CN118165107A - 结合tigit的抗体分子 - Google Patents

Abstract

本公开涉及抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段、包含所述抗体或其抗原结合片段的衍生物、相关的药物组合物，以及，上述物质在制备治疗肿瘤药物中的应用。

Description

结合TIGIT的抗体分子

技术领域

本公开涉及与TIGIT特异性结合的抗体分子或其抗原结合片段、包含所述抗体分子或其抗原结合片段的药物组合物及其应用。

背景技术

TIGIT(T cell Ig and ITIM domain，又称为WUCAM，Vstm3，VSIG9)是脊髓灰质炎病毒受体(PVR)/Nectin家族的成员。TIGIT由细胞外免疫球蛋白可变区(IgV)结构域，I型跨膜结构域和具有经典免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫球蛋白酪氨酸尾(ITT)基序的细胞内结构域组成。TIGIT在淋巴细胞特别是在效应和调节性CD4+T细胞、滤泡辅助CD4+T细胞和效应CD8+T细胞以及自然杀伤(NK)细胞中高表达。

TIGIT已成为一种重要的免疫检查点，能够抑制癌症免疫循环的每一步。TIGIT可能阻止NK细胞释放肿瘤抗原，损害树突状细胞对T细胞的启动，或抑制CD8+T细胞对癌细胞的杀伤。大量临床前研究表明，TIGIT将成为癌症患者的合适靶点。TIGIT阻断不仅降低了肿瘤浸润调节性T细胞的抑制能力，而且能激活抗肿瘤T细胞的反应，并增强抗肿瘤NK细胞的反应。当与其他免疫疗法结合时，靶向TIGIT可能是最有效的。在临床前研究中，靶向TIGIT和PD-1/PD-LI通路相比于任何一种单一疗法都显示出更好的肿瘤抑制效果。TIGIT阻断与PD-1/PD-L1阻断协同作用，能够增强CD8+T细胞的抗肿瘤作用。

目前许多抗TIGIT单克隆抗体的临床试验正在进行，这会有助于确定TIGIT阻断的效果。当然，设计癌症患者中TIGIT阻断的优化组合策略，也将有助于开发针对TIGIT治疗其他慢性疾病的疗法。

发明概述

本公开提供了一种抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人TIGIT和食蟹猴TIGIT，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：

(1)SEQ ID NO：9，10，11，12，13，14；或

(2)SEQ ID NO：15，16，17，18，19，20；或

(3)SEQ ID NO：21，22，23，24，25，26；或

(4)SEQ ID NO：27，28，29，30，31，32。

根据本公开的一个方面，所述一种抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别与如下任一一组的重链可变区和轻链可变区具有至少80％至100％的序列同一性：

(1)SEQ ID NO:1和2；或

(2)SEQ ID NO:3和4；或

(3)SEQ ID NO:5和6；或

(4)SEQ ID NO:7和8；或

(5)SEQ ID NO:33和34。

在一些优选的实施方案中，本公开所述的抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在一些优选的实施方案中，所述抗TIGIT的抗体为单克隆抗体。

在一些优选的实施方案中，所述抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段，还进一步包括重链恒定区和/或轻链恒定区，优选的，所述重链恒定区包括天然Fc或经过修饰的变体Fc，Fc来源于鼠或人。

在一些优选的实施方案中，所述抗TIGIT的抗体为全长抗体。

在一些优选的实施方案中，本公开的抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段，为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式。

在一些优选的实施方案中，本公开所述的抗原结合片段为Fab、Fv、scFv、F(ab’)₂、线性抗体、单结构域抗体。

在一些实施方案中，本公开提供一种偶联物，将前述抗体或其抗原结合片段与捕获标记物或检测标记物偶联形成。所述的检测标记物包括但不限于放射性核素、发光物质(例如荧光素)、有色物质或酶。

在一些实施方案中，本公开提供一种融合蛋白，其中的一个被融合的部分包含本公开的抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，本公开提供一种双特异性抗体或多特异性抗体，所述双特异性抗体或多特异性抗体中的一个抗原结合结构域包含本公开的抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，本公开提供了编码前述任一抗体或其抗原结合片段的核酸。以及，本公开还提供了包含所述核酸的重组载体。

在一些实施方案中，本公开提供了一种宿主细胞，其包含本公开所述的表达载体或含有编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。在一些优选的方案中，宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌；也可以是真核细胞，例如酵母或哺乳动物细胞，哺乳动物细胞例如CHO细胞或HEK293细胞。

