CN118176204A - 截短的流感神经氨酸酶及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了缺少全部或基本上全部茎区的、当在宿主细胞中表达时形成活性可溶性四聚体神经氨酸酶的经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶分子，以及包含所述四聚体神经氨酸酶或编码当在细胞中表达时形成四聚体NA的所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶分子的核酸的疫苗组合物。还提供了使用所述疫苗组合物以针对流感病毒对受试者进行疫苗接种或使受试者对流感病毒免疫的方法。

Description

截短的流感神经氨酸酶及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年8月11日提交的美国临时专利申请号63/231,790的权益，并依赖于其申请日期，将其全部公开内容通过引用并入本文。

背景技术

流感是由主要攻击上呼吸道(鼻、喉)和支气管以及很少还有肺的病毒引起的。感染通常持续约一周。它的特征在于突发高烧、肌痛、头痛和严重不适、无痰干咳、咽喉痛和鼻炎。大多数人在一到两周内康复，不需要任何药物治疗。然而，在非常年轻的人、老年人和患有医学病症(如肺部疾病、糖尿病、癌症、肾脏或心脏问题)的人中，流感构成了严重的风险。在这些人中，感染可导致基础疾病的严重并发症、肺炎和死亡，即使是健康的成年人和年龄较大的儿童也会受到影响。每年的季节性流感流行被认为会导致全世界每年三百万与五百万例之间的严重疾患和在250,000与500,000例之间的死亡。

流感病毒是正粘病毒科的成员。流感病毒存在三种主要亚型，分别为甲型流感、乙型流感和丙型流感。流感病毒体含有分段的负义RNA基因组，所述基因组编码以下蛋白质：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质(M1)、质子离子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)和非结构蛋白2(NS2)。HA、NA、M1和M2是膜相关的，而NP、PB1、PB2、PA和NS2是核衣壳相关蛋白。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，分别主要负责病毒附着和病毒颗粒渗透到细胞中并且从细胞释放。

HA和NA蛋白两者都是病毒中和和保护性免疫的主要免疫优势表位的来源，使得HA和NA蛋白成为预防性流感疫苗的重要组分。流感病毒的基因组成允许频繁的微小遗传变化，称为抗原漂移。因此，流感的主要抗原(包括HA和NA)的氨基酸序列在某些组、亚型和/或毒株之间是高度可变的。出于这个原因，每年都推荐使用当前的季节性流感疫苗，并且需要每年进行监测，以说明HA和NA蛋白中的突变(抗原漂移)并且匹配快速进化的病毒株。

流感NA是同四聚体II型跨膜糖蛋白，其中每个单体具有球状头部结构域、茎区、疏水性跨膜结构域和短的N末端胞质结构域。头部结构域的四聚化对于酶活性位点和唾液酸酶活性的形成是重要的，所述唾液酸酶活性对于从感染细胞释放新病毒颗粒是必需的。唾液酸酶活性对于病毒穿过宿主中的粘液屏障也显现出重要性。头部结构域也是NA最具免疫相关性的部分。针对流感NA头部区的抗体可以阻断NA的酶活性并且干扰病毒发病机制，尤其是干扰细胞至细胞的扩散和传播。

已经研究了通过蛋白水解或用洗涤剂溶解病毒膜获得的重组NA或纯化NA，用于结构、酶和免疫学分析。如果期望将可溶形式的NA用作免疫原，则NA分子必须在没有锚定跨膜区的情况下表达，这经常导致有助于将NA分子保持在其四聚体形式的稳定力的丧失。没有跨膜区以及将HA蛋白嵌入膜中的能力，四聚体NA头部的稳定性受损，导致部分拆解和免疫原性丧失。此外，NA茎和相关跨膜结构域的二级和三级结构是未知的，使得基于天然结构的合理蛋白质工程化方法复杂化。

因此，可溶性四聚体NA在细胞中的表达，特别是可溶性四聚体NA以高产率和/或在与治疗性重组蛋白的大规模生产相容的适当宿主细胞中的表达，是非常具有挑战性的。这些挑战部分源于从重组NA构建体装配四聚体NA受损，主要导致表达出无活性的可溶性单体和二聚体或包涵体(大的蛋白质聚集体，其对生物活性蛋白的大规模生产的回收构成重大挑战)，并且活性四聚体NA几乎没有表达。Mather等人,1992,Virus Res.,26:127-39；Castrucci等人,J.Virology,1993,67(2):759-64；Martinet,Eur.J.Biochem.,1997,247:332-38；Yongkiettrakul等人,2011,J.Virological Methods,156:44-51；Romanik等人,2012,FEBS Journal,279(增刊1):52-576,339。在一种情况下，制备了重组截短的NA，当在昆虫细胞中表达时，所述重组截短的NA产生了四聚体NA、二聚体NA和单体NA的混合群体，然而，从A/Victoria/3/1975流感毒株的NA产生的这种特异性构建体缺少NA蛋白的氨基酸1-45(即，胞质尾、跨膜区和仅茎区的前几个氨基酸)。DeRoo等人,Vaccine,1996,14(6):561-69。对DeRoo等人使用的A/Victoria/3/1975流感毒株的进一步研究表明，当去除基本上全部茎区时(即，缺少NA蛋白的氨基酸1-78或1-79的重组构建体)，当在昆虫细胞中表达时，仅产生单体NA。Martinet,Eur.J.Biochem.,1997,247:332-38。通过蛋白水解或洗涤剂溶解从病毒膜纯化的病毒NA是不稳定的，并且迅速失去酶活性。Schmidt等人,PLos ONE,2011,6(2):e16284。

为了克服这些挑战，本领域传授了使用全长异源四聚化结构域与NA头部区融合以制备形成四聚体NA的可溶性重组NA。Schmidt等人,PLos ONE,2011,6(2):e16284；Da Silva等人,J Biol Chem,2013,288(1):644-53；Dai等人,2016,J.Virology,90(20):9457-70；Bosch等人,2010,J.Virology,84(19):10366-74；Prevato等人,2015,PLos ONE,10(8):e0135474。已经表明，跨膜和茎结构域在稳定NA的头部区中的结构作用可以通过使用形成四螺旋束的全长异源四聚化结构域来模拟。这并不意味着天然茎结构域形成四螺旋束。如果是这样，那么使用生物信息学算法可以容易地预测结构，而事实并非如此，所述结构可以使用x射线晶体学和/或冷冻电子显微术来证明。虽然全长异源四聚化结构域提供了用于产生可溶性四聚体NA的便利的重组工具，但是在重组蛋白中使用全长异源四聚化结构域具有诱导针对外源四聚化结构域的免疫应答的潜力。

需要新的重组流感NA蛋白(和编码其的核酸)以帮助有效控制季节性流感感染并且避免大流行爆发，特别是可以在不使用全长异源寡聚化序列的情况下在细胞中表达以产生免疫原性四聚体NA的重组流感NA蛋白。

发明内容

本申请公开了经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶构建体，其缺少胞质尾、跨膜区和全部或基本上全部茎区，当在宿主细胞中表达时形成活性的可溶性四聚体神经氨酸酶。本申请中公开的重组设计策略允许大规模生产重组四聚体NA，允许对新出现的变体流感毒株的快速和灵活的反应。

第一方面涉及经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶(NA)，其包含流感病毒亚型2NA的头部区，其中所述流感病毒亚型2NA的胞质尾、跨膜区和全部或基本上全部茎区已经从所述经修饰的单体流感病毒亚型2NA中去除，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2NA不包括异源寡聚化结构域，并且其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2NA在细胞中的表达导致四聚体NA的分泌。在某些实施方案中，所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶包含信号肽，并且所述流感病毒亚型2NA的胞质尾、跨膜区以及全部或基本上全部茎区已被所述信号肽替代。第一方面还涉及编码所述经修饰的单体流感病毒亚型2NA的人工核酸。在本申请的整个公开文本中进一步详细描述了该第一方面的各种特征和实施方案。

第二方面涉及四聚体神经氨酸酶(NA)，其中所述四聚体NA包含经修饰的单体流感病毒亚型2NA的四个拷贝，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2NA包含流感病毒亚型2NA的头部区，但不包括1)所述流感病毒亚型2NA的胞质尾、跨膜区和全部或基本上全部茎区和2)异源寡聚化结构域。在本申请的整个公开文本中进一步详细描述了该第二方面的各种特征和实施方案。

第三方面涉及疫苗组合物，所述疫苗组合物包含所述四聚体NA(第二方面)或编码所述经修饰的单体流感病毒亚型2NA的人工核酸分子(第一方面)。所述疫苗组合物还可以包含佐剂。所述疫苗组合物可以进一步包含流感病毒血凝素。在某些实施方案中，所述流感病毒血凝素来自与所述经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶不同或不匹配的流感毒株。在本申请的整个公开文本中进一步详细描述了该第三方面的各种特征和实施方案。

第四方面涉及产生所述四聚体NA(第二方面)的体外方法，其中所述方法包括：在细胞培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞含有编码所述经修饰的单体流感病毒亚型2NA的人工核酸(第一方面)；以及在所述宿主细胞中表达所述经修饰的单体流感病毒亚型2NA，其中在所述经修饰的单体流感病毒亚型2NA表达后，所述宿主细胞上清液包含所述四聚体NA(第二方面)。所述方法还可以进一步包括纯化所分泌的四聚体NA以产生纯化的流感病毒亚型2四聚体NA的步骤。在本申请的整个公开文本中进一步详细描述了该第四方面的各种特征和实施方案。

第五方面涉及使受试者对流感病毒免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫有效量的所述疫苗组合物(第三方面)。在本申请的整个公开文本中进一步详细描述了该第五方面的各种特征和实施方案。

第六方面涉及针对流感病毒对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效针对流感病毒对所述受试者进行疫苗接种的一定量的所述疫苗组合物(第三方面)。在本申请的整个公开文本中进一步详细描述了该第六方面的各种特征和实施方案。

第七方面涉及使用所述疫苗组合物(第三方面)的其他方法，所述方法包括诱导针对流感病毒NA的免疫应答的方法、预防流感病毒病的方法和减少流感病毒感染的一种或多种症状(如体重减轻或体温升高(发烧))的方法。在本申请的整个公开文本中进一步详细描述了该第六方面的各种特征和实施方案。

前面的总体发明内容和下面的具体实施方式是示例性和解释性的，而非对权利要求的限制。

附图说明

并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图展示了某些实施方案，并且与书面描述一起解释了本文所公开的神经氨酸酶分子、组合物和方法的某些原理。

图1示出了野生型(“WT”)亚型2流感神经氨酸酶(“N2”)的示意图，其具有短的N末端胞质尾、跨膜区、茎区和头部区；以及先前描述的重组N2，其中胞质尾、跨膜区以及基本上全部茎区被信号肽(aka，分泌信号)、组氨酸标签和全长异源四臂(tetrabrachion)四聚化结构域(“tetNA”)替代。图1还包括工程化N2的示意图，其中胞质尾和跨膜区被信号肽(aka，分泌信号)和任选的组氨酸标签替代(“dTM36”)；dTM36含有N2的整个茎和头部区。图1中的最后一个示意图是示例性的工程化N2，其中胞质尾、跨膜区和基本上全部茎区被信号肽(aka，分泌信号)和任选的组氨酸标签替代(“dTM75”)。图1中的6HIS标签对应于SEQ ID NO:135。

图2示出了转染后在细胞中表达的来自37种不同亚型2流感毒株的dTM75变体的结合结果和NA酶活性。将从包含全长异源四臂四聚化结构域的经修饰的A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016NA表达的四聚体NA用作阳性对照。

图3A示出了在dTM75高通量筛选测定中测试的100种亚型2流感毒株的神经氨酸酶序列图，具有相对于其他毒株簇示出更高的NA序列相似性的毒株簇。

图3B示出了按分离毒株的年份排列的毒株簇。

图3C-图3D示出了来自100种亚型2流感毒株的dTM75变体的高通量筛选的结合结果(C)和NA酶活性(D)。示出了前37个dTM75结合者。

图4示出了来自三种毒株的一系列依序茎缺失变体的结合结果：A/PERTH/16/2009(PERT09)、A/BELGIUM/4217/2015(BELG15)和A/KANSAS/14/2017(KANS17)。对于PERT09、BELG15和KANS17，N2依序茎缺失变体包括从氨基酸60开始并且延伸至氨基酸90的神经氨酸酶茎区的缺失。PERT09 NA(SEQ ID NO:65)、BELG15 NA(SEQ ID NO:5)和KANS17 NA(SEQ ID NO:45)的氨基酸59-94(dTM60-dTM95)在图4中示出。圆圈的直径示出经修饰的茎缺失变体NA分子结合的量。图4按出现顺序分别公开了SEQ ID NO136-138。

图5示出了在从PERT09、BELG15、KANS17、A/Peru/4617/2017(PERU17)和A/Texas/71/2017(TEX17)大规模生产dTM75构建体之后纯化的NA蛋白的尺寸排阻色谱联用多角度光散射(SEC-MALS)分析。上图示出了样品中四聚体NA的百分比，而下图示出了样品中dTM75NA的分子量(MW)，其中单体dTM75具有约60kD的MW，并且四聚体dTM75具有约210kD的MW，如实施例4中所讨论的。KANS17 dTM75在两个峰中洗脱，池1(单体)和池2(四聚体)，并且其他dTM75构建体在包含四聚体NA的单峰中洗脱。

图6示出了在dTM75变体和tet-NA构建体的大规模生产和纯化后，来自PERT09、BELG15、KANS17、PERU17和TEX17的dTM75变体和tet-NA构建体的四聚体NA％、热稳定性、结合和酶活性。

图7示出了在大规模生产和纯化tet-NA构建体和dTM变体后，PERT09 tet-NA构建体和PERT09茎截短的变体dTM75、dTM74、dTM73、dTM72和dTM71的纯度、热稳定性、酶活性(dTM与tet-NA的MUNANA比率)和结合(dTM与tet-NA的比率)。

图8A示出了小鼠的给药方案。在第0天用初免剂量的重组N2蛋白(加佐剂)肌内(IM)免疫小鼠，随后在第21天用加强剂量的重组N2蛋白(加佐剂)免疫小鼠，并且在第35天收集血清，如实施例6中所述。

图8B示出了如图8A中所示施用至小鼠的PERT09、BELG15和KANS17 dTM75和tet-NA蛋白的免疫原性，如实施例6中所述。用来自KANS17 dTM75的池1的单体重组NA制剂或来自PERT09 dTM75、BELG17 dTM75、tet-NA或KANS17 dTM75的池2的四聚体重组NA蛋白制剂免疫小鼠。通过ELLA测量针对表达同源全长NA的H6N2重配病毒的NAI应答，并且表示为IC50。通过ELISA测量针对同源tet-NA(作为包被抗原)的IgG特异性NA应答，并且表示为EC50(50％最大有效浓度)。将单独的动物滴度归一化(Log2)并绘制为箱形图，其中数字代表组平均滴度。虚线指示测定的检测下限。

图9A示出了小鼠的给药方案。在第0天用初免剂量的重组N2蛋白(加佐剂)肌内(IM)免疫小鼠，随后在第21天用加强剂量的重组N2蛋白(加佐剂)免疫小鼠，并且在第35天收集血清，如实施例6中所述。

图9B示出了如图9A所示施用至小鼠的截短的PERT09 dTM75、dTM74、dTM73、dTM72和dTM71 N2蛋白的免疫原性，如实施例6中所述。通过ELISA测量针对同源tet-NA的IgG特异性NA应答，并且表示为EC50(50％最大有效浓度)。通过ELLA测量针对表达同源全长NA的H6N2重配病毒的NAI应答，并且表示为IC50。将单独的动物滴度归一化(Log2)并绘制为箱形图，其中数字代表组平均滴度。虚线指示测定的检测下限，而阴影区域代表tet-NA对照蛋白的4倍内的滴度。

图10A示出了预免疫雪貂的给药方案。在第0天用初免剂量的表达目的野生型NA的流感H1N2重配病毒鼻内免疫雪貂，随后肌内施用加强剂量的无佐剂的同源重组NA(dTM75或tet-NA)。如实施例7中所述，在第42天收集血清。

图10B示出了施用至预免疫雪貂的PERT09、BELG15和KANS17 dTM75和tet-NA蛋白的免疫原性，如实施例7中所述。通过ELLA测量针对表达同源全长NA的H6N2重配病毒的NAI应答，并且表示为IC50。通过ELISA测量针对同源tet-NA的IgG特异性NA应答，并且表示为EC50(50％最大有效浓度)。将单独的动物滴度归一化(Log2)并绘制为箱形图，其中数字代表组平均滴度。虚线指示测定的检测下限。“模拟”对照是仅在第0天用H1N2病毒预免疫但在第21天未用重组NA加强的组。

图11示出了SEQ ID NO:1-133的氨基酸序列。

图12A示出了在初试雪貂中用2个剂量的截短的PERT09 dTM75免疫接种、随后用PERT09 H3N2流感病毒攻击后的研究终点(血清学抗体应答和针对感染的保护和/或疾病严重程度)，如实施例8中所述。

图12B示出了初试雪貂研究的给药方案。如表4和实施例8中所述，在第0天，在有和没有佐剂的情况下，用初免剂量的重组N2蛋白(dTM75或tet-NA)肌内(IM)免疫初试雪貂，随后在第21天，在有和没有佐剂的情况下，用加强剂量的重组N2蛋白(dTM75或tet-NA)肌内免疫。然后如实施例8中所述，在第43天用PERT09 H3N2鼻内攻击初试雪貂。在第20、42和57天收集血清。

