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CN118166098B - 检测magea4-as1的试剂在制备诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒中的应用 - Google Patents

检测magea4-as1的试剂在制备诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒中的应用 Download PDF

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CN118166098B CN202410165415.8A CN202410165415A CN118166098B CN 118166098 B CN118166098 B CN 118166098B CN 202410165415 A CN202410165415 A CN 202410165415A CN 118166098 B CN118166098 B CN 118166098B
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Abstract

本申请公开了检测MAGEA4‑AS1的试剂在制备诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒中的应用。根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：MAGEA4‑AS1的表达量在OSCC患者的肿瘤组织和OSCC细胞中显著上调，受试者特征曲线显示AUC值在0.7以上；同时，MAGEA4‑AS1对OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭具有调控作用。因此，MAGEA4‑AS1对OSCC的发生发展起到重要的调控作用，可以作为有效的OSCC临床诊断标志物。

Description

检测MAGEA4-AS1的试剂在制备诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒 中的应用
技术领域
本申请涉及口腔鳞状细胞癌技术领域，尤其是涉及检测MAGEA4-AS1的试剂在制备诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒中的应用。
背景技术
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔颌面部最常见的口腔恶性肿瘤之一。虽然近年来关于口腔鳞状细胞癌的研究日益增多，在临床治疗方面也有了一定改善，但大多数OSCC患者的预后仍然较差，5年总体生存率维持在55％～65％。因此做好OSCC的筛查工作十分必要，但目前已发现的与OSCC发生发展密切相关的潜在生物标志物多为蛋白质分子和miRNA，传统标志物的特异性和灵敏度不高，同一种标志物可以预示多种癌症风险的可能，也存在较大的漏诊和误诊的几率。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度超过200个核苷酸且未翻译成功能蛋白的RNA，越来越多的研究表明lncRNA在基因表达调控过程中发挥着重要作用。相比于其他RNA分子，lncRNA的表达具有明显的组织特异性与时空特异性，不同组织之间的lncRNA表达量不同，同一组织或器官在不同生长阶段的lncRNA表达量也会发生变化。并且部分lncRNA可以直接在血液、尿液等体液中被检测出来，适用于非侵入性检查。因此，探索OSSC的lncRNA诊断标志物十分有必要。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种检测MAGEA4-AS1的试剂在制备诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒中的应用。
本申请的第一方面，提供检测MAGEA4-AS1的试剂在制备诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒中的应用。
根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：
MAGEA4-AS1的表达具有组织特异性，其表达量在OSCC患者的肿瘤组织和OSCC细胞中显著上调，受试者特征曲线显示AUC值在0.7以上；同时，MAGEA4-AS1对OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭具有调控作用。因此，MAGEA4-AS1对OSCC的发生发展起到重要的调控作用，可以作为有效的OSCC临床诊断标志物。
