扩增子成为使用第二组引物的第二阶段PCR的模板。第二组引物中的至少一个引物具有序列互补性并且可以在第一组的两个引物的杂交位点之间的位置，即在第一阶段PCR的扩增子的序列内的位置与目标多核苷酸序列杂交。

多重PCR是其中在同一反应混合物中同时进行多种潜在目标多核苷酸序列的扩增的PCR方法，参见，例如Bernard等人,Anal.Biochem.,273:221-228(1999)(双色实时PCR)。本发明的反应容器测定形式适于进行多重PCR。一组不同的引物包括在意在用于扩增和检测不同的目标多核苷酸序列的孔中。通常，在孔阵列排列中有许多含有与重复孔(duplicate well)相同引物的重复序列孔(repeat well)。例如，在非限制性的示例性实施方案中，一个完整的孔阵列可以包括不同的预制反应混合物，各自包含选自总共多达8个、16个、25个、50个或甚至100个不同的引物组的不同引物组，为每个包含不同的引物组的反应混合物提供8个重复孔的簇。

定量PCR是允许人们测量样品中一个或多个特定目标序列的丰度的PCR方法。定量PCR可以包括测量目标序列的绝对定量和相对定量。使用一个或多个参考序列进行定量测量，所述参考序列可以单独测定或与目标序列一起测定。参考序列可以是对于样品而言内源性的(天然存在的)或外源性的(人工添加的)，并且在后一种情况下，可以包括一个或多个竞争模板。典型的内源性参考序列包括以下基因的转录物的区段：β-肌动蛋白、GAPDH、β2-微球蛋白、核糖体RNA等。用于定量PCR的技术是本领域普通技术人员熟知的，参见例如Freeman等人,Biotechniques,26:112-126(1999)；Becker-Andre等人.,Nucleic AcidsResearch,17:9437-9447(1989)；Zimmerman等人,Biotechniques,21:268-279(1996)；Diviacco等人,Gene,122:3013-3020(1992)；Becker-Andre等人,Nucleic AcidsResearch,17:9437-9446(1989)。

如果允许在扩增反应进行的同时测量反应产物的检测机制是可用的，例如上述实时PCR，或者例如Leone等人,Nucleic Acids Research,26:2150-2155(1998)所述的实时NASBA，则扩增反应可以是“实时”扩增。如本文所用，术语“扩增”是指进行扩增反应。“反应混合物”是含有用于进行反应的所有必需反应物的溶液(或这样的溶液的冻干形式)，其可以包括但不限于缓冲剂、盐、辅因子、清除剂等。在一些实施方案中，在制造过程期间将冻干的试剂沉积在反应容器的孔中。在一些实施方案中，冻干的试剂含有用于扩增一个或多个目标多核苷酸序列的至少一组引物、核苷三磷酸、酶和/或指示一个或多个扩增子存在和/或数量的检测部分。在一些实施方案中，检测部分是荧光指示剂。实时PCR中的扩增子的检测或定量通常涉及使用荧光共振能量转移探针或FRET探针，例如探针、分子信标探针或蝎型探针(Scorpion probe)。

如本文所用，荧光指示剂是能够在存在扩增反应的一种或多种产物(即，扩增子)的情况下产生荧光信号的分子(例如，染料或探针)，使得当扩增子在反应混合物中累积时，荧光指示剂的信号至少在预定的扩增子浓度范围内增加。

在本发明的反应容器中进行的扩增反应中可以使用几种类型的荧光指示剂：首先，可以使用荧光染料。这类合适的染料对于扩增子的多核苷酸序列是非特异性的，例如与双链DNA产物结合的嵌入染料，例如溴化乙锭、SYBR Green I和II、SYBR Gold、YO(恶唑黄)、TO(噻唑橙)和PG(PicoGreen)，参见例如Ishiguro等人,Anal.Biochem.,229:207-213(1995)；Tseng等人,Anal.Biochem.,245:207-212(1997)；Morrison等人,Biotechniques,24:954-962(1998)。适用于本发明的其它荧光指示剂是本领域普通技术人员熟知的。

其次，在一些情况下，可以将一个或多个引物设计成具有发夹结构，其中荧光分子保持在荧光猝灭剂附近，使得荧光被猝灭剂猝灭，直到发夹结构被引物延伸迫使分开，参见，例如，Whitecombe等人,Nature Biotechnology,17:804-807(1999)(Amplifluor^TM引物)。合适的荧光分子包括在前面部分中提到的那些。

第三，荧光指示剂也可对目标核酸的多核苷酸序列有特异性。通常被称为荧光探针的这种类型的指示剂通常包含荧光猝灭基团附近的荧光基团，直到它们所附着的寡核苷酸部分与扩增产物特异性结合，参见例如Gelfand等人，美国专利号5,210,015(TaqMan探针)；Nazarenko等人,Nucleic Acids Research,25:2516-2521(1997)(蝎型探针)；Tyagi等人,Nature Biotechnology,16:49-53(1998)(分子信标)。荧光指示剂可以与实时PCR结合使用，或者它们可以用于测量反应完成时反应产物的总量。关于各种分子信标和其它发夹探针的综述，参见Broude,Encyclopedia of Diagnostic Genomics and Proeomics,2005，第846至851页。