图13示出了在初免后(第20天)、加强后(第42天)和攻击后(第57天)，由雪貂血清中的NAI抗体滴度指示的PERT09 dTM75和对照蛋白的免疫原性，如实施例8中所述。通过ELLA测量针对表达同源全长NA的H6N2重配病毒的NAI应答，并表示为如实施例6中对于小鼠所述的50％最大抑制浓度(IC50)。示出了单独的动物滴度，其中数字代表每组的平均滴度。

图14示出了在初免后(第20天)、加强后(第42天)和攻击后(第57天)，由雪貂血清中的NA结合抗体滴度(ELISA)指示的PERT09 dTM75和对照蛋白的免疫原性，如实施例8中所述。通过ELISA测量针对同源tet-NA(作为包被抗原)的IgG特异性NA应答，并且表示为如实施例6中对于小鼠所述的EC50(50％最大有效浓度)。示出了单独的动物滴度，其中数字代表每组的平均滴度。

图15示出了描绘H3N2流感病毒攻击先前用2个剂量的PERT09 dTM75免疫的初试雪貂后，由体温峰值变化(摄氏度)和体重峰值变化(变化百分比)指示的病毒脱落(AUC)和疾病严重程度的图，如实施例8中所述。还示出了来自对照组的结果。

图16示出了在H3N2流感病毒攻击先前用2个剂量的PERT09 dTM75免疫的初试雪貂后，以AUC(平均值、范围和平均差/p值用于成对比较)测量的总病毒脱落的减少，如实施例8中所述。还示出了来自对照组的结果。

图17示出了在H3N2流感病毒攻击先前用2个剂量的PERT09 dTM75免疫的初试雪貂后，以相对于攻击前基线的体温变化(平均值、范围和平均差/p值用于成对比较)测量的体温峰值变化的减少，如实施例8中所述。还示出了来自对照组的结果。

图18示出了在H3N2流感病毒攻击先前用2个剂量的PERT09 dTM75免疫的初试雪貂后，以相对于攻击前基线的体重变化％(按治疗组的平均值、范围和体重变化％分布)测量的体重峰值减轻的减少，如实施例8中所述。还示出了来自对照组的结果。

图19示出了在初免后(第20天)、加强后(第42天)和攻击后(第57天)，由雪貂血清中的NAI抗体滴度指示的PERT09 dTM75、SING16-rHA、以及PERT09 dTM75和SING16-rHA的组合的免疫原性，如实施例9中所述。通过ELLA测量针对表达同源全长NA的H6N2重配PERT09病毒的NAI应答，并且表示为如实施例6中对于小鼠所述的50％最大抑制浓度(IC50)。每个符号代表组(n＝9)内每个个体雪貂的NAI滴度。条形图和条内的数字代表具有95％ CI的几何平均值。“ns”表明没有显著差异。

图20示出了在初免后(第20天)、加强后(第42天)和攻击后(第57天)，由雪貂血清中的NA结合抗体滴度(ELISA)指示的PERT09 dTM75、SING16-rHA、以及PERT09 dTM75和SING16-rHA的组合的免疫原性，如实施例9中所述。通过ELISA测量针对同源PERT09 tet-NA(作为包被抗原)的IgG特异性NA应答，并且表示为如实施例6中对于小鼠所述的EC50(50％最大有效浓度)。每个符号代表组(n＝9)内每个个体雪貂的ELISA滴度。条形图和条内的数字代表具有95％ CI的几何平均值。“ns”表明没有显著差异。

图21示出了在初免后(第20天)、加强后(第42天)和攻击后(第57天)，由雪貂血清中的SING16 HAI滴度指示的PERT09 dTM75、SING16-rHA、以及PERT09 dTM75和SING16-rHA的组合的免疫原性，如实施例9中所述。每个符号代表组(n＝9)内每个个体雪貂的HAI滴度。条形图和条内的数字代表具有95％ CI的几何平均值。“ns”表明没有显著差异。

图22示出了在初免后(第20天)、加强后(第42天)和攻击后(第57天)，由雪貂血清中的PERT09 HAI滴度指示的PERT09 dTM75、SING16-rHA、以及PERT09dTM75和SING16-rHA的组合的免疫原性，如实施例9中所述。每个符号代表组(n＝9)内每个个体雪貂的HAI滴度。条形图和条内的数字代表具有95％ CI的几何平均值。“ns”表明没有显著差异。

图23A-图23C示出了H3N2流感病毒攻击先前用2个剂量的PERT09 dTM75、2个剂量的SING16 rHA、或2个剂量的PERT09 dTM75和SING16 rHA的组合免疫的初试雪貂后体重的降低，如实施例9中所述。还示出了来自对照组的结果。线展示了图例中指示的给定组的体重随时间(14天)的平均变化百分比。用5μg+AF03(图23A)或45μg(图23B)免疫的组的数据在两个图之间分开，并且每个图中呈现的PBS和PERT09预感染对照组源自相同的研究。对于体重减轻峰值的比较(图23C)，在条形图旁边描绘了每组的平均值，每个符号代表组内(n＝9)每个个体雪貂的体重减轻值。条形图和条内的数字代表平均值，并且误差条代表SEM。组之间的统计学上显著的差异由*表示，并且使用ANOVA的成对比较、随后使用图基检验(p值从0.0001至0.005)来估计。

图24A-图24C示出了描绘H3N2流感病毒攻击先前用2个剂量的PERT09 dTM75、2个剂量的SING16 rHA、或2个剂量的PERT09 dTM75和SING16 rHA的组合免疫的初试雪貂后病毒脱落的强度和持续时间的图，如实施例9中所述。还示出了来自对照组的结果。线展示了图例中指示的给定组的滴度的平均值。用5μg+AF03(图24A)或45μg(图24B)免疫的组的数据在两个图之间分开，并且每个图中呈现的PBS和PERT09预感染对照组源自相同的研究。图24C示出了总病毒脱落(AUC)和第45天的病毒脱落。

图25A示出了在H3N2流感病毒攻击后第0-8天鉴定具有可检测病毒的雪貂数量的时间过程。

图25B示出了H3N2流感病毒攻击先前用2个剂量的PERT09 dTM75、2个剂量的SING16 rHA、或2个剂量的PERT09 dTM75和SING16 rHA的组合免疫的初试雪貂后，在AM和PM以相对于攻击前基线的体温变化测量的体温峰值变化的增加，如实施例9中所述。还示出了来自对照组的结果。对于体温峰值，每组的平均值呈现在条形图上，每个符号代表组内(n＝9)每个个体雪貂的峰值，条内的数字代表平均值，并且误差条呈现为SEM。

具体实施方式

A.定义

为了更容易理解本公开文本，首先在下面定义某些术语。以下术语和其他术语的另外的定义可以通过说明书来阐述。如果下文阐述的术语的定义与通过引用并入的申请或专利中的定义不一致，则应使用本申请中阐述的定义来理解所述术语的含义。

除非上下文另有明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”包括复数指示物。因此，例如，对“一种方法”的提及包括一种或多种方法、和/或本文所述的和/或在阅读本公开文本之后对于本领域技术人员而言将变得清楚的类型的步骤等等。

在权利要求中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等的序数术语来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素比另一个权利要求要素的任何优先权、优先或顺序，或者进行方法的行为的时间顺序，而是仅用作标签，以区分具有特定名称的一个权利要求要素与具有相同名称(但是使用序数术语)的另一个要素以区分权利要求要素。

抗原：如本文所用，术语“抗原”是指引发免疫应答的因子；和/或(ii)当暴露或施用至生物体时由T细胞受体结合的因子(例如，当由MHC分子呈递时)或与抗体(例如，由B细胞产生)结合的因子。在一些实施方案中，抗原在生物体中引发体液应答(例如，包括抗原特异性抗体的产生)；可替代地或另外地，在一些实施方案中，抗原在生物体中引发细胞应答(例如，涉及其受体与抗原特异性相互作用的T细胞)。本领域技术人员将理解，特定抗原可以在靶标生物体(例如，小鼠、兔、灵长类动物、人)的一个或几个成员中引发免疫应答，但是不能在靶标生物体物种的所有成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原在靶标生物体物种的至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原与抗体和/或T细胞受体结合，并且在生物体中可能诱导或可能不诱导特定生理应答。在一些实施方案中，例如，抗原可以在体外与抗体和/或T细胞受体结合，无论在体内是否发生这种相互作用。在一些实施方案中，抗原与特定体液或细胞免疫的产物(包括由异源免疫原诱导的那些)反应。抗原包括如本文所述的截短的NA和由其形成的四聚体NA。

大约：如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与所陈述的参考值类似的值。在一些实施方案中，除非另外陈述或者上下文另有明确含义，否则术语“大约”或“约”是指落在所陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围(这个数字会超过可能值的100％的情况除外)。

人工核酸分子：如本文所用，人工核酸分子典型地可以理解为非天然存在的核酸分子，例如DNA或RNA。换句话说，人工核酸分子可以理解为非天然核酸分子。这种核酸分子由于其单独的序列(其是非天然存在的)和/或由于其他修饰(例如，非天然存在的核苷酸结构修饰)可以是非天然的。人工核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或包含DNA和RNA部分的杂交分子。典型地，可以通过基因工程方法设计和/或产生人工核酸分子以对应于期望的核苷酸的人工序列(异源序列)。此外，术语“人工核酸分子”不限于意指“一个单一分子”，而是典型地理解为包含相同分子的集合。因此，它可以涉及包含在等分试样中的多个相同的分子。

载体：如本文所用，术语“载体”是指与组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。在一些示例性实施方案中，载体可以包括无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些实施方案中，载体是或包括一种或多种固体组分。

表位：如本文所用，术语“表位”包括全部或部分地被免疫球蛋白(例如，抗体或受体)结合组分特异性识别的任何部分。在一些实施方案中，表位由抗原上的多个化学原子或基团构成。在一些实施方案中，当抗原采用相关的三维构象时，此类化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施方案中，当抗原采用这种构象时，此类化学原子或基团在空间上物理上彼此靠近。在一些实施方案中，当抗原采用可替代构象(例如被线性化)时，至少一些此类化学原子或基团在物理上彼此分离。

赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指可以包含在药物组合物中例如以提供或有助于所需的稠度或稳定作用的任何非治疗剂。合适的药物赋形剂包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。

糖基化：如本文所用，是指将糖单元添加至蛋白质。如本文所用，“N-聚糖”是指在蛋白质的N(天冬酰胺)残基的酰胺氮处附接至蛋白质的糖链。这样，通过N-糖基化过程形成N-聚糖。此聚糖可以是多糖。

免疫应答：如本文所用，术语“免疫应答”是指免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物(如抗原、免疫原或疫苗)的应答。免疫应答可以包括身体的参与宿主防御应答的任何细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天性和/或适应性免疫应答。如本文所用，保护性免疫应答是指保护受试者免受感染(预防感染或预防与感染相关的疾病的发生)的免疫应答。测量免疫应答的方法是本领域熟知的，并且包括例如测量淋巴细胞(如B或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。抗体应答或体液应答是产生抗体的免疫应答。“细胞免疫应答”是由T细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。

免疫原：如本文所用，术语“免疫原”或“免疫原性的”是指能够在适当条件下在动物中刺激免疫应答(如产生抗体或T细胞应答)的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物体内的组合物。如本文所用，“免疫”意指使受试者被保护而免受感染性疾病。

免疫有效量：如本文所用，术语“免疫有效量”意指足以免疫受试者的量。

在一些实施方案中：除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，术语“在一些实施方案中”是指本公开文本的所有方面的实施方案。

单体流感病毒神经氨酸酶：野生型流感病毒神经氨酸酶(NA)是四个相同单体的四聚体。野生型流感NA中的每个NA单体由四个不同的结构域组成：酶头部区、茎区、跨膜区和胞质尾。如本文所用，术语“单体流感病毒神经氨酸酶”是指可以与三种其他NA单体组合以形成四聚体NA的NA单体。在一些实施方案中，本文所述的经修饰的单体流感病毒神经氨酸酶缺少胞质尾、跨膜结构域和全部或基本上全部茎结构域。

N1：如本文所用，“N1”是指流感病毒亚型1神经氨酸酶(NA)。甲型流感病毒分为组1和组2。组1和组2被进一步分为亚型，所述亚型是指根据病毒表面上的两种蛋白质即血凝素(HA)和NA的序列对病毒的分类。目前，存在18种公认的HA亚型(H1-H18)和11种公认的NA亚型(N1-N11)。因此，N1不同于其他NA亚型(N2-N11)。

N2：如本文所用，“N2”是指流感病毒亚型2神经氨酸酶(NA)。甲型流感病毒分为组1和组2。组1和组2被进一步分为亚型，所述亚型是指根据病毒表面上的两种蛋白质即血凝素(HA)和NA的序列对病毒的分类。目前，存在18种公认的HA亚型(H1-H18)和11种公认的NA亚型(N1-N11)。因此，N2不同于其他NA亚型(N1和N3-N11)。

NB：如本文所用，“NB”是指乙型流感神经氨酸酶(NA)。乙型流感毒株分类为两个谱系：B/Yamagata和B/Victoria。

大流行毒株：“大流行”流感毒株是已经引起受试者群体(如人群体)的大流行感染或具有引起所述大流行感染的能力的流感毒株。在一些实施方案中，大流行毒株引起大流行感染。在一些实施方案中，这种大流行感染涉及跨多个地区的流行性感染；在一些实施方案中，大流行感染涉及跨彼此分离(例如，通过山脉、水体、作为不同大陆的一部分等)使得感染通常不会在它们之间传播的地区的感染。

预防：如本文所用，术语“预防”是指预防、避免疾病显现，延迟特定疾病、障碍或病症(例如，被例如流感病毒感染)的一种或多种症状的发作，和/或降低所述一种或多种症状的频率和/或严重程度。在一些实施方案中，在群体的基础上评估预防，使得如果在易患特定疾病、障碍或病症的群体中观察到所述疾病、障碍或病症的一种或多种症状的发展、频率和/或强度的统计上显著的降低，则认为药剂“预防”所述疾病、障碍或病症。

季节性毒株：“季节性”流感毒株是已经引起受试者群体(如人群体)的季节性感染(例如，每年流行)或具有引起所述季节性感染的能力的流感毒株。在一些实施方案中，季节性毒株已经引起季节性感染。

序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性以所述序列之间的相似性表示，原本也称为序列同一性。序列同一性经常用百分比同一性(或相似性或同源性)来测量；百分比越高，两个序列越相似。两个核酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的氨基酸的百分比。当使用标准方法比对时，给定基因或蛋白质的同源物或变体将具有相对较高程度的序列同一性。

术语“相同％”、“同一性％”或类似术语旨在具体是指在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯粹统计学的，并且两个序列之间的差异可以但不一定随机分布在待比较的序列的整个长度上。两个序列的比较通常通过以下方式进行：在最佳比对之后，关于区段或“比较窗口”比较所述序列，以鉴定相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可以手动地或借助于Smith和Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源性算法、借助于Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法、借助于Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性搜索算法、或借助于使用所述算法的计算机程序(威斯康星州遗传学软件包(Genetics Computer Group，575Science Drive，麦迪逊，威斯康星州)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)来进行。

通过以下方式获得同一性百分比：确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用此数目除以比较的位置的数目(例如，参考序列中的位置的数目)，并且将此结果乘以100。

在一些实施方案中，同一性程度是针对区域给出的，所述区域是参考序列的整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则针对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸(在一些实施方案中为连续核苷酸)给出同一性程度。在一些实施方案中，针对参考序列的整个长度给出同一性程度。

分别与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列可以具有所述给定序列的至少一种功能和/或结构特性，例如并且在一些情况下，在功能上和/或在结构上等同于所述给定序列。在一些实施方案中，与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列在功能上和/或在结构上等同于所述给定序列。

茎区：如本文所用，流感亚型2神经氨酸酶的“茎区”是指亚型2神经氨酸酶的约氨基酸36至约氨基酸82的区域。如本文所用，“基本上全部茎区”是指流感病毒亚型2NA的茎区的氨基酸36至氨基酸69。因此，缺少胞质尾、跨膜区和基本上全部茎区的经修饰的N2可以缺少流感病毒亚型2NA的氨基酸1-70、1-71、1-72、1-73、1-74、1-75、1-76、1-77、1-78、1-79、1-80或1-81。换句话说，本文所述的经修饰的N2可以包括流感病毒亚型2NA的茎区的至多13个最C末端氨基酸，其中茎区的最C末端氨基酸典型地是指N2的氨基酸70-82。在某些实施方案中，胞质尾、跨膜区和整个茎区(例如，氨基酸1-82)已经从经修饰的N2中去除。

护理标准毒株：每年，根据密集的监测工作，世界卫生组织(WHO)选择纳入季节性疫苗制剂中的流感毒株。如本文所用，术语“护理标准毒株”或“SOC毒株”是指由世界卫生组织(WHO)选择纳入季节性疫苗制剂中的流感毒株。护理标准毒株可以包括历史护理标准毒株、当前护理标准毒株或未来护理标准毒株。

受试者：如本文所用，术语“受试者”意指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“受试者”是指人。在一些实施方案中，“受试者”是指非人动物。在一些实施方案中，受试者包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，所述非人受试者是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、雪貂、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/猪)。在一些实施方案中，受试者可以是转基因动物、基因工程化动物和/或克隆。在一些实施方案中，所述受试者是成年人、青少年或婴儿。在一些实施方案中，术语“个体”或“患者”被使用并且旨在与“受试者”可互换。