其中，MAGEA4-AS1是编码基因黑色素相关抗原A4(melanoma-associated antigen4，MAGEA4)的反义lncRNA，位于chrX：151904431-chrX：151911455。反义lncRNA是以编码基因的反义链为模板进行转录获得的RNA，其命名基于邻近的编码基因位置，但反义lncRNA存在与邻近编码基因的编码区序列或非编码区序列互补配对等多种不同的可能。虽然部分研究结果表明，某些与编码基因的编码区具有互补配对性的反义lncRNA能够提高来源基因的mRNA稳定性，但MAGEA4-AS1的转录模板位于MAGE-A4编码区的上游，与MAGE-A4的编码区不具有互补性，两者的表达并无关联。此外，研究发现反义lncRNA相比于邻近的编码基因所编码的蛋白具有更为复杂的功能，能够在表观遗传水平、转录水平及转录后水平等多种水平下引起上游信号通路的变化，从而发挥表达调控功能，进而影响肿瘤的发生发展。因此，尽管MAGEA4在多种癌症细胞中广泛存在，然而本申请研究结果MAGEA4-AS1和MAGEA4可能在OSCC的发生发展中具有不同的功能。
MAGEA4-AS1的核苷酸序列如下，长度为432bp：
AGTTGATTTGGGAACCAGAGAACAGCAGCCTAAGTGTGACTGTAATTTTTGGCAGCTACAGATTCCCAAGACAACTAGGAAGGGAAAAGGAACCCTTCAAGGAAGTTCCAGGAAAAACGTCTCTCCCAAAAAGACCACCGCTTCAGGAAAACCTGAGGAAGGGAGTGGGCCAACAGTATCCTGCCACTGTGACCAGCTGAACGAGGAACTCCATCAAAATGAGCCACAGCTGGACCAAAACAGTGAGGAGACCTCCACCTTCTTCAGTGTCTCCCTGAGCAGTCAGTAATTTCAGGGCAAGCTGAGAGGTCTCCAGAGGTCTAACCCCAGATAAATAGCCAACAGGGTCTAGAGTACATTTTATACCCAACAGGGTATACCCCATGGTGATCAAAATAAAATAAACCTGTTGTAAAATGAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.5)。
在一些实施方式中，口腔鳞状细胞癌是指起源于口腔粘膜上皮的伴有鳞状分化的癌，口腔粘膜包括颊粘膜、牙龈粘膜、磨牙后三角区粘膜、舌体(界沟前2/3)粘膜、口底粘膜、硬腭粘膜和唇粘膜中的至少一种。
在一些实施方式中，检测MAGEA4-AS1的试剂为检测样本中MAGEA4-AS1的表达水平的试剂。
在一些实施方式中，样本为细胞、组织、体液中的至少一种。
在一些实施方式中，样本为口腔粘膜组织、血液、尿液、唾液中的至少一种。
在一些实施方式中，对于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒，当受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平高于阈值时，诊断受试者患有口腔鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，阈值为通过OSCC患者组与对照组构建ROC曲线满足一定特异性和/或灵敏度时的截断值，例如是特异性和灵敏度之和最大时的截断值。
在一些实施方式中，OSCC患者组与对照组分别为OSCC患者的癌组织和癌旁组织。在其他一些实施方式中，OSCC患者组与对照组也可以分别为OSCC患者的癌组织和正常人的样本组织。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为MAGEA4-AS1相对于内参基因的相对表达水平，例如可以是β-Actin、GAPDH、tubulin等其中任一种。
在一些实施方式中，计算相对表达水平所使用的内参基因为GAPDH。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为根据2-ΔΔCt公式计算得到的MAGEA4-AS1相对于内参基因的相对表达水平，例如内参基因为GAPDH。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为根据2-ΔΔCt公式计算得到的MAGEA4-AS1相对于内参基因GAPDH的相对表达水平，当受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平高于阈值时，诊断受试者患有口腔鳞状细胞癌，阈值为6.265。
在一些实施方式中，检测MAGEA4-AS1的试剂包括扩增MAGEA4-AS1的引物对。具体的引物对可以基于上述MAGEA4-AS1的核苷酸序列按照lncRNA引物设计方法结合本领域常用的引物设计软件设计得到，例如Prime 5。
在一些实施方式中，引物对包括：
核苷酸序列如TGGCAGCTACAGATTCCCAAG(SEQ ID NO.1)所示的上游引物，和，
核苷酸序列如GAGTTCCTCGTTCAGCTGGT(SEQ ID NO.2)所示的下游引物。
在一些实施方式中，试剂盒还包括RNA提取试剂和反转录试剂。
在一些实施方式中，RNA提取试剂包括TRIzol总RNA抽提试剂。
在一些实施方式中，反转录试剂包括反转录聚合酶、dNTPs、RT引物。
