CN118165944A - 一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂，该冻干保护剂中含有海藻糖，甘油，明胶，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，氯化钠，硫酸镁和纯化水，应用的噬菌体包括短尾噬菌体科沙门氏菌噬菌体GRNSaP202、肌尾噬菌体科沙门氏菌噬菌体GRNSaP219、长尾噬菌体科沙门氏菌噬菌体GRNSaP251。该冻干保护剂制备时，将海藻糖，甘油，明胶，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，氯化钠，硫酸镁以特定比例均匀溶解于双蒸水中，经121℃压力蒸汽灭菌15分钟，灭菌完成待冷却后即可使用。该沙门氏菌噬菌体冻干保护剂制备方法合理，应用方便，有着优异的噬菌体活性保护能力，冻干存后多种噬菌体存活率均大于76％，且可获得保存期大于2年的噬菌体制剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂。
背景技术
沙门氏菌属肠内杆菌科，为革兰氏阴性、兼性厌氧性短杆菌，不产生芽孢，属于细胞内寄生的病原。沙门氏菌广泛存在于人类、家畜(马、牛、羊、猪、狗、猫、兔等)、家禽(鸡、鸭、鹅、鸽等)与鼠类，甚至于两栖类、爬虫类和昆虫的肠道中。沙门氏菌能够感染的宿主范围广泛。
传统对沙门氏菌的预防与治疗多使用包含抗生素在内的化学製剂疗法(chemotherapy),虽然该方法快速且有效率,但是经常性地使用抗生素,会导致病原菌产生耐药性。因此,噬菌体作为一种潜在的天然绿色、安全有效的抗生素替代品，其高度的宿主专一性表现出极大地优势。然而现今对噬菌体的保存方式多为液态保存，现有冻干技术存在复溶后噬菌体活性不理想且长期保存稳定性不佳的问题，限制了噬菌体的应用。且噬菌体的型态非常多样，约有96.3％属于有尾部构造的有尾噬菌体目(Caudovirales)，有尾噬菌体目又可根据尾部构造细分为短尾噬菌体科(Podoviridae)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)以及长尾噬菌体科(Siphoviridae)，不同科噬菌体不同科的噬菌体冻干存活率及长期保存稳定性存在差异，肌尾噬菌体及长尾噬菌体存活率及稳定性较差。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂，以解决上述背景技术中提出的问题，本发明的冻干保护剂应用方便，有着优异的噬菌体活性保护能力，冻干后多种噬菌体存活率均大于76％，且可获得保存期大于2年的噬菌体制剂。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂，该冻干保护剂中含有海藻糖，甘油，明胶，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，氯化钠，硫酸镁和纯化水，该冻干保护剂应用的噬菌体包括短尾噬菌体科沙门氏菌噬菌体GRNSaP202、肌尾噬菌体科沙门氏菌噬菌体GRNSaP219、长尾噬菌体科沙门氏菌噬菌体GRNSaP251。
进一步的，该冻干保护剂按照以下流程制备：将海藻糖，甘油，明胶，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，氯化钠，硫酸镁以特定比例均匀溶解于双蒸水中，经121℃压力蒸汽灭菌15分钟，灭菌完成待冷却后即可使用。
进一步的，还包括以下应用流程：
S1、噬菌体发酵液经过11814xg，4℃离心30min；
S2、收集上清液并以30243xg，4℃离心180min，去除上清液并以冻干保护剂重悬噬菌体沉淀颗粒；
S3、使用0.22μm滤膜过滤噬菌体悬浮液；
S4、预降温：将上述悬浮液以0.5℃/min的速率降温至-40℃，并保持120min；
S5、一次干燥：将上述悬浮液于-40℃、0.3mbar压强的条件下干燥18h；
S6、；解析干燥：将上述悬浮液升温至10℃，并保持8h后得到噬菌体冻干粉；
S7、噬菌体冻干粉在无菌条件下密封于西林瓶中保存。
进一步的，密封后的冻干粉放置在4-37℃保存。
进一步的，所述噬菌体冻干粉剂应用于畜禽业及水产养殖业。
进一步的，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH为7.5。
本发明的有益效果：
1.该沙门氏菌噬菌体冻干保护剂制备方法合理，应用方便，有着优异的噬菌体活性保护能力，冻干存后多种噬菌体存活率均大于76％，且可获得保存期大于2年的噬菌体制剂。
2.该沙门氏菌噬菌体冻干保护剂与具有生物活性的噬菌体一起冻干处理，并控制保护剂组成物于特定浓度，使得冻干保护剂能够对噬菌体起到最佳保护作用，有效地保护噬菌体的结构和生物活性；可以降低冰晶的形成，从而减少冰晶对噬菌体颗粒的破坏。此外，也可保持蛋白质结构，避免蛋白质失活或聚集。
3.该沙门氏菌噬菌体冻干保护剂可以防止噬菌体受到冻干过程中的温度变化、氧化损伤和机械应力等因素的影响，从而保持其活性和稳定性，从而提高了噬菌体冻干粉制剂的运输和储存便利性，降低了噬菌体冻干粉制剂的运输和储存的经济成本，而且能够保证噬菌体冻干粉制剂经过长期保存和进行复溶后噬菌体的活性高，从而提高了噬菌体冻干粉制剂实际应用性；同时也不含有毒性成分，不会造成环境污染，适用于多种不同科的噬菌体，应用范围广泛。
附图说明
图1为沙门噬菌体GRNSaP202的电子显微镜图；
图2为沙门噬菌体GRNSaP219的电子显微镜图；
图3为沙门噬菌体GRNSaP251的电子显微镜图；
图4为本发明一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂的制备及使用流程图；
图5为本发明冻干保护剂的噬菌体冻干前后的存活率图；
图6为本发明冻干保护剂4℃保存的噬菌体长期存活率图；
图7为本发明冻干保护剂25℃保存的噬菌体长期存活率图；
图8为本发明冻干保护剂37℃保存的噬菌体长期存活率图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