四聚化结构域：如本文所用，术语“四聚化结构域”是指编码引起多肽或蛋白质的四聚体装配的结构域的氨基酸序列。对于特定蛋白质不是天然的四聚化结构域可以称为人工或异源四聚化结构域。示例性四聚化结构域包括但不限于来自四臂、GCN4亮氨酸拉链或血管舒张剂刺激磷蛋白(VASP)的序列。

疫苗接种：如本文所用，术语“疫苗接种(vaccination)”或“疫苗接种(vaccinate)”是指施用用以生成例如针对致病因子(如流感病毒)的免疫应答的组合物。疫苗接种可以在暴露于致病因子和/或发生一种或多种症状之前、期间和/或之后给予，并且在一些实施方案中，在暴露于所述因子之前、期间和/或之后不久给予。疫苗可能引发预防性(prophylactic)(预防性(preventative))和治疗性应答。施用方法根据疫苗而有所不同，但可包括接种、摄入、吸入或其他施用形式。接种可以通过多种途径(包括肠胃外，如静脉内、皮下、腹膜内、皮内或肌内)中的任一种递送。疫苗可与佐剂一起施用以增强免疫应答。在一些实施方案中，疫苗接种包括间隔适当时间的疫苗接种组合物的多次给予。

野生型(WT)：如本领域所理解的，术语“野生型”通常是指蛋白质或核酸的正常形式，如在自然界中发现的那样。例如，在流感病毒的天然分离株中发现野生型NA多肽。在NCBI流感病毒序列数据库中可以找到多种不同的野生型NA序列。

B.截短的N2

本申请公开了重组流感亚型2神经氨酸酶(N2)，其缺少胞质尾、跨膜区和全部或基本上全部茎区，在不使用异源四聚化结构域的情况下在细胞中表达时形成可溶性四聚体神经氨酸酶(NA)。

1.流感病毒的命名法

用于分类流感病毒的所有命名法都是本领域技术人员常用的命名法。因此，一类或一组流感病毒是指感染人的三种主要类型的流感：甲型流感、乙型流感或丙型流感。甲型和乙型流感每年都会导致显著的发病率和死亡率。本领域技术人员应理解，将病毒指定为特定类型涉及相应的Ml(基质)蛋白或P(核蛋白)中的序列差异。甲型流感病毒被进一步分为组1和组2。这些组被进一步分为亚型，所述亚型是指根据病毒表面上的两种蛋白质即HA和NA的序列对病毒的分类。目前，存在18种公认的HA亚型(H1-H18)和11种公认的NA亚型(N1-N11)。组1含有N1、N4、N5和N8以及H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18。组2含有N2、N3、N6、N7和N9以及H3、H4、H7、H10、H14和H15。已经在分离自蝙蝠的流感样基因组中鉴定出N10和N11。Wu等人,Trends in Microbiology,2014,22(4):183-91。虽然潜在地存在198种不同的甲型流感亚型组合，但是在自然界中仅检测到约131种亚型。目前通常在人群体中传播的引起季节性爆发的甲型流感病毒亚型包括：A(H1N1)和A(H3N2)。甲型流感亚型可以被进一步分解为不同的遗传“进化枝”和“子进化枝”。最后，术语毒株是指鉴于它们在基因组中具有较小的遗传变异而彼此不同的在亚型内的病毒。

为了方便起见，可以使用某些缩写来指代本文所述的蛋白质构建体及其部分。例如，NA可以指代流感神经氨酸酶蛋白或其部分。N2是指来自流感亚型2毒株的神经氨酸酶。术语tet-NA是指包含异源四聚化结构域的重组NA，其在细胞中表达时形成四聚体NA。HA是指血凝素或其部分。

2.神经氨酸酶(NA)

神经氨酸酶(NA)连同血凝素(HA)各是两种主要的流感表面蛋白中的一种。NA和HA二者的功能都涉及与唾液酸的相互作用，唾液酸是与细胞表面上表达的糖蛋白或糖脂上的糖部分结合的末端分子。HA与细胞表面上的唾液酸的结合会诱导细胞对病毒的胞吞作用，使病毒进入细胞并且感染细胞。唾液酸也被添加至HA和NA，作为在感染细胞内发生的糖基化过程的一部分。NA从细胞糖蛋白和糖脂以及从新生病毒粒子上新合成的HA和NA去除唾液酸。NA去除唾液酸通过阻止病毒颗粒聚集而促进了病毒颗粒从感染细胞表面有效释放。它还可以防止病毒经由HA与已经感染的垂死细胞结合，促进病毒感染的进一步传播。

a.野生型神经氨酸酶的结构

NA是II型跨膜糖蛋白，其在病毒表面上装配为四个相同单体的四聚体。取决于流感亚型，野生型单体的分子量为约55-72kDa；取决于流感亚型，四聚体的分子量为约240-260kDa。每个NA单体由四个不同的结构域组成：酶头部区、茎区、跨膜区和胞质尾。最大的结构域是头部区，其通过与跨膜区、最后N末端胞质尾连接的茎区拴系至病毒膜。本领域技术人员已知的技术可以用于描绘流感病毒神经氨酸酶的不同结构域。

不同甲型流感病毒亚型(包括N1和N2)中的茎区可以在大小和氨基酸结构上显著不同。Blok等人,Biochemistry,1982,21:4001-4007。茎长度的差异被认为调节酶头部区的距离并且影响NA接近细胞表面受体上的唾液酸的能力，其中较短的茎区与降低的唾液酸酶活性相关。Da Silva等人,J Biol Chem,2013,288(1):644-53；McAuley等人,Frontiers inMicrobiology,2019,10(39)。尽管不同亚型的茎区之间存在变异性，但NA茎区也共有一些结构特征，包括至少一个半胱氨酸残基和潜在的糖基化位点。一个或多个半胱氨酸残基可以参与NA单体之间二硫键的形成，并且有助于形成稳定的NA四聚体，而糖基化位点可以有助于四聚体稳定。McAuley等人,Frontiers in Microbiology,2019,10(39)。例如，N2的氨基酸位置78处或氨基酸位置78周围的保守半胱氨酸残基被认为在四聚体装配机制中起作用。Shtyrya等人,Acta Naturae.2009；1(2):26-32。

酶头部区由四个单体构成。头部中的每个单体形成保守的六叶片螺旋桨结构。每个叶片具有四个反向平行的β-折叠，它们通过二硫键稳定并且通过不同长度的环连接。McAuley等人,Frontiers in Microbiology,2019,10(39)。单体的四聚化对于活性位点的形成和酶促活性NA的合成是重要的。Dai等人,J.Virology,2016,90(20):9457-70。

b.亚型2(N2)流感病毒神经氨酸酶

虽然NA的氨基酸序列和长度在不同的甲型流感病毒NA亚型(如N1和N2)之间，特别是不同的甲型流感病毒NA亚型的NA茎区之间可以显著变化，但是来自不同流感毒株的N2的氨基酸序列长度典型地为约469个氨基酸，一些毒株具有约一个或两个(或更多个)氨基酸插入或缺失(典型地在头部区)。当提及野生型N2中的具体氨基酸残基时，具体氨基酸残基编号基于N2编号，如本领域所理解的。N末端胞质尾典型地对应于野生型N2序列的氨基酸1-6，而跨膜区典型地对应于野生型N2序列的氨基酸7-35。例如，在毒株A/PERTH/16/2009的野生型NA序列(SEQ ID NO:65)中，胞质尾对应于SEQ ID NO:65的氨基酸1-6，而跨膜区对应于SEQ ID NO:65的氨基酸7-35。N2茎区的长度典型地为约46个氨基酸，起始于野生型N2序列的约氨基酸36并且终止于野生型N2序列的约氨基酸82。例如，在毒株A/PERTH/16/2009的野生型NA序列(SEQ ID NO:65)中，茎区对应于SEQ ID NO:65的氨基酸36至约氨基酸82。然而，N2茎区的末端与N2头部区的起始之间的精确边界尚未通过x射线晶体学解析。

3.全部或基本上全部茎区的去除

设计重组N2，其缺少胞质尾、跨膜区和全部或基本上全部茎区。重组NA不含异源四聚化结构域，本领域传授所述异源四聚化结构域对于产生可溶性重组NA蛋白是重要的。Schmidt等人,PLos ONE,2011,6(2):e16284；Da Silva等人,J Biol Chem,2013,288(1):644-53；Dai等人,2016,J.Virology,90(20):9457-70；Bosch等人,2010,J.Virology,84(19):10366-74。然而，当在细胞中表达时，令人惊讶地发现缺少全部或基本上全部茎区的截短的N2形成可溶性四聚体NA。

最初的实验表明，缺少氨基酸1-74的重组N2在细胞中表达时形成四聚体NA。在来自不同毒株的截短的N2序列中观察到该特性。当缺失分析被扩展以覆盖去除了较少或较多的茎区的缺失变体时，发现缺少氨基酸1至至少氨基酸70-82的重组N2在细胞中表达时形成四聚体NA。事实上，在某些情况下，发现N末端缺失可以涵盖整个茎区并延伸几个氨基酸至头部区中，而仍然形成可溶性四聚体NA。

本公开文本的一个方面涉及编码经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶(N2)的人工核酸分子。在某些实施方案中，经修饰的单体N2缺少胞质尾、跨膜区和全部或基本上全部茎区，并且包含N2的头部区，其中经修饰的单体流感病毒亚型2NA不包括异源寡聚化结构域，并且其中经修饰的单体N2在细胞中的表达导致四聚体NA的分泌。在某些实施方案中，经修饰的单体N2包含信号肽和N2的头部区，其中N2的胞质尾区、跨膜区和全部或基本上全部茎区已被信号肽替代，其中经修饰的单体N2不包括异源寡聚化结构域。经修饰的单体N2在细胞中的表达导致四聚体NA的分泌。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1至至少氨基酸70-82已被信号肽替代。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-70已被信号肽替代。此类实施方案也称为dTM71。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-71已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM72。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-72已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM73。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-73已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM74。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-74已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM75。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-75已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM76。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-76已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM77。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-77已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM78。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-78已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM79。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-79已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM80。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-80已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM81。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-81已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM82。

在一些实施方案中，人工核酸分子编码经修饰的单体N2，其中N2(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-82已被经修饰的单体N2中的信号肽替代。此类实施方案也称为dTM83。

本公开文本的一个方面涉及四聚体NA，其包含经修饰的单体N2的四个拷贝。如上所讨论的，信号肽通常在翻译后加工期间被切割，使得分泌的多肽典型地不包含信号肽。因此，作为四聚体NA的一部分的经修饰的单体N2典型地仅包含流感病毒亚型2NA的头部区，并且不包括1)流感病毒亚型2NA的胞质尾、跨膜区和全部或基本上全部茎区，和2)异源寡聚化结构域。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2的全部茎区或缺少N2的氨基酸1至至少氨基酸70-82。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-70。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM71。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-71。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM72。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-72。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM73。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-73。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM74。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-74。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM75。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-75。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM76。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-76。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM77。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-77。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM78。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-78。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM79。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-79。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM80。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-80。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM81。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-81。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM82。

在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-82。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM83。

典型地，在经修饰的单体N2中，N2的头部区包含野生型N2的全长头部区，该全长头部区包括例如野生型N2的氨基酸83至末端氨基酸，对于大多数N2毒株是至氨基酸469，一些毒株具有约一个或两个(或更多个)氨基酸插入或缺失(典型地在头部区)。在一些实施方案中，N末端NA截短可以延伸超过茎区进入头部区，只要经修饰的单体N2在细胞中表达时仍然能够形成四聚体NA即可。例如，如实施例中所示，当在细胞中表达时，其中全部茎区和头部区起始处的几个氨基酸已经缺失的经修饰的单体N2可以形成四聚体NA。在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的胞质尾区、跨膜区、全部茎区、以及头部区的前1-5个氨基酸，或者人工核酸分子编码这种经修饰的单体N2。在一些实施方案中，经修饰的单体N2缺少氨基酸1至头部区的第一个或第二个氨基酸，或者人工核酸分子编码这种经修饰的单体N2。例如，经修饰的单体N2可以缺少流感病毒亚型2NA(例如，SEQ IDNO:1-115)的氨基酸1-83，或者人工核酸分子编码这种经修饰的单体N2(也称为dTM84)。例如，经修饰的单体N2可以缺少流感病毒亚型2NA(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-84，或者人工核酸分子编码这种经修饰的单体N2(也称为dTM85)。

如上所述，经修饰的单体N2可以缺少N2(例如，SEQ ID NO:1-115)的氨基酸1-74。此类实施方案以及由该经修饰的单体N2形成的四聚体NA也称为dTM75。代表性dTM75构建体包括但不限于SEQ ID NO:117-131中的任一个。

4.信号肽

野生型NA蛋白是包括跨膜结构域的膜结合蛋白。为了制备可溶性NA蛋白，可以缺失跨膜结构域并且添加信号肽。信号肽将重组NA蛋白靶向分泌途径，使得重组NA蛋白从表达重组NA的宿主细胞中分泌。当经修饰的单体N2核酸在宿主细胞内翻译成多肽时，多肽含有信号肽。然而，在翻译后加工期间，信号肽被切割，使得分泌的多肽不再含有信号肽。因此，尽管本文所述的核酸构建体可以编码信号肽以将经修饰的单体N2靶向分泌途径，但从表达核酸构建体的宿主细胞获得的可溶性四聚体NA由四个不再含有信号肽的经修饰的N2单体构成。

任何信号肽或编码其的核酸可以用于重组NA构建体中。信号肽应是由用于表达重组N2的宿主细胞识别的信号肽序列。信号肽可以是来自除了流感病毒以外的来源的异源信号肽，或者它可以是来自流感病毒的信号肽，如血凝素的信号肽。在一些实施方案中，信号肽是哺乳动物信号肽。在一些实施方案中，信号肽是人信号肽，包括例如来自以下的引导经修饰的NA分泌的信号肽：CD5、免疫球蛋白κ轻链、血清白蛋白、天青杀素、胰蛋白酶原、白介素-2和催乳素或其衍生物。Kober等人,Biotechnology&Bioen gineering,2012,110(4):1164-63；Dalton等人,Protein Sci.,2014,23(5):517-25。在一些实施方案中，信号肽是CD5信号肽。在一些实施方案中，CD5信号肽包含氨基酸序列MPM GSLQPLATLYLLGMLVASVLS(SEQ ID NO:132)或MPMGSLQPLATLYLLGMLVA SCLG(SEQ ID NO:133)。

5.接头序列

在一些实施方案中，经修饰的单体N2可以包含将信号肽与截短的NA连接的任选的接头序列。以这种方式，接头序列可以帮助将经修饰的N2的头部区与剩余部分分开。例如，在一些实施方案中，在整个茎区已经缺失的实施方案中，接头序列可以将信号肽连接至头部区。在其他实施方案中，在基本上全部茎区已经缺失的实施方案中，接头序列可以将信号肽连接至茎区。如果经修饰的NA含有蛋白质标签序列，则接头序列可以插入在蛋白质标签序列的N末端和/或C末端。接头序列不是天然存在的NA氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，接头序列包含甘氨酸和/或丝氨酸残基和任选的一个或多个丙氨酸残基。在一些实施方案中，接头序列的长度为约2-10个氨基酸，包括长度为2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，并且接头序列有助于提供重组NA的不同区域或部分之间的柔性。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸序列GSG、AGS或AGSG(SEQ ID NO:134)或由其组成。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸序列GS或SG或由其组成。

本领域已知的任何其他接头序列可以用于重组NA构建体中。其他示例性肽接头是美国专利号4,751,180、4,935,233和5,073,627中所述的那些，其各自通过引用以其整体特此并入。使用常规技术，在整个茎区已经缺失的实施方案中，编码所需接头序列的DNA序列可以插入在例如编码信号肽与头部区的DNA序列之间且在相同的阅读框中，或者在基本上全部茎区已经缺失的实施方案中，编码所需接头序列的DNA序列可以插入在茎区的末端氨基酸与头部区之间。

6.蛋白质标签序列

经修饰的单体N2可以包含可以用于纯化或以其他方式鉴定经修饰的N2的任选的蛋白质标签序列。例如，在一些实施方案中，经修饰的N2包含组氨酸标签序列。本领域已知的任何蛋白质标签序列可以用于重组NA构建体中。

7.蛋白酶切割位点

经修饰的单体NA还可以包含任选的蛋白酶切割位点。在重组NA在宿主细胞中表达后，蛋白酶切割位点可以用于通过促进从最终可溶性NA蛋白中去除序列(例如，蛋白质标签序列、接头序列等)来修饰重组NA。本领域已知的任何蛋白酶切割位点可以用于重组NA构建体中。

8.四聚体NA

已经发现，当编码如本文所述的经修饰的单体N2的核酸在细胞中表达时，可溶性四聚体NA在细胞上清液中是可检测的，并且可以以高产率从细胞上清液中纯化。尽管并非所有N2毒株都以可检测量产生可溶性四聚体NA，但所测试的大多数N2毒株产生可检测量的可溶性四聚体NA，表明此截短茎设计策略可以广泛应用于来自各种N2流感毒株的NA蛋白。当在细胞中表达时，某些N2毒株和特定毒株的某些茎缺失变体产生更高产量的可溶性四聚体NA。如实施例中所示，并在以下进一步详细讨论，高通量筛选可以用于容易地鉴定产生可溶性四聚体NA的那些毒株，以及对产生的可溶性四聚体NA的量进行定量。相同的高通量筛选也可以用于测试具有不同长度的茎区的经修饰的NA茎截短变体，以鉴定产生可溶性四聚体NA或最高量的可溶性四聚体NA的变体，如实施例中所证明的。

