CN118165111B

CN118165111B - 针对Tim-3的抗体

Info

Publication number: CN118165111B
Application number: CN202410598580.2A
Authority: CN
Inventors: 韩根成; 李葛; 杜琳; 杜春晓; 陈隽睿; 王智鼎; 李宇翔; 冯建男
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2024-05-15
Filing date: 2024-05-15
Publication date: 2024-08-13
Anticipated expiration: 2044-05-15
Also published as: CN118165111A

Abstract

本发明公开了针对Tim‑3的抗体。本发明提供了Tim‑3抗体、核酸分子、载体和宿主细胞，所述抗体能够与Tim‑3蛋白具有良好的结合活性，并且能够阻断Tim‑3信号进而发挥生物学活性作用，具有广阔的应用前景。

Description

针对Tim-3的抗体

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及针对Tim-3的抗体。

背景技术

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T cell immunoglobulinand mucin-domain-containing molecule 3，Tim-3），又称甲型肝炎病毒细胞受体2（hepatitis Aviruscellular receptor 2，HAVCR-2），是一种I型膜表面蛋白分子，属TIM家族成员。研究证实Tim-3表达的异常与许多疾病有密切的关系，如研究发现HIV，HCV感染的患者以及一些肿瘤患者，其T细胞上Tim-3表达升高，由于Tim-3能介导T效应细胞的调亡，传递负性调节信号，可导致机体的免疫功能瘫痪。任何阻断Tim-3/Gal-9结合的因素均可以使Th1、Th17细胞避开死亡，增强T效应细胞的活性，恢复免疫功能。

一方面，在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮（SLE）、哮喘等疾病中，由于Gal-9或Tim-3表达的升高，导致Th1细胞的功能受到抑制，进而打破体内的免疫平衡，引起病理性的Th2细胞的活性增强，导致疾病的发病。在这种情况下，任何阻断Tim-3/Gal-9结合的因素均能有利于体内免疫平衡的恢复，缓解疾病的进程。如给哮喘模型动物注射抗Tim-3抗体或重组Tim-3融合蛋白均能通过阻断Tim-3/Gal-9结合，增强Th1细胞活性，纠正由Th2细胞介导的哮喘症状，恢复体内Th1/Th2细胞平衡。另一方面，在一些自身免疫病如炎性肠病以及I型糖尿病模型中，研究发现阻断Tim-3的活性增强了体内Th1效应细胞的功能，进一步加重了自身免疫损伤，该结果再次证明Tim-3在体内免疫平衡的维持中发挥重要作用。

上述研究资料表明，Tim-3通路具有重要的免疫调节功能，其表达的异常与多种疾病的发生、发展有密切关系。因此建立和发展抗Tim-3抗体及其相关的检测产品，对本领域至关重要。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供了针对Tim-3的抗体。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了针对Tim-3的抗体，所述抗体包括如SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列的重链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；

以及如SEQ ID NO:9、10、11所示的氨基酸序列的轻链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。

进一步，所述抗体还包括与SEQ ID NO:4、5、6、7所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4；

以及与SEQ ID NO:12、13、14、15所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4。

进一步，重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、5、6、7所示；

轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:12、13、14、15所示。

进一步，所述抗体的重链可变区与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少70%序列同一性；

轻链可变区与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。

进一步，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

进一步，所述抗体是低岩藻糖基化抗体。

本发明的第二方面提供了如下任一项物质：

（1）核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的抗体；

（2）载体，所述载体包括（1）中所述的核酸分子；

（3）宿主细胞，所述宿主细胞包括（1）中所述的核酸分子或（2）中所述的载体；

（4）检测Tim-3的产品，所述产品包括本发明第一方面所述的抗体；

（5）药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的抗体；

（6）一种衍生物，所述衍生物包括在本发明第一方面所述的抗体上连接可检测试剂、治疗试剂。

进一步，所述药物组合物还包括其他药剂。

进一步，所述其他药剂包括靶向抗肿瘤药、化疗药物、小分子药物或刺激对给定癌症的免疫应答的抗体。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的第三方面提供了一种检测样本中Tim-3的方法，所述方法包括使本发明第一方面所述的抗体与待检测样本接触，从而检测样本中Tim-3的水平。