在一些实施方式中，反转录聚合酶包括Evo M-MLV RTase。
在一些实施方式中，RT引物包括随机引物和oligo dT中的至少一种。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括RNase抑制剂。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括gDNA去除试剂。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括无RNA酶水。
在一些实施方式中，试剂盒还包括内参引物对。
在一些实施方式中，内参引物对为GAPDH的引物对。
在一些实施方式中，内参引物对包括：
核苷酸序列如GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO.3)所示的上游引物，和，
核苷酸序列如GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO.4)所示的下游引物。
本申请的第二方面，提供一种计算机可读存储介质，计算机可读存储介质存储有计算机可执行指令，计算机可执行指令用于使计算机执行以下操作：
步骤1：获取受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平的信息：
步骤2：将表达水平与阈值进行比较，根据比较结果指示受试者是否患有口腔鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平的信息通过检测MAGEA4-AS1的试剂对样本进行检测得到。
在一些实施方式中，样本为细胞、组织、体液中的至少一种。
在一些实施方式中，样本为口腔粘膜组织、血液、尿液、唾液中的至少一种。
在一些实施方式中，当受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平高于阈值时，指示受试者患有口腔鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，阈值为通过OSCC患者组与对照组构建ROC曲线满足一定特异性和/或灵敏度时的截断值，例如是特异性和灵敏度之和最大时的截断值。
在一些实施方式中，OSCC患者组与对照组分别为OSCC患者的癌组织和癌旁组织，或分别为OSCC患者的癌组织和正常人的样本组织。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为MAGEA4-AS1相对于内参基因的相对表达水平，例如可以是β-Actin、GAPDH、tubulin等其中任一种。在一些实施方式中，计算相对表达水平所使用的内参基因为GAPDH。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为根据2-ΔΔCt公式计算得到的MAGEA4-AS1相对于内参基因的相对表达水平，例如内参基因为GAPDH。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为根据2-ΔΔCt公式计算得到的MAGEA4-AS1相对于内参基因GAPDH的相对表达水平，当受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平高于阈值时，指示受试者患有口腔鳞状细胞癌，阈值为6.265。
在一些实施方式中，检测MAGEA4-AS1的试剂包括扩增MAGEA4-AS1的引物对。
在一些实施方式中，引物对包括：
核苷酸序列如TGGCAGCTACAGATTCCCAAG(SEQ ID NO.1)所示的上游引物，和，
核苷酸序列如GAGTTCCTCGTTCAGCTGGT(SEQ ID NO.2)所示的下游引物。
在一些实施方式中，试剂盒还包括RNA提取试剂和反转录试剂。
在一些实施方式中，RNA提取试剂包括TRIzol总RNA抽提试剂。
在一些实施方式中，反转录试剂包括反转录聚合酶、dNTPs、RT引物。
在一些实施方式中，反转录聚合酶包括Evo M-MLV RTase。
在一些实施方式中，RT引物包括随机引物和oligo dT中的至少一种。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括RNase抑制剂。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括gDNA去除试剂。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括无RNA酶水。
在一些实施方式中，试剂盒还包括内参引物对。
在一些实施方式中，内参引物对为GAPDH的引物对。
在一些实施方式中，内参引物对包括：
核苷酸序列如GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO.3)所示的上游引物，和，
核苷酸序列如GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO.4)所示的下游引物。