通常，对于在本发明的反应容器中进行的每个反应，不管其本质是基于结合亲和力还是基于扩增，存在至少一个阳性对照和一个阴性对照，使得这些对照产生对成功反应的确认：检测到的任何阳性信号不是由于系统范围的污染，并且检测到的任何阴性信号不是由于测定系统的失能。在一些实施方案中，可以包括内部标准。内部标准是参与同一反应的已知分子，例如，在与目标多核苷酸同一的扩增反应中扩增的核酸序列，以允许定量(相对定量或绝对定量)样品中的目标分析物。内部标准可以是内源性的，即已知预先存在于样品中，或者是外源性的，即在测试之前加入。

V.设计分析试剂以适应反应条件

因为在本发明的反应容器中进行的多路复用测定通常在大致相同的条件下大致同时进行，所以必须仔细设计位于反应容器的每一个点上或每一个孔内的分析剂，以便在一组预定的反应参数下实现最佳或接近最佳的反应结果。在一个实例中，将8种不同的多核苷酸探针点样或固定在基板表面上，以通过基于序列互补性的杂交来检测样品中的8种不同的目标核酸。设计和优化每个目标探针序列以落入特定测定的预定反应参数内是本领域普通技术人员所熟知的。在设计和优化探针时，非限制性参数包括探针长度、目标序列内的相对位置和GC含量，这些参数在特定测定的给定反应条件下导致探针与其目标之间的特异性杂交。

在另一个实例中，意在用于扩增8个不同目标多核苷酸序列的8组不同反应混合物以4小块形式(4-patch format)排列，每个小块含有每种反应混合物的8个重复孔。这8组不同反应混合物中的每一组含有至少一组用于扩增不同目标序列的寡核苷酸引物。可以设计这8组引物，使得在相同的温度下和在相同的时间范围期间，对于8个不同的目标序列，变性、退火和延伸步骤全部都可以充分完成。

本领域技术人员能够通过调节探针或引物的长度、GC含量来完成必要的设计。在一些情况下，用修饰的或人工的核苷酸取代天然存在的核苷酸有效地进一步微调探针和引物的退火/变性表现。参见，例如，Leconte等人J Am Chem Soc.2008；130(7):2336-2343；美国专利号8,268,978。一些已知的类似物包括1-甲基腺嘌呤、1-甲基肌苷、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-硫代尿嘧啶、2,2-二甲基鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、3-甲基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-(羧甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5’-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、β-D-甘露糖基喹啉、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、羟丁氧肌苷、假异胞嘧啶、假尿嘧啶、假尿嘧啶、queosine、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯和尿嘧啶-5-氧乙酸等。许多核苷酸类似物可通过供应商如Sigma和AppliedBiosystems商购获得。

图6示出了流体控制和处理盒10，所述处理盒10包括具有多个室13的外壳12。位于内部的流体控制装置(未示出)和反应容器100连接到外壳12的不同部分。盒10通过与流体接口108流体地偶联，向反应容器提供样品流体和必要的其它流体。通常，包括反应容器的盒在美国加利福尼亚州Sunnyvale的的系统中使用。在一些实施方案中，包括反应容器的盒在如美国专利申请序号61/639820中所公开的异源系统的一个或多个模块中使用，该申请通过引用并入本文，并作为附录A的一部分附于本文。系统10和使用方法的另外细节在美国专利号8,048,386、8,187,557、8,119,352和美国公开号2008-0038737中描述，以上专利和公开中的每一个都通过引用并入本文，并作为附录A附于本文。在该实施方案中，被设计用于本文所述的反应容器的盒的11个可用的室中的两个被油占据。在一些实施方案中，试剂(例如珠)储存在一个或多个剩余室中。在一些实施方案中，流体接口的凸缘附接的盒的基座被设计用于搭扣配合接口(snap-fit interface)，所述搭扣配合接口(snap-fit interface)容易地接收反应容器并且将反应容器流体地偶联到完成的样品盒。在传统的盒设计中，反应容器在样品盒的组装期间被连接并且不能被容易地移除。通过在样品盒的基座内提供卡扣配合接口，可以将高级多路复用反应容器连接以在组装后根据需要选择样品盒，从而在允许使用用于标准测定和高度多路复用测定两者的盒方面提供更大的通用性和效率。

图7示出了系统200，其具有布置在罩壳201内具有共同外壳203的多个测定模块210。该系统包括八个模块，尽管可以理解该系统可以包括任意数量的模块。每个模块210配置有门211，其打开以接收(手动地或机器人地)样品盒10，如图6所示。模块210以从外壳罩壳(housing enclosure)取出的左下视图示出。每个模块210包括仪器核心组件，其具有用于处理/测试样品盒中的流体样品的部件(机械和光学元件/传感器)。应当理解，系统的一个或多个模块可被配置成处理高级多路复用反应容器，例如本文所述的那些中的任一者。系统还可以包括一个或多个常规模块，其被配置成处理较低水平的多路复用反应容器，例如常规反应容器的那些。