由本文所述的经修饰的单体N2构建体形成的大多数可溶性四聚体NA保留了神经氨酸酶的酶活性。在一些实施方案中，本文所述的可溶性四聚体NA具有神经氨酸酶活性。神经氨酸酶活性可以使用本领域已知的技术测量，包括例如MUNANA测定或测定(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)。在MUNANA测定中，使用2'-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸(MUNANA)作为底物。样品中含有的任何酶活性神经氨酸酶切割MUNANA底物，释放4-甲基伞形酮(4-MU)，其为一种荧光化合物。因此，测试样品中神经氨酸酶活性的量与释放的4-MU的量相关。在一些实施方案中，如本文所述的可溶性四聚体NA具有范围为1至25mole/min/μg的活性，如通过MUNANA测定测量的。

出于确定本公开文本的可溶性四聚体NA的神经氨酸酶活性的目的，MUNANA测定应使用以下条件进行：将可溶性四聚体NA与缓冲液[33.3mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES，pH6.5)、4mM CaCl2、50mM BSA]和底物(100μM MUNANA)混合，并且在37℃下伴随振荡孵育1小时；通过添加碱性pH溶液(0.2M Na₂CO₃)终止反应；分别使用355nm和460nm的激发和发射波长测量荧光强度；并且计算相对于4MU参考值的酶活性。如果需要，可以使用等晓的测定来测量神经氨酸酶的酶活性。

为了检测四聚体NA，开发了新的结合测定，如实施例中所述。筛选测定还在2021年8月11日提交的题为检测和纯化流感神经氨酸酶的方法和相关方面(METHODS AND RELATED ASPECTS OF DETECTING AND PURIFYING INFLUENZANEURAMINIDASE)的美国申请号63/231,795中进一步详细描述，其通过引用以其整体特此并入。简言之，磷酸奥司他韦()是NA酶活性的竞争性抑制剂。在本申请中，术语磷酸奥司他韦和可以互换使用。奥司他韦底物对四聚体NA头部的酶位点具有特异性。相比之下，无酶活性的单体NA胞外结构域变体不结合磷酸奥司他韦。因此，结合测定中重组NA结合的水平与装配为四聚体的重组NA的浓度成比例，并且可以以μg/mL测量。例如，如本文所述的可溶性四聚体NA可以具有至少5μg/mL(如至少20μg/mL、至少50μg/mL或至少100μg/mL)的结合值。如本文所述，可溶性四聚体NA可以具有40-1000μg/mL、50-800μg/mL、100-800μg/mL、100-500μg/mL或100-250μg/mL的结合值。可替代地，结合测定中重组NA结合的水平与装配为四聚体的重组NA的浓度成比例，并且可以测量为相对于阳性对照四聚体NA分子(如包含异源四聚化结构域的经修饰的流感N2)的结合的单位，该阳性对照包括例如本申请中使用的阳性对照，如包含全长四臂四聚化结构域的经修饰的A/Singapore/INFIMH160019/2016NA。例如，相对于包含全长四臂四聚化结构域(SEQ ID NO:116)的经修饰的A/Singapore/INFIMH160019/2016NA的结合，如本文所述的可溶性四聚体NA可以具有约0.5至10个单位的结合值，如约2至10或约5至10个相对单位。

出于确定本公开文本的可溶性四聚体NA的结合活性的目的，结合测定应使用以下条件进行：在链霉亲和素包被的生物传感器(例如，高精度链霉亲和素(SAX)浸入即读生物传感器，目录号18-51182)的表面上捕获磷酸奥司他韦生物素缀合物(5-10μg/ml，在1xKB缓冲液(在PBS中0.1％ BSA和0.02％ Tween 20，pH 7.4)中)；将磷酸奥司他韦结合的生物传感器浸入含有连续2倍稀释的重组NA样品(1xKB中0.16-40μg/ml)的样品孔中；并且使用Octet仪器(ForteBio，Molecular Devices，LLC)上的生物层干涉测量法(BLI)技术测量重组NA与磷酸奥司他韦的结合动力学。如果需要，可以使用等同的测定来测量结合。

10.N2毒株和NA序列

本文公开的经修饰的单体流感病毒NA来自亚型2(N2)流感病毒，即经修饰的单体N2。如其他地方所讨论的，当前的季节性流感疫苗必须每年施用，并且需要每年更新以考虑HA和NA蛋白的突变(抗原漂移)并且匹配快速进化和新出现的病毒毒株。HA引发病毒中和抗体，并且比NA进化得更迅速。遗传上更稳定的NA可以用作不同季节性疫苗的补充剂，从而提高功效。换句话说，重组NA蛋白(或通过核酸疫苗递送的蛋白)可以不需要像HA那样频繁的季节性更新。本申请中公开的用于产生在细胞中表达时形成四聚体NA的截短重组NA的策略可以用于从此类新出现的N2流感毒株(包括未来的N2护理标准(SOC)毒株或任选的历史SOC或非SOC毒株)产生经修饰的N2。

本申请中公开的用于产生在细胞中表达时形成四聚体NA的截短的重组NA的策略可以用于从工程化N2蛋白(如使用分子建模方法获得的工程化N2蛋白)产生经修饰的N2，如例如在美国公开申请号2018/0298063、美国公开申请号2019/0161519和美国公开申请号2021/0046176中所披露的，其通过引用以其整体特此并入。

本申请中公开的用于产生在细胞中表达时形成四聚体NA的截短重组NA的策略也可以用于从现有的野生型N2流感毒株(包括护理标准(SOC)N2毒株或非SOC N2毒株)产生经修饰的N2。在一些实施方案中，N2来自甲型流感病毒毒株。在一些实施方案中，N2来自A/(H3N2)毒株。在一些实施方案中，所述甲型流感病毒毒株是以下毒株之一：A/Perth/16/2009、A/Kansas/14/2017、A/Belgium/4217/2015、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016、A/Switzerland/8060/2017、A/Nevada/32/2013、A/Yamagata/62/1993、A/Niger ia/120/2014、A/Bangkok/1/1979、A/Albany/42/1975、A/Washington/60/2014、A/HongKon g/CUHK13510/2001、A/Marrakech/79/2014、A/HongKong/1774/99、A/Illinois/34/2012、A/Kannur/MCVR5404/2010或A/Peru/3216/2016。在下表中提供了这些毒株中每一种的NA的SEQ ID NO:、对应于预期头部区的氨基酸、GISAID参考编号和分离株ID。

在一些实施方案中，甲型流感病毒毒株是以下毒株之一：A/Ohio/13/2017、A/Nanjing/1663/2010、A/Fukuoka/DS7282/2017、A/Ohio/62/2012、A/Minnesota/11/2010、A/Utah/11/2011、A/Hokkaido/10H079/2011、A/Ishikawa/DS7157/2016、A/Gambia/G0071436/2012、A/Kagawa/DS722/2016、A/South_Australia/85/2018、A/Victoria/361/2011、A/Tokyo/DS7334/2017、A/Hochiminh/4596/2010、A/Kagawa/DS7144/2016、A/Peru/4617/2017、A/Switzerland/9715293/2013、A/Tokyo/UTSK1/2007、A/WesternAustralia/13/2001、A/Tasma nia/1018/2015、A/Sweden/3/2017、A/Kansas/13/2009、A/Tokyo/DS763/2016、A/Newcastl e/67/2016、A/SouthAustralia/34/2019、A/Stockholm/32/2014、A/Stockholm/14/2012、A/St ockholm/15/2014、A/Guangxigangbei/190/2019、A/Xinjiangtianshan/1411/2012、A/NewYo rk/654/1994、A/Netherlands/620/1989、A/NewYork/758/1993、A/Catalonia/9503S/2017、A/Paris/2379/2014或A/Heilongjiangxiangyang/1134/2011。在下表中提供了这些毒株中每一种的NA的SEQ ID NO:、对应于预期头部区的氨基酸、GISAID参考编号和分离株ID。

甲型流感毒株还可以是以下之一：A/TEXAS/50/2012(SEQ ID NO:87)、A/PORTOALEGRE/LACENRS2376/2014(SEQ ID NO:69)、A/MEMPHIS/18/1978(SE Q ID NO:49)、A/BELGIUM/4217/2015(SEQ ID NO:5)、A/TAIWAN/1/1969(SE Q ID NO:81)、A/SIENA/3/1991(SEQ ID NO:71)、A/BRISBANE/273/2016(SEQ ID NO:7)、A/ONTARIO/RV3236/2016(SEQID NO:63)、A/TEHRAN/996/2012(SEQ ID NO:85)、A/ANKARA/2396/2015(SEQ ID NO:3)、A/KANSAS/14/2017(SEQ ID NO:45)、A/TEXAS/71/2017(SEQ ID NO:88)、A/HONGKONG/4801/2014(SEQ ID NO:30)、A/HONGKONG/3089/2017(SEQ ID NO:29)、A/FUKUOKA/DS729/2016(SEQ ID NO:12)、A/TOKUSHIMA/DS5288/2015(SEQ ID NO:89)、A/HELSINKI/823/2013(SEQID NO:22)、A/ALASKA/251/2015(SEQ ID NO:1)、A/HATAY/4990/2016(SEQ ID NO:20)、A/HANOI/ELI15597/2015(SEQ ID NO:19)、A/MISSISSIPPI/1/1985(SEQ ID NO:51)、A/INDIANA/18/2017(SEQ ID NO:36)、A/POLAND/19B/2017(SEQ ID NO:68)、A/TENNESSEE/18/2017(SEQ ID NO:86)、A/HONGKONG/1774/1999(SEQ ID NO:28)、A/DAKAR/14/2014(SEQ IDNO:10)、A/SAUDIARABIA/21/1999(SEQ ID NO:70)、A/GIFU/DS7388/2017(SEQ ID NO:15)、A/NEWYORK/581/1997(SEQ ID NO:57)、A/HELSINKI/941/2013(SEQ ID NO:23)、A/ISHIKAWA/DS7294/2017(SEQ ID NO:39)、A/GUANGDONGDUANZH OU/1227/2017(SEQ ID NO:16)、A/AUCKLAND/5/1996(SEQ ID NO:4)、A/ISHI KAWA/DS7215/2016(SEQ ID NO:38)、A/WESTVIRGINIA/17/2012(SEQ ID NO:98)、A/SINGAPORE/INFIMH160019/2016(SEQ ID NO:72)、A/KAGAWA/DS7115/2016(SEQ ID NO:42)、A/BILTHOVEN/21801/1971(SEQ ID NO:6)、A/FUKUO KA/DS72/2016(SEQ ID NO:11)、A/MORAMANGA/1907/2017(SEQ ID NO:52)、A/HUNAN/01/2014(SEQ ID NO:33)、A/WISCONSIN/16/2015(SEQ ID NO:100)、A/CANBERRA/13/2015(SEQ ID NO:8)、A/HONGKONG/107/1971(SEQ ID NO:27)、A/LYON/1242/2000(SEQ ID NO:48)、A/NAGANO/2153/2017(SEQ ID NO:53)、A/NANJING/49/1977(SEQ ID NO:54)、A/ALBANY/6/1970(SEQ ID NO:2)、A/KAGAWA/DS769/2016(SEQ ID NO:41)、A/TAIWAN/4183/2004(SEQ ID NO:83)、A/KOREA/KUMCGR570/2011(SEQ ID NO:47)、A/SYDNEY/24/2015(SEQID NO:80)、A/KOREA/KUMCGR99/2011(SEQ ID NO:46)、A/TOKYO/DS7277/2017(SEQ ID NO:91)、A/HONGKONG/CUHK18194/1998(SEQ ID NO:31)、A/GU NMA/DS7107/2016(SEQ ID NO:18)、A/HONGKONG/8/1968(SEQ ID NO:26)、A/TOKYO/DS7448/2017(SEQ ID NO:93)、A/PERTH/61/2015(SEQ ID NO:65)、A/TW/875/2004(SEQ ID NO:95)、A/TAIWAN/2332/2001(SEQ ID NO:82)、A/INDIA/C058671/2005(SEQ ID NO:34)。

本文公开的经修饰的单体N2可以包含野生型N2的一部分(例如，野生型N2的茎区的头部区或C末端区的一部分)。还可以将一个或多个突变引入野生型N2的茎区的头部区和/或C末端区，只要经修饰的单体N2在细胞中表达时保留形成四聚体NA的能力即可。在某些实施方案中，相对于野生型N2的茎区的头部区和/或C末端区，经修饰的单体N2的茎区的头部区和/或C末端区含有1、2、3、4或5个突变。在某些实施方案中，经修饰的单体N2与野生型N2的头部区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在某些实施方案中，经修饰的单体N2与SEQ ID NO:1-115的任何氨基酸序列的头部区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

C.组合物

在某些方面，本公开文本提供了包含四聚体神经氨酸酶或编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子的疫苗组合物，所述四聚体神经氨酸酶包含如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝。基于质粒DNA、载体或RNA(例如，mRNA)的核酸疫苗是本领域已知的，并且已被有效地针对感染性疾病(如病毒感染)使用。载体包括但不限于：体内重组表达载体，如多核苷酸载体或质粒(EP-A2-1001025；Chaudhuri P,Res.Vet.Sci.2001,70:255-6)；病毒载体，包括但不限于腺病毒载体、甲病毒载体、黄病毒载体、痘病毒载体(如禽痘(美国专利号5,174,993；美国专利号5,505,941；和美国专利号5,766,599)或金丝雀痘病毒载体(美国专利号5,756,103))。RNA(例如，mRNA)疫苗可以与脂质纳米颗粒一起配制。如本文所述，编码经修饰的单体N2的人工核酸可以通过对核酸分子的一种或多种化学修饰来稳定，该一种或多种化学修饰包括一种或多种主链、糖和/或碱基修饰，如本领域已知的，包括例如如PCT申请号WO2017/140905中所披露的，其通过引用以其整体特此并入。

在某些实施方案中，本公开文本提供了包含编码如本文所述的经修饰的单体N2的mRNA分子的疫苗组合物。在一个实施方案中，mRNA分子被包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。用于递送mRNA疫苗的LNP是本领域已知的，包括例如，如美国专利申请号63/110,965和63/212,523中所披露的，其通过引用以其整体特此并入。

疫苗组合物还可以进一步包含佐剂。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或媒介物。佐剂可以包括其上吸附有抗原的矿物质(明矾、铝盐，包括例如氢氧化铝/羟基氧化铝(AlOOH)、磷酸铝(AlPO₄)、羟基磷酸硫酸铝(AAHS)和/或硫酸铝钾)的悬浮液；或其中抗原溶液在矿物油中乳化的油包水乳液(例如，弗氏不完全佐剂)，有时会包含杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸(如，包括CpG基序的那些)也可以用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂还包括生物分子，如脂质和共刺激分子。示例性生物佐剂包括AS04(Didierlaurent,A.M.等人,J.Immunol.,2009,183:6186-6197)、IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41BBL。

在某些实施方案中，所述佐剂是基于鲨烯的佐剂，其包含至少含有以下的水包油佐剂乳液：鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂。在某些实施方案中，所述乳液是热可逆的，任选地其中油滴的按体积计90％的群体具有小于200nm的大小。

在某些实施方案中，所述聚氧乙烯烷基醚具有式CH₃-(CH₂)x-(O-CH₂-CH₂)n-OH，其中n是从10至60的整数，并且x是从11至17的整数。在某些实施方案中，所述聚氧乙烯烷基醚表面活性剂是聚氧乙烯(12)十六烷十八烷基醚。

在某些实施方案中，油滴的按体积计90％的群体具有小于160nm的大小。在某些实施方案中，油滴的按体积计90％的群体具有小于150nm的大小。在某些实施方案中，油滴的按体积计50％的群体具有小于100nm的大小。在某些实施方案中，油滴的按体积计50％的群体具有小于90nm的大小。

在某些实施方案中，所述佐剂进一步包含至少一种糖醇，包括但不限于甘油、赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。

在某些实施方案中，所述亲水性非离子表面活性剂的亲水/亲脂平衡值(HLB)大于或等于10。在某些实施方案中，所述疏水性非离子表面活性剂的HLB小于9。在某些实施方案中，所述亲水性非离子表面活性剂的HLB大于或等于10，并且所述疏水性非离子表面活性剂的HLB小于9。

在某些实施方案中，所述疏水性非离子表面活性剂是脱水山梨糖醇酯(如脱水山梨糖醇单油酸酯)或脱水甘露糖醇酯表面活性剂。在某些实施方案中，鲨烯的量在5％与45％之间。在某些实施方案中，聚氧乙烯烷基醚表面活性剂的量在0.9％与9％之间。在某些实施方案中，疏水性非离子表面活性剂的量在0.7％与7％之间。在某些实施方案中，所述佐剂包含：i)32.5％的鲨烯，ii)6.18％的聚氧乙烯(12)十六烷十八烷基醚，iii)4.82％的脱水山梨糖醇单油酸酯，和iv)6％的甘露糖醇。

在某些实施方案中，所述佐剂进一步包含烷基多糖苷和/或冷冻保护剂，如糖，特别是十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖。

在某些实施方案中，所述佐剂包括AF03，如Klucker等人,J.Pharm.Sci.2012,101(12):4490-500中所述，将其通过引用以其整体特此并入。