请参阅图1至图8，本发明提供以下技术方案：
以下实施例中，TSB液体培养基的配方为：酪蛋白胰酶消化物17g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，纯化水1000mL，pH 7.3±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。
TSB半固体培养基的配方为：酪蛋白胰酶消化物17g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂7.5g，纯化水1000mL，pH 7.3±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。
实施例中，具有生物活性的噬菌体为沙门氏菌噬菌体GRNSaP202、GRNSaP219及GRNSaP251，分别为短尾噬菌体科，肌尾噬菌体科与长尾噬菌体科噬菌体，其形态如图1、图2及图3所示。
实施例1：
参照图4所示，一种沙门氏菌噬菌体的冻干保存方法，在5％的湿度条件下完成，包括以下步骤：
噬菌体冻干剂中的噬菌体为噬菌体裂解液。首先，分别对3株噬菌体原液进行扩大培养，具体操作方法为:取处于对数期中期(OD600＝0.40)的沙门氏菌GRNSa0011.2 ml加入到1200mL的TSB液体培养基中，37℃振荡培养；加入1.8×108PFU的噬菌体(GRNSaP202或GRNSaP219或GRNSaP251)溶液继续在摇床培养至混合液完全变为澄清；将混合液分装至高速离心管(High-Speed PPCO Centrifuge Tubes,Thermo Scientific)，以高速冷冻离心机(Avanti JXN-26,Beckman Coulter)在4℃下离心11814xg，30min，收集上清液并以30243xg，4℃离心180min；去除上清液并以1000ml冻干保护剂重悬噬菌体沉淀颗粒；使用0.22μm滤膜过滤上清液得到噬菌体悬浮液；对照组则以TSB液体培养基1000ml重悬；取1ml悬浮液以测定冻干前效价；使用Tofflon LYO-0.5冷冻干燥机进行冻干作业，步骤如下:
1)预降温：将上述悬浮液以0.5℃/min的速率降温至-40℃，并保持120min；
2)一次干燥：将上述悬浮液于-40℃、0.3mbar压强的条件下干燥18h；
3)解析干燥：将上述悬浮液升温至10℃，并保持8h后得到噬菌体冻干粉；
4)噬菌体冻干粉在无菌条件下密封于西林瓶中保存，所述西林瓶置于4℃，25℃，37℃环境保存。
实施例2：
噬菌体冻干存活率试验：
以999ml纯化水复溶噬菌体冻干粉，进行序列稀释并采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作三份复管培养取平均值。结果如图5所示，短尾噬菌体GRNSaP202、肌尾噬菌体GRNSaP219及长尾噬菌体GRNSaP251冻干存活率分别为：大于95％、大于85％、大于80％，具有良好的冻干存活率。
实施例3：
噬菌体长期存活率试验：
将噬菌体冻干粉分别置于4℃、25℃和37℃保存，24月后测定噬菌体效价，各点均作三份复管培养取平均值。结果如图6、图7、图8所示，短尾噬菌体GRNSaP202、肌尾噬菌体GRNSaP219及长尾噬菌体GRNSaP25124个月保存的存活率为：大于84％、大于74％、大于81％，展现出优异的长期保存稳定性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂，其特征在于：该冻干保护剂中含有海藻糖，甘油，明胶，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，氯化钠，硫酸镁和纯化水，该冻干保护剂应用的噬菌体包括短尾噬菌体科沙门氏菌噬菌体GRNSaP202、肌尾噬菌体科沙门氏菌噬菌体GRNSaP219、长尾噬菌体科沙门氏菌噬菌体GRNSaP251。
2.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂，其特征在于，该冻干保护剂按照以下流程制备：将海藻糖，甘油，明胶，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，氯化钠，硫酸镁以特定比例均匀溶解于双蒸水中，经121℃压力蒸汽灭菌15分钟，灭菌完成待冷却后即可使用。
3.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂，其特征在于，还包括以下应用流程：
S1、噬菌体发酵液经过11814xg，4℃离心30min；
S2、收集上清液并以30243xg，4℃离心180min，去除上清液并以冻干保护剂重悬噬菌体沉淀颗粒；
S3、使用0.22μm滤膜过滤噬菌体悬浮液；
S4、预降温：将上述悬浮液以0.5℃/min的速率降温至-40℃，并保持120min；
S5、一次干燥：将上述悬浮液于-40℃、0.3mbar压强的条件下干燥18h；
S6、解析干燥：将上述悬浮液升温至10℃，并保持8h后得到噬菌体冻干粉；
S7、噬菌体冻干粉在无菌条件下密封于西林瓶中保存。
4.根据权利要求3所述的一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂，其特征在于：密封后的冻干粉放置在4-37℃保存。
5.根据权利要求3所述的一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂，其特征在于：所述噬菌体冻干粉剂应用于畜禽业及水产养殖业。
6.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌噬菌体冻干保护剂，其特征在于：所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH为7.5。
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