进一步，所述方法为非诊断目的的方法。

本发明的第四方面提供了一种制备本发明第一方面所述的抗体的方法，所述方法包括培养本发明第二方面中所述的宿主细胞，回收抗体。

进一步，所述方法还包括纯化所述的抗体。

本发明的第五方面提供了本发明第一方面所述的抗体在检测Tim-3或在制备检测Tim-3的产品中的应用。

本发明的第六方面提供了本发明第一方面所述的抗体在制备抑制Tim-3相关疾病的药物组合物中的应用。

进一步，Tim-3相关疾病包括Gal-9或Tim-3异常升高相关的疾病。

进一步，所述Tim-3相关疾病包括癌症、免疫病症、哮喘、感染相关疾病。

本发明的第七方面提供了本发明第一方面所述的抗体在制备阻断Tim-3信号的药物组合物中的应用。

进一步，通过上调炎性因子的表达阻断Tim-3信号。

进一步，所述炎性因子包括IL-6和/或TNF-α。

本发明的第八方面提供了本发明第一方面所述的抗体在制备激活T细胞的药物组合物中应用。

进一步，通过促进T淋巴细胞中IFN-γ的表达激活T细胞。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了Tim-3抗体、核酸分子、载体和宿主细胞，所述抗体能够与Tim-3蛋白具有良好的结合活性，并且能够阻断Tim-3信号进而发挥生物学活性作用，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是考马斯亮蓝方法鉴定的抗体图；

图2是anti-Tim-3抗体结合能力测定图，其中，2A是Biacore检测anti-Tim-3抗体亲和力图，2B是ELISA检测anti-Tim-3与抗原结合活性图；

图3是anti-Tim-3抗体阻断活性检测图，其中，3A是RT-PCR检测anti-Tim-3抗体与BV2细胞孵育后IL-6表达图，3B是RT-PCR检测anti-Tim-3抗体与BV2细胞孵育后TNF-α表达图，3C是RT-PCR检测anti-Tim-3抗体与RAW264.7细胞孵育后IL-6表达图，3D是RT-PCR检测anti-Tim-3抗体与RAW264.7细胞孵育后TNF-α表达图。

具体实施方式

下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

本发明提供了针对Tim-3的抗体，所述抗体包括如SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列的重链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；

在本发明的一种实施方式中，抗体包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段。抗体的实例包括单克隆抗体、重组生成的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体（包括双特异性抗体）、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链分子和两个轻链分子的四聚抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体（intrabody）、异源缀合（heteroconjugate）抗体、抗体-药物缀合物、单域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv（scFv）、骆驼化抗体、亲和体（affybody）、Fab片段、F（ab’）2片段、二硫键连接的Fv（sdFv）、抗-独特型（抗-Id）抗体（包括，例如抗-抗-Id抗体）及上述任一种的抗原结合片段。

在本发明的一种实施方式中，抗原结合片段指保留与抗原（例如人Tim-3）特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。包含在抗体（例如本申请所述的抗Tim-3抗体）的抗原结合部分内的结合片段的实例包括（i）Fab片段（来自木瓜蛋白酶切割的片段）或由V_L、V_H、LC和CH1结构域组成的类似的单价片段；（ii）F（ab'）2片段（来自胃蛋白酶切割的片段）或包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的类似的二价片段；（iii）由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；（v）dAb片段（Ward等人,（1989）Nature 341:544-546），其由V_H结构域组成；（vi）分离的互补决定区（CDR）和（vii）可任选地由合成接头连接的两个或多个分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使它们能够作为其中V_L和V_H区配对以形成单价分子的单个蛋白链形成（称为单链Fv（scFv）；参见例如Bird等人（1988）Science 242:423-426；和Huston等人（1988）Proc.Natl .Acad.Sci.USA 85:5879-5883）。此种单链抗体也意欲包含在术语抗体的抗原结合部分内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。抗原结合片段可通过重组DNA技术、或通过完整的免疫球蛋白的酶或化学切割得到。

在发明的一种实施方式中，对于抗体的互补决定区CDR的精确氨基酸序列边界，可根据公知方法来定义，例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia（Chothia等，Nature 342:877-883，1989；Al-Lazikani等，Journal of Molecular Biology，273:927-948，1997）；或者基于抗体序列可变性的Kabat（Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health，1987）、AbM（University of Bath）、Contact（University College London）以及IMGT（the international ImMunoGeneTicsdatabase,1999Nucleic Acids Research,27,209-212）；或者基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类（affinity propagation clustering）的North CDR定义。本申请中抗体的CDR可以由本领域技术人员根据本领域的任何方案（例如上述任选的定义方法）确定边界。

