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CN118186074A - Dpp4作为类风湿关节炎标志物及靶点的应用 - Google Patents

Dpp4作为类风湿关节炎标志物及靶点的应用 Download PDF

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CN118186074A
CN118186074A CN202410500613.5A CN202410500613A CN118186074A CN 118186074 A CN118186074 A CN 118186074A CN 202410500613 A CN202410500613 A CN 202410500613A CN 118186074 A CN118186074 A CN 118186074A
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CN
China
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dpp4
cells
rheumatoid arthritis
cell
expression
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Application number
CN202410500613.5A
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钟继新
饶小泉
魏莹莹
林丽蔓
黄志文
凃巍
董凌莉
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Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Original Assignee
Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
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Abstract

本申请公开了DPP4作为类风湿关节炎标志物及靶点的应用。本申请发现了DPP4能够作为类风湿性关节炎诊断标志物及治疗靶点。通过检测DPP4的表达水平能够用于诊断类风湿性关节炎。过表达DPP4能够抑制滑膜成纤维细胞增殖和侵袭转移，抑制促炎炎症因子分泌，降低胶原诱导关节炎的发生率。

Description

DPP4作为类风湿关节炎标志物及靶点的应用
技术领域
本申请涉及类风湿关节炎技术领域，具体涉及DPP4作为类风湿关节炎标记物及靶点的应用。
背景技术
类风湿关节炎(RA)是以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病，表现出显著的临床异质性。RA导致滑膜的许多改变，成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)的扩张及其行为的变化是RA导致的重要差异之一。FLS通过产生滑液成分来维持健康关节中的滑液和细胞外基质稳态。FLS在RA血管翳的发展中起关键作用。血管翳由新生血管、炎性细胞及增生肥大的滑膜组织组成，是导致晚期RA造成关节软骨和骨破坏的病理基础。
对于RA的诊断，主流仍然是使用美国风湿病学院1987年拟定的一套标准，主要靠临床表现以及排除其他关节炎从而判断是否为RA，另外，X线改变和类风湿因子也是判断RA的常用标准。但上述方法操作繁琐且特异性不高，容易拖延确诊时间。
对于RA诊断方面的研究，在分子水平上取得了一些进展，例如使用磷酸甘油激酶1(中国专利公开号CN104698194A)、生腱蛋白C(中国专利公开号CN104105967A)、microRNA(miRNA)分子标记物(中国专利公开号CN103805696A)，以及自身抗体结合抗原(中国专利公开号CN104987366A、CN102796173A)等。
发明内容