除了四聚体神经氨酸酶或编码经修饰的单体N2的人工核酸分子和任选的佐剂之外，疫苗组合物还可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。通常，所述赋形剂的性质将取决于所使用的特定施用方式。例如，肠胃外配制品通常包含注射液，所述注射液包括药学上和生理学上可接受的流体，如作为媒介物的水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括，例如，药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的疫苗组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、药学上可接受的盐(以调节渗透压)、防腐剂、稳定剂、缓冲液、糖、氨基酸和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

典型地，疫苗组合物是被配制用于肠胃外施用(如静脉内、皮下、腹膜内、皮内或肌内施用)的无菌液体溶液。疫苗组合物还可以被配制用于鼻内或吸入施用。疫苗组合物还可以被配制用于任何其他预期的施用途径。

在一些实施方案中，疫苗组合物被配制用于皮内注射、鼻内施用或肌内注射。在一些实施方案中，注射剂以常规形式制备，作为液体溶液剂或混悬剂、适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或作为乳剂。在一些实施方案中，注射溶液剂和混悬剂由无菌粉末或颗粒制备。在用于通过这些途径施用的药剂的配制和制造中的一般考虑可以见于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995(通过引用并入本文)中。目前，口服或鼻用喷雾剂或气溶胶途径(例如，通过吸入)最常用于将治疗剂直接递送至肺和呼吸系统。在一些实施方案中，使用递送计量剂量的疫苗组合物的装置施用疫苗组合物。用于递送本文所述的皮内药物组合物的合适装置包括短针装置，如描述在以下中的那些：美国专利号4,886,499、美国专利号5,190,521、美国专利号5,328,483、美国专利号5,527,288、美国专利号4,270,537、美国专利号5,015,235、美国专利号5,141,496、美国专利号5,417,662(将其全部通过引用并入本文)。皮内组合物也可以通过限制针进入皮肤的有效穿透长度的装置施用，如通过引用并入本文中的WO 1999/34850中描述的那些及其功能等同物。此外，射流注射装置也是合适的，其经由液体射流注射器或经由刺穿角质层的针将液体疫苗递送至真皮，并产生到达真皮的射流。射流注射装置描述于例如美国专利号5,480,381、美国专利号5,599,302、美国专利号5,334,144、美国专利号5,993,412、美国专利号5,649,912、美国专利号5,569,189、美国专利号5,704,911、美国专利号5,383,851、美国专利号5,893,397、美国专利号5,466,220、美国专利号5,339,163、美国专利号5,312,335、美国专利号5,503,627、美国专利号5,064,413、美国专利号5,520,639、美国专利号4,596,556、美国专利号4,790,824、美国专利号4,941,880、美国专利号4,940,460、WO 1997/37705和WO 1997/13537(将所有这些都通过引用并入本文)。此外，弹道粉末/颗粒递送装置也是合适的，其使用压缩气体来加速呈粉末形式的疫苗穿过皮肤外层至真皮。另外，常规针筒可以用于皮内施用的经典曼托(mantoux)方法中。

用于肠胃外施用的制剂典型地包括无菌的水性或非水性溶液剂、混悬剂和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)以及可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

所述疫苗组合物可以进一步包含流感病毒血凝素蛋白。在某些实施方案中，流感病毒血凝素和经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶来自不同的流感病毒毒株。在某些实施方案中，流感病毒血凝素和经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶来自不同的甲型流感病毒毒株。在某些实施方案中，流感病毒血凝素和经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶来自不同的A/(H3N2)病毒毒株。

D.核酸、克隆和表达系统.

本公开文本进一步提供了编码所公开的经修饰的单体N2的人工核酸分子。核酸可以包含DNA或RNA，并且可以是全部或部分合成的或重组的。除非上下文另有要求，否则对本文所述的核苷酸序列的提及涵盖具有指定序列的DNA分子，并且涵盖具有其中U或其衍生物(如假尿苷)取代T的指定序列的RNA分子。可以将其他核苷酸衍生物或经修饰的核苷酸掺入编码所公开的经修饰的单体N2的人工核酸分子中。

本公开文本还提供了呈包含编码经修饰的单体N2的人工核酸分子的载体(例如，质粒、噬菌粒、粘粒、转录或表达盒、人工染色体等)形式的构建体。本公开文本进一步提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含一种或多种如上所述的构建体。

还提供了制备由这些人工核酸分子编码的经修饰的单体N2的方法。经修饰的N2多肽可以使用重组技术产生。重组蛋白的产生和表达是本领域熟知的，并且可以使用常规程序(如披露于Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版2012),ColdSpring Harbor Press中的那些)进行。例如，经修饰的N2多肽的表达可以通过在适当条件下培养含有编码经修饰的单体N2多肽的人工核酸分子的宿主细胞来实现。因此，用于产生四聚体NA的方法可以包括：在细胞培养基中培养宿主细胞，其中宿主细胞含有编码经修饰的单体N2的人工核酸；以及在宿主细胞中表达经修饰的N2，其中经修饰的N2作为可溶性四聚体NA从宿主细胞分泌。通过表达产生后，可以使用任何合适的技术分离和/或纯化四聚体NA，然后适当地使用。

用于在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是本领域熟知的。可以使用与本申请中公开的构建体相容的任何蛋白质表达系统(例如稳定的或瞬时的)来产生本文所述的经修饰的N2。

可以选择或构建合适的载体，使得它们含有适当的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他适当的序列。

本公开文本的另外的方面提供了包含如本文所公开的人工核酸分子的宿主细胞。仍另外的方面提供了一种包括将此类人工核酸分子引入宿主细胞中的方法。所述引入可以采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染以及使用逆转录病毒或其他病毒(例如痘苗病毒)或对于昆虫细胞而言使用杆状病毒的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。这些技术是本领域中熟知的。(参见例如，“Current Protocols in MolecularBiology,”Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons,2010)。DNA引入之后可以采用选择方法(例如，抗生素抗性)来选择含有载体的细胞。

宿主细胞可以是植物细胞、酵母细胞或动物细胞。动物细胞涵盖无脊椎动物(例如昆虫细胞)、非哺乳动物脊椎动物(例如，禽类、爬行动物和两栖动物)和哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的例子包括但不限于COS-7细胞、HEK293细胞；幼仓鼠肾(BHK)细胞；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；小鼠支持细胞；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(例如，HeLa)；犬肾细胞(例如MDCK)等。在一个实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。

D.生产的方法

本文公开的截短的NA茎设计允许可溶性四聚体NA的大规模生产和纯化。如上所述，可以将包含编码所公开的经修饰的单体N2的人工核酸分子的载体插入合适的宿主细胞中以产生可溶性四聚体NA。

在一些实施方案中，产生可溶性四聚体NA的方法使用大规模生产条件。如本文所用，“大规模生产条件”是指在通常为生物反应器的培养器皿中培育宿主细胞，所述培养器皿具有在10与10,000升之间、在25与5000升之间、在25与2000升之间、在50升与1000升之间、在50与500升之间、在50与250升之间、在50与200升之间、在100与200升之间、在100升与5000升之间、在500升与8000升之间、在1500升与6500升之间、约1500-1600升、约3000-3200升、约6000-6400升、大于或等于25升、如大于或等于100升、如至少100升并且小于或等于10,000升、如至少100升并且小于或等于8000升、如至少100升并且小于或等于4000升或如至少100升并且小于或等于2000升的工作体积。

如本文所述，本文所述的可溶性四聚体NA可以使用色谱技术(包括例如离子交换色谱、亲和色谱和尺寸排阻色谱)从细胞培养上清液中纯化。例如，如果经修饰的N2含有带电荷的标签(如组氨酸标签)，则可以使用离子交换色谱纯化可溶性NA。在一些实施方案中，使用尺寸排阻色谱(SEC)纯化如本文所述的可溶性四聚体NA。此外，例如，可以使用SEC-多角度光散射(SEC-MALS)以确定可溶性NA分子的分子量和纯度。

在一些N2流感毒株中，当经修饰的单体N2在宿主细胞中表达时，宿主细胞上清液含有经修饰的NA的混合物，所述经修饰的NA的混合物包含经修饰的NA的单体形式、经修饰的NA的四聚体形式和/或经修饰的NA的其他寡聚形式，如二聚体NA、三聚体NA和/或更高级的寡聚体NA(例如，经修饰的单体、二聚体、三聚体或四聚体NA的聚集体或其他多聚体)。在一些N2流感毒株中，其中将宿主细胞上清液应用于色谱柱，可溶性NA可以在两个主峰或池中洗脱，而对于其他N2流感毒株，可溶性NA可以作为单峰或单池洗脱。对于一些N2流感毒株，当经修饰的单体N2在细胞中表达并且将细胞上清液应用于色谱柱时，可溶性NA可以在多于两个主峰或池中洗脱。当可溶性NA在两个峰或池中洗脱时，第一峰或池主要含有分子量为约60kD的单体NA，而第二峰主要含有分子量为约210kD的四聚体NA。当可溶性NA作为单峰或单池洗脱时，池典型地含有单体和四聚体NA的混合物。细胞上清液中四聚体NA的纯度可以在不同的N2毒株之间变化，其中某些毒株，像PERT09和BELG17，以单峰或单池洗脱，在所述单峰或单池中分别含有约70％-100％和20％-25％的四聚体NA。在一些实施方案中，可溶性四聚体NA代表宿主细胞上清液中经修饰的N2的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％，如使用SEC测量的。在一些实施方案中，可溶性四聚体NA以约50-150mg/L(包括例如约75-140mg/L、约80-135mg/L或约80mg/L至120mg/L)的量存在于宿主细胞上清液中。如果需要，可以对从宿主细胞上清液中获得的可溶性四聚体NA进行进一步纯化。

在一些实施方案中，使用亲和色谱纯化如本文所述的可溶性四聚体NA。例如，可以使用新的结合测定纯化可溶性四聚体NA，如在实施例中所述的。纯化方法还在2021年8月11日提交的题为检测和纯化流感神经氨酸酶的方法和相关方面(METHODS AND RELATED ASPECTS OF DETECTING AND PURIFYING INFLUENZANEURAMINIDASE)的美国临时专利申请号63/231,795中描述，其通过引用以其整体特此并入。因为发现重组单体NA不与结合，纯化方法提供了一种便利的方式以纯化包含可溶性四聚体和单体NA的混合物中的可溶性四聚体NA。在一些实施方案中，结合缀合物用于从细胞培养上清液中纯化可溶性四聚体NA。在一些实施方案中，使细胞培养上清液经受第一纯化方法，如离子交换色谱或SEC，以获得含有单体和四聚体NA的混合物的经部分纯化的峰或池；随后经受第二纯化方法，其中第二纯化方法是基于的纯化方法，包括将包含单体NA和四聚体NA的混合物与缀合物一起孵育以及分离与缀合物结合的四聚体NA以纯化四聚体NA的步骤。

在一些实施方案中，在纯化后，获得纯化的组合物，所述组合物包含至少90％的四聚体NA。在一些实施方案中，纯化的样品包含至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的四聚体NA。在一些实施方案中，在纯化后，获得纯化的组合物，所述组合物包含浓度为至少0.01、0.2、0.5、1、2、3、4或5mg/mL，如0.01mg/mL至约25mg/mL、0.2mg/mL至约25mg/mL，如0.5mg/mL至10mg/mL、2mg/mL至10mg/mL、0.5mg/mL至20mg/mL、2mg/mL至20mg/mL、0.5mg/mL至15mg/mL、或2mg/mL至15mg/mL的四聚体NA。

E.使用方法

本公开文本提供了向受试者施用本文所述的疫苗组合物的方法。所述方法可用于使受试者接种针对流感病毒的疫苗。在一些实施方案中，疫苗接种方法包括向有需要的受试者以有效针对流感病毒对受试者进行疫苗接种的量施用疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子，或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA，和任选的佐剂。同样地，本公开文本提供了用于针对流感病毒对受试者进行疫苗接种的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子，或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA，和任选的佐剂。

本公开文本还提供了使受试者对流感病毒免疫的方法，所述方法包括向受试者施用免疫有效量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子，或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA，和任选的佐剂。同样地，本公开文本提供了用于使受试者对流感病毒免疫的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子，或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA，和任选的佐剂。

在一些实施方案中，所述方法或用途预防受试者中的流感病毒感染或疾病。在一些实施方案中，所述方法或用途引起所述受试者的保护性免疫应答。在一些实施方案中，所述保护性免疫应答是抗体应答。

本文提供的免疫方法可以引发针对一种或多种流感病毒的广泛中和免疫应答。因此，在各种实施方案中，本文所述的组合物可以提供针对不同类型的流感病毒的广泛交叉保护。在一些实施方案中，组合物提供针对禽流感、猪流感、季节性流感和/或大流行流感病毒的交叉保护。在一些实施方案中，免疫的方法能够引发针对一种或多种季节性流感毒株(例如，护理标准毒株)的改善的免疫应答。例如，改善的免疫应答可以是改善的体液免疫应答。在一些实施方案中，免疫的方法能够引发针对一种或多种大流行流感毒株的改善的免疫应答。在一些实施方案中，免疫的方法能够引发针对一种或多种猪流感毒株的改善的免疫应答。在一些实施方案中，免疫的方法能够引发针对一种或多种禽流感毒株的改善的免疫应答。

还提供了在受试者中预防流感病毒疾病的方法，所述方法包括向受试者以有效预防受试者中的流感病毒疾病的量施用疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子，或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA，和任选的佐剂。同样地，本公开文本提供了用于预防受试者的流感病毒疾病的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子，或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA，和任选的佐剂。

还提供了在受试者中诱导针对流感病毒NA的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子，或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA，和任选的佐剂。同样地，本公开文本提供了用于在受试者中诱导针对流感病毒NA的免疫应答的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子，或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA，和任选的佐剂。

可以将包含编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA和任选的佐剂的疫苗组合物在流感感染的一种或多种症状发生之前或之后施用。也就是说，在一些实施方案中，可以预防性施用本文所述的疫苗组合物以预防流感感染或改善潜在的流感感染的症状。在一些实施方案中，如果受试者将与已知或怀疑已经被大流行流感病毒感染的其他个体或牲畜(例如，猪)接触和/或如果受试者将出现在已知或被认为流感感染常见或流行的地方，则所述受试者具有流感病毒感染的风险。在一些实施方案中，将疫苗组合物施用至患有流感感染的受试者，或受试者展现出通常与流感感染相关的一种或多种症状。在一些实施方案中，已知或认为受试者已经暴露于流感病毒。在一些实施方案中，如果已知或相信受试者已经暴露于流感病毒，则所述受试者具有流感感染的风险或易患流感感染。在一些实施方案中，如果受试者已经与已知或怀疑已经被大流行流感病毒感染的其他个体或牲畜(例如，猪)接触和/或如果受试者出现或已经出现在已知或被认为流感感染常见或流行的地方，则已知或相信所述受试者已经暴露于流感病毒。本文公开的疫苗组合物可以用于治疗或预防由季节性或大流行流感毒株之一或两者引起的疾病。

可以将根据本公开文本的疫苗组合物以适合于实现所需结局的任何量或剂量施用。在一些实施方案中，所需结局是诱导针对广谱流感毒株(包括季节性和大流行毒株两者)的持久适应性免疫应答。在一些实施方案中，所需结局是降低一种或多种流感感染症状的强度、严重程度、和/或频率，和/或延迟一种或多种流感感染症状的发作。所需的剂量将根据以下而在受试者之间有所不同：受试者的物种、年龄、体重和一般状况，被治疗的感染的严重程度，所使用的特定组合物及其施用方式。

在各种实施方案中，将本文所述的疫苗组合物施用至受试者，其中受试者可以是动物界的任何成员。在一些实施方案中，受试者是非人动物。在一些实施方案中，非人受试者是禽类(例如，鸡或鸟)、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，非人受试者是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。

在一些实施方案中，将本文所述的疫苗组合物施用至人受试者。在特定实施方案中，人受试者为6月龄以上，为6月龄至35月龄，为36月龄至8岁，或者为9岁以上。在一些实施方案中，人受试者是婴儿(小于36个月)。在一些实施方案中，人受试者是儿童或青少年(小于18岁)。在一些实施方案中，人受试者是老年人(至少60岁或至少65岁)。在一些实施方案中，人受试者是非老年成人(至少18岁且小于65岁)。

在一些实施方案中，本文所述的疫苗组合物的方法和用途包括初免-加强疫苗接种策略。初免-加强疫苗接种包括施用初免疫苗，然后在经过一段时间后，向所述受试者施用加强疫苗。免疫应答在施用初免疫苗后被“启动”，并且在施用加强疫苗后被“加强”。初免疫苗可以包括疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子，或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA，和任选的佐剂。同样，加强疫苗可以包括疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子，或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体神经氨酸酶，和任选的佐剂。初免疫苗组合物可以但不必需与加强疫苗相同。加强疫苗的施用通常是在施用初免组合物后的几周或几个月，优选约2-3周或4周、或8周、或16周、或20周、或24周、或28周、或32周。

可以将疫苗组合物使用任何合适的施用途径施用，包括例如肠胃外递送，如上所讨论的。

典型地，将编码如本文所述的经修饰的单体N2的人工核酸分子或含有如本文所述的经修饰的单体N2的四个拷贝的四聚体NA和佐剂作为相同疫苗组合物的组分一起施用。然而，人工核酸分子或四聚体NA和佐剂不是必需作为相同疫苗组合物的一部分施用。也就是说，如果需要，可以将人工核酸分子或四聚体NA和佐剂依序施用至受试者。

