CN118166097A - 用于结直肠癌及癌前病变诊断的dna甲基化水平检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于结直肠癌及癌前病变诊断的DNA甲基化水平检测试剂盒，以Chr9:129620145‑129620733和Chr17:45261770‑45262263区域内的特定片段作为双靶点的甲基化标志物，通过人血液或粪便样本中该特定标志物的甲基化水平检测，实现了对结直肠癌及其癌前病变，尤其是结直肠侧向发育型肿瘤的优异的检测灵敏度和特异性，具有良好的临床应用前景。

Description

用于结直肠癌及癌前病变诊断的DNA甲基化水平检测试剂盒

技术领域

本发明属于医学体外诊断技术领域，更具体地，涉及一种用于结直肠癌及癌前病变的检测试剂盒。

背景技术

结直肠侧向发育型肿瘤(Laterally spreading tumor，LST)是一类直径类直径≥10mm的扁平腺瘤性息肉样病变，其贴近结肠黏膜表面呈侧向生长，占结直肠癌癌前病变的1％～6％。结直肠侧向发育型肿瘤的癌变率非常高，且恶化周期相较于一般腺瘤更快，内镜随访发现，结直肠侧向发育型肿瘤可在3年内发展为晚期结直肠癌，且有较大发展为黏膜下浸润癌的风险。如果在结直肠侧向发育型肿瘤阶段被早期发现，可行内镜下黏膜切除术(ESR)、内镜下黏膜剥离术(ESD)，进行治疗，可保持消化道优势，降低癌变风险。因此，对结直肠侧向发育型肿瘤的早期诊断可大幅提高患者的生存质量，降低癌变风险和死亡率。

但是，结直肠侧向发育型肿瘤病变形态较为平坦，其容易生长在袋状皱褶、回盲瓣等部位，这些部位的解剖结构极易隐藏病变，内镜下不容易被看见。且部分病变在普通白光内镜下仅表现为不易被观察的黏膜局限性颜色变化等特征。数据显示，结直肠LST在内镜下的检出率不高，约为0.5-2.0％，非常容易漏诊。因此，LST作为结直肠癌重要的癌前病变，开发一种对LST具有优异检出效率的分子诊断试剂，具有极大的临床应用价值。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于结直肠癌及癌前病变诊断的DNA甲基化水平检测试剂盒，通过人血液或粪便样本中目的基因的甲基化水平检测为结直肠癌及其癌前病变，尤其是结直肠侧向发育型肿瘤的早筛早诊提供参考，具有良好的临床应用前景。

为实现上述目的，本发明提供了一种DNA甲基化水平检测试剂盒，包括第一引物对和第一荧光探针，以及第二引物对和第二荧光探针，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQID NO.21～SEQ ID NO.22所示，所述第二引物对的核苷酸序列选自SEQ ID NO.29～30、SEQID NO.33～34、或SEQ ID NO.35～36中的至少一组。

在一些实施例中，所述第一荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，所述第二荧光探针选自SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.45中至少一种。

在一些实施例中，所述第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.21～SEQ IDNO.22，所述第一荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，所述第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.29～30，所述第二荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.42。

在一些实施例中，所述第一荧光探针的5’端和第二荧光探针的5’端分别包括不同的荧光报告基团，3’端包括荧光淬灭基团。

在一些实施例中，还包括内参基因的检测引物对和探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、亚硫酸氢盐转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。

在一些实施例中，所述扩增试剂为PCR扩增反应试剂，包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液中的一种或多种。

