CN118161877A - 一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用 - Google Patents
一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用，涉及链孢粘帚霉挥发物提取技术领域。该具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法，具体包括以下步骤：S1.活化培养；S2.链孢粘帚霉培养；S3.萃取头的筛选；S4.挥发物提取。本发明提供一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用，该专利展示的链孢粘帚霉及其挥发物成分提取和培养方法，相较于现有技术，主要优势在于提高了挥发物的提取效率和精度，同时优化了链孢粘帚霉的培养条件以增强其产香能力，这些研究结果不仅提升了目标化合物的检测灵敏度和生产收率，还通过减少化学试剂的使用，降低了生产成本和环境影响，为天然香料的开发与应用提供了新的可能性。
Description
技术领域
本发明涉及链孢粘帚霉挥发物提取技术领域，具体为一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用。
背景技术
香味物质因其令人愉悦、舒缓压力等特点而备受关注，人们对于这类物质的应用已渗入生活各个方面，例如食品轻工、化妆品等制造业。香味物质的应用依托于香精香料，传统的香精香料来源多半从芳香植物或动物麝中直接提取或通过化学合成法得到高纯度香味物质，但以上方法高耗低产，不能满足市场需求。与传统方法相比，微生物发酵和生物转化的方法具有高效、绿色、环保等众多优点，现已成为香精香料开发的研究热点。因此，发掘具有产香功能的微生物成为香精香料市场的迫切需求。
近年来，真菌成为微生物中具有产香功能的关注重点。真菌所产生的挥发性有机化合物(VOCs)包括多种化学类别，并应用于工业生产中。例如张鹏等利用产黑色素短梗霉(Aureobas id i um me l anogenum)发酵液改善烟丝香味，周森等筛选出具有白酒风味的产香白地霉(Geotr ichum cand i dum)。链孢粘帚霉(C l onostachys rosea f.catenu lata)属子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordar i omycetes)肉座菌目(Hypocrea l es)生赤壳科(Bi onectr i aceae)螺旋聚孢霉属(Cl onostachys)，是粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)的一种变型。该菌具有广泛的分布区域，在各温度带的土壤、沙漠以及水域中都有存在。作为一种兼性腐生菌，该菌常在土壤中与各种病原菌的菌核、菌丝以及线虫的胞囊共存。此外，该菌也常在植物中被分离得到，如大麦、洋葱、草莓、玫瑰和可可，其中根、叶和花是主要的分离部分，频率最高的部分是根。同时该菌可以在植物不同组织部位表现出内生能力，例如在天竺葵叶片以及黄瓜根部定植。以往对链孢粘帚菌的研究多集中于其作为重寄生菌的特性开发生防菌剂以及针对其作为土传病原菌展开病害防治。链孢粘帚霉与其他产香真菌相比，具有不可多得重寄生能力，该能力可以让其寄生于其他真菌内并发生物质交换，从而拓展其代谢产物的来源。目前，对于链孢粘帚霉的研究大多集中在代谢产物中的非挥发性成分上，对链孢粘帚霉挥发性成分的研究则鲜有报道。结合链孢粘帚霉已具有的高应用价值，以及其本身在拓展代谢产物来源上的能力，开发具有产香能力的链孢粘帚霉极具市场应用前景，但目前，关于链孢粘帚霉在其挥发物方面的研究较少，因此开发其在挥发物方面的应用在微生物来源的香料领域极具潜力。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用，在一定程度上弥补了链孢粘帚霉在其挥发物方面的研究较少的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法，具体包括以下步骤：
S1.活化培养
将链孢粘帚霉从保存的冷冻管里用接种针挑取出并将其接种在含有20mLPSA培养基的直径为8.5cm培养皿的正中间，28℃恒温培养7天备用；
S2.链孢粘帚霉培养
选择500mL培养瓶作为培养容器，每个培养瓶加入120mL培养基；
S3.萃取头的筛选
使用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在气相色谱进样口处以250℃老化至少2小时直至无杂峰备用；
S4.挥发物提取
将培养好的链孢粘帚霉培养瓶置于萃取温度28℃、平衡时间30分钟、萃取时间40分钟、解析时间3分钟的条件下进行挥发性有机化合物(VOCs)的萃取。
优选的，所述方法步骤中还包括GC-MS分析。