图8示出了模块210的详细视图，其被配置成用于从系统罩壳取出的高级多路复用。模块包括热循环单元220，所述热循环单元220包括吹风机风扇225，所述吹风机风扇225用于在高级多路复用反应容器的预扩增室中对流体样品进行热循环。组件还包括与反应容器的主面相邻的光学检测器(未示出)，以允许检测在阵列上空间隔离的反应。因此，与平台中的常规模块不同，这些模块允许高度多路复用反应容器中的PCR孔阵列中的热循环和检测。模块包括代表用于分析高度多路复用样品的可缩放解决方案的仪器核心组件。在该实施方案中，模块允许每孔进行至少两个同时反应(例如，目标和对照)。在一些实施方案中，模块能够与标准仪器外壳中的常规模块一起操作。这些模块包括灵活的连接和软件，以便于高度多路复用的反应管的热循环和分析测试。在一些实施方案中，这代表可缩放的架构，其可以被缩放以适应各种等级的多路复用。通过这种方法，现有的分析测试系统可以被改装为具有一个或多个改进的模块，所述模块能够与高级多路复用反应容器一起使用，从而系统可以有效地提供全范围的可用测定。

图9A示出了图8中模块的仪器核心组件的选择部件的分解图。仪器核心包括热循环组件220，其包括加热器224和具有吹风机盖226a、226b的风扇吹风机225以及TEC组件220A，TEC组件220A包括TEC 221、散热器222和散热器风扇223；光学激发装置230，其包括红色LED 231和绿色LED 232(其各自可包括滤光片233和光圈234)，以及光学传感器，其包括透镜240。在此，仪器被配置成用于单侧加热，所述单侧加热控制用于流体样品的热循环的反应容器的温度，这使得反应容器的另一侧可用于光学传感器的光学检测，所述光学传感器可以包括光电二极管或照相机。光学激发装置包括双色成像，一种颜色是目标通道(例如，绿光)，而另一通道是对照通道(例如，红光)。在一些实施方案中，目标通道使用红光，而对照通道使用绿光。应当理解，一些实施方案可以利用各种其它颜色来用于目标和对照，或者也可以利用另外的颜色来用于另外的目标。通过这种方法，对照允许用户确定哪些孔可被依赖用于测试，并且目标通道指示这些孔中有多少孔指示对应于目标检测的反应。在一些实施方案中，该仪器核心被配置成快速装入模块中并替换常规的仪器核心，从而允许常规的模块被改装以适应高级多路复用。在一些实施方案中，邻近平面反应容器的主面放置光学传感器需要额外的空间，使得改装模块可能需要系统内的额外宽度，例如，高级多路复用模块可能占用两个常规模块的空间。此外，高级多路复用模块可能需要使用新的网关。

图9B示出了高级多路复用反应容器100的侧视图，其连接到样品盒，所述样品盒与沿孔室的上边缘和下边缘布置的红色LED组件231和绿色LED组件232相互作用。

图10A示出了反应容器100的高级多路复用阵列的照片，其中每个孔填充有用于分析测试的流体样品。如所示，这是一个32×32的阵列，具有1024个适于高级多路复用的孔。

图10B示出了在分析测试期间来自图10中的高级多路复用阵列的选择孔中的反应的发光的图像，指示检测到哪些目标分析物。这样的照片可以通过仪器核心的光学传感器通过反应容器的第一基板获得，并被分析以确定哪些指示反应的孔对应于选择的分析物。在该实例中，所有孔用相同的样品混合物填充，但仅一些孔含有至少一个拷贝的目标以开始反应。在一些实施方案中，系统可以获得多张照片，每张照片对应于在不同波长范围的光学激发。例如，该照片可以代表来自特定波长范围的激发(例如，来自红色LED的激发)的发光，并且另一图像可以在另一范围内的激发期间(例如，来自绿色LED)获得。可以同时或快速相继地获得这些图像。在一些实施方案中，系统每个PCR热循环获得两张图像，一张图像用于绿色激发，并且一张图像用于红色激发。收集每个热循环的一组图像允许跟踪每个单独孔的PCR曲线作为循环数的函数。有利的是，这提供了执行测试小组的能力，所述测试小组用单个测试检测大量目标分析物，例如流感小组或癌症特征测定，如以下实例中所进一步描述的。

图11A至图11B描绘了乳腺癌特征测定。在该测定中，存在20个用于检测的标志物目标，即CYFIP-1、TOP2A、EBP、CYFIP-5、NUP107、DHX15、FMOD、DTX4、RACGAP、SYNE2、SUPT4、PRC1、NUSAP1、FADD、TXNIP、CCNB2、CALD1、APOC1、AP1AR和MAPKAPK2。为了简化分析和调试，将测定分成单独的5目标组合，加上CIC对照。每个反应容器用特定的组合(重(plex))形成模式。每个反应容器重复该模式14次，或者如果需要，重复该模式多于14次。如图12和图13所示，可以运行没有点样的散装填充(所有孔填充相同的PCR)进行比较，其中图12描绘了散装填充性能，而图13描绘了点样PCR性能。

点样可以以任何合适的所需图案排列。图14示出了可用于乳腺癌小组的20个目标图案的示例。该图案可支持5×5栅格中的25个目标。每个目标有4个重复。引物-探针组各以400nM点样。实验结果表明，预扩增和孔内PCR的整合导致20个点样目标中有15个为阳性。实验结果表明，整个测定可以在145分钟内进行(在反应容器上进行的时间)，这被预期可以进一步优化到约100分钟，这比许多现有的通过常规方法进行的乳腺癌特征小组具有更高的时间效率。