本发明还提供上述的检测试剂盒在制备结直肠癌或结直肠癌前病变检测产品中的应用。

在一些实施例中，所述结直肠癌前病变为结直肠侧向发育型肿瘤。

在一些实施例中，所述检测产品通过甲基化特异性实时荧光定量PCR法对离体生物样本进行检测。

在一些实施例中，所述离体生物样本选自来源于人的血液、粪便或离体肠道粘膜组织中的至少一种。

本发明提供了一种用于结直肠癌及癌前病变诊断的DNA甲基化水平检测试剂盒，以Chr9:129620145-129620733和Chr17:45261770-45262263区域内的特定片段作为双靶点的甲基化标志物，通过人血液或粪便样本中该特定标志物的甲基化水平检测，实现了对结直肠癌及其癌前病变，尤其是结直肠侧向发育型肿瘤的优异的检测灵敏度和特异性，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1为引物对M1、M3、M4分别在组织样本中检测结直肠侧向发育型肿瘤的ROC曲线；

图2为引物对M8、M9、M10和M11分别在组织样本中检测结直肠侧向发育型肿瘤的ROC曲线；

图3为引物对M1、M3、M4与引物对M8、M9、M10、M11两两组合在组织样本中检测结直肠侧向发育型肿瘤的ROC曲线；

图4为引物对M1、M3、M4分别在组织样本中检测结直肠癌的ROC曲线；

图5为引物对M8、M9、M10和M11分别在组织样本中检测结直肠癌的ROC曲线；

图6为引物对M1、M3、M4与引物对M8、M9、M10、M11两两组合在组织样本中检测结直肠癌的ROC曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语“检测”是指确定生物样本中的目的片段是否表现为相对于正常人的差异甲基化，进而为受试者的健康状态提供参考，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中，“检测”结直肠癌及其癌前病变是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有结直肠癌及其癌前病变，为疾病的诊断或辅助诊断提供参考指标。

术语“受试者”是指接受观察、检测或实验的对象。一些实施例中，受试者可以是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类)以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。一些实施例中，哺乳动物可以是人。

术语“生物标志物”或“标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，如蛋白质、DNA或RNA等，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。

术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代笔定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100％，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。

术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。

术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。在本申请公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物对，若Ct值满足所述要求，则表明目标序列是甲基化的。

术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。

结直肠侧向发育型肿瘤是一类直径类直径≥10mm的扁平腺瘤性息肉样病变，其贴近结肠黏膜表面呈侧向生长。结直肠侧向发育型肿瘤具有进展为恶性病变的可能性，是结直肠癌的一种癌前病变。

本发明提供了一种DNA甲基化水平检测试剂，包括检测人基因组中第一靶区域和第二靶区域的DNA甲基化水平的试剂，其中第一靶区域包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，第二靶区域包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在一些实施例中，该检测试剂包括第一引物对和第一荧光探针，以及第二引物对和第二荧光探针，第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.22所示，第二引物对的核苷酸序列选自SEQ ID NO.29～30、SEQ ID NO.33～34、或SEQ ID NO.35～36中的至少一组；第一荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，第二荧光探针选自SEQ IDNO.42、SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.45中至少一种。

上述引物对对于结直肠癌及癌前病变尤其是结直肠侧向发育型肿瘤比其他引物对显示出更加优异的检测灵敏度和特异性。这可能是与目的片段中的CpG位点在上述疾病中的表观遗传现象有关，也与引物对在检测过程中对目的片段的扩增效率有关。

需要说明的是，若一种引物对与上述引物对所示的核苷酸序列具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)等以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定的结直肠癌或其癌前病变诊断功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了一种用于检测结直肠癌及其癌前病变的试剂盒，其包括上述试剂。

一些实施例中，上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、亚硫酸氢盐转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。

一些实施例中，上述内参基因可以为但不限于ACTB。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他内参基因，此时，内参基因的检测引物对和探针对应设计即可。

较佳实施例中，上述第一荧光探针、上述第二荧光探针、上述内参基因ACTB的探针的5’端均包含有荧光报告基团，上述第一荧光探针、上述第二荧光探针、上述内参基因ACTB的探针的3’端均包含有荧光淬灭基团。上述各探针的荧光报告基团独立地选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种；上述各探针的荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。各探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于上述所列举。