通过参考下述实施例，会更加全面地理解本公开文本。

实施例

实施例1.具有截短的茎区的NA的设计

如图1中所示的，设计了具有截短的茎区的工程化亚型2流感神经氨酸酶(“N2”)，其中野生型神经氨酸酶的氨基酸1-74(包括胞质结构域、跨膜区以及基本上全部茎区)被分泌信号和任选的组氨酸标签替代，所述组氨酸标签可以用于纯化截短的N2。该工程化N2称为dTM75。由于可以通过不涉及组氨酸标签的方法纯化截短的N2，因此重组截短茎构建体不是必需包括该组氨酸标签。设计另一个截短的N2，其中胞质结构域和跨膜区(氨基酸1-35)被分泌信号和组氨酸标签替代。该构建体在图1中被称为dTM36，并且包括整个茎区。图1中还描绘了1)工程化N2，其中胞质结构域、跨膜区和基本上全部茎区被分泌信号、组氨酸标签和全长异源四臂四聚化结构域替代(“tet-NA”)；和2)野生型N2(“WT”)，其具有短的N末端胞质结构域、跨膜区、茎区和头部区。来自A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016的N2序列(SEQID NO:72)在初始实验中用作代表性N2序列。tet-NA构建体的氨基酸序列示于SEQ ID NO:116中。

将dTM36、dTM75和tet-NA构建体在CHO细胞中表达，并且纯化至接近同质，用于进一步表征。通过MUNANA测定测量酶活性，并且比活性以nmol/min/μg蛋白表示。MUNANA测定基于先前描述的方法(Potier等人Anal.Biochem.94,287-296,1979)进行了修改。简言之，使用2'-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸(MUNANA)作为底物。样品中含有的神经氨酸酶切割MUNANA底物，释放4-甲基伞形酮(4-MU)，其为一种荧光化合物。通过测量荧光强度(RFU，相对荧光单位)来确定测试样品的神经氨酸酶活性。此外，具有已知浓度的NA样品的标准曲线可以用于确定在测试样品中的NA浓度(μg/ml)。

通过添加缓冲液[33.3mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES，pH 6.5)、4mM CaCl2、50mMBSA]和底物(100μM MUNANA)引发MUNANA反应。孵育1小时(37℃，伴随振荡)后，通过添加碱性pH溶液(0.2M Na₂CO₃)终止反应。在SpectraMax M5(Molecular Devices)上分别使用355和460nm的激发和发射波长检测荧光强度。相对于4MU参考值计算酶活性，并且结果以μM/60min表示总NA活性，并且以nmol/min/μg表示NA比活性。

dTM36变体的酶活性比tet-NA低得多，而dTM75变体具有与tet-NA相似/与其相比更高的活性。通过尺寸排阻色谱联用多角度光散射(SEC-MALS)分析(在实施例4中描述)，tet-NA是四聚体，dTM36主要是单体(90％)、具有少于10％的四聚体，并且dTM75至少90％是四聚体(表1)。基于该结果，选择dTM75设计用于在其他N2毒株中的进一步评价。

表1

样品	NA比活性	寡聚体状态
			Tet-NA_SG16	9.33	四聚体
dTM36_SG16	0.34	90％单体
			dTM75_SG16	14.57	至少90％四聚体

实施例2.来自37种不同N2毒株的dTM75的高通量(HT)筛选

接下来，使用来自37种天然存在的亚型2流感毒株的N2序列合成dTM75构建体，并且针对NA活性和四聚体形成进行筛选。将dTM75构建体插入质粒中，并且使用Expifectamine CHO转染试剂盒(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)按照制造商的方案将质粒转染至ExpiCHO细胞中。培养4-5天后，澄清含有可溶性截短NA蛋白的上清液，过滤并且等分用于进一步表征，包括NA活性和四聚体形成。

对澄清的上清液使用测定(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)按照制造商的方案测试神经氨酸酶活性水平。将样品收集在96孔板中并且进行连续3倍稀释。将样品转移至测定板，并且当测定完成时，在Envision读板仪中读取板。使用Prism软件分析和绘制数据。

为了测量四聚体NA的形成，开发了新的高通量结合测定。磷酸奥司他韦()是NA酶活性的竞争性抑制剂。奥司他韦底物对四聚体NA头部的酶位点具有特异性。使用磷酸奥司他韦作为配体以确定重组NA蛋白的结合动力学。重组NA与的结合表明在重组NA的头部区上存在活性位点，并且所述结合用于测量四聚体NA浓度。最初，使用tet-NA构建体，通过证明各种流感毒株的四聚体NA以剂量依赖性方式与结合，验证了结合测定。相比之下，无酶活性的单体NA胞外结构域变体不结合因此，结合测定中重组NA结合的水平与装配为四聚体的重组NA的浓度成比例。

对于结合测定，在链霉亲和素包被的生物传感器的表面上捕获磷酸奥司他韦-生物素缀合物(5-10μg/ml，在1xKB缓冲液(在PBS中1％ BSA+0.02％ Tween)中)，并且使用Octet仪器(ForteBio，Molecular Devices，LLC，加利福尼亚州费利蒙市)上的生物层干涉测量法(BLI)技术测量神经氨酸酶与磷酸奥司他韦的结合动力学。将生物传感器浸入含有连续2倍稀释的重组NA样品(0.16-10ug/ml，在1xKB中)的孔中。结合的分子数量的任何变化都会导致在检测器处测量到图案中的偏移。

如图2中所示，37种dTM75构建体中的许多具有显著的NA活性和/或 结合(四聚体形成)，包括例如来自以下毒株的dTM75构建体：A/Nevada/32/2013、A/Washington/60/2014、A/Nigeria/120/2014、A/Bangkok/1/1979、A/Kannur/MCVR5404/2010、A/HongKong/1774/99、A/Marrakech/79/2014、A/Albany/42/1975、A/Yamagata/62/1993、A/Peru/3216/2016、A/HongKong/CUHK13510/2001和A/Illinois/34/2012。包含全长异源四臂四聚化结构域的经修饰的A/Singapore/INFIMH160019/2016NA用作阳性对照。尽管在所有测试的流感亚型2毒株中dTM75构建体均未形成活性四聚体，但结合测定提供了便利的高通量筛选测定，其可以用于鉴定哪些截短的N2分子在细胞中表达时形成可溶性四聚体。

对来自约100种另外的亚型2流感毒株的dTM75构建体进行第二高通量筛选。部分结果在图3C-图3D中示出。当在细胞中表达时，来自A/PERTH/16/2009(PERT09)毒株的dTM75构建体形成约70％的四聚体。来自第二高通量筛选中测试的另外的毒株的约20％的dTM75构建体比PERT09 dTM75构建体展现出更高的结合。约38％的测试毒株中具有的结合在用来自PERT09的dTM75构建体观察到的结合的3倍内。参见图3C。经测试但未显示出在PERT09的3倍内的结合的另外的毒株是A/TE XAS/50/2012(SEQ ID NO:87)、A/PORTOALEGRE/LACENRS2376/2014(SEQ ID NO:69)、A/MEMPHIS/18/1978(SEQ ID NO:49)、A/BELGIUM/4217/2015(SEQ ID NO:5)、A/TAIWAN/1/1969(SEQ ID NO:81)、A/SIENA/3/1991(SEQ ID NO:71)、A/BRISBANE/273/2016(SEQ ID NO:7)、A/ONTARIO/RV3236/2016(SEQ ID NO:63)、A/TEHRAN/996/2012(SEQ ID NO:85)、A/ANKARA/2396/2015(SEQ ID NO:3)、A/KANSAS/14/2017(SEQ ID NO:45)、A/TEXAS/71/2017(SEQ ID NO:88)、A/HONGKONG/4801/2014(SEQ ID NO:30)、A/HONGKONG/3089/2017(SEQ ID NO:29)、A/FUKUOKA/DS729/2016(SEQ ID NO:12)、A/TOKUSHIMA/DS5288/2015(SEQ ID NO:89)、A/HELSINKI/823/2013(SEQ ID NO:22)、A/AL ASKA/251/2015(SEQ ID NO:1)、A/HATAY/4990/2016(SEQ ID NO:20)、A/HA NOI/ELI15597/2015(SEQ ID NO:19)、A/MISSISSIPPI/1/1985(SEQ ID NO:51)、A/INDIANA/18/2017(SEQ ID NO:36)、A/POLAND/19B/2017(SEQ ID NO:68)、A/TENNESSEE/18/2017(SEQ ID NO:86)、A/HONGKONG/1774/1999(SEQ ID NO:28)、A/DAKAR/14/2014(SEQ ID NO:10)、A/SAUDIARABIA/21/1999(SEQ ID NO:70)、A/GIFU/DS7388/2017(SEQ ID NO:15)、A/NEWYORK/581/1997(SEQ ID NO:57)、A/HELSINKI/941/2013(SEQ ID NO:23)、A/ISHIKAWA/DS7294/2017(SEQ ID NO:39)、A/GUANGDONGDUANZHOU/1227/2017(SEQ ID NO:16)、A/AUCKLAND/5/1996(SEQ ID NO:4)、A/ISHIKAWA/DS7215/2016(SEQ ID NO:38)、A/WESTVIRGINIA/17/2012(SEQ ID NO:98)、A/SINGAPORE/INFIMH160019/2016(SEQ ID NO:72)、A/KAGAWA/DS7115/2016(SEQ ID NO:42)、A/BILTH OVEN/21801/1971(SEQ ID NO:6)、A/FUKUOKA/DS72/2016(SEQ ID NO:11)、A/MORAMANGA/1907/2017(SEQ IDNO:52)、A/HUNAN/01/2014(SEQ ID NO:33)、A/WISCONSIN/16/2015(SEQ ID NO:100)、A/CANBERRA/13/2015(SEQ ID NO:8)、A/HONGKONG/107/1971(SEQ ID NO:27)、A/LYON/1242/2000(SEQ ID NO:48)、A/NAGANO/2153/2017(SEQ ID NO:53)、A/NANJING/49/1977(SEQIDNO:54)、A/ALBANY/6/1970(SEQ ID NO:2)、A/KAGAWA/DS769/2016(SE Q ID NO:41)、A/TAIWAN/4183/2004(SEQ ID NO:83)、A/KOREA/KUMCGR570/2011(SEQ ID NO:47)、A/SYDNEY/24/2015(SEQ ID NO:80)、A/KOREA/KUM CGR99/2011(SEQ ID NO:46)、A/TOKYO/DS7277/2017(SEQ ID NO:91)、A/HO NGKONG/CUHK18194/1998(SEQ ID NO:31)、A/GUNMA/DS7107/2016(SEQ ID NO:18)、A/HONGKONG/8/1968(SEQ ID NO:26)、A/TOKYO/DS7448/2017(SEQIDNO:93)、A/PERTH/61/2015(SEQ ID NO:65)、A/TW/875/2004(SEQ ID NO:95)、A/TAIWAN/2332/2001(SEQ ID NO:82)、A/INDIA/C058671/2005(SEQ ID NO:34)。

在第二高通量筛选中约25％的测试毒株低于检测水平。因此，虽然在测试的所有亚型2流感毒株中dTM75构建体不形成四聚体，但当dTM75构建体在细胞中表达时，大多数测试毒株确实形成可溶性NA四聚体，表明来自亚型2流感毒株的dTM75构建体展现出产生可溶性四聚体NA的高概率。此外，结合测定提供了快速筛选截短的NA构建体以确定哪些构建体形成期望的四聚体NA的便利方式。

实施例3.N2茎的连续缺失以鉴定另外的可溶性设计

为了评估具有更少茎截短的其他经修饰的N2蛋白是否可以产生可溶性四聚体NA，合成了一组来自PERT09背景的构建体，并且如上所述针对NA活性和结合进行筛选。一种构建体，即dTM36，缺少胞质结构域和跨膜结构域(即，PERT09的氨基酸1-35)，但含有整个茎结构域。参见图1。从野生型PERT09 NA序列的氨基酸60开始，并且一次缺失一个氨基酸，产生了一组茎截短变体，并且针对NA活性和结合进行测试并且与对于PERT09 dTM75变体获得的结果进行比较。PERT09茎截短变体和高通量筛选的结果在下表中示出。还参见图4。

表2

高通量筛选结果表明，一种截短物，即dTM73，具有比dTM75对照显著更高的结合活性。其他设计，包括dTM74、dTM72和dTM71，具有与dTM75类似的值。这些结果表明，可以使用与dTM75大小可比的其他茎截短变体来成功产生可溶性四聚体N2。

对两种另外的亚型2流感毒株进行连续缺失分析，并且延伸超过茎区的氨基酸74并进入NA头部区，所述NA头部区被认为起始于N2序列的氨基酸83附近。两种另外的毒株是A/BELGIUM/4217/2015(BELG15)和A/KANSAS/14/2017(KANS17)。合成了PERT09、BELG15和KANS17的从氨基酸60开始并且延伸至氨基酸90的依序缺失突变体，并且如上所述进行高通量筛选。在所有三个测试毒株中缺少整个茎区的截短N2茎变体形成可溶性四聚体NA。从该筛选测定，还示出延伸至推定的头部区中的茎缺失仍然能够形成四聚体NA。虽然缺少N2蛋白的直到前84个氨基酸的截短变体能够形成四聚体，但在所测试的三种N2流感毒株中将截短延伸超过氨基酸84不会导致形成可溶性四聚体NA。筛选分析还示出，在测试的所有三种毒株中，可溶性四聚体NA可以由可变长度的截短的茎变体形成，其中N2茎区的氨基酸36至约至少氨基酸70-84已经缺失。例如，对于PERT09、BELG15和KANS17，许多不同的茎截短变体形成了四聚体NA，其中dTM73和dTM74构建体示出PERT09的结合量最高，dTM76、dTM78和dTM82构建体示出BELG15的结合量最高，以及dTM78和dTM83构建体得出KANS17的结合量最高。结果示于图4中。

实施例4.dTM75的大规模生产和纯化

大规模(典型地200ml)表达和纯化来自以下五种亚型2流感毒株的dTM75构建体：PERT09、BELG15、KANS17、A/Peru/4617/2017(PERU17)和A/Texas/71/2017(TEX17)，用于详细表征产量、酶活性和构象。如上所述，来自这些毒株的每一种的含有全长异源四臂四聚化结构域(“tetNA”)的重组NA构建体也被大规模表达和纯化。

简言之，用1mg/mL的编码dTM75构建体的质粒转染CHO-S细胞。使用Gibco ExpiCHO转染试剂(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行转染。在转染后一天，培养细胞并且将温度从36.5℃转变至32℃。在转染后第4天，将细胞以10,500xg离心30分钟，并且通过0.2μm真空过滤器过滤上清液。将澄清的上清液使用掺入dTM75蛋白中的6His标签(SEQ ID NO:135)通过固定化金属离子色谱(IMAC)纯化。将HisTrap^TM HP(MilliporeSigma，马萨诸塞州伯灵顿)柱(其预装有高性能Ni琼脂糖并且被设计用于简单一步纯化带组氨酸标签的蛋白质)用20mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)和500mM氯化钠(NaCl)平衡。将澄清的上清液样品直接加载到HHisTrap^TM HP(Millipore Sigma，马萨诸塞州伯灵顿)柱上(5mL柱/200mL上清液)。将柱用平衡缓冲液洗涤，并且使用具有500mM NaCl和1M咪唑缓冲液的线性梯度的洗脱缓冲液20mM PBS(0-100％洗脱缓冲液，经10个柱体积)洗脱靶蛋白。该初始Ni亲和色谱步骤捕获单体和四聚体NA。

BELG15、PERT09、PERU17、TEX17和KANS17的纯化的dTM75样品的总产率是通过测量在适当的摩尔消光系数的情况下的A280蛋白浓度乘以每个回收池的体积来计算。池是指洗脱峰。KANS17在两个峰中洗脱，其中较大峰代表单体NA，并且另一个峰代表四聚体NA。对于剩余的dTM75构建体，在峰之间没有观察到可区分的分离度，并且因此，收集到代表单体和四聚体NA的混合物的单池。对于所有dTM75构建体观察到高总产量，对于BELG15、PERT09、PERU17、TEX17和KANS17在约25-250mg/L的范围内。

将从初始Ni亲和色谱步骤获得的样品进行尺寸排阻色谱联用多角度光散射(SEC-MALS)以确定纯化的dTM75池的纯度和分子量，并且进行进一步表征(热稳定性、结合和NA活性)。对于SEC-MALS，使用来自Tosoh Bioscience的TSK-GEL G4000PWXL(7.8mm X 30cm)柱。柱的流动相是含有0.02％叠氮化钠的1x PBS，pH 7.4。(Waters Corporation，马萨诸塞州米尔福德)软件用于在色谱图上对UV峰面积进行积分。基于具体峰面积/总峰面积的百分比计算样品的纯度。通过ASTRA(Wyatt Technologies，加利福尼亚州圣巴巴拉市)软件使用光散射信号和浓度检测器(RI或UV)测定峰中的蛋白质的分子量(MW)。重组N2单体(胞外结构域)具有约74kD的MW，而由tet-NA构建体形成的四聚体NA具有约262kD的MW，是单体NA的约4倍。

SEC-MALS分析的结果在图5中示出。对于来自KANS17的dTM75构建体，池1样品的MW为约60kD，与茎截短的NA单体的预期大小一致，而池2的MW为约210kD，与由茎截短的NA(没有全长四臂结构域)形成的四聚体NA的预期大小一致。图5(底部小图)。KANS17 dTM75的池2级分含有几乎100％的四聚体NA。图5(顶部小图)。对于BELG15、PERT09、PERU17和TEX17，收集到单池并且通过SEC-MALS分析。这些单池中的每一个的计算MW为约210kD，表明为四聚体NA。图5(底部小图)。还分析了这些单池中的每一个池的主峰，以确定单池中四聚体NA的纯度，该纯度在测试的不同毒株之中变化。来自PERT09的dTM75构建体产生约70％的四聚体NA；来自PERU17的dTM75构建体产生约40％-45％的四聚体NA；来自TEX17的dTM75构建体产生约30％的四聚体NA；来自BELG15的dTM75构建体产生约20％的四聚体NA。图5(顶部小图)和图6。来自所有五种毒株的tetNA构建体产生约90％-100％的四聚体。图6.