在一些实施方案中，本公开提供了制备所述抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合的条件下培养本公开的宿主细胞，并从所述细胞中纯化获得表达产物。

在一些实施方案中，本公开提供了所述抗体或其抗原结合片段的用途，其应用于治疗肿瘤。

在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，其包含有效量的本公开的抗体或其抗原结合片段、或包含有效量的编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸、或包含有效量的含有编码核酸的重组载体、或包含有效量的含有编码核酸的宿主细胞、或包含有效量的本公开的融合蛋白、或包含有效量的本公开的双特异性抗体或多特异性抗体。在一些更优选的实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

在一些具体的实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种额外的其他治疗剂。所述额外的治疗剂为可与本公开的药物组合物联合给予受试者使用的药物制剂。

在一些实施方案中，本公开提供所述药物组合物在制备治疗疾病的药物中的用途，其中，所述疾病可以为肿瘤，进一步地，所述肿瘤可以为癌症。

附图说明

附图更进一步说明了本说明书所公开的新特性。参照这些附图将能更好地理解本说明书中所公开的特性和优点，但应当理解，这些附图仅用于说明本文所公开原理的具体的实施方案，而非意欲对所附权利要求的范围加以限制。

图1显示了人源化抗体TAb07与人TIGIT、食蟹猴TIGIT的结合情况。其中，图1A显示了TAb07与人TIGIT的结合活性情况，图1B显示了TAb07与食蟹猴TIGIT的结合活性情况。

图2显示了人源化抗体TAb07与过表达人TIGIT细胞和过表达食蟹猴TIGIT细胞的结合情况。其中，图2A显示了TAb07与过表达人TIGIT细胞的结合活性情况，图2B显示了TAb07与过表达食蟹猴TIGIT细胞的结合活性情况。

具体实施方式

术语

本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入一般。

在下文详细描述本公开前，应理解本公开不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本公开的范围。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。

本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本公开的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本公开的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。例如，从1至6的范围的描述应当被认为具体公开了从1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及在这些范围内的具体的数值点，例如1、2、3、4、5、6。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。

当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语“约”是指包括指定值的±20％、或在某些情况下±10％、或在某些情况下±5％、或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变化。

本文所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。

本文所用的术语“TIGIT”是指保留至少部分TIGIT活性的任何形式的TIGIT及其变体。

本文所用的术语“抗TIGIT的抗体”或“结合TIGIT的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合人TIGIT、食蟹猴TIGIT，即，该抗体既能够识别并结合人TIGIT，也能够识别并结合食蟹猴TIGIT。

人来源的TIGIT表示为：hTIGIT，因此，“抗人TIGIT的抗体”、“针对hTIGIT的抗体”等表述是特指能够以足够的亲和力结合hTIGIT以致所述抗体可以用作靶向hTIGIT的诊断剂和/或治疗剂。

食蟹猴来源的TIGIT表示为cyno TIGIT。

本文所用的术语“抗体”，典型是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重(H)多肽链和两条轻(L)多肽链的Y型四聚蛋白。天然IgG抗体即具有这样的结构。每条轻链由一个轻链可变结构域(VL)和一个轻链恒定结构域(CL)组成。每条重链包含一个重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH)，或称为重链恒定区(CH)。

本领域已知五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，对应的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ，IgG和IgA可以进一步分为不同的亚类，例如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被识别为两种明显相异的类型之一，称为κ和λ。

在IgG、IgA和IgD抗体的情形中，该重链恒定区包含称为CH1、CH2和CH3的三个结构域(IgM和IgE具有第四结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区分离，该铰链区是可变长度的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。每类抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。

术语“可变区”或“可变结构域”显示出从一种抗体到另一种抗体的氨基酸组成的显著变化，并且主要负责抗原识别和结合。每个轻链/重链对的可变区形成抗原结合位点，使得完整的IgG抗体具有两个结合位点(即它是二价的)。重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)结构域各包含具有极端变异性的三个区域，被称为高变区(HVR)，或更通常地，被称为互补决定区(CDR)，VH和VL各有4个骨架区FR，分别用FR1，FR2，FR3，FR4表示。因此，CDR和FR序列通常出现在重链可变结构域(VH)(或轻链可变结构域(VL))的以下序列中：FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。

术语“Fc”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

如在此使用的，广义上的“抗体”的类型可包括如多克隆抗体(polyclonalantibodies)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体及灵长类化抗体、CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)、人类抗体(包括重组产生的人类抗体)、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括突变蛋白及其变体)等等。