在本发明的一种实施方式中，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，例如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分GlcNAc结构的抗体。此类改变的糖基化模式已证实增加抗体的ADCC能力。例如，通过在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体，可以实现这样的碳水化合物修饰。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述，并且可用作宿主细胞，在所述宿主细胞中表达本申请所述的重组抗Tim-3抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。

本发明提供了如下任一项物质：

（1）核酸分子，所述核酸分子编码上述抗体；

（2）载体，所述载体包括（1）中所述的核酸分子；

（4）检测Tim-3的产品，所述产品包括上述抗体；

（5）药物组合物，所述药物组合物包括上述抗体；

（6）一种衍生物，所述衍生物包括在上述抗体上连接可检测试剂、治疗试剂。

在本发明的一种实施方式中，核酸分子可以包含编码含有本申请所述的抗体的VL、FR和CDR（参见，例如表1）的轻链的核苷酸序列或编码含有本申请所述的抗体的VH、FR和CDR（参见，例如表1）的重链的核苷酸序列。核酸分子可以通过例如密码子/RNA优化、异源信号序列置换和mRNA不稳定性元件的消除来对其进行优化。

在本发明的一种实施方式中，载体是指其能够运送与其连接的另一种核酸。在一些实施方式中，载体是质粒，即可以与另外的DNA区段连接的DNA的环状双链段。在一些实施方式中，载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。在一些实施方式中，载体能够在接受其导入的宿主细胞内自我复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体）。在其他实施方式中，可以将载体（例如非附加体哺乳动物载体）在导入宿主细胞后掺入宿主细胞的基因组中，并从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。载体在本申请中又可被称作重组表达载体或表达载体。

在一些实施方式中，通过如下表达本申请的抗Tim-3抗体或其抗原结合部分：将编码部分或全长轻链和重链的DNA（如以上描述地获得的）插入表达载体中，使得将基因可操作连接至必要的表达控制序列，诸如转录和翻译控制序列。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒（AAV）、植物病毒，诸如花椰菜蚀刻病毒、烟草蚀刻病毒、粘粒、YAC、衍生自EBV的附加体等等。可以将抗体编码序列连接至载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体编码序列的转录和翻译的期望功能。可以选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞兼容。可以将抗体轻链编码序列和抗体重链编码序列插入分开的载体中，并且可以可操作连接至相同的或不同表达控制序列（例如启动子）。在一个实施方式中，将编码序列两者插入相同的表达载体中，并且可以可操作连接至相同的表达控制序列（例如共同启动子）、分开的相同的表达控制序列（例如启动子）、或不同表达控制序列（例如启动子）。可以通过标准方法（例如抗体基因片段和载体上的互补限制位的连接、或平端连接，如不存在限制性位点）将抗体编码序列插入表达载体中。

在本发明的一种实施方式中，宿主细胞意指已经接受重组表达载体导入的细胞。可以将编码抗Tim-3抗体的核酸分子和包含这些核酸分子的载体用于转染合适的哺乳动物、细菌或酵母菌宿主细胞。转化可以通过任何已知用于将多核苷酸导入宿主细胞中的方法进行。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域公知的，且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺（Polybrene）介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包囊于脂质粒中、和将DNA直接微注射至细胞核中。此外，可以通过病毒载体将核酸分子导入哺乳动物细胞中。

其中，哺乳动物细胞系包括但不限于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、293Freestyle细胞（Invitrogen）、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾脏（BHK）细胞、非洲绿猴肾脏细胞（COS）、人肝细胞癌细胞（例如Hep G2）、A549细胞和许多其他细胞系。可以使用的其他细胞系还包括昆虫细胞系（诸如Sf9或Sf21细胞）。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一段时间生产抗体，该时间段足以允许抗体在宿主细胞中的表达或更优选将抗体分泌至培养宿主细胞的培养基。可以自培养基使用标准蛋白质纯化方法回收抗体。细菌宿主细胞包括大肠杆菌（E.coli）和链霉菌属（Streptomyces）物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）、酿酒酿母（Saccharomyces cerevisiae）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。