纯化的四聚体NA经受进一步表征。如上所述测试四聚体NA的TAMIFLU结合和酶活性(MUNANA测定)。所有纯化的dTM75构建体均展现出结合。图6.来自PERT09的dTM75构建体具有最高的结合，与PERT09tet-NA的结合可比，随后是KANS17和PERU17，PERU17也示出与PERU17tet-NA构建体可比的结合。图6.所有形成四聚体NA的构建体均具有酶活性。图6.只有KANS17池1级分(单体NA)是无酶活性的。图6.

还使用Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR仪器和Protein ThermalShift^TM(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)软件以通过玻尔兹曼(Boltzmann)或微分曲线方法计算蛋白质熔解温度(Tm)来测试四聚体NA的热稳定性。对于KANS17dTM75构建体，与池1(单体)级分相比，池2(四聚体)纯化级分具有更高的Tm，示出四聚体NA是比单体NA更稳定的分子。图6.

这些大规模生产和纯化实验示出，截短的N2茎设计可以应用于各种亚型2流感毒株，以成功产生可溶性的有酶活性的四聚体NA。一些毒株，像PERT09和PERU17，可以产生更高比例的四聚体NA。一些毒株，像PERT09和KANS17可以产生对具有更高结合亲和力的四聚体NA。然而，设计策略可以一致地用于获得亚型2流感毒株中的四聚体NA。

实施例5.另外的截短的茎变体的大规模生产和纯化

大规模表达在PERT09 N2背景中的另外的截短的茎变体，并且通过如上所述的Ni-亲和纯化进行纯化。具体地，将以下PERT09构建体合成，插入质粒中，转染至CHO-S细胞中，并且纯化：dTM71、dTM72、dTM73、dTM74和dTM75。所有截短的茎变体都产生了可以纯化的四聚体NA，通过SEC-MALS证实了由高通量结合测定鉴定的其他截短的茎变体形成四聚体NA，并且证明在大规模生产后可以获得由这些截短的茎变体形成的大量高度纯化的四聚体NA。如下表3中所示，截短的茎变体的预计四聚体产率的范围为从约50mg/L至约135mg/L，并且所有构建体都具有酶活性，具有结合活性和约48-52Tm的热稳定性。还参见图7。

表3

实施例6.dTM75构建体在小鼠中的免疫原性

使用初试小鼠模型来评估重组的、截短的茎N2变体的免疫原性。Sultana等人,Vaccine 29(2011)2601-2606；Eichelberger等人,Current Opinion in Immunology2018,53:38-44。在第0天和第21天用与水包角鲨烯佐剂(AF03)一起配制的1微克剂量的经Ni亲和纯化的重组修饰的N2肌内(IM)免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(n＝6只/组)两次。实验时间表在图8A中展示。在第二次免疫接种后14天收集血清。

使用神经氨酸酶特异性酶联免疫吸附测定(NA ELISA)测试免疫小鼠的NA特异性抗体的存在。将源自目的H3N2毒株的His标记的tet-NA固定在镀镍板上。洗涤板后，将它们用5％牛奶BLOT-QuickBlocker^TM(G-BioSciences，密苏里州圣路易斯)封闭以消除非特异性结合。接下来，将板与来自免疫小鼠的连续稀释的血清一起孵育，以允许结合抗NA抗体，随后与HRP连接的山羊抗小鼠IgG检测抗体(ABCAM，英国剑桥)一起孵育，并且引入含有TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)和过氧化氢的混合物。通过添加酸性终止缓冲液终止反应。用读板仪SpectraMaxi3(Molecular Devices，加利福尼亚州圣地亚哥)读取450nm处的吸光度。使用GraphPad Prism(加利福尼亚州圣地亚哥)软件用非线性4PL曲线得出近似OD450值，并且计算50％最大有效浓度(EC50)。

通过酶联凝集素测定(ELLA)测量针对含有源自目的H3N2毒株的NA的H6N2重配病毒的神经氨酸酶抑制性抗体应答。简言之，在胎球蛋白包被的板中滴定含有源自目的H3N2毒株的NA的H6N2重配病毒，以确定提供70％的最大NA酶活性的病毒的标准量。通过对热灭活的血清进行连续稀释并且在胎球蛋白包被的板中添加标准量的病毒，来实现免疫小鼠血清中存在的NA抑制(NAI)抗体的滴定。将血清-病毒混合物孵育过夜。洗涤板并且在与过氧化物酶缀合的PNA一起孵育后显色。相对于病毒对照的低信号或无信号表明由于NA特异性抗体的存在而抑制NA活性。使用GraphPad Prism软件用非线性4PL曲线得出近似NAI滴度，并且计算50％最大抑制浓度(IC50)。

根据图8A中展示的时间表，用包含水包角鲨烯佐剂(AF03)和来自KANS17、BELG15和PERT09的经Ni亲和纯化的dTM75变体或来自每种毒株的tet-NA阳性对照的疫苗组合物免疫初试BALB/c小鼠。对于KANS17，施用两种疫苗组合物，一种含有单体dTM75 NA(获自池1洗出液)，和四聚体dTM75 NA(获自池2洗出液)洗出液。如通过ELISA所测量的，池2的KANS17dTM75引发在大小上与KANS17 tet-NA阳性对照可比的NA特异性IgG应答。图8B.与四聚体池2级分相比，来自KANS17 dTM75的池1级分的单体NA引发更低的ELISA滴度。图8B.类似地，如通过ELLA所确定的，池2的KANS17 dTM75级分引起比池1的KANS17 dTM75级分高得多的NAI应答，但与KANS17 tet-NA对照相比更低。图8B.

由PERT09和BELG15 dTM75构建体形成的四聚体NA引发高同源ELISA滴度，类似于用来自KANS17的四聚体dTM75获得的结果。图8B.总IgG NA特异性应答在所有三种测试的dTM75构建体之间是可比的，并且接近tet-NA对照的那些。类似于来自KANS17的四聚体dTM75，来自PERT09和BELG15的四聚体dTM75也引发NAI应答，但低于由tet-NA诱导的NAI应答。图8B.

接下来，扩展小鼠免疫原性研究以评价其他不同长度的N2茎截短的变体并且将它们与dTM75构建体进行比较。具体地，评价以下PERT09 dTM变体的免疫原性：dTM74、dTM73、dTM72和dTM71，并且与PERT09 dTM75和tet-NA构建体进行比较。根据图9A中展示的时间表，在第0天和第21天用dTM变体加水包角鲨烯佐剂(AF03)或tet-NA对照加佐剂(AF03)免疫初试BALB/c小鼠。

如上所述，在第35天通过ELISA测量NA特异性IgG应答，并且表示为EC50ELISA滴度。通过ELLA测量针对表达同源全长NA的H6N2重配病毒的NAI应答，并且如上所述表示为IC50 NAI滴度。将单独的动物滴度归一化(Log2)并且绘制为箱形图。虚线指示测定的检测下限(LLD)，而灰色阴影区域代表tet-NA对照蛋白的4倍内的滴度。如图9B中所示，PERT09dTM75、dTM74、dTM73、dTM72和dTM71变体在初试小鼠中的免疫原性与tet-NA对照是可比的。

总体而言，这些小鼠数据表明，由多种长度的且来自不同N2毒株的不同的截短的N2茎变体形成的四聚体NA在小鼠中诱导NA特异性抗体应答。

实施例7.dTM75构建体在预免疫雪貂中的免疫原性

雪貂先前已经用于评估流感神经氨酸酶的免疫原性，但大多数研究都专注于对疫苗的初试应答或对自然感染的应答(Bosch等人J.Virol.2010年10月,第10366-10374页)。这里，代替使用初试或自然感染的雪貂，开发了新的免疫原性模型，其中对雪貂通过鼻内途径用表达目的野生型NA的流感H1N2重配病毒预免疫，所述目的野生型NA例如为来自用于开发截短的茎变体的亚型2流感毒株之一(如KANS17 H3N2毒株)的野生型NA。这种预免疫雪貂模型测量了重组NA抗原回忆或加强由先前病毒感染引起的应答的能力。

根据图10A中所示的时间表免疫Fitch雪貂。具体来说，对雪貂在第0天用单一鼻内(IN)剂量的含有野生型KANS17 NA的H1N1病毒重配体进行免疫，并且在第21天用单一肌内(IM)剂量的无佐剂、纯化的KANS17 dTM75或tet-NA进行免疫，并且21天后对动物取血，以如上所述通过ELISA和ELLA评价NA特异性应答。

如通过ELISA所测量的，KANS17 dTM75变体N2有效地加强了预免疫雪貂中的IgG特异性NA应答，其中dTM75变体N2产生比tet-NA对照略高的ELISA滴度。图10B.来自BELG15和KANS17的dTM75变体产生与tet-NA对照可比的ELISA滴度。与模拟疫苗接种的动物(仅H1N2病毒预免疫的组)相比，具有dTM75-NA设计的单次肌内疫苗接种能够将预免疫雪貂中的NAI应答加强3倍(PERTH09)至5倍(BELG15和KANS17)。图10B.

总体而言，这些预免疫雪貂数据表明使用本申请中公开的N2截短的茎设计形成的四聚体NA是高度免疫原性的。即使在单次免疫接种后和在没有佐剂的情况下，在病毒预暴露的雪貂中也观察到高NA特异性抗体应答。

实施例8.用重组截短的NA变体免疫的初试雪貂中的免疫原性和针对病毒感染和/或疾病严重程度的保护

评估用重组截短的NA变体(PERT09 dTM75)免疫的初试雪貂的免疫原性、针对病毒感染和/或疾病严重程度的保护。图12A.对于这项研究，对远交17-21周龄初试雄性Fitch雪貂(n＝9/组)在第0天和第21天用经Ni亲和纯化的重组PERT09 dTM75或作为阳性对照的PERT09 tet-NA，使用与AF03佐剂一起配制的5μg剂量或有或没有佐剂情况下的45μg剂量肌内(IM)免疫两次。对阴性对照组在第0天和第21天用磷酸盐缓冲盐水(模拟)或模拟+佐剂肌内注射。对另外的对照组在第0天鼻内接种低剂量(10e3噬斑形成单位(PFU))的同源H3N2病毒(A/PE/09预感染)，随后在第21天鼻内接种模拟。用45μg剂量的重组HA(rHA)免疫的雪貂组也用作对照。参见表4。

对所有组在第二次(加强)给药前一天(第20天)取血，然后在三周后(第42天)在病毒攻击前取血。图12B.为了评估免疫原性，如上文实施例6中所述，对血清样品(储存在-20℃直到需要)使用ELLA测定NAI(IC50)或使用ELISA测定NA特异性IgG滴度(EC50)。

在第43天，对所有雪貂组鼻内接种10⁶PFU的PERT09 H3N2野生型甲型流感攻击病毒(1,000μL/剂量，在鼻孔之间均匀分开)。另外的对照组经由灌胃途径接受(10mg/kg/天)，分成两个日剂量，并且初始给药在攻击后6小时开始。在攻击后14天监测动物的临床症状，包括体重变化(每日一次)和温度变化(每日两次)。在攻击后第57天收集血清并且储存在-20℃直到进行如上所述的ELLA或ELISA测试。图12B.

为了评估总病毒脱落，在攻击后第1天和第7天之间每日从所有被攻击的动物收集鼻洗液，并且将样品储存在-65℃或低于-65℃。用氯胺酮(25mg/kg)和甲苯噻嗪(2mg/kg)混合物麻醉雪貂，并且将0.5mL含有青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和庆大霉素(50μg/mL)的无菌PBS注射至每个鼻孔中，收集并且储存在-65℃或低于-65℃。通过标准的50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)测定滴定鼻洗液样本中的病毒。将鼻洗液解冻，然后通过离心澄清。将所得上清液进行10倍连续稀释，然后转移至含有单层Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)细胞的96孔板的相应孔中用于滴定。

如图13中所示，与模拟(有或没有佐剂)相比，基于PERT09的dTM75在攻击之前(第20天和第42天)和之后(第57天)引发更高水平的NAI滴度。NAI滴度通过佐剂加强。dTM75与佐剂(5μg和45μg)在第二次免疫接种后诱导的NAI滴度水平高于由先前感染诱导的滴度水平。佐剂的添加是剂量节约的(例如，5μg+AF03比没有佐剂的45μg更具免疫原性)。对于NAELISA滴度观察到类似的趋势。图14.

如图15-图18中所示，与模拟相比，PERT09 dTM75疫苗接种降低了病毒脱落和疾病严重程度，如由在初试雪貂中同源H3N2攻击后降低的体温峰值(发烧)变化和降低的体重峰值变化所指示的。NA介导的用于减少病毒脱落的保护作用的特征是佐剂依赖性，其中在存在佐剂的情况下5μg剂量导致最高的减少，与rHA组中的减少可比并且显著高于组中的减少。图15和图16.尽管PERT09 dTM75在减少病毒脱落方面显现不如预先感染有效，但该结果是预期的，因为感染除了提供针对保守表位的T细胞免疫之外还提供抗NA和抗HA免疫。

NA介导的针对体温峰值升高的保护的特征在于剂量和佐剂依赖性。与模拟相比，仅添加佐剂AF03的(5μg和45μg)PERT09 dTM75或tet-NA的剂量显著降低。图15和图17.尽管不显著，但与模拟相比，在所有处理组中观察到NA介导的针对体重峰值降低的保护。然而，这些差异不显著。图15和图18.

总体而言，初试雪貂数据表明PERT09 dTM75诱导NA特异性抗体应答，其与保护免受感染和疾病严重程度相关。

表4

实施例9.在用不匹配的血凝素的背景下的重组神经氨酸酶免疫的初试雪貂中的免疫原性和针对病毒感染和/或疾病严重程度的保护

使用初试雪貂攻击模型以证明将重组NA与来自不匹配的流感毒株的HA组合的疫苗策略的益处。一般疫苗接种时间线概述于图12B中，而进一步的细节总结于表5中。

表5

对于这项研究，对远交17-21周龄初试雄性Fitch雪貂(n＝9/组)在第0天和第21天用5μg或45μg的1)A/Perth/16/2009重组N2 dTM75、2)不匹配的A/Singapore/INFIMH160019/2016重组血凝素(rHA)、或3)PERT09 dTM75-NA和SING16rHA二者的组合，进行两次肌内免疫(IM；500μL/剂量)。施用具有1:1比率的AF03佐剂的5μg剂量。加强疫苗接种后三周，雪貂接受10^3PFU的A/Perth/16/2009H3N2野生型甲型流感病毒(1,000μL/剂量，在鼻孔之间均匀分开)的鼻内攻击。在攻击后14天内，每日一次监测动物的临床症状和体重变化，以及每日两次监测体温。攻击后1-7每天从所有受攻击的动物收集鼻洗液，并且将样品储存在≤-65℃用于病毒脱落评估。对第1组仅用PBS稀释剂免疫，并且用作阴性对照以展现攻击/感染后最严重的症状。第2组在D0接受A/Perth/16/2009H3N2病毒的活体鼻内攻击(预感染)，而不是用PERT09 dTM75-NA或SING16-rHA进行疫苗接种，并且用作阳性对照，因为它对攻击的保护最好。如表6中总结的，评估研究的终点。

表6

对所有雪貂在基线(D0)和在初免后三周(加强前一天或就在加强前，D20)和加强疫苗接种后三周(D42)以及攻击后两周(D57)镇静下取血，并且将血清样品(储存在-20℃直到需要)如上所述通过ELLA测试以评估NAI活性，如上所述通过NA ELISA评估结合抗体水平，以及通过血凝素抑制测定(HAI)评估对A/Perth/16/2009病毒或SING16-rHA的血凝素抗原的抗体应答。在攻击后14天内，每日一次监测动物的临床症状和体重变化，以及每日两次(AM和PM)监测体温。鼻内攻击后，每日从实验感染的雪貂中收集鼻洗液样本。如下通过标准的50％组织培养感染剂量(TCID50)测定滴定鼻洗液样本中的病毒。将鼻洗液解冻，然后通过离心澄清。将所得上清液进行10倍连续稀释，然后转移至96孔板的相应孔中，用于在单层Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)细胞上滴定。

基本上如上文实施例6中所述，通过ELLA测量针对含有源自目的毒株的NA的H6重配病毒的NAI抗体应答。在初始剂量或初免后三周和加强疫苗接种后三周收集血清，并且经由ELLA进行测试以分别使用H6N2 A/Perth/16/2009病毒作为唾液酸酶来源评估NAI抗体活性。用单一PERT09 dTM75-NA或dTM75NA和rHA的组合免疫的组之间的NAI应答的比较未揭示任何统计学上显著的差异。图19.在施用活病毒(PERT09预感染)或用低剂量(5μg+AF03)或高剂量(45μg)PERT09 dTM75-NA免疫的所有雪貂中观察到抗NA A/Perth/16/2009滴度(ELLA)随时间(D20、D42和D57)的稳健诱导。图19.含有低剂量(5μg+AF03)dTM75-NA(仅dTM75-NA或dTM75-NA+rHA)的疫苗配制品与含有高剂量(45μg)dTM75-NA的疫苗配制品相比诱导更高的NAI滴度。图19.