术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文中可以被交换地替代使用，指结构与天然抗体结构基本相似或具有包含Fc区的抗体。

术语“单克隆抗体”(或称“单抗”)指由单一细胞克隆产生的基本均质、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物、合成技术或上述技术的组合等。

术语“嵌合抗体”是一种构建体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而这个或这些链的剩余部分与来自另一物种的或属于另一个抗体类别或亚类的抗体、以及这类抗体的片段中的相应序列相同或同源。狭义的，嵌合抗体包含与人类轻链和重链恒定区可操作地连接的全部或大多数的所选鼠类重链和轻链可变区。恒定区序列或其变体或衍生物可以使用标准分子生物学技术可操作地与所披露的重链和轻链可变区缔合，以提供本身可以使用或可以掺入本公开的抗TIGIT的全长抗体。

术语“人源化抗体”是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的杂合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR的残基被来自具有所需的特异性、亲和力和性能的非人物种(供体抗体)的CDR的残基替代，例如小鼠、大鼠、兔子或灵长类动物。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区残基被相应的非人残基代替。在某些情况下，“回复突变”可以引入到人源化抗体中，其中受体人类抗体的可变区的一个或多个FR中的残基被来自非人类物种供体抗体的相应残基替换。这样的回复突变可以有助于保持一种或多种嫁接CDR的适当三维构型并因此改进亲和性和抗体稳定性。可以使用来自各种供体物种的抗体，这些供体物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物。另外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中未发现的新残基，以为进一步改善抗体性能。

需说明的是，本公开的单克隆抗体可变区的CDR和FR的划分是根据Kabat定义确定的。而其他命名和编号系统，例如Chothia、IMGT或AHo等，也是本领域技术人员已知的。因此，以本公开的单抗序列为基础，包含任何命名系统衍生的一种或多种CDR的人源化抗体均明确地保持在本公开的范围内。

术语“序列同一性”或“序列相似性”或“序列同源性”，是指在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。

术语“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如在此所使用，抗体分子的“片段”包括抗体的“抗原结合片段”，并且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体中与所选抗原或其抗原表位特异性结合或反应的多肽片段，或由此片段进一步衍生的融合蛋白产物，例如单链抗体，嵌合抗原受体中的胞外结合区等。示例性的抗体片段或其抗原结合片段包括但不限于：可变轻链片段(VL)、可变重链片段(VH)、Fab片段、F(ab’)₂片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、线性抗体、单链抗体(scFv)及由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体等。

术语“Fab片段”包括重链可变区和轻链可变区，并且还包括轻链的恒定区和重链的第一恒定区CH1，其为单价的抗体片段。术语“F(ab’)₂片段”包含2个Fab片段以及铰链区，其为二价的抗体片段。

术语“Fd片段”一般包含重链可变区和恒定区CH1；术语“Fv片段”含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。

术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。

术语“融合蛋白”是指通过基因重组或化学方法将不同的多肽/蛋白连接起来形成更大的分子，可以使用接头(linker)进行连接，也可以不使用。

术语“多特异性抗体”是指，将抗体通过功能连接(例如化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方法)至一个或多个其他结合分子上，从而形成与两个以上不同位点和/或靶点结合的新的抗体构建体。其中，使用较多的是“双特异性抗体”，其特指针对两种不同抗原具有特异性的抗体构建体。通常，双特异性抗体或多特异性抗体至少包括2个抗原结合结构域。

术语“抗原”是指被抗体或其抗原结合片段识别并特异性结合的物质，广义上，抗原可以包括所选靶标的任何免疫原性片段或决定簇，包括单表位、多表位、单结构域、多结构域、或完整的胞外结构域(ECD)或蛋白质。

术语“表位”，又称为“抗原决定簇”，是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常由3-15个氨基酸残基组成。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。“衍生自”指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。该术语还包括由指定的核酸序列表达的多肽。

术语“氨基酸修饰”(或“修饰的氨基酸”)包括在多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。“氨基酸取代”或“取代”意指用另一种氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代S32A指第32位的丝氨酸被丙氨酸替换。

人源化抗体可变区与人类受体可变区的序列同一性或同源性可以如在此所论述的进行测定，并且当这样测量时，将优选地共享至少60％或65％的序列同一性，更优选至少70％、75％、80％、85％或90％的序列同一性，甚至更优选至少93％、95％、98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸置换而不同。“保守取代”是一个氨基酸残基被具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基替换的氨基酸取代。一般而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括含碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，可以用其他相似侧链的氨基酸残基替换本公开抗体的CDR区中或框架区中的一个或多个氨基酸残基。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情形中，序列同一性百分比或相似性程度可以向上调整以校正该取代的保守性质。