在本发明的一种实施方式中，可检测试剂可以是具有可检测的物理或化学特性的任何物质。这类可检测的试剂在免疫测定领域已良好开发，并且一般来说，在这类方法中有用的任何标记的大部分可以应用于所提供的方法。因此，标记可以是通过光谱、光化学、生化、免疫化学、电学、光学或化学方法可检测的任何组合物。可检测试剂包括但不限于荧光染料（例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等），放射性标记（例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P），特别地，放射性标记（例如，¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Cr和⁵⁶Fe），金属离子（例如，¹¹¹In、⁹⁷Ru、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr和²⁰¹Tl），酶（例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及ELISA中常用的其他酶），电子转移剂（例如，包括金属结合蛋白和化合物），发光和化学发光标记（例如，萤光素和2,3-二氢酞嗪（2,3-dihydrophtahlazinediones），例如，鲁米诺），磁珠（例如，DYNABEADSTM），以及比色标记，例如胶体金或有色玻璃或塑料珠（例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳）。

在本发明的一种实施方式中，合适的治疗试剂包括抗代谢物、烷化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选通过可切割的接头例如肽基、二硫化物或腙接头缀合。在其他实施方式中，接头是肽基接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。

本发明提供了上述抗体在制备抑制Tim-3相关疾病的药物组合物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，抗Tim-3抗体可以刺激NK细胞介导的对靶细胞的杀伤，并且可以增强CD4+T细胞的IFN-γ分泌和增殖。因此，在某些实施方式中，本申请中描述的抗Tim-3抗体分子适用于刺激所要的免疫应答，例如抗癌症细胞或病原体的免疫应答。Tim-3相关疾病包括Gal-9或Tim-3异常升高相关的疾病，包括免疫病症、哮喘、癌症、感染相关疾病等。

在本发明的一种实施方式中，免疫病症包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病、克罗恩病、红斑狼疮（如系统性红斑狼疮）、I型糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、过度增生性免疫障碍和感染性疾病。

在本发明的一种实施方式中，癌或癌症指在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。癌症的非限定性的实例包括黑素瘤（例如转移性恶性黑素瘤）、肾癌（例如透明细胞癌）、前列腺癌（例如激素难治性前列腺腺癌）、乳腺癌、结肠癌和肺癌（例如非小细胞肺癌）。另外，可以利用本申请中描述的抗体分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。癌症包括但是不同限于基底细胞癌、胆道癌、膀肮癌、骨癌、大脑和CNS癌症、原发性CNS淋巴瘤、中枢神经系统（CNS）瘤、乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼睛癌症、头部和颈部癌症、胃癌、土皮内瘤、肾癌、喉癌、白血病（包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巳母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性或急性白血病）、肝癌、肺癌（例如小细胞和非小细胞癌）、淋巴瘤，包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、黑素瘤，例如皮肤或眼内的恶性黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌（例如唇、舌、口腔癌）；卵巢癌，胰腺癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌症、肉瘤:皮肤癌、胃癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、肝癌、月工区癌症、输卵管癌、阴道癌、外阴癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、脊椎轴肿瘤、神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波因肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括由石棉诱导的那些癌症，以及其它癌和肉瘤和所说的癌症的组合。

在本发明的一种实施方式中，感染相关疾病包括但不限于HIV感染、HCV感染。

所述药物组合物还包括其他药剂。

在本发明的一种实施方式中，所述其他药剂包括用于治疗癌症的其他化合物、药物和/或药剂。此类化合物、药物和/或药剂可以包括例如靶向抗肿瘤药、化疗药物、小分子药物或刺激对给定癌症的免疫应答的抗体。