优选的，所述GC-MS分析的GC条件为：使用HP-5MS色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；载气为氦气，流速0.8mL/min；不分流进样，进样口温度250℃；升温程序设定为初始温度40℃保持5分钟，以5℃/min速度升温至130℃并保持5分钟，再以10℃/min速度升温到230℃并保持2分钟。
优选的，所述GC-MS分析的MS条件为：电子离子源，离子源温度230℃；数据采集方法为全扫描，质量范围m/z：35-550u。
优选的，所述步骤S2链孢粘帚霉培养中的培养条件为：培养基体积120mL，培养温度27.5℃，培养天数27天,碳源为蔗糖，不添加氮源，pH值为自然。
一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物在生产香味、香精香料方面的应用。
(三)有益效果
本发明提供了一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用。具备以下有益效果：
本发明提供了一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用，本发明通过精心选择的SPME(固相微萃取)萃取头(50/30μmDVB/CAR/PDMS)，结合优化的GC-MS(气相色谱-质谱联用)分析条件，该方法能够高效且准确地从链孢粘帚霉中提取挥发性有机化合物(VOCs)，这种提取和分析方法提高了检测的灵敏度和分辨率，使得挥发物的识别更为准确，同时保持了成分的完整性，通过细致的实验设计和优化，发现了链孢粘帚霉最佳的培养条件，包括培养基体积、温度和培养天数，这些条件的优化不仅提高了菌株的生长和代谢活性，也显著增强了其产香能力，实验结果与模型拟合良好，验证了优化培养条件的可行性和有效性，通过这两项技术的应用，不仅为链孢粘帚霉挥发物的提取和分析提供了标准化方法，也为进一步研究和开发其在香味、香精香料及相关领域的应用打下了坚实的基础，特别是在食品和化妆品领域，这种天然来源的香料具有潜在的市场优势，使用链孢粘帚霉作为天然香料来源，避免了化学合成香料可能带来的环境和健康风险，此外，优化的培养条件减少了对化学试剂的依赖，降低了实验过程中的化学废物产生，符合绿色化学和可持续发展的原则，通过提高培养效率和挥发物提取的准确性，减少了实验材料和时间的浪费，从而降低了生产成本，这为商业化生产链孢粘帚霉提取物提供了可能，有利于实现经济效益和环境保护的双赢。
附图说明
图1为本发明为不同规格萃取头对链孢粘帚霉VOCs的吸附能力表图；
图2为本发明基础培养基中碳源、氮源对链孢粘帚霉VOCs有效峰的影响(a)碳源；(b)氮源表图；
图3为本发明单因素试验下，不同培养条件对链孢粘帚霉VOCs有效峰的影响(a)pH值；(b)培养基体积；(C)培养天数；(d)培养温度表图；
图4为本发明响应面实验下，不同培养条件交互作用对链孢粘帚霉VOCs有效峰数量影响表图；
图5为本发明链孢粘帚霉VOCs的化学结构示意图；
图6为本发明GC-MS分析的链孢粘帚霉VOCs总离子流色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：具产香能力的链孢粘帚霉挥发物成分提取：
(1)萃取头的筛选
将直径为5mm的链孢粘帚霉菌丝接种于装有120mLPSA培养基的500mL培养瓶中，28℃培养20d备用。
将50/30μm DVB/CAR/PDMS、75μm CAR/PDMS、100μm PDMS三种规格的萃取头在气相色谱进样口处以温度250℃老化至少2h至无杂峰备用。选取培养好的链孢粘帚霉培养瓶，将其置于萃取温度28℃、平衡时间30min、萃取时间40min、解析时间3min的条件下进行VOCs萃取后，按照GC-MS分析条件进行检测，以VOCs有效峰数量为指标，筛选合适的萃取头。不同萃取头的吸附效果因涂层材料差异而不同，挥发性成分的不确定性会影响萃取头的吸附效果，因此应在实验开始进行萃取头筛选。以检测到的有效峰为指标，通过对三种不同材质的萃取头进行吸附能力比较。结果如图1所示，50/30μmDVB/CAR/PDMS对链孢粘帚霉VOCs的吸附能力最好，因此选择50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取头为最适萃取头。
实施例2：挥发性物质GC-MS分析条件
GC条件需结合链孢粘帚霉挥发物色谱峰情况进行设定，为获得最适链孢粘帚霉挥发物的GC条件，首先将起始温度设为40℃，并以5℃/min升至230℃，氦气流速1.0mL/min观察其色谱峰分离情况。通过降低氦气流速和改变升温速度来获得最终条件：
GC条件：HP-5MS色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；载气为氦气，流速为0.8mL/min；不分流进样，进样口温度250℃；升温程序：初始温度40℃保持5min，以5℃/min速度升温至130℃并保持5min，再以10℃/min速度升温到230℃并保持2min；
MS条件：电子离子源；离子源温度230℃；
数据采集方法：全扫描；质量范围m/z：35-550u；
实施例3：具产香能力的链孢粘帚霉的培养基及培养条件优化