在单克隆抗体生产过程中，不同的理化因素易产生各种翻译后修饰(post-translational modification，PTM)变异体，如糖基化、氧化、糖化、脱酰胺、异构化及端基环化等，这些PTM可能引起抗体理化性质变化，改变与抗体Fc受体的相互反应，影响与目标抗原的结合活性；一些PTM的发生甚至可能降低抗体稳定性、引起免疫原性等(JARASCH等，JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES，2015)。可以通过对PTM位点的氨基酸修饰，例如保守取代，来消除其所带来的负面影响。基于改造PTM的目的对抗体CDR进行氨基酸取代，也均明确地保持在本公开的范围内。

本公开的抗体还可以包括恒定区(例如Fc)的取代或修饰，包括但不限于氨基酸残基取代、突变和/或修饰，它们产生具有以下优选的特征的化合物，这些优选的特征包括但不限于：改变的药物代谢动力学、增加的血清半衰期、增加的结合亲和力、降低的免疫原性、增加的产量、改变的与Fc受体(FcR)的结合、增强或减弱的ADCC或CDC、改变的糖基化和/或二硫键以及修饰的结合特异性。

术语“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。术语“KD”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离常数。可以使用本领域已知的各种技术来确定结合亲和力，例如表面等离子体共振、生物层干涉法、双极化干涉法、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、ELISA、分析超速离心和流式细胞术等。

术语“药物组合物”是指包含一种、两种或多种活性成分的制剂或制剂的组合形式，其允许包含在其中的活性成分以生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。当“药物组合物”以含有不同的、两种以上活性成分的单独制剂的组合形式存在时，可以同时、依次、分别或间隔给药，其目的是发挥多种活性成分的生物活性，共同用于治疗疾病。

术语“药用载体”或“药学上可接受的载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂或媒介物。

术语“有效量”指本公开的抗体或其抗原结合片段的药物制剂的剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如人种差异；体重、年龄和健康状况；涉及的具体疾病；疾病的严重程度；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

本文所用的术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。

术语“稳定转染”或“稳转”是指将外源核酸、DNA或RNA引入和整合到转染细胞的基因组中。术语“稳定转染体”(stable transfectant)是指将外来DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。

术语“分离的多核苷酸”或“分离的核酸”指已从其天然环境取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本公开的目的，将包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸视为分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括包含在通常含有该多核苷酸分子的细胞中的多核苷酸分子，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置上。分离的RNA分子包括本公开的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式及双链形式。

术语“核酸分子编码”、“编码DNA序列”和“编码DNA”是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，核酸序列编码氨基酸序列。

生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。发明所述的抗体或其抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，(2001)ISBN：012441351上获得。

本公开工程化的抗体或其抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。

本文所用的术语“个体”或“受试者”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的个体包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。

本文所用的术语“疾病”或“病症”或“紊乱”等是指任何损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的改变或失调。例如，所述的“疾病”包括但不限于：肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病、T细胞功能障碍性疾病、或免疫耐受能力缺陷(如移植排斥)等。

本文所用的术语“肿瘤”指的是一种以细胞或组织的病理性增生为特征的疾病，及其随后的迁移或侵袭其他组织或器官。肿瘤生长通常是不受控制的和进行性的，不诱导或抑制正常细胞增殖。肿瘤包括“癌症”，泛指所有恶性肿瘤。

本文所用的术语“治疗”是指在试图改变个人或处理细胞引起的疾病过程中的临床干预，既可以进行预防也可以在临床病理过程干预。治疗效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少任何疾病直接或间接的病理后果、防止转移、减慢疾病的进展速度、改善或缓解病情、缓解或改善预后等。

本文所用的术语“联合”涉及提供至少两种或两种以上不同的疗法以实现指定治疗效果的治疗方案，所述疗法既可以是物理性的，例如放疗，也可以是化学性的，例如给予受试者药物，所述药物也包括联合用药物。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1动物免疫

选取6-8周龄的BALB/c小鼠(维通利华，动物使用许可证号：SYXK(鲁)2021-0014)用于动物免疫。分别给予每只小鼠注射25μg的重组人TIGIT蛋白，首次注射的TIGIT蛋白剂量为50μg/小鼠，每隔一周注射一次。通过ELISA对免疫血清进行效价检测，确定动物的免疫应答情况，4轮免疫后，选择血清效价较高的小鼠进行安乐死，收集脾脏用于制备杂交瘤细胞。

