CN118126977A - 一种糖基转移酶突变体及其催化合成甜茶苷衍生物Rub2G的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种糖基转移酶突变体及其催化合成甜茶苷衍生物Rub2G的方法，所述突变体是在原糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1基础上进行的单突变或者组合突变，最终筛选出催化效果较好的LbUGT突变菌株_{_}SuSy体系，实现高效催化合成甜茶苷衍生物Rub2G。通过定点突变提高了糖基转移酶LbUGT的酶活、延长了半衰期，利用该突变体实现了高效催化合成Rub2G，合成方法条件温和，操作简单，时间短，催化效率之高，产率高，具有较好的应用前景。

Description

一种糖基转移酶突变体及其催化合成甜茶苷衍生物Rub2G的 方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种糖基转移酶突变体及其催化合成甜茶苷衍生物Rub2G的方法。

背景技术

甜茶是蔷薇科悬钩子属植物的一个新品种，八十年代初才开始在我国作为药物发现。甜茶叶在民间应用已久，常被用来代替蔗糖加工食品，作为民间入药用于补肾降压，被誉为神茶，与罗汉果等齐名。甜茶中富含的甜茶苷是一种二萜糖体，甜度为蔗糖的300倍，而热值仅是蔗糖的1％，属高甜度、低热能的天然甜味物质。甜茶苷能激活人的胰岛素，降低血糖，有很好的保健作用，对糖尿病患者和肾病病人有一定的疗效。甜茶叶提取的甜茶苷是甜味植物中口感最佳的甜味剂，因其绿色天然，保健低热而在食品，饮料，冷食制品，调味品，医药工业，美容化妆品等各类行业中展现出良好的经济价值。

但甜茶苷携带的浓厚后苦味影响了其在市场的应用与推广。Rub2G是在甜茶苷的C19位连接的第一个葡萄糖基的C-2’位和C-6’位都添加一个葡萄糖基(见图1)，相比甜茶苷，甜度增加31％，苦味消除。因此，Rub2G比甜茶苷具有更好的糖特性和更理想的味道。

目前，Rub2G在植物中含量低(<0.1％)，无法通过物理浸提法获取，阻碍了其的商业应用和推广。来源于枸杞的LbUGT可以依次催化甜菊糖苷类化合物C19位连接的第一个葡萄糖基的C-6’和C-2’糖基化反应，因此何以通过LbUGT催化甜茶苷获得高值甜味剂Rub2G。

LbUGT是“Leloir”型糖基转移酶，属于GT1家族，通常以UDPG为糖基供体合成糖苷类化合物，可由大肠杆菌或酿酒酵母等异源表达大量获得，用于催化甜茶苷获得Rub2G。随着UDPG生产方式的不断改进，可通过SuSy等用酶法大量合成。在此基础上使用SuSy-UGT级联反应体系，运用SuSy为LbUGT提供糖基供体，实现UDPG的循环利用，大大缩减了应用成本。对于LbUGT-SuSy级联体系中，SuSy为糖基化反应顺利进行提供所需的糖基供体，当UDPG再生速度不成为限制时(例如可通过提高蔗糖浓度)，合成Rub2G效率高低的关键在于LbUGT。然而枸杞来源的LbUGT热稳定性较差，催化活性也有局限，一般在催化12h后酶基本失活，限制了糖基转移酶的高效应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种糖基转移酶突变体，及利用该糖基转移酶突变体催化合成Rub2G的方法；利用LbUGT突变体实现甜茶苷的糖基化修饰，高效催化制备得到Rub2G，并为工业化生成提供一定借鉴。

为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：

一种适用于Rub2G合成的糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO:1的V31L、V36A、A48P、S104A、Q127P、L143F、S152A、N175Y、G195D、G225L、G256D、G256Y、A297L、A297V、F329W、P333A、N337A、G343A、D358S、I368F、I368L、L370F、M374L、M421A中至少一个位点的氨基酸残基的突变。优选V31L、Q127P、G225L、G256D、G343A、I368L、M374L，进一步优选V31L、Q127P、G343A、I368L、M374L，更优选地,V31L、I368L、M374L。