本申请的第三方面，提供一种设备，包括处理器和存储器，存储器上存储有可在处理器上运行的计算机程序，处理器在运行计算机程序时实现以下操作：
步骤1：获取受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平的信息：
步骤2：将表达水平与阈值进行比较，根据比较结果指示受试者是否患有口腔鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平的信息通过检测MAGEA4-AS1的试剂对样本进行检测得到。
在一些实施方式中，样本为细胞、组织、体液中的至少一种。
在一些实施方式中，样本为口腔粘膜组织、血液、尿液、唾液中的至少一种。
在一些实施方式中，当受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平高于阈值时，指示受试者患有口腔鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，阈值为通过OSCC患者组与对照组构建ROC曲线满足一定特异性和/或灵敏度时的截断值，例如是特异性和灵敏度之和最大时的截断值。
在一些实施方式中，OSCC患者组与对照组分别为OSCC患者的癌组织和癌旁组织，或分别为OSCC患者的癌组织和正常人的样本组织。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为MAGEA4-AS1相对于内参基因的相对表达水平，例如可以是β-Actin、GAPDH、tubulin等其中任一种。在一些实施方式中，计算相对表达水平所使用的内参基因为GAPDH。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为根据2-ΔΔCt公式计算得到的MAGEA4-AS1相对于内参基因的相对表达水平，例如内参基因为GAPDH。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为根据2-ΔΔCt公式计算得到的MAGEA4-AS1相对于内参基因GAPDH的相对表达水平，当受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平高于阈值时，指示受试者患有口腔鳞状细胞癌，阈值为6.265。
在一些实施方式中，检测MAGEA4-AS1的试剂包括扩增MAGEA4-AS1的引物对。
在一些实施方式中，引物对包括：
核苷酸序列如TGGCAGCTACAGATTCCCAAG(SEQ ID NO.1)所示的上游引物，和，
核苷酸序列如GAGTTCCTCGTTCAGCTGGT(SEQ ID NO.2)所示的下游引物。
在一些实施方式中，试剂盒还包括RNA提取试剂和反转录试剂。
在一些实施方式中，RNA提取试剂包括TRIzol总RNA抽提试剂。
在一些实施方式中，反转录试剂包括反转录聚合酶、dNTPs、RT引物。
在一些实施方式中，反转录聚合酶包括Evo M-MLV RTase。
在一些实施方式中，RT引物包括随机引物和oligo dT中的至少一种。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括RNase抑制剂。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括gDNA去除试剂。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括无RNA酶水。
在一些实施方式中，试剂盒还包括内参引物对。
在一些实施方式中，内参引物对为GAPDH的引物对。
在一些实施方式中，内参引物对包括：
核苷酸序列如GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO.3)所示的上游引物，和，
核苷酸序列如GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO.4)所示的下游引物。
本申请的第四方面，提供一种口腔鳞状细胞癌风险评估系统，包括：
获取模块，用于获取受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平的信息：
评估模块，用于将表达水平与阈值进行比较，根据比较结果指示受试者是否患有口腔鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，还包括检测模块，用于根据受试者的样本检测MAGEA4-AS1的表达水平。
可以理解的是，获取模块可以通过直接或间接的方式根据MAGEA4-AS1的检测结果获取受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平的信息。
在一些实施方式中，样本为细胞、组织、体液中的至少一种。
在一些实施方式中，样本为口腔粘膜组织、血液、尿液、唾液中的至少一种。
在一些实施方式中，检测模块包括检测MAGEA4-AS1的试剂。
在一些实施方式中，检测MAGEA4-AS1的试剂包括扩增MAGEA4-AS1的引物对