一些实施例中，上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。本发明对甲基化转化试剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重硫酸盐(例如重硫酸钠、重硫酸钾、重硫酸铵)和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或多种。

一些实施例中，上述扩增试剂包括但不限于扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg²⁺中的一种或多种。一些实施例中，上述阳性对照是指其中包含甲基化的结直肠癌及其癌前病变标志物，用于监测试剂盒中试剂的检测性能；上述阴性对照是指其中不包含甲基化的结直肠癌及其癌前病变标志物，用于监测实验是否受到污染。

一些实施例中，上述试剂盒的检测样本包括但不限于分离自受试者的器官、组织、细胞和/或体液的组合物。一些实施例中，上述样本可以为组织、体液样本，进一步地，上述组织包括肺组织；上述体液包括血液、血浆、血清、细胞外液、组织液、淋巴液等，还包括痰液、尿液、唾液、粪便等。更进一步地，在本发明的具体实施例中，待测样本为血浆样本。

本申请对上述试剂盒检测样本中结直肠癌及其癌前病变生物标志物的甲基化水平的方法没有特别的限定，所用方法可以是但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序(BSP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。

基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述结直肠癌及其癌前病变生物标志物的甲基化水平进行检测，对结直肠癌及其癌前病变进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种通过检测样本中目的基因的靶区域的甲基化水平来检测结直肠癌及其癌前病变的方法。一些实施例中，本发明采用如下方法进行检测，该方法包括如下步骤：提取受试者的组织样本DNA，采用核酸转化试剂对其进行转化，随后对转化的DNA进行纯化，并采用本发明所述试剂盒进行PCR扩增和桑戈尔测序，进而判断待测组织样本为结直肠癌及其癌前病变阴性或阳性。

另一些实施例中，本发明采用如下方法进行检测，该方法包括如下步骤：提取受试者生物样本的DNA，采用核酸转化试剂对其进行转化，随后对转化的DNA进行纯化，并采用本发明所述试剂盒进行qPCR扩增，通过qMSP法检测NRN1基因的靶区域的甲基化水平，进而判断待测样本为结直肠癌及其癌前病变阴性或阳性。在一些实施例中，该样本为血液样本或粪便样本。

本发明还提供了上述试剂或上述试剂盒在制备结直肠癌及其癌前病变诊断产品中的应用。

一些实施例中，上述结直肠癌及其癌前病变诊断产品包括试剂、试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。可选地，上述试剂可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。需要说明的是，本发明提供的结直肠癌及其癌前病变诊断产品并不限于上述所列举的检测结直肠癌及其癌前病变的试剂，只要能满足结直肠癌及其癌前病变的诊断或辅助诊断的需求的产品均在本发明的保护范围内。

本发明还提供了上述试剂盒在监测受试者是否罹患结直肠癌及其癌前病变、或监测结直肠癌及其癌前病变患者是否结直肠癌及其癌前病变复发中的应用。在一些实施例中，可以通过以下方式在一段时间内监测上述受试者：以一定间隔重复采集样本，并分析上述样本，以确定上述结直肠癌及其癌前病变受试者是否正在进展。可监测任何进展期的结直肠癌及其癌前病变，包括早期结直肠癌及其癌前病变、晚期结直肠癌及其癌前病变或结直肠癌及其癌前病变复发。

本申请中所涉及的染色体坐标位置以GRCh38.p14为参考基因组。

以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。

本发明实施例中，所用试剂如无特殊说明，均为市售产品。

以下为实施例：

实施例1甲基化检测引物对和探针的优化筛选

本实施例对第一靶区域和第二靶区域分别设计了多对甲基化引物对，并采用SYBRGREEN I荧光染料法进行甲基化特异性荧光定量PCR检测所用引物对进行筛选。

以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2作为原始DNA序列，分别获得两个原始DNA序列完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4以及完全未甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，人工合成SEQ ID NO.3～6。为了尽可能多地检测样本中的靶区域，尤其考虑到粪便样本中ctDNA的片段大小，提高PCR扩增效率，将PCR扩增子长度限定在85-180bp范围内。因此，第一靶区域和第二靶区域分为若干个子区域进行检测，具体如表1所示，并根据表1中完全甲基化并经亚硫酸氢盐转化后的序列设计多对甲基化引物对，如表2所示。