根据本发明实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含V31L、V36A、A48P、S104A、Q127P、L143F、S152A、N175Y、G195D、G225L、G256D、G256Y、A297L、A297V、F329W、P333A、N337A、G343A、D358S、I368F、I368L、L370F、M374L、M421A中任意两个位点的氨基酸残基的突变，并且至少其中一个突变位点为V31L、Q127P、G225L、G256D、G343A、I368L、M374L中任意一个；优选，所述突变体的氨基酸序列的其中一个突变位点为M374L，另一突变位点为V31L、S104A、G225L、G256D、G343A、I368L、M421A中任意一个。

根据本发明实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含V31L、S104A、G225L、G256D、G343A、I368L、M374L、M421A中任意三个位点的氨基酸残基的突变。优选，突变组合为M374L/V31L/G225L、M374L/V31L/G256D、M374L/V31L/G343A、M374L/V31L/I368L、M374L/S104A/G343A、M374L/G343A/I368L、M374L/G343A/M421A中的突变体。进一步优选地突变为M374L/V31L/I368L，M374L/I368L/G343A，M374L/V31L/G256D。

一种适用于Rub2G合成的糖基转移酶突变体，所述突变体是在氨基酸序列如SEQID NO:1所示的糖基转移酶的基础上进行M374L单点突变或者M374L/V31L、M374L/V36A、M374L/A48P、M374L/S104A、M374L/Q127P、M374L/L143F、M374L/S152A、M374L/N175Y、M374L/G195D、M374L/G225L、M374L/G256D、M374L/G256Y、M374L/A297L、M374L/A297V、M374L/F329W、M374L/P333A、M374L/N337A、M374L/G343A、M374L/D358S、M374L/I368F、M374L/I368L、M374L/L370F、M374L/M421A中任意一种双位点突变或者M374L/V31L/G225L、M374L/V31L/G256D、M374L/V31L/G343A、M374L/V31L/I368L、M374L/S104A/G343A、M374L/G343A/I368L、M374L/G343A/M421A中任意三点突变所得。

一种适用于Rub2G合成的糖基转移酶突变体M374L，所述突变体M374L是在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的糖基转移酶LbUGT序列中第374位氨基酸由蛋氨酸(M)突变成亮氨酸(L)。突变体M371L与原始菌株相比酶活提高了89％和Rub2G产量提高了5.7g/L。

一种适用于Rub2G合成的糖基转移酶突变体M374L/I368L，所述突变体M374L/I368L是在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的糖基转移酶LbUGT序列中第374位氨基酸由蛋氨酸(M)突变成亮氨酸(L)，同时第368位氨基酸由异亮氨酸(I)突变成亮氨酸(L)。突变体M374L/I368L与原始菌株相比酶活提高了487％和Rub2G产量提高了21.3g/L。

一种适用于Rub2G合成的糖基转移酶突变体M374L/I368L/V31L，所述突变体M374L/I368L/V31L是在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的糖基转移酶LbUGT序列中第374位氨基酸由蛋氨酸(M)突变成亮氨酸(L)，同时第368位氨基酸由异亮氨酸(I)突变成亮氨酸(L)，同时第31位氨基酸由缬氨酸(V)突变成亮氨酸(L)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。突变体M374L/I368L/V31L与原始菌株相比酶活提高了774％，Rub2G产量提高了30.8g/L，半衰期延长19.4h。

根据本发明的实施方案，所述突变体与SEQ 1D NO.1所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性，例如80％以上的同源性，再例如90％以上、95％以上、98％以上的同源性。