本申请发现了DPP4能够作为类风湿性关节炎诊断标志物及治疗靶点。通过检测DPP4的表达水平能够用于诊断类风湿性关节炎。过表达DPP4能够抑制滑膜成纤维细胞增殖和侵袭转移，抑制促炎炎症因子分泌，降低胶原诱导关节炎的发生率。
为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
第一方面，实施例公开了类风湿性关节炎的标志物，所述标志物为DPP4。DPP4(二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4)，DPP4广泛表达于免疫细胞，包括T细胞、B细胞和树突状细胞，DPP4是一种丝氨酸蛋白酶，能够参与葡萄糖调节。
第二方面，实施例公开了DPP4作为类风湿性关节炎诊断标志物在制备类风湿性关节炎诊断试剂或试剂盒中的应用。
在第二方面的实施例中，所述诊断试剂或诊断试剂盒检测体外样本中DPP4基因或蛋白表达水平，所述表达降低提示所述体外样本的个体患有类风湿性关节炎。
在第二方面的实施例中，所述体外样本为含有个体滑膜组织的样本。
在第二方面的实施例中，所述诊断试剂或试剂盒包括特异性扩增DPP4的引物，所述的引物包括如SEQ ID NO.1～2所示的DNA分子。
在第二方面的实施例中，所述诊断试剂或试剂盒包括DPP4的单克隆抗体。
第三方面，实施例公开了DPP4作为类风湿性关节炎治疗靶点在制备治疗类风湿性关节炎药物中的用途。
在第三方面的实施例中，所述药物为DPP4、或用以增强DPP4基因或蛋白表达水平或含量的试剂。
在第三方面的实施例中，所述试剂包括如SEQ ID NO.3所示的目的序列或携带如SEQ ID NO.3所示的目的序列的质粒。
第四方面，实施例公开了一种类风湿性关节炎治疗药物，包括DPP4，所述DPP4以MID1为药物作用靶点。
附图说明
图1为实施例提供的构建DPP4过表达MH7A类风湿样成纤维滑膜细胞(RA-FLS)的表达、增殖及细胞周期相关结果。(A)为DPP4过表达细胞MH7A的Western Blot检测DPP4表达结果。(B)为DPP4过表达细胞MH7A的qRT-PCR检测DPP4表达结果。(C)CellTraceTM CFSE染色48h后，采用流式细胞术检测过表达(DPP4-Flag)DPP4的MH7A细胞增殖情况。(D)CCK8法测定过表达(DPP4-Flag)DPP4的MH7A细胞活力。(E)流式细胞术检测稳定过表达(DPP4-Flag)DPP4的MH7A细胞的细胞周期。
图2为实施例提供的DPP4抑制体内RA-FLS的增殖相关结果。(A)将稳定过表达DPP4(DPP4-Flag)的MH7A细胞注射进入严重免疫缺陷的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠右上侧腋窝皮下。于14周后测量并采集MH7A异种移植肿块，n＝5/组。(B)NSG小鼠接种的DPP4过表达(DPP4-Flag)异种移植物肿块的质量，n＝5/组。(C)对NSG小鼠接种的DPP4过表达(DPP4-Flag)异种移植物肿块的体积进行每隔一周的测量并记录和绘制成生长曲线。(D)从接种DPP4过表达(DPP4-Flag)的NSG小鼠上获取异种移植物肿块，并对获取的组织进行H&E、Ki67和DPP4染色，n＝5/组。(E)对接种DPP4过表达(DPP4-Flag)的NSG小鼠上获取的异种移植物肿块的Ki67阳性率统计分析结果，n＝5/组。(F)对接种DPP4过表达(DPP4-Flag)的NSG小鼠上获取的异种移植物肿块的DPP4阳性率统计分析结果，n＝5/组。
图3为实施例提供的DPP4抑制RA-FLS的侵袭迁移相关结果。(A)为采用体外划痕测试结果。(B)为测试的稳定过表达(DPP4-Flag)DPP4的MH7A细胞的迁移和侵袭结果。(C)为细胞迁移和侵袭测试的上室下表面的细胞计数结果。(D)为采用qRT-PCR检测过表达的MH7A细胞中MMPs的mRNA水平。