实施例2抗TIGIT鼠源单克隆抗体的制备

采集免疫小鼠的淋巴结和脾脏细胞，分别与Sp2/0骨髓瘤细胞以1：1的比例混合后使用PEG溶液进行融合，将融合后的细胞重悬于HAT培养基中(DMEM+20％FBS+1×HAT)，混匀制成细胞悬液，然后将其转移至96孔板中。融合的细胞在37℃、5％CO₂培养箱中培养12天。用ELISA法进行杂交瘤细胞的初步筛选，筛选出与人TIGIT抗原结合的阳性克隆，随后将其转移至24孔板培养。3天后，再次对杂交瘤上清进行FACS检测，挑选出与过表达人TIGIT细胞和过表达食蟹猴TIGIT细胞均结合的阳性克隆，筛选的阳性克隆进行亚克隆，进而获得稳定单一的杂交瘤细胞；通过ELISA检测、FACS测定等实验对获得的单克隆进行再次筛选，共挑选出4个对过表达人TIGIT细胞和过表达食蟹猴TIGIT细胞均结合的杂交瘤细胞株。

采取常规的生物学方法从细胞中提取总RNA，以总RNA为模板，使用HiScript III1st Strand cDNASynthesis Kit(Vazyme)，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用抗体的恒定区引物进行扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化回收DNA片段，经核酸测序并翻译后获得本公开的4个鼠源单克隆抗体可变区的氨基酸序列，结果如表1所示。

表1 4个鼠源单克隆抗体可变区的氨基酸序列

克隆ID	重链可变区(VH)	轻链可变区(VL)
			18D7E11	SEQ ID NO：1	SEQ ID NO：2
19C6E8	SEQ ID NO：3	SEQ ID NO：4
			19D4F4	SEQ ID NO：5	SEQ ID NO：6
22G9E9	SEQ ID NO：7	SEQ ID NO：8

在表1所公开的可变区氨基酸序列的基础上，利用Kabat编号规则划分抗体可变区的CDR和FR，每个抗体的6个CDR序列组成如下表2所示，表2中括号内数字表示序列号，例如(9)即代表SEQ ID NO：9。

表2 4个鼠源单克隆抗体可变区CDR的氨基酸序列

实施例3鼠源抗TIGIT抗体的人源化

将挑选出的鼠源单克隆抗体18D7E11进行人源化改造：使用人恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)的恒定结构域制备嵌合抗体，再根据亲本和人抗体的同源性选择人种抗体序列，进行人源化。

(1)人源化抗体的设计

根据文献(Antibody humanization by framework shuffling，doi：10.1016/j.ymeth.2005.01.005)报道的常用人IgG胚系序列(germline)，重链和轻链分别选择两条FW1，两条FW2和两条FW3作为骨架区。将鼠源抗体18D7E11序列的重链CDR区，即HCDR1(SEQID NO：9)、HCDR2(SEQ ID NO：10)和HCDR3(SEQ ID NO：11)移植入上述选择的重链的骨架区；将18D7E11的轻链CDR区，即LCDR1(SEQ ID NO：12)、LCDR2(SEQ ID NO：13)和LCDR3(SEQID NO：14)移植入上述选择的轻链的骨架区。

(2)人源化抗体的表达

将各种人源化变体的重链和轻链基因分别合成、克隆进表达质粒后，将测序正确的重链表达质粒和轻链表达质粒共转染进CHO-S细胞进行表达。表达后的各种人源化变体经筛选后，获得其中的一个活性较优的分子，将其命名为TAb07，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示。

实施例4人源化抗体TAb07的结合活性

选择ELISA方法，用于测定实施例3中得到的人源化抗体TAb07与人TIGIT、食蟹猴TIGIT的结合活性。

实验流程大致如下：包被100μL/孔的抗原(hTIGIT-his：1μg/mL；cyno TIGIT：2μg/mL)，4℃过夜。用200μL的封闭液(1％BSA在PBS中)室温封闭1小时。每孔加入100μL稀释抗体，抗体起始浓度为3μg/mL或20nM，按照1：3倍比稀释。室温孵育2小时。PBST洗涤3次。每孔加入100μL已稀释的HRP抗人二抗，室温孵育1小时。PBST洗涤3次。每孔加入50μLTMB底物，室温孵育5分钟，随后每孔加入50μL终止液，终止反应。酶标仪(Tecan Spark)读取450nm波长处的OD值。结果分别见图1A和图1B。