一种表达基因，该基因编码上述任一种糖基转移酶突变体。

一种重组质粒，该重组质粒连接有上述的表达基因和蔗糖合酶基因SuSy。

一种重组细胞，该重组细胞包含有上述重组表达载体或上述糖基转移酶突变体的表达基因。

上述糖基转移酶突变体在制备Rub2G的应用。

一种利用糖基转移酶突变体催化合成Rub2G的方法，包括如下步骤：

1)构建含双酶共表达的重组菌株：将糖基转移酶LbUGT的突变体的基因与蔗糖合酶基因共同构建至质粒中得到重组质粒；

2)将重组质粒转化到宿主菌中，得到含双酶共表达体系的重组菌株；

3)将重组菌株活化，转接到TB诱导培养基中，添加诱导剂诱导培养，低温离心并收集菌体，菌体重悬于适量缓冲液并破碎，离心收集上清液即为粗酶液；

4)Rub2G的催化合成：在催化反应体系中加入甜茶苷，蔗糖和粗酶液，反应5-100h，高温灭活，离心得上清即为Rub2G。

所述诱导剂的终浓度为0.02-1g/L,诱导时间为4-50h。

甜茶苷的浓度为1-500g/L；蔗糖浓度为1-1500g/L；粗酶添加量为0.1-1000g/L。

其中所述的宿主菌包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或者谷氨酸棒杆菌。

催化合成Rub2G的方法，包括如下步骤：

1)构建含双酶共表达体系的重组菌株：将糖基转移酶LbUGT的核苷酸序列如SEQID NO:3或者相应突变体核苷酸序列与蔗糖合酶核苷酸序列如SEQ ID NO:4所共表达得到重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到含双酶共表达体系的重组菌株；

2)重组菌株的诱导产酶：将重组菌株活化，按1％～3％转接到TB诱导培养基中，37℃，培养约2小时，乳糖添加量为0.02g/L，温度降至25℃，继续诱导培养20h，200rpm，低温离心并收集菌体。菌体重悬于适量缓冲液并破碎，离心收集上清液极为粗酶液；

3)Rub2G的催化合成：在催化反应体系中加入甜茶苷，蔗糖和粗酶液，反应5-100h，高温灭活酶，离心得上清即为Rub2G。

步骤3)中所述催化反应体系中为甜茶苷的浓度为1-500g/L；蔗糖浓度为1-1500g/L；粗酶添加量为0.1-1000g/L。优选的，甜茶苷的浓度为30-80g/L；蔗糖浓度为1-1500g/L；粗酶添加量为5-20g/L。

糖基转移酶LbUGT的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，蔗糖合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

蛋白质的热稳定性与催化活性残基可以通过蛋白结构模拟，并通过多种策略预测，利用突变技术将蛋白质的相关残基如柔性残基钢化，提高蛋白质热稳定性等。本发明以糖基转移酶LbUGT为基础，对其预测的活性残基及柔性残基进行单点及组合突变，通过对其突变体菌株相对活性以及半衰期的比较，检测糖基转移酶突变体催化水平检测。将该糖基转移酶突变体与蔗糖合酶级联，以甜茶苷为底物，添加适量蔗糖，催化合成Rub2G。该突变体制备简单，实现了高效催化合成Rub2G，相同条件下，突变体的活性是原始酶的108-874％倍，半衰期延长了9-19.4h，Rub2G的产量提高了7.3-30.8g/L。基于突变菌株M374L/I368L/V31L的反应体系的催化效果优于未突变体系，Rub2G浓度在反应36h为41.0g/L，转化率达到95％以上。

本发明通过突变提高了糖基转移酶LbUGT的热稳定性以及催化活性，进而提高催化产Rub2G的效率。

有益效果：

本发明通过定点突变提高了糖基转移酶LbUGT的酶活、延长了半衰期，利用该突变体实现了高效催化合成Rub2G，合成方法条件温和，操作简单，时间短，催化效率之高，产率高，具有较好的应用前景。