图4为实施例提供的DPP4降低炎症因子分泌并减缓关节炎疾病的相关结果。(A)蛋白-蛋白相互作用网络呈现DPP4与RA相关炎症因子之间的相互作用。(B)为DPP4过表达稳转细胞中DPP4 mRNA相对表达水平测试结果。(C)为DPP4过表达稳转细胞中各炎症因子mRNA相对表达水平测试结果。(D)在第0天和第21天分别将含Freund’s Complete佐剂和二型胶原蛋白的混合物注射到小鼠尾部根部，第40天注射到小鼠背部，构建胶原诱导的关节炎模型。(E)以每隔1周测得的小鼠体重为基础，绘制免疫小鼠体重曲线。(F)胶原免疫的WT和DPP4-/-小鼠后爪图像及关节H&E染色。(G)胶原免疫的WT和DPP4-/-小鼠关节炎临床评分(WT组n＝9,DPP4-/-组n＝6)。
图5为实施例提供的DPP4靶向MID1抑制滑膜细胞增殖、迁移和侵袭的相关结果。(A)在稳定过表达MID1-HA的MH7A细胞中转染表达DPP4-Flag的载体或空载体，采用WesternBlot检测MID1和DPP4的表达。(B)在稳定过表达MID1-HA的MH7A细胞中转染表达DPP4-Flag的载体或空载体，采用qRT-PCR检测MID1和DPP4的表达。(C)用表达DPP4-Flag的载体或空载体转染过表达MID1-HA的MH7A细胞，然后用CellTraceTM CFSE标记。CFSE染色48h后，采用流式细胞术检测MH7A细胞的增殖情况。(D)流式细胞术检测表达DPP4-Flag的载体或空载体转染过表达MID1-HA的MH7A后细胞周期各阶段差异。(E-F)采用细胞划痕愈合实验和实验评估在过表达MID1-HA的情况下，同时过表达或不过表达DPP4的MH7A细胞的迁移和侵袭。(G-H)采用qRT-PCR检测MID1-HA过表达的MH7A细胞中，过表达或不过表达DPP4情况下，MMPs和RA相关炎症因子的mRNA水平。
图6为实施例提供的DPP4靶向MID1抑制体内RA进展。(A)将稳定过表达MID1细胞或稳定过表达MID1和DPP4的MH7A细胞皮下注射至NSG小鼠右上侧，构建异种移植物模型。采集MH7A异种移植物肿块并成像以评估肿块体积。(B)NSG小鼠接种的稳定过表达MID1或稳定过表达MID1和DPP4的异种移植物肿块的质量，n＝5/组。(C)对接种的稳定过表达MID1或稳定过表达MID1和DPP4的NSG小鼠移植物的体积进行每隔一周测量并记录和绘制生长曲线。(D)从NSG小鼠上获取异种移植物肿块，并对获取的组织进行H&E、Ki67(P＝0.0016)和DPP4(P<0.001)染色。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规测试方法，可从现有技术中获知。
qRT-PCR
一些实施例提供的滑膜组织中包括DPP4在内的各基因mRNA表达水平检测方法包括：
(1)总RNA提取
采用Trizol试剂提取滑膜组织的总RNA。
(2)逆转录
将提取的1μg总RNA、3μL 5×gDNAdigester Mix和余量的DEPC水共15μL作为去除基因组反应体系，混匀，瞬时离心，42℃加热2min，以去除基因组中的DNA。将15μL去除基因组反应体系反应液与5μL4×ⅢSuperMix plus混匀，置于PCR反应仪，25℃5min、55℃15min、85℃5min、4℃Hold，以将RNA逆转录成为cDNA。
(3)qRT-PCR
配制qRT-PCR反应体系。该体系以10μL计包含：1μL cDNA，5μL qPCR SYBRGreen Master Mix(NoRox)，0.25μL 10μM上游引物，0.25μL 10μM下游引物和余量的无菌超纯水。PCR扩增程序为：预变性95℃5min，变性95℃10s\退火60℃20s\延伸72℃20s(共40个循环)，仪器自动设置溶解曲线。采用2-ΔΔCt方法对目的基因进行相对表达量分析。
其中，用于扩增人源DPP4的引物如SEQ ID NO.1～2所示，用于扩增鼠源DPP4的引物如SEQ ID NO.3～4所示。用于扩增人源参考基因GAPDH的引物如SEQ ID NO.5～6所示。用于扩增鼠源参考基因GAPDH的引物如SEQ ID NO.7～8所示。用于扩增人源MID1的引物如SEQID NO.9～10所示。用于扩增鼠源MID1的引物如SEQ ID NO.11～12所示。用于扩增人源IL-1β的引物如SEQ ID NO.13～14所示。用于扩增人源IL-6的引物如SEQ ID NO.15～16所示。用于扩增人源IL-8的引物如SEQ ID NO.17～18所示。用于扩增人源IL-13的引物如SEQ IDNO.19～20所示。用于扩增人源MMP2的引物如SEQ ID NO.21～22所示。用于扩增人源MMP3的引物如SEQ ID NO.23～24所示。用于扩增人源MMP7的引物如SEQ ID NO.25～26所示。用于扩增人源MMP9的引物如SEQ ID NO.27～28所示。