图15图示了流感小组的另一个实例。点样反应容器的实验结果表明，可接受的结果也证明了进行流感小组的可行性。

VI.孔点样的化学成分

在又一方面，本发明涉及改进的孔内试剂的点样，其特别适合于具有本文所述的高级多路复用反应容器的使用者。模板特异性试剂(TSR)孔基质化学成分的目的是将特异性试剂(例如引物和探针)保留在实时PCR检测所需的每个孔内。在用流体样品填充孔和孔室期间，孔必须将点样试剂保留在每个孔内，但也必须在油隔离后释放试剂以允许实时PCR检测。所选择的一般方法是在制造期间(膜密封之前)将TSR试剂预先分配(或“点样”)到每个孔中，以规定反应容器检测哪些分析物。然后可以干燥、加热和/或固化该化学成分以在处理&加工期间将试剂保持就位。通常，分配到孔中的仅有PCR试剂是引物和探针；酶、盐、dNTP和实时PCR所需的所有其它试剂通常以液体形式从样品提供。

需要仔细选择TSR基质化学成分以确保在孔样品填充过程期间不会太快地发生重构以避免化学/试剂串扰。然而，基质化学成分也必须允许在油隔离后将引物/探针释放到每个孔的整体液体中，以便允许实时PCR发生。化学/试剂串扰的量必须足够低，以便不与指定的孔PCR反应显著竞争，估计在样品填充&油隔离期间进入最近的相邻孔的量<25％。

此外，孔基质化学成分必须不能显著抑制或干扰实时PCR(化学或光学)，必须是可制造的(用于方便分配的液体样品是优选的)，并且当在2℃至8℃储存时，在点样至少高达9个月后必须随时间稳定。

在早期的点样开发期间观察到，在孔样品填充和油隔离步骤期间，点样在孔内的材料会渗出并被冲走。在填充期间将点样材料(引物/探针)保留在孔内的方法对于随后的实时PCR反应是必需的。尽管在孔内保持点样材料(填充保留)是重要的，但同样必需能够从点样基质中释放引物/探针(孔内PCR性能)，以允许在每个孔内混合样品，从而发生孔内实时PCR。

用于确定最合适的化学试剂的三个主要筛查标准如下：1)点样基质必须能够在孔填充和油隔离步骤期间将大部分点样材料保留在孔内；2)点样基质必须能够在单独的孔油隔离之后释放点样的材料，以允许在孔内进行相同的混合；和3)点样基质必须与孔内实时PCR兼容(即它必须在化学上和光学上都是非抑制性的)。

用于确定最合适的化学试剂的四个次要标准如下：1)为了易于制造，点样化学基质必须易于配制，具有在室内或室外制造的灵活性，需要最少量的设备；2)点样基质的制备必须尽可能简单，化学成分和添加剂数量连同处理步骤最少；3)基质化学成分必须易于使用手动点样系统进行点样，注意阻碍点样的化学和物理性质。必须考虑点样过程期间的粘度、胶凝、蒸发和特殊储存要求等性质；和4)基质化学成分应该具有最少且简单的二次加工步骤(例如干燥、固化)。

还考虑了三个不太关键的标准如下：1)原始化学材料的成本和点样基质的制造应针对成本进行优化；2)应该从非动物来源获得原始化学材料，以最小化具有规章限制的干扰；和3)原始化学材料及其副产物应无毒且非致癌，以最小化对操作人员和操作该原料的人员的健康危险影响。

VII.孔化学成分基质研究综述

在一方面，适于与可与填充相容的化学试剂和与本文所述的反应容器相关的PCT技术混合的基质材料可包括：1)聚合物类型材料；2)顺磁性颗粒；3)聚合物和顺磁性颗粒种类。

在各种条件下进行的广泛的实验研究中，考虑并分析了各种基质材料和材料种类。所考虑的基质材料包括但不限于：HEC(羟乙基纤维素)、NIPAM(正异丙基丙烯酰胺)、PVA(聚乙烯醇)、琼脂糖、甲基纤维素、HPMC(羟丙基)甲基纤维素、PEG(聚乙二醇)、颗粒HPC(羟丙基纤维素)、CMC(羧甲基纤维素钠)、甘油、蔗糖、海藻糖、BSA(牛血清白蛋白)、SPA(聚丙烯酸钠)、Cepheid通用冻干缓冲液聚丙烯酰胺、DNA稳定剂试剂盒、支链淀粉藻酸盐+氯化钙、蜡、1-十四烷醇、果胶、TMOS(原硅酸四甲酯)、棕榈酸，Pluronic、聚蔗糖、明胶、PVP、Gantrez及它们的混合物。

在应用以上开发的筛查程序时，确定HEC(羟乙基纤维素)、NIPAM(正异丙基丙烯酰胺)和羟丙基纤维素(HPC)是用于与试剂混合并在孔中点样的最合适物质。HEC和NIPAM两者在根据期望标准填充孔期间都提供合适的保留性能。特别地，HEC在填充孔期间提供了期望的保留性能，并且另外显示了期望的孔内PCR性能。

在聚合物类型的材料中，水溶性聚合物是优选的，使得流体样品的引入释放材料内的试剂。合适的这样的材料可以包括但不限于：纤维素，或纤维素的衍生物或变体；丙烯酰胺或丙烯酰胺的衍生物或变体；琼脂糖或琼脂糖的衍生物或变体；醇或醇的衍生物或变体；聚(乙二醇)或聚(乙二醇)的衍生物或变体或它们的混合物。