(1)供试真菌活化培养
将供试菌株从保存的冷冻管里用接种针挑取出并将其接种在含有20mL PSA培养基直径为8.5cm培养皿的正中间，28℃恒温培养7d，备用。
(2)培养基碳源和氮源单因素优化实验
添加琼脂至马铃薯浸出液中，以此为基础培养基分别进行培养条件的碳源和氮源优化。选择500mL培养瓶作为链孢粘帚霉培养容器，每个培养瓶加入培养基120mL，将4种不同碳源(蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉)以20g/L分别加入培养基中，待培养基冷却凝固后在培养基中心接入直径为5mm的链孢粘帚霉菌饼，在26℃下培养20d；以VOCs有效峰数量为指标进行GC-MS分析，筛选最适碳源。在筛选出最适碳源基础上，加入质量浓度为5g/L的不同种类氮源(氯化铵、硫酸铵、蛋白胨、硝酸钾)，按照上述培养条件，测定VOCs有效峰数量，筛选最适氮源，所有试验3个重复。
碳源的选择会影响有效峰的数量。结果如图2所示，当碳源为蔗糖时，链孢粘帚霉VOCs有效峰的数量最多，其次是麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉。在优化碳源为蔗糖的基础上，添加不同的氮源，有效峰数量由高到底依次是硝酸钾＞蛋白胨＞硫酸铵＞氯化铵。与未加氮源相比，在培养基添加氮源后有效峰数量整体呈现下降趋势，因此供试氮源并不适合链孢粘帚霉菌丝VOCs产生。后续试验用的优化培养基碳源为蔗糖，不添加氮源。
(3)培养条件单因素优化试验
利用优化的培养基，以VOCs有效峰数量为指标，考察挥发性成分影响因素pH值(5、6、7、8)，培养基体积(装液量)(80mL、100mL、120mL、140mL)，培养温度(24℃、26℃、28℃、30℃)、培养时间(22d、24d、26d、28d)对链孢粘帚霉挥发性成分的影响所有试验3个重复。
以优化培养基为链孢粘帚霉培养基础，研究不同培养条件对链孢粘帚霉VOCs有效峰数量的影响，结果如图3所示。首先改变培养条件中的pH值，探索不同pH值对链孢粘帚霉VOCs有效峰的影响。在pH值为7时有效峰数量最多，但在pH5-8范围内的pH值变化对有效峰数量的影响并不明显，因此培养基pH值保持自然水平。
以pH值自然水平，改变培养条件中培养基体积，研究培养基体积对链孢粘帚霉VOCs有效峰数量的影响。有效峰数量随着培养基体积增多出现先下降后上升再下降的趋势，在培养基体积为120mL时有效峰数量最多，其次是140mL、80mL、100mL，因此最适培养基体积选择为120mL。
在前述pH值自然、培养基体积120mL的培养条件下研究不同培养天数对链孢粘帚霉VOCs有效峰数量的影响。随着培养天数的增加，有效峰数量呈现先上升后下降的趋势，当天数为26d时有效峰数量最大，因此最适培养天数选择为26d。
在上述因素优化基础上研究不同培养温度对链孢粘帚霉VOCs有效峰数量的影响。随着培养温度上升，有效峰数量呈先上升后下降的趋势，培养温度28℃时有效峰数量最大，因此最适培养温度选择为28℃。
(4)挥发性成分影响响应面试验
根据步骤3单因素试验结果，根据Box-Behnken的组合设计原理，采用Des i gn-Expert.V8.0软件设计3因素3水平响应面优化方案试验(表1)，以培养基体积(A)、培养温度(B)、培养时间(C)为考察因素，确定链孢粘帚霉的最佳培养条件，每个试验组3个重复。
表1响应面实验因素与水平设计
根据表1的响应面实验因素与水平设计得出的响应面实验设计结果如表2所示。利用Des i gn Expert 13.0对表2进行二次回归方程方差分析结果如表3所示，链孢粘帚霉VOCs有效峰数量(Y)与培养基体积(A)、培养温度(B)、培养天数(C)的多元二次回归方程如下：
表2响应面试验设计结果
由表3可知：模型F值为29.79，P值＜0.0001，模型极显著。失拟项P值为0.4663＞0.05，差异不显著，说明该回归方程拟合度较好，可信度较高，该模型适用于对链孢粘帚霉VOCs的培养条件优化分析和结果预测。由方差分析可以看出，一次项培养基体积A对结果影响达到显著水平，一次项培养温度B和二次项A2对结果影响达到极显著水平。根据F值对VOCs有效峰数量影响由从高到低进行排序，依次为培养温度、培养基体积、培养时间。
表3二次回归方程方差分析
利用Des ign Expert 13.0绘制的模型响应面曲面与等高线图，图4中显示在培养基体积、培养温度、培养天数中任意两个变量之间的交互作用对链孢粘帚霉VOCs有效峰数量的影响。在响应面分析图中，响应面曲线图的形状可以反应两个变量之间交互作用的强弱，曲面坡度越陡，等高线图形越接近椭圆形，表明两两变量交互作用越显著；反之则不显著。由图可知各曲面陡峭度为AB＞BC＞AC，但除AC外，AB和BC的等高线椭圆并不明显，且AC曲面中未呈现极大值，因此可知A、B、C三个变量之间的两两交互作用对链孢粘帚霉VOCs有效峰数量的影响不显著，结论与表3一致。
(5)最佳培养条件的预测和验证