Western Blot
一些实施例提供的滑膜组织Western Blot检测DPP4或MID1的表达水平的检测方法包括：
将滑膜组织的匀浆液进行10％PAGE凝胶电泳，去除分子量大于180KD或小于25KD的凝胶，转印于PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭1h后，用TBST洗膜4次，切膜后于DPP4的单克隆抗体的一抗液(稀释倍数1:1000)中4℃孵育12～14h。TBST清洗4次，加入二抗液室温孵育1～2h，TBST洗膜4次，曝光和显影。其中，涉及蛋白来源为：GAPDH，60004-1-Ig，Proteintech。DPP4，A1455，ABclonal。MID1，Ab70770，Abcam。鼠抗HA-Tag抗体，AE008，ABclonal。兔抗HA-Tag抗体，AE105，ABclonal。Cy3标记山羊抗小鼠IgG，GB21301，Servicebio。FITC标记的山羊抗兔IgG，GB22303，Servicebio。
DPP4过表达质粒的构建
一些实施例提供的滑膜组织中DPP4过表达质粒的构建方法包括：
1、引物
以人源DPP4(Gene ID:1803)的CDS(NM_001379604.1，CCDS:CCDS92882.1，SEQ IDNO.36)为目的序列，设计并合成如SEQ ID NO.34～35所示的引物对。
2、PCR
以目的序列为模板，以上述如SEQ ID NO.34～35所示的引物对进行PCR扩增。一些实施例提供的PCR扩增体系以50μL计包含：25μL 2×Phanta Flash Master Mix，2.5μL 10μM上游引物，2.5μL 10μM下游引物，5μL 25ng/μL cDNA模板和余量的ddH2O。一些实施例提供的PCR扩增程序为：98℃30s，98℃10s\Tm 5s\72℃4～5s/kb(共28～35个循环)，72℃1min。
3、酶连
将目的序列的PCR扩增产物经电泳和纯化后与pHAGE-CMV-MCS-PGK puroR+Flag(JImmunother Cancer.2023；11(1):e003837)的酶切产物进行连接。
一些实施例中，pHAGE-CMV-MCS-PGKpuroR+Flag的酶切体系以50μL计包含：1μLFastDigestBamH I，1μLFast DigestNot I，5μL 10×Fast Digest Buffer，2.5μg质粒(pHAGE-CMV-MCS-PGKpuroR+Flag)和余量的ddH2O，37℃预热的恒温金属浴上酶切4h，瞬时离心酶切载体产物，加入50μL灭菌水(总体积100μL)，使用Fast Pure Gel DNA ExtractionMini Kit对酶切载体产物进行纯化。
一些实施例中，连接反应体系以5μL计包含：0.5μLExnase II，1μL 5×CE IIBuffer，2μLDPP4的PCR扩增纯化产物，1.5μL纯化后的酶切质粒(pHAGE-CMV-MCS-PGKpuroR+Flag)，混匀后瞬时离心，放37℃预热的恒温金属浴上酶连1h。
4、转化、筛选及提取DPP4过表达质粒
将酶联产物常规方法转入感受态大肠杆菌，于含Amp的LB平板上初步筛选阳性克隆后，进行菌落PCR验证，验证后的阳性转化子进行测序确认。并使用Endo-Free PlasmidMaxi Kit从确认的阳性菌落中提取DPP4过表达质粒。
一些实施例中，菌落PCR的反应体系以20μL计包含：10μL 2×Taq Plus MasterMix(Dye Plus)，0.5μL 10μM上游引物(SEQ ID NO.1)，0.5μL 10μM下游引物(SEQ IDNO.2)，2μL菌液和余量的ddH2O。PCR扩增程序为：95℃5min，95℃15s\60℃15s\72℃60s/kb(共30～35个循环)，72℃1min，4℃保持。