在顺磁颗粒中，这些材料被弱地吸引到磁体的磁极，但它们本身不是磁性的。基于珠的分子测定已经在文献中显示了数十年，并且可以在许多市场上的产品(例如，Gen-Probe/Hologic)中获得。聚苯乙烯颗粒可以用反应性基团官能化以捕获/保留引物/探针，并且然后可以裂解反应性基团以释放捕获的引物/探针。另选地，引物/探针可以非特异性吸附，并且然后从颗粒表面释放。

可以设想，TSR寡核苷酸可以附着到颗粒并在基质化学成分中点样，其中基质化学成分可以捕集相对较大的颗粒。此外，将顺磁性颗粒与置于反应容器模块内在孔后面的磁体组合使用可有助于将颗粒保留在每个孔中。

顺磁性聚苯乙烯(PS-MAG)和二氧化硅微粒(SiO2-MAG)，分别具有3.9μm和7.52μm的直径，从Microparticles GmbH获得，用于作为在孔中的物理保留机制进行测试。这些颗粒通过吸附或通过官能化表面用目标特异性试剂涂覆，并通过放置在反应容器模块内的磁体保持在孔中就位。然而，这种方法显示出在孔之间的点样的不一致，并且观察到孔之间的携流(carryover)。

在聚合物和顺磁性颗粒种类中，优选的材料表现出聚合物材料以及顺磁性材料的优点。合适的材料可以包括但不限于：HEC-(羟乙基纤维素)；NIPAM-(正异丙基丙烯酰胺)；PVA-聚乙烯醇；琼脂糖；甲基纤维素；HPMC-(羟丙基)甲基纤维素；PEG-(聚乙二醇)；颗粒-(顺磁性)；HPC-(羟丙基纤维素)；及它们的混合物。

在一些实施方案中，HEC材料内的化学试剂在填充期间的保留以及孔内PCR性能方面表现出优异的性能。从广泛的研究和进行的实验确定以下特征：

·分子量(MW)-90K-1,300K道尔顿(优选具有MW 720K)

·浓度1％至2％(优选2％)

·干燥条件-70℃至105℃，1天至6天(HEC的性能在90℃，持续24小时时最佳)

基于各种点样基质筛查标准和系列测试，2％HEC(MW 720k)溶液连续并成功地证明了其点样保留和释放性质，同时不干扰或抑制孔内PCR。因此，MW 720k HEC被认为对于用作孔点样基质是特别有利的。

如为确定最合适的试剂基质材料所进行的广泛研究中所证明的，注意到HEC相对于其他提出的基质材料具有显著的优势，包括：i)HEC可被点样到多个孔中而不无破坏；ii)点样的HEC在物理上保持完整，显示出可接受的TSR保留，并且当孔填充有流体样品混合物时显示出有限的HEC浸出；(iii)HEC中的点样TSR释放并与主混合物中的目标相互作用；(iv)可以在孔中点样的油隔离的HEC中测量PCR活性；(v)携流污染或由于化学串扰进入非点样孔而导致的终点荧光信号，相对于点样孔中的终点PCR信号是最小的。

广泛的实验证明HEC表现出比常规使用的试剂基质提供显著优点的特征。特别地，HEC表现出适当的延迟水溶性，以确保在孔的初始填充期间点样试剂保持被捕集在基质内，从而确保孔的化学成分完整性，以用于适当的PCR性能以及避免与相邻孔的交叉污染。HEC在最短暴露时间后进一步展示出期望的水溶性，这确保了试剂在每个孔隔离后适当地释放到流体样品中，以确保满意的孔内PCR性能。另外，HEC提供了在加热时表现出交联的额外优点，这使得基质在暴露于水时在更长的持续时间内保持完整性。该性质可通过在填充期间加热反应容器来利用以进一步改善填充期间基质的完整性和/或在暴露于流体样品时延迟基质的分解直到孔被隔离。实验结果还表明在孔的填充期间关于保留的特征是期望的，而且还表明对于孔内性能的进一步开发的需要。

关于HEC作为基质材料的性能的实验结果示于图16至图22中。如可以看出的，2％HEC表现出最适合本文描述的点样应用的特征，并且表现出远远超过大量可选基质材料的性能。图17示出了2％HEC溶液的反应容器填充观察结果；图18示出了当在a)70℃干燥1天b)70℃干燥6天和c)90℃干燥1天和d)90℃干燥6天时在填充保留测试期间的填充后图像；图19示出了在2％HEC的保留测试期间捕获的填充后图像；图20示出了在105℃干燥1天的1％HEC的点样保留测试；图21示出了在90℃干燥6天的2％HEC的底层上的2％HEC帽的填充测试；以及图22示出了在a)70℃干燥1天，b)70℃干燥6天和c)90℃干燥6天的2％HEC封顶样品的填充后图像。

本申请中引用的所有专利、专利申请和其它出版物出于所有目的以全文引用的方式并入。

Claims (101)

1.反应容器，其包括：

平面框架，其限定第一平面基板和第二平面基板之间的流体路径；和

流体接口，其位于所述平面框架的一端，所述流体接口包括第一流体端口和第二流体端口，其中所述流体路径在所述第一流体端口和第二流体端口之间延伸；

其中所述流体路径进一步包括具有多个孔的孔室，所述孔室布置在所述第一基板和第二基板之间的所述平面框架中，所述孔室沿着所述流体路径布置成与离所述第二流体端口相比更靠近所述第一流体端口；和