在一些实施方式中，引物对包括：
核苷酸序列如TGGCAGCTACAGATTCCCAAG(SEQ ID NO.1)所示的上游引物，和，
核苷酸序列如GAGTTCCTCGTTCAGCTGGT(SEQ ID NO.2)所示的下游引物。
在一些实施方式中，试剂盒还包括RNA提取试剂和反转录试剂。
在一些实施方式中，RNA提取试剂包括TRIzol总RNA抽提试剂。
在一些实施方式中，反转录试剂包括反转录聚合酶、dNTPs、RT引物。
在一些实施方式中，反转录聚合酶包括Evo M-MLV RTase。
在一些实施方式中，RT引物包括随机引物和oligo dT中的至少一种。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括RNase抑制剂。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括gDNA去除试剂。
在一些实施方式中，反转录试剂还包括无RNA酶水。
在一些实施方式中，试剂盒还包括内参引物对。
在一些实施方式中，内参引物对为GAPDH的引物对。
在一些实施方式中，内参引物对包括：
核苷酸序列如GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO.3)所示的上游引物，和，
核苷酸序列如GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO.4)所示的下游引物。
在一些实施方式中，在评估模块中，当受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平高于阈值时，指示受试者患有口腔鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，阈值为通过OSCC患者组与对照组构建ROC曲线满足一定特异性和/或灵敏度时的截断值，例如是特异性和灵敏度之和最大时的截断值。
在一些实施方式中，OSCC患者组与对照组分别为OSCC患者的癌组织和癌旁组织，或分别为OSCC患者的癌组织和正常人的样本组织。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为MAGEA4-AS1相对于内参基因的相对表达水平，例如可以是β-Actin、GAPDH、tubulin等其中任一种。在一些实施方式中，计算相对表达水平所使用的内参基因为GAPDH。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为根据2-ΔΔCt公式计算得到的MAGEA4-AS1相对于内参基因的相对表达水平，例如内参基因为GAPDH。
在一些实施方式中，MAGEA4-AS1的表达水平为根据2-ΔΔCt公式计算得到的MAGEA4-AS1相对于内参基因GAPDH的相对表达水平，当受试者的样本中MAGEA4-AS1的表达水平高于阈值时，指示受试者患有口腔鳞状细胞癌，阈值为6.265。
本申请的第五方面，提供特异性抑制MAGEA4-AS1表达的物质在制备a1～a2中的应用：a1.治疗口腔鳞状细胞癌的药物；a2.抑制口腔鳞状癌细胞的增殖、迁移或侵袭的药物。
在一些实施方式中，物质包括MAGEA4-AS1的反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，ASO)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、短发卡RNA(shorthairpin RNA，shRNA)、微小RNA(micro RNA，miRNA)、规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRSIPR)系统、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)系统、锌指核糖核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)系统中的任一种。其中，ASO例如可以是GapmeR，CRSIPR系统例如可以是CRISPR-Cas13系统。
在一些实施方式中，shRNA的Top strand和Bottom strand的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；
其中：
GATCCGAGAGGTCTCCAGAGGTCTACTCGAGTAGACCTCTGGAGACCTCTTTTTTT G(SEQ IDNO.6)；
AATTCAAAAAAAGAGGTCTCCAGAGGTCTACTCGAGTAGACCTCTGGAGACCTCT CG(SEQ IDNO.7)。
在一些实施方式中，物质还包括负载上述ASO、siRNA、shRNA、miRNA、CRSIPR系统、TALEN系统、ZFN系统的载体。
在一些实施方式中，载体为无机载体、有机载体、无机-有机复合载体中的任一种。
在一些实施方式中，载体包括质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒中的任一种。