一些实施例中，测序引物为CMV-F(SEQ ID NO.32)和PGK-R(SEQ ID NO.33)。
MID1过表达质粒的构建
实施例提供的MID1过表达质粒构建方法与DPP4过表达质粒的构建方法大致相同。其中，以人源MID1的CDS为目的序列(SEQ ID NO.31)，设计并合成如SEQ ID NO.29～30所示引物对。经PCR扩增得到目的序列插入pHAGE-CMV-MCS-PGKpuroR+HA中，得到MID1过表达质粒。
DPP4过表达稳转细胞的构建
实施例提供的DPP4过表达稳转细胞构建方法包括：
将指数增长期且融合度达95％左右的人成纤维样滑膜细胞系MH7A(购自日本RIKEN细胞库)消化后铺到6孔板内，放至细胞培养箱培养6～8h，细胞贴壁且细胞融合度在60％～70％，弃去培养基，PBS洗一次。加入无血清的DMEM，放至细胞培养箱饥饿培养24h。弃去原来的无血清的DMEM，加入含DPP4过表达质粒和PEI(质粒：PEI＝1μg：2μL)，以pHAGE-CMV-MCS-PGKpuroR+Flag作为对照，混匀，静置15min。弃去培养基，PBS洗一遍，加入新鲜无血清DMEM，放入培养箱继续培养8～10h。弃上清，PBS洗一次。加入500μL胰酶，将消化下来的细胞转移至装有5mLDMEM完全培养基的25T细胞培养瓶中，并加入嘌呤霉素(8μg/mL)进行药筛。每3天更换一次含嘌呤霉素(8μg/mL)的DMEM完全培养基，持续2周，可获得DPP4过表达稳转细胞MH7A。
提取构建的稳转MH7A细胞株的RNA和蛋白质进行qRT-PCR和WesternBlot验证DPP4是否过表达。
一些实施例还提供的了MID1过表达稳转细胞的构建方法，其方法大致同DPP4过表达稳转细胞的构建，将MID1过表达质粒转染人成纤维样滑膜细胞系MH7A细胞，筛选得到MID1过表达稳转细胞。
过表达DPP4质粒转染MID1过表达稳转细胞
实施例提供的过表达DPP4质粒转染MID1过表达稳转细胞的方法包括：
将指数增长期且融合度达95％左右的MID1过表达稳转细胞消化后铺到6孔板内，放至细胞培养箱培养6～8h，细胞贴壁且细胞融合度在60％～70％，弃去培养基，PBS洗一次。提前混匀DPP4过表达质粒和PEI(质粒：PEI＝1μg：2μL)，以pHAGE-CMV-MCS-PGKpuroR+Flag作为对照，静置15min。分别加入6孔板的2个孔内，摇匀，使其覆盖细胞，放入培养箱继续培养30min。每孔各加入1.6mL无血清DMEM，放入培养箱继续培养8～10h。弃上清，PBS洗一次。加入2mL DMEM完全培养基继续培养，即可获得过表达DPP4质粒转染MID1过表达的稳转细胞。
细胞的羧基荧光素二乙酸丁二酰酯(CFSE)标记测试
实施例提供的细胞CFSE标记测试包括：
对处于指数增长期且融合度达到90％左右的细胞进行消化，细胞计数。取1×107个细胞转移至15mL无菌离心管，800rpm，常温离心5min，弃上清。加入5mL PBS洗2次。1mL 37℃预温的PBS重悬细胞，加入4μM的CFSE染色液(CFSE荧光染料，HY-D0938，MedChemExpress)，混匀。37℃避光孵育孵育10min。加入5mL完全培养基冰上放置5min终止染色，常温，800rpm，离心5min，弃上清，重复此步骤。加入5mL PBS重悬细胞，常温，800rpm，离心5min，弃上清。加入5mL PBS重悬细胞，取200μL细胞悬液转移至流式管中，用流式仪488nm激发光检测，并记为母代。剩余细胞则根据测试设计方案，按10万个细胞/mL的密度铺板，并于测试设计相应时间点收集细胞，消化后用流式仪488nm激发光检测。
细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测试
实施例提供的细胞CCK-8测试包括：