预扩增室，其布置在所述第一基板和第二基板之间的所述平面框架中，并且沿着所述流体路径布置成与离所述第一流体端口相比更靠近所述第二流体端口。

2.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述流体路径包括布置在所述预扩增室和所述孔室之间的一个或多个阀。

3.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述流体路径进一步包括所述预扩增室和所述孔室之间的蜿蜒通道。

4.根据权利要求3所述的反应容器，其中所述流体路径进一步包括从所述蜿蜒通道朝向所述孔室延伸的中间通道，其中所述中间通道朝向所述孔室向下倾斜。

5.根据权利要求4所述的反应容器，其中所述流体路径进一步包括在所述蜿蜒通道和所述孔室之间的流体路径阀。

6.根据权利要求5所述的反应容器，其中所述流体路径进一步包括与所述中间通道的下游部分流体连通的油室，所述油室的尺寸和配置用于捕集从所述蜿蜒通道流向所述孔室的油。

7.根据权利要求6所述的反应容器，其中所述油室进一步包括集油阀。

8.根据权利要求1所述的反应容器，其中当所述第一平面基板和第二平面基板垂直定向，且所述第一流体端口在所述第二流体端口下方时，预扩增室出口位于所述预扩增室的最上部。

9.根据权利要求8所述的反应容器，其中所述流体路径包括位于所述孔室的最下部的孔室入口。

10.根据权利要求9所述的反应容器，其中所述流体路径包括从所述第一流体端口向所述孔室延伸的入口通道。

11.根据权利要求10所述的反应容器，其中所述入口通道基本上是水平的。

12.根据权利要求11所述的反应容器，其中在所述入口通道和孔室之间的所述孔室入口朝向所述孔室向上倾斜。

13.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述流体路径包括一个或多个阀，所述阀包括收缩部，使得沿着所述流体路径的流体流动能够受到通过所述第一流体端口和第二流体端口中的任一个的变化压力的影响。

14.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述孔基板包括100个至2000个孔。

15.根据权利要求14所述的反应容器，其中所述孔基板包括多个深度为约100μm至约500μm的孔。

16.根据权利要求14所述的反应容器，其中所述孔基板包括多个直径为约50μm至约500μm的孔。

17.根据权利要求14所述的反应容器，其中所述多个孔中的每一个的体积在约0.5nL至约2nL的范围内。

18.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述第二平面基板与所述平面框架一体地形成或模制。

19.根据权利要求18所述的反应容器，其中所述第一平面基板包括薄膜，所述薄膜与所述平面框架流体密封。

20.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述平面框架经通过所述流体接口流体连接到样品容器。

21.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述多个孔用一种或多种与液体形式的基质材料混合的试剂点样，其中所述试剂和基质材料混合物被干燥或烘烤成固体形式。

22.根据权利要求1所述的反应容器，其中用不同的试剂点样不同的孔，以便于在同一反应容器内检测不同的目标。

23.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述多个孔用多种试剂点样以便于10个或更多个目标的检测。

24.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述多个孔用不同组中的多种不同试剂点样，所述不同组在空间上分开，以便于识别所述不同组中的不同反应。

25.根据权利要求24所述的反应容器，其中所述不同组以重复模式点样，以便于识别所述不同组中的不同反应。

26.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述多个孔用与水溶性基质材料混合的多种试剂点样。

27.根据权利要求26所述的反应容器，其中所述基质材料包括在暴露于水达到最小持续时间时降解或溶解的聚合物，其中所述聚合物在该最小持续时间之前保持完整。

28.根据权利要求27所述的反应容器，其中所述最小持续时间为10秒、15秒、20秒、30秒、1分钟或更长中的任一个。

29.根据权利要求27所述的反应容器，其中所述基质材料包括在加热时交联的聚合物，以便加热所述基质材料有助于延长所述聚合物在暴露于水之后的完整性。

30.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述基质材料包括HEC、NIPAM和HPC中的任一种。

31.方法，其包括：

向反应容器的流体接口提供流体样品，其中所述反应容器包括平面框架，所述平面框架在垂直定向时限定第一平面基板和第二平面基板之间的流体路径，其中所述流体接口布置在所述平面框架的一端并包括第一流体端口和第二流体端口，所述第二流体端口布置在所述第一流体端口上方，其中所述流体路径包括具有多个孔的孔室和预扩增室；