表1标志物序列

表2引物对列表

人工合成表2中的引物对。将SEQ ID NO.3～6分别导入到pMD18T质粒载体上。将含有SEQ ID NO.3的质粒和SEQ ID NO.5的质粒等体积混合，每种模板浓度均为10³copies/μL，作为评估第一靶区域引物对的模板；同样的，将含有SEQ ID NO.4的质粒和SEQ ID NO.6的质粒等体积混合，每种模板浓度均为10³copies/μL，作为评估第二靶区域引物对的模板。

将模板加入到PCR反应管中，并加入可扩增对应模板的待检测扩增性能的引物对，例如要检测SEQ ID NO.3-4，则加入人工合成的引物对M1-M6中至少一组。再加入SYBRGreen PCR mix，进行PCR扩增反应。PCR配置体系如表3所示，反应程序如表4所示。

根据熔解曲线分析针对每个子区域的甲基化引物对的扩增特异性，当熔解曲线仅展示出一个峰时，表明扩增产物是单一的。

此外，将各个子区域的DNA序列(完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化的序列)分别人工合成，并构建至pMD18T质粒载体上，再依次将质粒载体稀释至10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、0copies/μL，以稀释好的质粒作为标准品，加入对应的引物对，进行PCR扩增，根据得到的Ct值以及质粒载体浓度的对数值绘制标准曲线，并计算每对甲基化引物对扩增子区域的扩增效率。

表3 SYBR Green PCR体系配置

组分	用量(μL)
		上游引物10μM	1
下游引物10μM	1
		2×SYBR Green PCR mix	12.5
模板	5
		超纯水	补足至25

表4 SYBR Green PCR反应程序

筛选出仅扩增含完全甲基化的转化后的序列的质粒模板，而不扩增含完全未甲基化的转化后的序列的质粒模板的甲基化引物对，且每对甲基化引物对扩增目标区域的扩增效率大于等于90％而小于等于110％。在经过筛选的甲基化引物对的扩增区域内设计检测探针，并且针对内参基因ACTB设计引物对和探针，如表5所示。

表5引物对筛选结果及检测探针列表

实施例2检测试剂在组织样本中检测结直肠癌及癌前病变的性能评估

1.样本的收集

从中国人民解放军海军军医大学第一附属医院收集131例经肠镜检查和病理活检确认的组织样本，包括45例经ESD剥离的结直肠侧向发育型肿瘤(LST组)及肿瘤旁正常黏膜组、86结直肠癌(CRC组)及癌旁正常黏膜组，所有样本均为经过福尔马林浸泡和石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。

入组标准：

LST组：符合Kudo定义，病变直径≥10mm，呈水平扩散生长，经病理诊断为黏膜下浸润癌的，分入CRC组，不纳入本组；肿瘤旁正常黏膜组为距离病变边缘≥5cm，且病理检查未发现浸润性病变的正常组织。

CRC组：外科切除术，术前未接受过放化疗或生物治疗，术后病理诊断确诊为癌，癌旁正常黏膜组为距离癌变部位边缘≥10cm，病理检查未发现浸润性病变的正常组织。

排除标准：有结直肠手术史、其他部位肿瘤放化疗手术史；合并其他恶性肿瘤；有溃疡性结肠炎、克罗恩病、或肠结核病史者；经病理诊断为良性增生性息肉者。

2.样本DNA的提取

使用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本中的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。