对处于指数增长期且融合度达到90％左右的细胞进行消化，细胞计数。根据测试设计的重复孔及时间点，按10万个细胞/mL的密度计算测试所需细胞数。根据计算的测试所需细胞数和细胞密度，计算出需要取的细胞悬液的量，将细胞悬液转移至15mL无菌离心管，常温，800rpm，离心5min，弃上清。DMEM完全培养基重悬细胞，按1万个细胞/孔的密度进行96孔板铺板，按十字交叉法晃动培养板，使细胞铺匀，并放置细胞培养箱内。6～8h后，待细胞贴壁，弃去上清，每孔加入100μL按1：9(CCK-8液：完全培养基，CCK-8增殖试剂盒，40203ES76，翌圣)比例配置的CCK-8工作液。将培养板避光放至37℃恒温培养箱内孵育1～4h，第一次测试时可每间隔30min取出细胞，并使用酶标仪在450nm波长下检测吸光度，选择最佳孵育时间。后续可根据测试方案设计的时间点对吸光度进行检测，并采用上一步选择的最佳孵育时间。
细胞存活率％＝(OD测试组-OD空白对照组)/(OD阴性对照组-OD空白对照组)。
细胞周期测试
实施例提供的细胞周期测试包括：
对处于指数增长期的细胞进行消化，细胞计数。按30万个细胞/mL细胞密度铺6孔板，2mL/孔，根据测试设计分组，每组取相同细胞量。当细胞融合度达100％时，弃上清。2mLPBS洗1次，加入2mL无血清DMEM。饥饿60h后，加入500μL胰酶进行消化，将细胞悬液转移至装有3mL无血清的DMEM的15mL无菌离心管，常温，800rpm，离心5min，弃上清。5mL PBS重悬，取10μL，加入装有90μL PBS的流式管中，流式仪计数。按10万个细胞/mL细胞密度取细胞铺12孔板，1mL/孔，每个测试分组设置3个复孔。另取10万个细胞转移至新的1.5mLEP管，常温，800rpm，离心5min。加入1mL冰上预冷的75％酒精充分吹匀，-20℃低温冰箱固定过夜，记为0h。第一次测试时在铺板8h后每间隔2h设置一个时间点，收集细胞至流式管中，1mL PBS洗1次，加入1mL冰上预冷的75％酒精充分吹匀，-20℃低温冰箱固定过夜。取出固定后的细胞，常温，1500rpm，离心5min，弃上清。加入1mLPBS重悬细胞，常温，1500rpm，离心5min，弃上清。加入200μL周期PI染色工作液(1mg/mL PI 200～500μL+DNase-free RNaseA2mg+Triton X-10010μL+1×PBS定容至10mL)重悬细胞。避光孵育30min，流式检测，使用Modfit LT5对流式周期结果进行拟合分析。
细胞划痕测试
实施例提供的细胞划痕测试包括：
对处于指数增长期的细胞进行消化，细胞计数。按30万个细胞/mL细胞密度铺6孔板，2mL/孔，根据测试设计分组，每组取相同细胞量。当细胞融合度达100％时，弃上清。2mLPBS洗1次，加入2mL无血清DMEM。饥饿60h后，用200μL枪头在孔板内轻轻划出一条直线。2mLPBS洗2次，加入2mL无血清DMEM，立即捕获图像，并在48h后再次捕获图像，计算所划出的直线闭合百分比。
细胞迁移测试
实施例提供的细胞细胞迁移测试包括：
对处于指数增长期的细胞进行消化，细胞计数。按30万个细胞/mL细胞密度铺6孔板，2mL/孔，根据测试设计分组，每组取相同细胞量。当细胞融合度达100％时，弃上清。2mLPBS洗1次，加入2mL无血清DMEM。饥饿48h后，加入500μL胰酶进行消化，将细胞悬液转移至装有3mL无血清的DMEM的15mL无菌离心管，常温，800rpm，离心5min，弃上清。5mL PBS重悬，取10μL，加入装有90μL PBS的流式管中，流式仪计数。取出所需细胞量(按5万个细胞/孔密度，每个测试分组设置3个复孔计算)，并转至新的15mL无菌离心管，常温，800rpm，离心5min，弃上清。用无血清DMEM按200μL/孔重悬细胞，并将细胞悬液加入24孔上室(货号3422，Costar)中，下室则加入DMEM完全培养基700μL/孔，将培养板放入CO2恒温细胞培养箱中。36h后，取出上室，PBS洗3次。
10)将上室浸泡于4％多聚甲醛中，对细胞进行固定30min，PBS洗3次。1％结晶紫染色30min，PBS洗3次，并用棉签轻轻擦拭上室上表面，去除上室上表面残留的细胞。将上室放至干净的24孔板内，放至干燥箱内烘干，显微镜下拍照。
细胞侵袭测试
实施例提供的细胞侵袭测试包括：