在一些实施方式中，口腔鳞状癌细胞为舌鳞癌细胞。
在一些实施方式中，口腔鳞状癌细胞包括HSC-3、HN6和CAL-27中的至少一种。
根据以上应用，本申请实施例还涉及一种药物组合，包括特异性抑制MAGEA4-AS1表达的物质。
在一些实施方式中，药物组合还包括联用药物，例如口腔鳞状细胞癌的化疗药物、光敏剂、光热剂、免疫治疗药物中的至少一种。其中，化疗药物例如可以是紫杉醇、喜树碱、5-氟尿嘧啶、顺铂、多柔比星、丝裂霉素、表柔比星中的至少一种；光敏剂例如可以是硼二吡咯、二氢卟吩、孟加拉红的至少一种；光热剂例如可以是贵金属纳米粒子、有机聚合物类、碳基纳米材料、磁性纳米材料、半导体纳米材料中的至少一种；免疫治疗药物例如可以是免疫细胞治疗药物、免疫检查点抑制剂中的至少一种。可以理解的是，联用药物与MAGEA4-AS1或增加MAGEA4-AS1表达量的物质可以同时或先后使用。
在一些实施方式中，药物组合还包括靶向递送系统。
本申请实施例还涉及特异性抑制MAGEA4-AS1表达的物质在治疗口腔鳞状细胞癌或抑制口腔鳞状癌细胞的增殖、迁移或侵袭中的应用。
本申请实施例还涉及治疗口腔鳞状细胞癌的方法，包括向患者施用有效剂量的特异性抑制MAGEA4-AS1表达的物质。
本申请实施例还涉及抑制口腔鳞状癌细胞的增殖、迁移或侵袭的方法，包括将有效剂量的特异性抑制MAGEA4-AS1表达的物质与口腔鳞状癌细胞混合。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请实施例对TCGA数据库中OSCC患者肿瘤组织中lncRNA的差异表达分析结果。
图2是本申请实施例中MAGEA4-AS1在OSCC患者的癌组织和癌旁组织中的相对表达水平。其中，采用Wilcoxon检验，*p<0.05。
图3是本申请实施例中MAGEA4-AS1在不同OSCC细胞系中的相对表达水平。其中，采用多重t检验，p值经FDR法校正，**p校正<0.01，***p校正<0.001。
图4是本申请实施例中利用癌组织和癌旁组织验证MAGEA4-AS1对OSCC诊断效能的ROC曲线。其中，AUC为曲线下面积，特异度为88.24％，灵敏度为52.94％，截断值为6.265，p＝0.0201。
图5是HN6稳转细胞系的CCK-8实验结果。其中，采用独立样本t检验，*p<0.05，**p<0.01。
图6是CAL-27稳转细胞系的CCK-8实验结果。其中，采用独立样本t检验，*p<0.05。
图7是HN6和CAL-27稳转细胞系的细胞迁移实验结果。其中，A为显微镜下的染色照片，标尺为200μm；B为根据照片计算得到的迁移细胞数，采用独立样本t检验，*p<0.05，**p<0.01。
图8是HN6和CAL-27稳转细胞系的细胞侵袭实验结果。其中，A为显微镜下的染色照片，标尺为200μm；B为根据照片计算得到的侵袭细胞数，采用独立样本t检验，*p<0.05。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数，约的含义是指在本数±20％、10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％等的范围内。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
本申请下述实施例中涉及的主要试剂与仪器来源如下：
TRIzol试剂(大连TaKaRa公司)；
氯仿(上海凌峰化学试剂有限公司)；
异丙醇、无水乙醇(广东华光科技股份有限公司)；
高保真PCR聚合酶2×Vazyme Lamp Master Mix(Dye Plus)，Cat.#P312-01(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；
反转录试剂盒Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR，Cat.#AG11728、荧光定量PCR试剂SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II，Cat.#AG11702(湖南艾科瑞生物工程有限公司)；
无RNA酶水(中国Biosharp公司)；
引物(生工生物工程上海股份有限公司)；
人OSCC细胞系(HSC-3、HN6和CAL-27)人口腔角质细胞(HOK)；
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、链霉素-青霉素双抗混合液(美国Thermo Fisher Scientific公司)；
胎牛血清(德国PAN-Biotech公司)；
慢病毒、聚凝胺(汉恒生物科技上海有限公司)；
CCK-8(Cell Counting Kit-8)细胞增殖检测试剂盒(深圳艾普诺生物医疗科技有限公司)；
基质胶(美国Corning公司)；
10％多聚甲醛(广州维格斯生物科技有限公司)；
PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；