通过所述第二流体端口将流体样品导入所述预扩增室，并扩增所述流体样品；

从所述预扩增室排出所述流体样品；

用扩增的流体样品填充所述孔室，使得所述扩增的流体样品至少部分地填充所述孔室的多个孔；以及

从所述孔室排出过量的扩增的流体，使得所述多个孔中的大部分保持被至少一些所述扩增的流体样品润湿。

32.根据权利要求31所述的方法，其中从所述预扩增室排出所述流体样品包括通过所述第二流体端口回收所述扩增的流体样品。

33.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括：

在将所述流体样品引入之前将油引入所述预扩增室中，以便在所述流体样品被扩增期间用油覆盖所述流体样品。

34.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括：

在所述预扩增室内热循环所述流体样品以扩增所述流体样品预PCR。

35.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括：

通过沿着所述预扩增室和所述孔室之间的所述流体路径布置的蜿蜒通道，抑制所述预扩增室中的水分和/或流体的前进，以抑制所述多个孔的污染。

36.根据权利要求35所述的方法，其进一步包括：

通过沿着所述预扩增室和所述孔室之间的所述流体路径布置的一个或多个阀，进一步抑制所述预扩增室中的水分和/或流体的前进，从而抑制所述多个孔的污染。

37.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括：

利用沿着所述预扩增室和所述孔室之间的所述流体路径布置的集油器来捕集沿着所述流体路径前进的超过所述预扩增室的油，以抑制所述多个孔的污染。

38.根据权利要求31所述的方法，其中排空所述孔室包括通过所述第一流体端口回收所述流体样品。

39.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括：

通过所述第一流体端口将油引入所述孔室并填充孔室以去除任何剩余的过量流体样品和/或覆盖所述多个孔以隔离所述多个孔内的所述流体样品。

40.根据权利要求39所述的方法，其进一步包括：

通过所述第一流体端口从所述孔室排出油。

41.根据权利要求39所述的方法，其中将油引入所述孔室包括：

用第一油填充所述孔室，填充到所述孔室中，以去除所述孔室内在所述多个孔之外的任何过量流体样品；

从所述孔室排出所述第一油；

用比所述第一油轻的第二油填充所述孔室以覆盖所述多个孔从而隔离所述多个孔内的所述流体样品；以及

从所述孔室排出过量的第二油。

42.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括：

对布置在所述多个孔内的所述流体样品进行热循环。

43.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括：

对布置在所述多个孔内的所述流体样品进行PCR测试以检测一种或多种目标分析物。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种分析物包括10种或更多种目标分析物。

45.根据权利要求43所述的方法，其中进行PCR测试进一步包括：

通过所述反应容器的边缘光学激发所述流体样品；和

用光学检测器光学检测来自所述流体样品的反应的任何荧光，所述光学检测器沿着所述反应容器的主面布置，穿过所述第一平面基板。

46.根据权利要求45所述的方法，其中光学激发所述流体样品包括：

通过沿所述孔室的第一边缘发射来自第一波长范围的光，提供用于反应检测的对照通道；和

通过沿所述孔室的第二边缘发射来自第二波长范围的光，提供用于所述反应检测的目标通道。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述对照通道是红光，并且所述目标通道是绿光。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述对照通道是绿光，并且所述目标通道是红光。

49.根据权利要求43所述的方法，其进一步包括：

通过使用具有延迟水溶性的水溶性基质材料，在孔隔离后，释放在所述多个孔内点样的试剂。

50.根据权利要求43所述的方法，其进一步包括：

在填充所述孔室期间加热所述反应容器，以通过与所述试剂混合的基质材料的交联促进在所述多个孔内点样的试剂的保留；

在隔离填充有扩增的流体样品的所述多个孔之后冷却所述反应容器以促进所述试剂从所述基质材料释放。

51.根据权利要求49所述的方法，其中所述基质材料包括HEC、NIPAM和HPC中的任一种。

52.用于对液体形式的试剂进行点样的试剂点样装置，其包括：

多个毛细管，其以规则的空间排列相对彼此固定成束，其中所述多个毛细管中的每一个包括具有减小的直径的远端部分；

外壳，其覆盖所述多个毛细管的近端部分；和

基座，其从所述多个管和保护外壳横向向外延伸，通过所述基座可以操纵或定位所述装置。

53.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其中所述减小的直径部分的外径为约0.01至约1mm。

54.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其中所述减小的直径为约0.05至约0.5mm。

55.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其中所述减小的直径为约0.10mm。

56.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其中所述多个管空间排列成矩形阵列。

57.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其中所述多个管包括在25个至1,024个管范围内的多个管。

58.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其中所述多个管包括100个至500个管的多个管。

59.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其中所述多个管在其近端向大气开放。

60.根据权利要求59所述的试剂点样装置，其中所述多个管选择性地向大气开放，以允许所述多个管吸取其中的液体溶液，并且所述多个管能够选择性地关闭，以将所述液体试剂溶液保留在其中，用于后续的点样。

61.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其进一步包括：

压力控制特征部，其便于控制所述多个管内的压力。

62.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其进一步包括：

调压器，其用于调节所述多个管内的压力。

63.根据权利要求62所述的试剂点样装置，其中所述调压器包括压电元件。

64.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其进一步包括：

孔板，其具有与所述多个管的孔相对应的规则空间排列的孔，其中每个孔的尺寸被设计成容纳足够量的液体试剂溶液，用于用所述多个管中的单个毛细管来点样一个或多个反应容器的所述多个孔。