对处于指数增长期的细胞进行消化，细胞计数。按30万个细胞/mL细胞密度铺6孔板，2mL/孔，根据测试设计分组，每组取相同细胞量。当细胞融合度达100％时，弃上清。2mLPBS洗1次，加入2mL无血清DMEM。饥饿48h后，加入500μL胰酶进行消化，将细胞悬液转移至装有3mL无血清的DMEM的15mL无菌离心管，常温，800rpm，离心5min，弃上清。5mL PBS重悬，取10μL，加入装有90μLPBS的流式管中，流式仪计数。取出所需细胞量(按5万个细胞/孔密度，每个测试分组设置3个复孔计算)，并转至新的15mL无菌离心管，常温，800rpm，离心5min，弃上清。用无血清DMEM按200μL/孔重悬细胞，并将细胞悬液加入24孔上室(需提前一天用Matrigel胶制备含凝胶的培养皿上室)中，下室则加入DMEM完全培养基700μL/孔，将培养板放入CO2恒温细胞培养箱中。36h后，取出上室，PBS洗3次。将上室泡在4％多聚甲醛中，对细胞进行固定30min，PBS洗3次。1％结晶紫染色30min，PBS洗3次，并用棉签轻轻擦拭上室上表面，去除上室上表面残留的细胞。将上室放至干净的24孔板内，放至干燥箱内烘干，显微镜下拍照。
体内皮下移植测试
本测试所有动物测试均按照华中科技大学动物爱护与使用委员会的伦理标准进行(批准编号：TJH-202206052)。雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)重度免疫缺陷小鼠购自上海南模生物。
对于皮下移植模型：将5×106DPP4过表达稳转细胞、MID1过表达稳转细胞或DPP4和MID1稳转细胞分别注射入小鼠右上肢腋窝皮下。定期监测小鼠的体重和体积，当皮下移植物体积达到100～200mm3时对小鼠进行安乐死。14周后对皮下肿块称重，拍照，4％多聚甲醛固定，脱水包埋，及后续组织学染色。
DPP4抑制RA-FLS的增殖
为了评估DPP4在类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLS)中的生物学意义，如图1A和1B所示，实施例成功构建了DPP4过表达的MH7A细胞系。如图1C和1D所示，羧基荧光素二乙酸丁二酰酯(CFSE)标记和细胞计数试剂盒-8(CCK-8)显示DPP4过表达抑制MH7A的增殖如图1E所示，DPP4过表达降低MH7A细胞G1/S期转变。
为了对体外研究结果进行补充，实施例还将DPP4过表达的MH7A细胞皮下异种移植小鼠。如图2A～F所示，对照组中，DPP4缺失显著促进了MH7A异种移植物的增殖。与对照组相比，过表达DPP4的MH7A细胞皮下异种移植物的质量、重量、体积和Ki67阳性细胞的比例都有所降低。
这些结果均表明，DPP4能够抑制MH7A细胞(RA-FLS)增殖。
DPP4抑制RA-FLS的侵袭迁移
上述结果得出DPP4在类风湿关节炎滑膜组织中显著升高，为了了解DPP4的异常表达对类风湿关节炎，尤其是对类风湿关节炎滑膜组织的影响。接下来将评估DPP4对RA-FLS细胞系MH7A的生物学影响。
如图3A～C，过表达DPP4可减弱MH7A的迁移和侵袭。如图3D所示，DPP4过表达能够降低MH7A细胞中MMP2、MMP3、MMP7和MMP9的mRNA水平。总之，这些结果强调了DPP4在MH7A迁移和侵袭中的抑制作用。
DPP4降低促炎炎症因子分泌进而减轻胶原诱导的关节炎
如图4A所示，对蛋白-蛋白相互作用网络的分析表明，DPP4与RA相关的炎症因子之间存在密切关联。如图4B-C，在MH7A细胞中，DPP4过表达能够促炎炎症因子(IL-1β、IL-13、IL-6、IL-8)的分泌。这些数据验证了DPP4在抑制MH7A炎症炎症因子产生中的作用。
本研究采用与Jackson测试室签订合同使用CRISPR-Cas9技术生成的DPP4-/-小鼠进一步验证体内DPP4在类风湿关节炎发生发展中发挥的作用。使用Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂免疫野生型C57BL/6(WT)和C57BL/6背景的DPP4-/-小鼠，建立胶原诱导的关节炎模型(图4D)。