3.样本DNA的亚硫酸氢盐转化

将提取好的样本DNA进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNAMethylation-Gold ^TM Kit，具体实验操作参见试剂盒说明书。

4.定量甲基化特异性PCR(qMSP)

将亚硫酸氢盐转化后的样本DNA进行qMSP反应以检测各个待测样本中靶区域的甲基化状态。

本实施例提供的结直肠癌及癌前病变的检测试剂包括如表5所示的任一种或多种引物对和检测探针。例如任一检测试剂包括检测第一靶区域的甲基化水平的引物对和检测探针的组合M1、M3或M4中的一种，和/或检测第二靶区域的甲基化水平的引物对和探针的组合M8～M11中的一种。

其中检测探针均为TaqMan探针，第一靶区域的检测探针M1、M3或M4的5’端荧光报告基团为ROX，3’端荧光淬灭基团为BHQ，第二靶区域的检测探针的5’端荧光报告基团M8～M11为VIC，3’端荧光淬灭基团为BHQ。内参基因ACTB的探针其5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为MGB。

进行PCR反应时，在一个PCR管中，根据表5加入引物对和检测探针。检测单区域时，加入一组引物对和探针，检测双区域时，加入两组引物对和探针。

采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Invitrogen,Cat:14966005)进行PCR扩增，PCR反应液配置体系如表6所示，按照表7展示的扩增程序进行PCR扩增。

表6TaqManPCR反应体系

表7TaqMan PCR程序

5.结果分析

Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

结果判读：

分别对LST组和CRC组进行检测，并对根据检测的Ct值用R语言进行ROC分析，对于结直肠侧向发育肿瘤组的检测结果如表8和图1、图2和图3所示，对于结直肠癌组的检测结果统计如表8和图4、图5和图6所示。

表8检测试剂在组织样本中的检测性能

根据表8和图1-图6可以看出，在组织样本中，M4、M8、M10和M11均表现出较好的检测效果，尤其是M4组，对结直肠侧向发育型肿瘤具有优异的灵敏度，但其在结直肠癌癌旁组织中特异性相对较差。因此，本申请的发明人探究了两个靶区域联合检测的效果，发现M4和M8、M10和M11联合检测均能达到良好的灵敏度和特异性，尤其是M4和M8联合，相对于结直肠癌癌旁组织的特异性大幅提高，可达到80.2％以上。

实施例3甲基化检测试剂在血液样本和粪便样本中检测结直肠癌及癌前病变的性能评估

为进一步评估本申请的DNA甲基化检测试剂在实际临床样本中检测结直肠癌及癌前病变的效果，本实施例参考实施例2的结果，进一步在实际临床样本中评估双靶点的DNA甲基化检测试剂在血液样本和粪便样本中的检测性能。

1.样本的收集

从中国人民解放军海军军医大学第一附属医院入组38例临床诊断为结直肠侧向发育型肿瘤(LST组)和176例确诊为结直肠癌的病人，对照组入组良性增生性肠息肉的病人45例，肠道无疾病的健康人163例。其中结直肠侧向发育型肿瘤患者、结直肠癌患者和良性增生性肠息肉患者均依据肠镜和病理活检结果确诊；健康人组有肠镜结果。

收集每位受试者的血液样本和粪便样本，血液样本不少于8mL。粪便样本采用武汉艾米森粪便样本采集保存管(鄂汉械备20191654号)按说明书要求进行采集。

编盲后用本申请实施例提供的核酸组合物进行甲基化水平检测，检测完成后再与病理结果和肠镜结果进行揭盲对比。

样本的收集过程经过伦理委员会的审批，受试者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。

入组标准参考实施例2。

2.样本DNA的提取

血液样本采用采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。

粪便样本采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20200225号)进行DNA提取。

粪便样本采用捕获探针对目的片段进行捕获，捕获探针上标记有生物素，且和链霉亲和素磁珠混合形成捕获剂。捕获剂过量添加。

第一靶区域的捕获探针：

AGGCGCGTGGCCAGGGAGGACCCCGACTTCTT(SEQ ID NO.49)