其中，靶向抗肿瘤药包括但不限于17-AAG、2-deoxyglucose、阿比特龙（Abiraterone）、ABT-263、AC-220、AT-406、AZD4547、AZD5363、AZD7762、BI-2536、Birinapant、BMS-754807、硼替佐米（Bortezomib）、BX-795、卡博替尼（Cabozantinib）、CAL-101、卡非佐米（Carfilzomib）、克唑替尼（crizotinib）、danusertib、达沙替尼（Dasatinib）、Dovitinib、Elesclomol、Embelin、恩替诺特（Entinostat）（MS-275）、Enzastaurin、依维莫司（Everolimus）、Foretinib、氟维司群（Fulvestrant）、Ganetespib、GDC0941、GSK429286A、JQ1、KU-55933、KX2-391、Lenvatinib、Linifanib、Linsitinib、LY2157299、Masitinib、MK-1775、MK-2206、MLN-4924、Neratinib、NU7441、Nutlin-3、NVPBEZ235、NVP-BKM120、Orantinib、PCI-32765、PD-0325901、PD-0332991、PD-173074、PH-797804、PRT062607、R-406、Refametinib、瑞戈非尼（Regorafenib）、SCH900776、sgi-1776、索拉非尼（Sorafenib）、舒尼替尼（Sunitinib）、TAE684、替西莫司（Temsirolimus）、TG-101348、Tideglusib、Tipifarnib、Tivantinib、Toremifene、Tozasertib、曲美替尼（Trametinib）、维甲酸（Tretinoin）、Triptolide、伐地考昔（Valdecoxib）、维莫德吉（Vismodegib）、Volasertib、伏立诺他（Vorinostat）、YM-155、CHIR-99021、NVP-BGJ398、LY2090314。

化疗药包括但不限于六甲蜜胺、氨鲁米特、阿那罗唑、阿扎胞苷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡培他滨、卡铂、顺铂、克拉曲滨、氯法拉宾、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、地西他滨、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊甙、伊西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、洛莫司丁、6-巯基嘌呤、美司钠、甲胺喋呤、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、奈拉滨、培美曲塞、喷司他汀、普拉曲沙、甲苄肼、雷替曲噻、链脲霉素、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、长春花碱、长春瑞滨、唑来膦酸。

所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

在本发明的一种实施方式中，药学上可接受的载体适用于与人和动物组织接触而没有过度毒性、刺激、变态反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。所述载体应当是可接受的，这意味着它与该制剂的其它成分相容，并且对受体无害。药学上可接受的载体包括与药物给药相容的缓冲液、溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。

含有抗体（如本申请公开的那些）的药物组合物可以以剂量单位形式存在并且可以通过任何合适的方法制备。药物组合物应当配制为与其预期的给药途径相容。给药途径的示例包括静脉内（IV），皮内，吸入，透皮，局部，透粘膜和直肠给药。抗体的优选给药途径是静脉内输注。有用的制剂可以通过药学领域众所周知的方法制备。适合肠胃外给药的制剂组分包括无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如EDTA；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。

对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛ELTM（巴斯夫（BASF），新泽西州帕西潘尼）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。该载体在制造和储存条件下应保持稳定，并应防止微生物侵害。运载体可以是包含水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇）及其合适的混合物的溶剂或分散介质。

药物制剂优选是无菌的。灭菌可以例如通过无菌滤膜过滤来完成。在组合物冻干的情况下，可以在冻干和重建之前或之后进行过滤器灭菌。

在本发明的一种实施方式中，阻断或抑制可互换使用，并且涵盖部分和完全抑制/阻断。

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例

1实验材料

实验细胞：RAW264.7细胞和BV2细胞（ATCC，美国）。

实验试剂：Fab capture kit以及CM5 sensor芯片（GE Health，美国）；抗人Tim-3抗体（GGC）由本实验室表达纯化；上样缓冲液、巯基乙醇、考马斯亮蓝染液、脱色液（江苏康为世纪生物科技有限公司，中国）；TMB（Thermofish，美国）。

仪器设备：蛋白纯化仪（AKTAprime plus, GE Health，美国）；酶标仪（ThermoMULTISKAN MK3，美国）；CO₂细胞培养箱（Thermo Fish，美国）；流式细胞仪（BDFACSCalibur，美国）；恒压恒流电泳仪（Bio-Rad，美国）；生物分子相互作用分析仪（GEBiacore T200，美国）。

2实验方法

2.1 SDS-PAGE

使用PBS稀释GGC抗体至2 μg，分别加入含巯基乙醇的上样缓冲液和不含巯基乙醇的上样缓冲液，沸水煮10 min后，加样进行SDS电泳，电泳结束后，将胶整个放入考马斯亮蓝染液中，室温染色2 h，之后使用脱色液进行过夜脱色，脱色彻底后进行拍照保存。