在胶原诱导的关节炎小鼠模型中，每只小鼠(包括野生型C57BL/6和DPP4-/-)接种100μL含有2mg/mL鸡Ⅱ型胶原和2mg/mL完全弗氏佐剂的混合物。在第0天和第21天分别在距离尾根1～2cm的皮下注射该混合物，并于第40天在背部皮下注射该混合物以建立关节炎模型小鼠。每周观察小鼠的体重和足爪红肿情况。对小鼠进行安乐死后取四肢固定于4％多聚甲醛中，在EDTA脱钙液中进行脱钙，每3天更换一次脱钙液，共脱钙21天，脱水包埋，及后续组织学分析。小鼠的关节炎临床评分最高16分，每个爪子最高4分。正常关节0分，只有1根手指轻微肿胀1分，关节炎涉及2个关节2分，涉及两个以上关节3分，整个爪子严重关节炎4分。
如图4E～G，与WT小鼠相比，DPP4缺陷(DPP4-/-)小鼠表现出更高的关节炎评分和更严重的关节炎。而两组间体重无显著差异。这些观察结果强调了DPP4对胶原诱导关节炎的影响。
MID1特异性降解DPP4
为此，实施例将DPP4过表达质粒引入稳定过表达HA标记的MID1的MH7A细胞中，通过WesternBlot和qRT-PCR检测MID1和DPP4的表达，结果如图5A和5B所示，DPP4过表达质粒引入后，DPP4的表达升高。
如图5C～D所示，DPP4过表达抑制了MID1诱导的细胞增殖，阻碍了MID1介导的细胞G1/S期转变。
如图5E～F所示，过表达DPP4可减弱MID1诱导的细胞迁移和侵袭。
如图5G～H所示，DPP4过表达在MID1过表达细胞中导致MMPs(MMP2、MMP3、MMP7和MMP9)和促炎炎症因子(IL-1β、IL-13、IL-6和IL-8)mRNA表达降低。
以上结果表明，DPP4能够与MID1靶向作用，以抑制RA-FLS增殖、迁移和侵袭，并且还能抑制MID1过表达引起的炎症因子和MMPs表达分泌。
DPP4抑制RA发展
通过将过表达MID1细胞或稳定过表达MID1和DPP4的MH7A细胞皮下注射至NSG小鼠右上侧，构建异种移植物模型。采集MH7A异种移植物肿块并成像以评估肿块体积、质量，绘制肿块生长曲线，并对获取的组织进行H&E、Ki67、DPP4(P<0.001)染色。
结果如图6A～D所示，DPP4过表达抑制了过表达MID1的MH7A异种移植物的生长，这可以通过Ki67表达的减少和移植物重量和体积的减少来证明。
由此可见，DPP4本身可以作为药物抑制类风湿性关节炎，并阻断MID1介导的促进滑膜细胞增殖作用和促进类风湿关节炎疾病进展作用。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.类风湿性关节炎的标志物，所述标志物为DPP4。
2.DPP4作为类风湿性关节炎诊断标志物在制备类风湿性关节炎诊断试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述诊断试剂或诊断试剂盒检测体外样本中DPP4基因或蛋白表达水平，所述表达降低提示所述体外样本的个体患有类风湿性关节炎。
4.根据权利要求3所述的应用，所述体外样本为含有个体滑膜组织或滑液的样本。
5.根据权利要求2所述的应用，所述诊断试剂或试剂盒包括特异性扩增DPP4的引物，所述的引物包括如SEQ ID NO.1～2所示的DNA分子，和/或如SEQ ID NO.3～4所示的DNA分子。
6.根据权利要求2所述的应用，所述诊断试剂或试剂盒包括DPP4的单克隆抗体。
7.DPP4作为类风湿性关节炎治疗靶点在制备治疗类风湿性关节炎药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，所述药物为DPP4、或用以增强DPP4基因或蛋白表达水平或含量的试剂。
9.根据权利要求8所述的用途，所述试剂包括如SEQ ID NO.36所示的目的序列或携带如SEQ ID NO.36所示的目的序列的质粒。
10.一种类风湿性关节炎治疗药物，包括DPP4，所述DPP4以MID1为药物作用靶点。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070196835A1 (en) * 2005-09-27 2007-08-23 Danute Bankaitis-Davis Gene expression profiling for identification monitoring and treatment of rheumatoid arthritis

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