TGAGGGTGCGGTGAGCTGAGTGCGGGGCCAA(SEQ ID NO.50)

第二靶区域的捕获探针：

CTCAGCCCCTGCGCGGTGCACACCCATG(SEQ ID NO.51)

GCCCGAAACCTAAATGCGGCTCCCTGC(SEQ ID NO.52)

3.样本DNA的亚硫酸氢盐转化

将提取好的样本DNA进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNAMethylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见试剂盒说明书。

4.定量甲基化特异性PCR(qMSP)

将亚硫酸氢盐转化后的样本DNA进行qMSP反应以检测各个待测样本中靶区域的甲基化状态。具体检测方法于实施例2相同。

阴性对照和阳性对照：在对各个目的基因分别进行检测时，应在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测。阴性对照为纯化水。阳性对照为人工合成质粒，阳性对照的制备方法为：将完全甲基化的各目的基因的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列(即各扩增区域中除了CG二核苷酸中的C保持不变外，其余位置的C均变成T)进行人工合成，并克隆至载体pMD18T上，形成人工合成质粒，将质粒稀释到10³拷贝/微升。

Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照的Ct值均应在26-30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

PCR结果分析：

对于粪便样本，若某一目的基因在样本上的Ct值≤38，则认为该目的基因在该样本中为甲基化阳性，若某一目的基因在样本上的Ct值>38，则认为该目的基因在该样本中为甲基化阴性；对于血液样本，若某一目的基因在样本上的Ct值≤48，则认为该目的基因在该样本中为甲基化阳性，若某一目的基因在样本上的Ct值>48，则认为该目的基因在该样本中为甲基化阴性。

当评价两个基因联合时的检测效果时，只要至少一个基因在样本中为甲基化阳性，则认为该基因组合在该样本中为甲基化阳性，当两个基因在样本中均为甲基化阴性时，则认为该基因组合在该样本中为甲基化阴性，将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的灵敏度和特异性。检测结果如表9所示。

表9双靶点检测试剂在血液和粪便样本中的检测性能

根据以上结果可知，M4和M8、M10或M11的双靶点组合在血液样本和粪便样本中均有良好的效果，尤其是M4和M8组合的双靶点，虽然在粪便样本中总特异性在90.87％左右，但总灵敏度可达93.46％，而且对结直肠侧向发育型肿瘤和结直肠癌均有较好的灵敏度，因此，该引物探针组合可以用于临床辅助诊断产品的开发，在血液检测和粪便检测方面均能达到良好的效果，尤其是可用于结直肠侧向发育型肿瘤的早期诊断。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种DNA甲基化水平检测试剂盒，其特征在于，包括第一引物对和第一荧光探针，以及第二引物对和第二荧光探针，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～SEQ IDNO.22所示，所述第二引物对的核苷酸序列选自SEQ ID NO.29～30、SEQ ID NO.33～34、或SEQ ID NO.35～36中的至少一组。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述第一荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，所述第二荧光探针选自SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.45中至少一种。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.22，所述第一荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，所述第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.29～30，所述第二荧光探针的核苷酸序列为SEQID NO.42。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述第一荧光探针的5’端和第二荧光探针的5’端分别包括不同的荧光报告基团，3’端包括荧光淬灭基团。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括内参基因的检测引物对和探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、亚硫酸氢盐转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂为PCR扩增反应试剂，包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液中的一种或多种。

7.权利要求1-6任一项所述的检测试剂盒在制备结直肠癌或结直肠癌前病变检测产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌前病变为结直肠侧向发育型肿瘤。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测产品通过甲基化特异性实时荧光定量PCR法对离体生物样本进行检测。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述离体生物样本选自来源于人的血液、粪便或离体肠道粘膜组织中的至少一种。