2.2抗体亲和力检测

将抗人Fab抗体偶联到CM5芯片上，之后稀释抗体样品至1-2 μg/ml，并以30 ml/min的流速进样60-150秒，将hTim-3-his融合蛋白进行梯度稀释至浓度为3.125 nM，6.25nM，12.5 nM，25 nM，50 nM，100 nM，并以30 μL/min流速进样抗原，使其结合120s，之后解离1200 s。实验结束后使用10 mM Glycine-HCl pH=2.1进行再生60 s。之后利用BiacoreT200分析软件分析结果。

2.3 ELISA检测GGC抗体的结合

使用直接ELISA方法进行检测：

a包被hTim-3融合蛋白2 μg/ml，100 μL/孔，4℃过夜；

b封闭：5%牛奶（PBST配置）封闭，200 μL/孔，室温1 h；

c加样：使用PBS稀释制备的抗人anti-Tim-3抗体，100 μL/孔，终浓度分别为125 μg/ml，25 μg/ml，5 μg/ml，1 μg/ml，0.2 μg/ml，0.04 μg/ml，0.008 μg/ml，同时设置空白对照孔；37℃，1 h；

d二抗：按照说明书比例加入100 μL/孔anti-human-HRP二抗，室温40 min；

e显色终止：加入TMB，100 μL/孔，室温避光显色5 min后，加入100 μL/孔终止液，之后检测OD₄₅₀值。

2.4 RT-PCR检测anti-Tim-3抗体阻断后，细胞中炎症因子的表达

取处于对数生长期的RAW264.7细胞和BV2细胞，铺于24孔板中，待细胞贴壁后，加入对照抗体和anti-Tim-3抗体（终浓度为1 μg/ml和10 μg/ml），24 h后收集细胞进行RNA提取，之后反转为cDNA，进行后续实时定量PCR检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达。

3实验结果

3.1 SDS-PAGE鉴定制备的抗人Tim-3抗体

由考马斯亮蓝结果可以看出制备的抗人Tim-3抗体还原打开二硫键后轻重链位置分别有单一条带，非还原条带位置在目的分子量位置，且纯度较好。表明成功获得了抗人Tim-3抗体（GGC）（图1），抗体的序列如表1所示。

表 1 Tim-3抗体序列

3.2抗Tim-3抗体结合能力测定

首先利用Biacore测定了抗Tim-3抗体的亲和力，使用人Tim-3蛋白作为抗原，图2A显示了抗体的亲和力动力学曲线及测定结果。结果显示，抗Tim-3抗体的亲和力为10^-8，显示了良好的结合能力。通过包被人Tim-3蛋白，利用直接ELISA方法检测anti-Tim-3抗体结合活性，结果表明制备的anti-Tim-3抗体能够特异性与Tim-3蛋白结合，并具有梯度依赖性（图2B）。以上结果均提示制备的抗人Tim-3抗体与hTim-3蛋白具有良好的结合活性。

3.3体外验证抗Tim-3抗体的功能

通过使用anti-Tim-3抗体与小鼠RAW264.7细胞和BV2细胞共孵育，检测炎性因子的表达。RT-PCR检测结果也能看到，anti-Tim-3抗体与对照抗体相比也能明显上调BV2细胞和RAW264.7细胞表达IL-6和TNF-α上调。提示anti-Tim-3抗体能够阻断Tim-3信号进而发挥生物学活性作用（图3）。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.针对Tim-3的抗体，其特征在于，所述抗体包括如SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列的重链可变区互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体还包括与SEQ ID NO:4、5、6、7所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4；

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少70%序列同一性；

4.如下任一项物质：

（1）核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3任一项所述的抗体；

（2）载体，其特征在于，所述载体包括（1）中所述的核酸分子；

（3）宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括（1）中所述的核酸分子或（2）中所述的载体；

（4）检测Tim-3的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-3任一项所述的抗体；

（5）药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3任一项所述的抗体。

5.一种非诊断目的的检测样本中Tim-3的方法，其特征在于，所述方法包括使权利要求1-3任一项所述的抗体与待检测样本接触，从而检测样本中Tim-3的水平。

6.一种制备权利要求1-3任一项所述的抗体的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求4中所述的宿主细胞，回收抗体。

7.权利要求1-3任一项所述的抗体在制备检测Tim-3的产品中的应用。