根据响应面优化结果可知，当链孢粘帚霉的培养条件为培养基体积122.708mL、培养温度27.5091℃、培养天数26.881d时，此条件下的链孢粘帚霉VOCs有效峰数量最多，可达到6.35087个。结合实际实验条件，将最佳培养条件调整为培养基体积120mL、培养温度27.5℃、培养天数27d。在此条件下进行验证试验，得到的结果与预测值比，相对误差为0.315％，说明实验结果与模型拟合较好，利用响应面法得到的优化培养条件可行有效。
实施例4：具产香能力的链孢粘帚霉挥发物成分分析
使用实施例1中获得的挥发物检测条件对实施例2给出的最佳培养条件下真菌挥发物进行检测，筛选匹配度大于80(最大值100)的VOCs，采用面积归一法定量，使用N IST14标准谱库定性。结果如表4所示，化合物结构如图5所示，VOCs色谱峰如图6所示。
表4链孢粘帚霉VOCs的组成及相对含量
经优化培养条件培养后的链孢粘帚霉通过HS-SPME-GC-MS技术分析其VOCs成分，其化学组成及相对含量见表4。由表4可知，经响应面培养条件优化后，共检测出6种链孢粘帚霉VOCs，包括醇类3种、芳香族类1种、倍半萜烯类2种，相对含量占比分别为25.05％、14.82％和59.13％。其中1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢-4-甲基-7-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-,(1S,4R,4aS)-萘(5)、(E)-菖蒲烯(6)的相对含量较高，分别为29.96％、29.17％，应为链孢粘帚霉VOCs的主要成分。
实施例5：具产香能力的链孢粘帚霉香气成分分析
醇类、芳香族类以及萜烯类挥发性物质组成了具产香能力的链孢粘帚霉的VOCs主要成分，而以上三类物质具有独特的挥发性气味特征应为VOCs为花果香味的主要原因。本研究发现2,4-二甲基-1-庚醇在链孢粘帚霉整个培养过程中均能检出，其是否能作为链孢粘帚霉特征挥发物值得进一步研究。在链孢粘帚霉VOCs中，根据风味网信息(http://www.fl avornet.org/f l avornet.html)辛醇被形容为蔬菜的味道，被作为香精香料大量使用，此外，其作为萃取剂也可以有效地回收废水中低浓度的N,N-二甲基甲酰胺。尤其值得注意的是，链孢粘帚霉VOCs中含量最多的为倍半萜烯类化合物，开展链孢粘帚霉该类化合物生物合成相关研究，将为链孢粘帚霉作为微生物香料的进一步开发应用提供参考。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.活化培养
将链孢粘帚霉从保存的冷冻管里用接种针挑取出并将其接种在含有20mLPSA培养基的直径为8.5cm培养皿的正中间，28℃恒温培养7天备用；
S2.链孢粘帚霉培养
选择500mL培养瓶作为培养容器，每个培养瓶加入120mL培养基；
S3.萃取头的筛选
使用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在气相色谱进样口处以250℃老化至少2小时直至无杂峰备用；
S4.挥发物提取
将培养好的链孢粘帚霉培养瓶置于萃取温度28℃、平衡时间30分钟、萃取时间40分钟、解析时间3分钟的条件下进行挥发性有机化合物(VOCs)的萃取。
2.根据权利要求1所述的一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用，其特征在于：所述方法步骤中还包括GC-MS分析。
3.根据权利要求2所述的一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用，其特征在于：所述GC-MS分析的GC条件为：使用HP-5MS色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；载气为氦气，流速0.8mL/min；不分流进样，进样口温度250℃；升温程序设定为初始温度40℃保持5分钟，以5℃/min速度升温至130℃并保持5分钟，再以10℃/min速度升温到230℃并保持2分钟。
4.根据权利要求2所述的一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用，其特征在于：所述GC-MS分析的MS条件为：电子离子源，离子源温度230℃；数据采集方法为全扫描，质量范围m/z：35-550u。
5.根据权利要求1所述的一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物提取方法及其应用，其特征在于：所述步骤S2链孢粘帚霉培养中的培养条件为：培养基体积120mL，培养温度27.5℃，培养天数27天,碳源为蔗糖，不添加氮源，pH值为自然。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种具有产香能力的链孢粘帚霉挥发物在生产香味、香精香料方面的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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