使用GraphPad prism 8.0软件计算半数结合浓度(EC50)，TAb07与人TIGIT、食蟹猴TIGIT的EC50分别为0.0237nM、1.28nM。此结果表明，人源化抗体TAb07与hTIGIT和cynoTIGIT均具有较强的结合活性。

实施例5人源化抗体TAb07的亲知力检测

为确定TAb07是否与过表达人TIGIT的CHO-K1细胞或过表达食蟹猴TIGIT的CHO-K1细胞结合，分别使用过表达人TIGIT的CHO-K1细胞或过表达食蟹猴TIGIT的CHO-K1细胞进行FACS细胞结合检测。简单而言，将生长状态良好的细胞按2×10⁵个细胞/孔的密度接种于96孔板中，离心去上清后，用200μL的封闭液(5％BSA在PBS中)4℃封闭30分钟。每孔加入100μL稀释抗体，抗体浓度为3μg/mL或20nM，2μg/mL或13.33nM，1μg/mL或6.67nM。4℃孵育1个小时后，96孔板用清洗液(1％BSA在PBS中)清洗3次。之后，加入已稀释的PE anti-human IgGFc。4℃孵育40分钟后，96孔板用清洗液清洗3次，然后使用FACS检测仪(BD)检测细胞荧光，结果分别见图2A和图2B。此结果表明，人源化抗体TAb07与过表达人TIGIT的CHO-K1细胞和过表达食蟹猴TIGIT的CHO-K1细胞均具有较强的结合活性。

上文所述的本公开的实施方案仅为示例性的，任何本领域技术人员都可以认识到或者可以确定无数的特定化合物、材料和操作的等价物，而不需要进行超出常规的试验。所有这些等价物都是在本公开范围之内的，并且被权利要求所包含。

Claims (16)

1.一种抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人TIGIT，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：

(1)SEQ ID NO:9，10，11，12，13，14；或

(2)SEQ ID NO:15，16，17，18，19，20；或

(3)SEQ ID NO:21，22，23，24，25，26；或

(4)SEQ ID NO:27，28，29，30，31，32。

2.一种抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别与如下任一一组的重链可变区和轻链可变区具有至少80％至100％的序列同一性：

(1)SEQ ID NO:1和2；或

(2)SEQ ID NO:3和4；或

(3)SEQ ID NO:5和6；或

(4)SEQ ID NO:7和8；或

(5)SEQ ID NO:33和34。

3.如权利要求1或2所述的抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段，其还具有以下特征的一种或多种：

(1)其还包括重链恒定区和/或轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区包含Fc；更优选地，Fc来源于鼠或人；更优选地，Fc的序列是天然的或经过修饰的变体；

(2)其为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体；

(3)其为单克隆抗体；或为全长抗体，或其抗原结合片段为Fab、Fv、scFv、F(ab’)₂、线性抗体、单结构域抗体；

(4)其为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式。

4.一种偶联物，将前述任一抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段与捕获标记物或检测标记物偶联形成，所述的检测标记物包括放射性核素、发光物质、有色物质或酶。

5.一种融合蛋白，其中的一个被融合的部分包含前述任一抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段。

6.一种双特异性抗体或多特异性抗体，其中的一个抗原结合结构域包含前述任一抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段。

7.编码前述任一抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段的核酸。

8.包含权利要求7所述核酸的重组载体。

9.一种宿主细胞，其包含权利要求8的重组载体或权利要求7的核酸。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其为原核细胞，例如大肠杆菌；或其为真核细胞，例如酵母或哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞例如CHO细胞或HEK293细胞。

11.制备前述任一抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合的条件下培养权利要求9或10的宿主细胞，并从所述细胞中纯化获得表达产物。

12.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-3的任一抗TIGIT的抗体或其抗原结合片段、或包含有效量的权利要求5的融合蛋白、或包含有效量的权利要求6的双特异性抗体或多特异性抗体、或包含有效量的权利要求7的核酸、或包含有效量的权利要求8的重组载体、或包含有效量的权利要求9或10的宿主细胞。

13.如权利要求12所述的药物组合物，还包含药学上可接受的载体。

14.如权利要求13所述的药物组合物，还包含额外的其他治疗剂。

15.权利要求12-14任一所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

16.如权利要求15所述的用途，所述肿瘤为癌症。