在施用活病毒(PERT09预感染)或用低剂量(5μg+AF03)或高剂量(45μg)PERT09dTM75-NA免疫的所有雪貂中观察到抗NA A/Perth/16/2009结合(ELISA)滴度随时间(D20、D42和D57)的稳健诱导。图20.在初始剂量或初免后三周和加强疫苗接种后三周收集血清，并且基本上如上文实施例6所述经由ELISA测试以评估NA结合滴度。用单一PERT09 dTM75-NA或dTM75-NA和rHA的组合免疫的组之间的ELISA NA结合滴度的比较与ELLA数据一致，未揭示任何统计学上显著的差异。与NAI滴度一样，含有低剂量(5μg+AF03)dTM75-NA(仅dTM75-NA或dTM75-NA+rHA)的疫苗配制品与含有高剂量(45μg)dTM75-NA的疫苗配制品相比诱导更高的ELISA滴度。图20.

在第二次免疫接种后(D42)，由含有rHA或dTM75-NA+rHA的疫苗配制品在没有另外的加强的情况下诱导稳健的SING16 HAI抗体滴度。图21.在初始剂量或初免后三周和加强疫苗接种后三周收集血清，并且经由HAI测试以评估对A/Singapore/INFIMH 160019/2016rHA的应答。用单一SING16-rHA或dTM75NA和rHA的组合免疫的组之间的HAI滴度的比较与ELLA和ELISA数据一致，未揭示任何统计学上显著的差异。图21.有趣的是，在用A/Perth/16/2009病毒攻击后，在D57观察到另外的SING16 HAI滴度加强(4-10倍)，表明异源攻击后交叉反应性HAI滴度增加。图21.与NAI和ELLA滴度一致，含有低剂量(5μg+AF03)dTM75-NA(仅dTM75-NA或dTM75-NA+rHA)的疫苗配制品与含有高剂量(45μg)dTM75-NA的疫苗配制品相比诱导更高的SING16 HAI滴度。图21.

为了测量HAI滴度，在HAI测定之前，用破坏受体的酶(RDE；Denka Seiken，Co.，日本)处理血清以灭活非特异性抑制物。简言之，将三份RDE添加至一份血清中，并且在37℃孵育过夜。将RDE通过在56℃下用6倍血清体积孵育30分钟来灭活，并且添加至在v底96孔微量滴定板中2倍连续稀释的经0.9％盐水RDE处理的血清中。将来自组中的等体积的每种病毒(调节至4血凝单位(HAU)/50μL)添加至每个孔中。对于目前的研究，同源病毒组包括在蛋中生长的A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)病毒。将板覆盖并且在室温下孵育20分钟，随后添加在PBS中的1％鸡红细胞(CRBC)(Lampire Biologicals)。将板通过搅动混合并且覆盖，并且允许RBC在室温下沉淀1小时。通过含有非凝集RBC的最后一个孔的稀释度倒数确定HAI滴度。

在A/Perth/16/2009病毒攻击后(D57)，由含有rHA或dTM75-NA+rHA的疫苗配制品在没有另外的加强的情况下诱导稳健的PERT09 HAI抗体同源滴度。图22.在初始剂量或初免后三周和加强疫苗接种后三周收集血清，并且经由HAI测试以评估能够中和A/Perth/16/2009病毒的抗体滴度。用单一SING16-rHA或dTM75-NA和SING16-rHA的组合免疫的组之间的HAI滴度的比较与ELLA和ELISA数据一致，未揭示任何统计学上显著的差异。图22.有趣的是，在用SING16-rHA或SING16-rHA和dTM75-NA的组合免疫的组中，在第42天观察到低水平的交叉反应性，这证明了针对PERT09病毒的可检测的异源滴度(>50HAI滴度)。图22.

用单独或组合施用的两个剂量的PERT09 dTM75-NA或SING16 rHA进行免疫接种，提供了针对由活A/Perth/16/2009病毒攻击诱导的体重减轻的保护。图23A-图23C.在攻击后14天的时间段内观察到体重的变化(图23A-图23B)。到第6天，未接种疫苗的动物(PBS对照组)体重减轻高达9.8％，而5μg SING16 rHA+AF03或5μg SING16 rHA+5μg PERT09dTM75-NA+AF03的组合分别体重减轻5.3％和3.9％(图23C)。接种疫苗的动物显现出比未接种PBS的组更快地恢复体重。包含5μg dTM75NA与5μg rHA和AF03组合的疫苗配制品提供了类似于PERT09-预感染雪貂的防止体重减轻的保护。图23A和图23C.

在攻击后7天内每日评估病毒脱落，并且TCID50/ml滴度的变化呈现在图24A-图24B中。对于包含5μg dTM75NA与5μg rHA和AF03的组合的疫苗配制品，病毒脱落的持续时间和强度(AUC)明显降低。图24A-图24C.计算所有组的AUC，并且成对比较分析证明，与PBS对照组相比，所有低剂量(5μg+AF03)组(dTM75-NA、rHA或dTM75-NA和rHA的组合)诱导统计学上显著减少的病毒脱落(图24C)。此外，攻击后2天的log10TCID50/ml值证明低剂量(5μg+AF03)组合组(1.3Log10)和仅rHA组(1.6Log10)的病毒脱落滴度最低，然而，这些降低的滴度与未受保护的PBS对照组(2.8Log10)没有统计学上显著的差异。

在用较低剂量(5μg+AF03)接种疫苗的所有组中，与未接种疫苗(PBS)的动物相比，感染的持续时间和感染的雪貂的数量随时间减少，感染的持续时间从6天减至3天(图25A)。高剂量(45μg)组证明仅在rHA组中病毒脱落持续时间减少，而在接种高剂量dTM75-NA或高剂量dTM75-NA+rHA的两组中均未减少感染时间(长达6天)。图25A.在14天的时间段内每日监测体温(BT)，证明与PBS对照相比，发烧减少，呈现出所有接种疫苗的组在下午(PM)的体温峰值升高。图25B.对于AM体温峰值，仅在PBS对照组与PERT09预感染雪貂组之间鉴定出统计学上显著的差异，其中体温的总体峰值分别为1.6和0.9摄氏度。图25B.

总之，在雪貂攻击研究中，包含rNA变体和rHA的组合的疫苗配制品的血清学数据与包含仅rNA变体或仅rHA的疫苗配制品的血清学数据相似，其中低剂量配制品(5μg+佐剂)与高剂量配制品(45μg，无佐剂)相比持续诱导更高的滴度。尽管血清学数据相似，但重组NA变体加上来自不匹配的流感毒株的重组HA在雪貂攻击模型中提供了增加的保护。用dTM75-NA和rHA的低剂量(5μg+AF03)组合进行疫苗接种的动物的体重减轻与未进行疫苗接种的动物的体重减轻显著不同。此外，用低剂量(5μg+AF03)rHA或低剂量(5μg+AF03)dTM75-NA和rHA的组合进行疫苗接种的动物展现出病毒脱落(AUC)和病毒清除时长的显著降低。

尽管出于清楚和理解的目的，已经通过说明和举例的方式比较详细地描述了前述公开文本，但是本领域普通技术人员通过阅读本公开文本将清楚，可以在不脱离本公开文本的真实范围的情况下在形式和细节上做出各种变化并且可以在所附权利要求的范围内实践。例如，所有蛋白质构建体、方法和/或组分特征、步骤、要素或其其他方面可以以各种组合使用。

除非上下文明确指示相反或其他含义，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、用于或以其他方式相关于给定产物或工艺，则包括一组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或说明被视为满意的。本公开文本包括如下实施方案，在所述实施方案中组中的恰好一个成员存在于、用于或以其他方式关联于给出的产品或方法。本公开文本还包括其中多于一个或全部组成员存在于、用于或以其他方式关联于给定产物或方法的实施方案。此外，应理解，本公开文本涵盖其中将来自所列权利要求中的一项或多项的一种或多种限制、要素、条款、描述项等引入从属于相同基础权利要求(或相关的任何其他权利要求)的另一权利要求中的所有变型、组合和排列，除非另有说明或除非本领域普通技术人员清楚会出现矛盾或不一致。在要素被呈现为列表(例如以马库什群组或类似形式)的情况下，应理解还公开了所述要素的每个子组，并且可以从所述群组中移除一种或多种任何要素。应理解，通常，在本公开文本的实施方案或方面被称为包括特定要素、特征等的情况下，某些实施方案和方面由此类要素、特征等组成或基本上由此类要素、特征等组成。为了简单起见，这些实施方案并不是在每种情况下都以如此多的词语在本文中具体阐述。还应理解，本公开文本的任何实施方案或方面都可以明确地从权利要求中排除，而不管在本说明书中是否叙述了特定的排除。

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Claims (46)

1.一种经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶包含：

信号肽；和

流感病毒亚型2神经氨酸酶的头部区，

其中所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的胞质尾、跨膜区以及全部或基本上全部茎区已被所述信号肽替代，

其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶不包括异源寡聚化结构域，并且

其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶在宿主细胞中的表达导致所述宿主细胞分泌四聚体神经氨酸酶。

2.一种编码根据权利要求1所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶的人工核酸。

3.一种四聚体神经氨酸酶，所述四聚体神经氨酸酶包含经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶的四个拷贝，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶包含：

流感病毒亚型2神经氨酸酶的头部区，

其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶不包含流感病毒亚型2神经氨酸酶的胞质尾、跨膜区和全部或基本上全部茎区，并且

其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶不包括异源寡聚化结构域。

4.根据权利要求1所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、根据权利要求2所述的人工核酸分子、或根据权利要求3所述的四聚体神经氨酸酶，其中在所述宿主细胞中表达所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶后，宿主细胞上清液包含经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶，所述经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶至少包含所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶的四聚体神经氨酸酶和单体形式，并且其中所述四聚体神经氨酸酶占所述宿主细胞上清液中所述经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶的至少40％、至少60％、至少80％或至少90％，如通过尺寸排阻色谱所测量的。

5.根据权利要求1、2或4中任一项所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶或人工核酸分子，其中流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1至至少氨基酸70-82已被所述信号肽替代；或根据权利要求3或4所述的四聚体神经氨酸酶，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶缺少所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的茎区或缺少所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1至70-82。

6.根据权利要求5所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶或人工核酸分子，其中所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1-70、1-71、1-72或1-73已被所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶中的信号肽替代；或根据权利要求5所述的四聚体神经氨酸酶，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2缺少所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1-70、1-71、1-72或1-73。

7.根据权利要求5所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶或人工核酸分子，其中所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1-74已被所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶中的信号肽替代；或根据权利要求5所述的四聚体神经氨酸酶，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶缺少所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1-74。

8.根据权利要求5所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶或人工核酸分子，其中所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1-75、1-76、1-77、1-78或1-79已被所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶中的信号肽替代；或根据权利要求5所述的四聚体神经氨酸酶，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶缺少所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1-75、1-76、1-77、1-78或1-79。

9.根据权利要求5所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶或人工核酸分子，其中所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1-80、1-81或1-82已被所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶中的信号肽替代；或根据权利要求5所述的四聚体神经氨酸酶，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶缺少所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1-80、1-81或1-82。

10.根据权利要求5所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶或人工核酸分子，其中所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1-82已被所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶中的信号肽替代，并且其中所述头部区的第一个氨基酸或第一个和第二个氨基酸已经缺失；或根据权利要求5所述的四聚体神经氨酸酶，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶缺少所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的氨基酸1-83或1-84。

11.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述信号肽是哺乳动物信号肽。

12.根据权利要求11所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述哺乳动物信号肽是CD5信号肽。

13.根据权利要求12所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述CD5信号肽包含氨基酸序列MPMGSLQPLATLYLLGMLVASVLS(SEQID NO:132)或MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG(SEQ ID NO:133)。

14.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶进一步包含接头序列，所述接头序列将所述头部区连接至所述信号肽或至所述茎区的C末端氨基酸。

15.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述接头序列包含甘氨酸和/或丝氨酸残基并且长度为2-10个氨基酸。

16.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中宿主细胞是哺乳动物细胞。

17.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述流感病毒亚型2神经氨酸酶来自护理标准流感毒株。

18.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述流感病毒亚型2神经氨酸酶来自甲型流感病毒。

19.根据权利要求18所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述甲型流感病毒是以下之一：A/Perth/16/2009、A/Kansas/14/2017、A/Belgium/4217/2015、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016、A/Switzerland/8060/2017、A/Nevada/32/2013、A/Yamagata/62/1993、A/Nigeria/120/2014、A/Bangkok/1/1979、A/Albany/42/1975、A/Washington/60/2014、A/HongKong/CUHK13510/2001、A/Marrakech/79/2014、A/HongKong/1774/99、A/Illinois/34/2012、A/Kannur/MCVR5404/2010、A/Peru/3216/2016、A/Ohio/13/2017、A/Nanjing/1663/2010、A/Fukuoka/DS7282/2017、A/Ohio/62/2012、A/Minnesota/11/2010、A/Utah/11/2011、A/Hokkaido/10H079/2011、A/Ishikawa/DS7157/2016、A/Gambia/G0071436/2012、A/Kagawa/DS722/2016、A/South_Australia/85/2018、A/Victoria/361/2011、A/Tokyo/DS7334/2017、A/Hochiminh/4596/2010、A/Kagawa/DS7144/2016、A/Peru/4617/2017、A/Switzerland/9715293/2013、A/Tokyo/UTSK1/2007、A/WesternAustralia/13/2001、A/Tasmania/1018/2015、A/Sweden/3/2017、A/Kansas/13/2009、A/Tokyo/DS763/2016、A/Newcastle/67/2016、A/SouthAustralia/34/2019、A/Stockholm/32/2014、A/Stockholm/14/2012、A/Stockholm/15/2014、A/Guangxigangbei/190/2019、A/Xinjiangtianshan/1411/2012、A/NewYork/654/1994、A/Netherlands/620/1989、A/NewYork/758/1993、A/Catalonia/9503S/2017、A/Paris/2379/2014或A/Heilongjiangxiangyang/1134/2011。

20.根据权利要求19所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述甲型流感病毒是以下之一：A/Perth/16/2009、A/Kansas/14/2017、A/Belgium/4217/2015、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016、A/Switzerland/8060/2017、A/HongKong/4801/2014、A/SouthAustralia/34/2019、A/Victoria/361/2011或A/HongKong/45/2019。

21.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述流感病毒亚型2神经氨酸酶的头部区是SEQ IDNO:1-115中任一个的流感病毒亚型2神经氨酸酶的头部区。

22.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶、人工核酸分子或四聚体神经氨酸酶，其中所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶包含选自SEQ ID NO:117-131的氨基酸序列。

23.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据前述权利要求中任一项所述的人工核酸分子。

24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中宿主细胞是哺乳动物细胞。

25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

26.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的四聚体神经氨酸酶或根据前述权利要求中任一项所述的编码经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶的人工核酸分子。

27.根据权利要求26所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物进一步包含佐剂。

28.根据权利要求26或27所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物进一步包含流感病毒血凝素。

29.根据权利要求28所述的疫苗组合物，其中所述流感病毒血凝素来自第一流感毒株，并且所述经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶来自第二流感毒株，其中所述第一流感毒株和所述第二流感毒株是不同的流感毒株。

30.一种产生根据权利要求3-22中任一项所述的四聚体神经氨酸酶的体外方法，其中所述方法包括在细胞培养基中培养根据权利要求23-25中任一项所述的宿主细胞，以及在所述宿主细胞中表达所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶，其中在所述宿主细胞中表达所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶后，宿主细胞上清液包含经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶，所述经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶至少包含所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶的四聚体神经氨酸酶和单体形式。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述四聚体神经氨酸酶占所述经修饰的单体流感病毒亚型2神经氨酸酶在所述宿主细胞中表达后分泌的所述经修饰的流感病毒亚型2神经氨酸酶的至少20％、至少50％、至少70％或至少90％，如通过尺寸排阻色谱所测量的。

32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述宿主细胞在10-10,000升体积的细胞培养基中培养。

33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述细胞培养物中纯化所分泌的四聚体神经氨酸酶以产生纯化的流感病毒亚型2四聚体神经氨酸酶的步骤。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述纯化的四聚体流感病毒亚型2神经氨酸酶以至少0.5mg/mL的量存在。

35.一种使受试者对流感病毒免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫有效量的根据权利要求26-29中任一项所述的疫苗组合物。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法预防所述受试者的流感病毒感染。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法引起所述受试者的保护性免疫应答。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述保护性免疫应答是抗体应答。

39.一种减少流感病毒感染的一种或多种症状的方法，所述方法包括向受试者施用预防有效量的根据权利要求26-29中任一项所述的组合物。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述流感病毒感染的一种或多种症状是体重减轻。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述流感病毒感染的一种或多种症状是体温升高。

42.一种针对流感病毒对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效针对流感病毒对所述受试者进行疫苗接种的一定量的根据权利要求26-29中任一项所述的疫苗组合物。

43.根据权利要求35-42中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

44.根据权利要求35-43中任一项所述的方法，其中将所述疫苗组合物肌内、皮内、皮下、静脉内或腹膜内施用。

45.根据权利要求35-44中任一项所述的方法，其中所述方法治疗或预防由季节性或大流行流感毒株之一或两者引起的疾病。

46.根据权利要求35-45中任一项所述的方法，其中所述人受试者为6月龄以上、小于18岁、至少60岁、至少65岁、至少6月龄且小于18岁、或至少18岁且小于65岁。