65.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其进一步包括：

混合站，其用于将试剂与一种或多种液体形式的基质材料混合以产生所述试剂溶液。

66.根据权利要求65所述的试剂点样装置，其中所述一种或多种基质材料包括HEC、NIPAM和HPC中的任一种。

67.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其进一步包括：

定位工具，其被配置成支撑所述多个管的束并控制所述束在x-y-z方向上的精确运动，以便于对一个或多个反应容器的所述多个孔进行自动化点样。

68.根据权利要求67所述的试剂点样装置，其进一步包括：

一个或多个另外的束，每个束具有彼此以相同的空间排列固定的多个管，并且每个束由所述定位工具支撑，以便于同时对多个反应容器进行点样。

69.根据权利要求68所述的试剂点样装置，其进一步包括：

托盘，其用于容纳多个反应容器，每个反应容器具有多个用所述试剂溶液点样的孔。

70.根据权利要求69所述的试剂点样装置，其中所述托盘包括多个凹陷，每个凹陷被塑形用于以预定的对齐方式支撑反应容器。

71.根据权利要求52所述的试剂点样装置，其进一步包括：

加热器或加热罩壳，其用于在所述反应容器点样后干燥点样的液体试剂溶液。

72.对多个孔进行点样的方法，其包括：

将毛细管的束定位在反应容器的多个孔上方，所述毛细管以彼此之间的规则空间排列固定，并且每个毛细管具有减小的直径的远端部分；

使所述反应容器的多个孔中的至少一些与所述毛细管的减小的直径部分接触；和

从所述毛细管的减小的直径部分沉积液体试剂溶液并收回所述毛细管的束。

73.根据权利要求72所述的方法，其中沉积所述液体试剂溶液至少部分地依赖于所述液体试剂溶液的接触表面张力。

74.根据权利要求72所述的方法，其中外壳覆盖所述多个毛细管的近端部分，并且基座从所述多个管横向向外延伸，其中，定位所述束包括手动地或通过机器人自动化来移动所述基座。

75.根据权利要求72所述的方法，其中所述减小的直径部分的外径为约0.01至约1mm。

76.根据权利要求72所述的方法，其中所述减小的直径为约0.05至约0.5mm。

77.根据权利要求72所述的方法，其中所述减小的直径为约0.10mm。

78.根据权利要求72所述的方法，其中所述多个管空间排列成矩形阵列。

79.根据权利要求72所述的方法，其中所述多个管包括25个至2,000个管范围内的多个管。

80.根据权利要求72所述的方法，其中所述多个管包括50个至1,024个管的多个管。

81.根据权利要求72所述的方法，其中所述多个管包括50个至500个管的多个管。

82.根据权利要求72所述的方法，其进一步包括：

用所述液体试剂溶液装载所述多个毛细管。

83.根据权利要求82所述的方法，其中所述多个管选择性地向大气开放，以允许通过大气压力吸取液体溶液来装载所述多个管，并且所述多个管选择性地向大气关闭，以将所述液体溶液保留在所述多个管内，用于后续的点样。

84.根据权利要求72所述的方法，其进一步包括：

控制所述多个管内的压力以促进所述液体试剂溶液的装载和/或沉积。

85.根据权利要求84所述的方法，其进一步包括：

用调压器调节多个管内的压力。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述调压器包括压电元件。

87.根据权利要求82所述的方法，其中装载所述多个管包括将其远端部分放置在孔板的孔中，所述孔以与所述多个管的孔相对应的规则空间排列方式布置，其中，每个孔的尺寸被设置成容纳足够量的液体试剂溶液，用于对一个或多个反应容器的多个孔进行点样。

88.根据权利要求72所述的方法，其进一步包括：

混合试剂，其与一种或多种液体形式的基质材料混合以产生试剂溶液。

89.根据权利要求88所述的方法，其中所述一种或多种基质材料包括HEC、NIPAM和HPC中的任一种。

90.根据权利要求72所述的方法，其中定位所述束包括在x-y-z方向上操作支撑所述多个管的束的定位工具，以便于一个或多个反应容器的所述孔的自动点样。

91.根据权利要求82所述的方法，其进一步包括：

用所述液体试剂溶液填充一个或多个另外的束，每个所述另外的束具有多个毛细管；

同时定位一个或多个另外的反应容器的多个孔的一个或多个另外的束；

使所述一个或多个反应容器中的每一个的所述多个孔中的至少一些与每个束的所述毛细管的减小的直径部分接触；和

同时将液体试剂溶液从所述毛细管沉积在所述一个或多个反应容器中并收回所述毛细管束。

92.根据权利要求91所述的方法，其进一步包括：

将多个反应容器放置在托盘中，每个反应容器具有多个用试剂溶液点样的孔。

93.根据权利要求92所述的方法，其中所述托盘包括多个凹陷，每个凹陷被塑形用于以预定的对齐方式支撑反应容器。

94.根据权利要求72所述的方法，其进一步包括：

在用所述液体试剂溶液点样之后，加热所述反应容器，以促进所述液体试剂溶液干燥成固体形式。

95.液体试剂溶液，其包括：

一种或多种试剂；

基质材料，其用于与所述试剂溶液混合，其中所述基质材料可溶于水以形成液体溶液，并且当在反应容器中点样和干燥时形成固体，

其中所述基质材料在暴露于水最小持续时间后是水溶性的。

96.根据权利要求95所述的液体试剂溶液，其中所述最小持续时间为10秒至2分钟。

97.根据权利要求96所述的液体试剂溶液，其中所述最小持续时间为30秒至1分钟。

98.根据权利要求95所述的液体试剂溶液，其中所述基质材料是聚合物。

99.根据权利要求95所述的液体试剂溶液，其中所述基质材料是顺磁性的。

100.根据权利要求95所述的液体试剂溶液，其中所述基质材料是在加热时交联的聚合物，使得当点样的反应容器被加热时，溶解性的最小持续时间延长。

101.根据权利要求95所述的液体试剂溶液，其中所述基质材料是HEC、NIPAM和HPC。