NanoDrop One核酸测定仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；
Lightcycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)；
Multiskan GO全自动酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；
DMi8倒置荧光显微镜(德国LEICA公司)。
实施例1：TCGA数据库分析
从TCGA(The cancer genome atlas，癌症基因组图谱)数据库中下载头颈鳞状细胞癌患者组织的转录组数据，从中筛选出447例OSCC患者，对OSCC患者的肿瘤组织和癌旁组织的转录组数据作lncRNA的差异表达分析，并按照差异表达水平从高到低筛选top 20的差异lncRNA，从中选择MAGEA4-AS1作为后续研究目标。参考图1，上述患者的样本数据显示，MAGEA4-AS1的log2(Fold change)>5，-log10(FDR校正p值)>2。
MAGEA4-AS1是MAGE家族A4(MAGE family member A4，MAGEA4)编码基因的反义lncRNA，该基因别名为CT1.4、MAGE4、MAGE4A、MAGE4B、MAGE-41和MAGE-X2。MAGEA4-AS1位于chrX:151904431-chrX:151911455，长度为432bp，核苷酸序列如下：
>NR_136578.1Homo sapiens MAGEA4 antisense RNA 1(MAGEA4-AS1),long non-coding RNA
AGTTGATTTGGGAACCAGAGAACAGCAGCCTAAGTGTGACTGTAATTTTTGGCAGCTACAGATTCCCAAGACAACTAGGAAGGGAAAAGGAACCCTTCAAGGAAGTTCCAGGAAAAACGTCTCTCCCAAAAAGACCACCGCTTCAGGAAAACCTGAGGAAGGGAGTGGGCCAACAGTATCCTGCCACTGTGACCAGCTGAACGAGGAACTCCATCAAAATGAGCCACAGCTGGACCAAAACAGTGAGGAGACCTCCACCTTCTTCAGTGTCTCCCTGAGCAGTCAGTAATTTCAGGGCAAGCTGAGAGGTCTCCAGAGGTCTAACCCCAGATAAATAGCCAACAGGGTCTAGAGTACATTTTATACCCAACAGGGTATACCCCATGGTGATCAAAATAAAATAAACCTGTTGTAAAATGAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.5)。
实施例2：lncRNA在OSCC患者组织以及不同OSCC细胞系中相对表达量的检测
依据世界卫生组织对于OSCC的诊断标准，经北京大学深圳医院伦理委员会批准，患者本人或家属同意并签署知情同意书后，收集就治于北京大学深圳医院口腔颌面外科17例患者的癌组织和癌旁粘膜组织(无肿瘤细胞)，患者的选择标准为：①患者均根据组织病理学结果确诊；②患者术后均有完善的随访资料；③患者均进行了彻底的原发灶清理手术，并选择性地行颈淋巴结清扫术。所有患者未曾在术前行放化疗，且患者自身无类风湿性关节炎、心血管疾病、糖尿病、甲状腺亢进等全身其他疾病或其他肿瘤疾病史。患者的病理资料见表1。
表1.患者组织的临床信息
(1)研磨17例患者的OSCC组织和癌旁组织，采用TRIzol法分别提取各组织的总RNA；同时提取HOK、HSC-3、HN6和CAL-27细胞的总RNA。
(2)经核酸测定仪检测总RNA浓度后，通过反转录试剂盒Evo M-MLV RT Mix Kitwith gDNA Clean for qPCR获得cDNA。
(3)利用荧光定量PCR试剂SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II和Lightcycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪检测各样本中内参基因(GAPDH)以及MAGEA4-AS1的循环阈值(Ct)，最后利用2-ΔΔCt公式计算各癌组织和癌旁组织以及不同OSCC细胞系中MAGEA4-AS1的相对表达水平。qRT-PCR所用的引物序列如下：
MAGEA4-AS1上游引物：TGGCAGCTACAGATTCCCAAG(SEQ ID NO.1)；
MAGEA4-AS1下游引物：GAGTTCCTCGTTCAGCTGGT(SEQ ID NO.2)；
GAPDH上游引物：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO.3)；
GAPDH下游引物：GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO.4)。
结果如图2和3所示，相对于癌旁组织，MAGEA4-AS1在OSCC癌组织中的表达水平显著上调；并且与HOK细胞相比，在HSC-3、CAL-27及HN6这三种OSCC细胞系中，MAGEA4-AS1的表达水平均显著上升。
此外，根据17例患者的癌组织和癌旁组织中MAGEA4-AS1的相对表达水平建立ROC曲线验证其诊断效能，结果如图4所示，从图中可以看出，ROC曲线下面积可以达到0.7336，特异度为88.24％，灵敏度为52.94％，截断值为6.265，p＝0.0201，说明环状RNA MAGEA4-AS1对OSCC具有一定的诊断意义。
实施例3：细胞实验
在细胞培养孔板中分别接种HN6和CAL-27细胞于37℃和5％ CO2条件下培养，培养基由90％DMEM和10％FBS组成。然后利用慢病毒悬液和聚凝胺将载有敲减MAGEA4-AS1质粒的慢病毒感染实验组细胞(Si-lnc)，同时将载有对照质粒的慢病毒感染阴性对照组细胞(Si-vector)，分别构建两种OSCC细胞的稳转细胞系，并根据实施例2中的引物经qRT-PCR法检测表达水平。结果所示，在两种实验组细胞(Si-lnc)中，MAGEA4-AS1的表达量均显著敲低，说明成功构建得到两种OSCC细胞的稳转细胞系。
其中，敲减MAGEA4-AS1所用的shRNA序列如下：
Top strand：
GATCCGAGAGGTCTCCAGAGGTCTACTCGAGTAGACCTCTGGAGACCTCTTTTTTT G(SEQ IDNO.6)；
Bottom strand：
AATTCAAAAAAAGAGGTCTCCAGAGGTCTACTCGAGTAGACCTCTGGAGACCTCT CG(SEQ IDNO.7)。
1.CCK-8实验
在细胞培养孔板中，分别接种对照组(Si-vector)和实验组(Si-lnc)细胞，并分别在24h、48h、72h和96h加入1：10的CCK-8试剂，孵育1h后用酶标仪检测450nm下的吸光度。用Graphpad prism软件绘制细胞增殖曲线，并完成统计分析。结果如图5和图6所示，说明MAGEA4-AS1的敲减抑制了两种OSCC细胞的增殖速率。
2.细胞迁移实验
在可穿透性细胞培养小室中分别接种悬浮于无血清DMEM的对照组(Si-vector)和实验组(Si-lnc)细胞，在小室下方加入含10％血清的DMEM，在培养箱中(37℃，5％CO2)培养至细胞发生迁移后，用PBS洗2～3次，用10％多聚甲醛固定细胞，再用1％结晶紫溶液染色，最后冲洗掉染料并用棉棒擦拭干净小室内残余染料。经显微镜拍摄，用Image J软件计算迁移的细胞数。用Graphpad prism软件绘制统计图，并作统计分析。结果如图7所示，说明MAGEA4-AS1的敲减抑制了两种OSCC细胞的迁移能力。
3.细胞侵袭实验
在可穿透性细胞培养小室底部加入基质胶，吹干基质胶后，分别接种悬浮于无血清DMEM的对照组(Si-vector)和实验组(Si-lnc)细胞，在小室下方加入含10％血清的DMEM，在培养箱中(37℃，5％CO2)培养至细胞发生侵袭后，用PBS洗2～3次，用10％多聚甲醛固定细胞，再用1％结晶紫溶液染色，最后冲洗掉染料并用棉棒擦拭干净小室内残余染料。经显微镜拍摄，用Image J软件计算侵袭的细胞数。用Graphpad prism软件绘制统计图，并作统计分析。结果如图8所示，说明MAGEA4-AS1的敲减抑制了两种OSCC细胞的侵袭能力。
综合以上结果可以看出，MAGEA4-AS1的表达具有组织特异性，MAGEA4-AS1的表达量在OSCC患者的肿瘤组织和OSCC细胞中显著上调；同时，MAGEA4-AS1对OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭具有调控作用。因此，MAGEA4-AS1对OSCC的发生发展起到重要的调控作用，有望成为有效的OSCC临床诊断标志物和靶向治疗药物。
实施例4：诊断实验
按照实施例2的方法和选择标准另外入组就诊的多名OSCC患者和正常人，收集患者的癌组织和正常人的口腔粘膜组织样本，检测MAGEA4-AS1的相对表达水平。结果发现，患者组的相对表达水平明显高于正常人的对照组，差异具有统计学意义(p<0.05)；ROC曲线显示AUC值大于0.7。这些结果进一步表明了MAGEA4-AS1对于OSCC的诊断能力。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (3)

1.检测MAGEA4-AS1的试剂在制备诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒中的应用，所述试剂包括扩增MAGEA4-AS1的引物对；所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂和反转录试剂。
3.特异性抑制MAGEA4-AS1表达的物质在制备抑制口腔鳞状癌细胞的增殖、迁移或侵袭的药物中的应用，所述物质为MAGEA4-AS1的shRNA，所述shRNA的Top strand和Bottomstrand的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
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