附图说明

图1.LbUGT催化甜茶苷生成Rub2G的路径图；

图2.LbUGT与UDPG和甜茶苷对接的复合物模型。

具体实施方式

实施例1双酶表达体系的构建

选择双基因表达载体pRSFDuet-1，在载体的NdeI/XhoI位点插入糖基转移酶LbUGT(核苷酸序列如SEQ 1D NO.3所示)或者其糖基转移酶LbUGT突变体的核苷酸序列，在位点NcoI/EcoRI插入拟南芥来源的蔗糖合酶SuSy核苷酸序列(序列如SEQ 1D NO.4所示)构成对应的重组表达质粒，并构建至pRSFDuet-1载体上。将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，构成双酶共表达重组菌。LbUGT催化甜茶苷生成Rub2G的路径图的示意图见图1。

实施例2糖基转移酶突变位点的选取

通过alphafold2对LbUGT糖基转移酶3D结构模拟，使用rosetta对LbUGT、UDPG和Rub进行对接(如图2所示)，并通过多个结构分析软件(如hotspot等)及AMBER对多个位点的溶剂可及表面面积平均B-因子及热稳定性评分进行评分(表1)。选取参数优于野生菌株(Wt)的突变点进行单点突变。参数优于Wt的突变体有V31L、V36A、A48P、S104A、Q127P、L143F、S152A、N175Y、G195D、G225L、G256D、G256Y、A297L、A297V、F329W、P333A、N337A、G343A、D358S、I368F、I368L、L370F、M374L、M421A。

定点突变体编码基因的PCR扩增：利用PCR扩增技术，以未突变菌株pRSFDuet-LbUGT-AtSUS1为模版DNA进行快速突变：

对V31L定点突变的引物为：

正向引物：5’-TTTGAACCTGGCCAAGAAGCTGGTCGACCGCG-3’

反向引物：5’-TCTTGGCCAGGTTCAAAAACGGGCTAATATGACC-3’

对V36A定点突变的引物为：

正向引物：5’-AAGAAGCTGGCCGACCGCGGTTTTCTGATCTATC-3’

反向引物：5’-CGGTCGGCCAGCTTCTTGGCCACGTTCAAAAA-3’

对A48P定点突变的引物为：

正向引物：5’-CTCAACCCCGATTAATCTGAAGAGCACCATTAAAAAGA-3’

反向引物：5’-GATTAATCGGGGTTGAGCACAGATAGATCAGAAAAC-3’

对S104A定点突变的引物为：

正向引物：5’-GAAAATGGCCAAGCCGAATTTCAGCAAGATCC-3’

反向引物：5’-TCGGCTTGGCCATTTTCAGAGCCTTTTGCAGA-3’

对Q127P定点突变的引物为：

正向引物：5’-TGATCTGCTGCAGCCGTGGGCAGAAGGTGTCGCTAA-3’

反向引物：5’-ACGGCTGCAGCAGATCATAGATGACGAGATCC-3’

对L143F定点突变的引物为：

正向引物：5’-TTAAATTCCTAACGAGCGGCGCGGCAGTGCTCT-3’

反向引物：5’-TCGTTAGGAATTTAACCGCCGGGATGTTTTGTTC-3’

对S152A定点突变的引物为：

正向引物：5’-CAGTGCTCGCTTATTTCTTCAATCTGGTTAAAAAACCG-3’

反向引物：5’-GAAATAAGCGAGCACTGCCGCGCCGCTCGTTA-3’

对N175Y定点突变的引物为：

正向引物：5’-GCGCAAATACGAACTAGAGAAGATGTCTGAGTTGCTG-3’

反向引物：5’-CTAGTTCGTATTTGCGCAGGTAAATCGCCGGA-3’

对G195D定点突变的引物为：

正向引物：5’-ACCAGATGATGTTGACCCGTTCGCCGATGGTA-3’

反向引物：5’-GGTCAACATCATCTGGTTCTTTGTCTTTTGCAGA-3’

对G225L定点突变的引物为：

正向引物：5’-CTTCAGCCTTCTGTCTAACTGGAAAGTTGTTCCG-3’

反向引物：5’-TAGACAGAAGGCTGAAGTAATCAATGTACTTCGCC-3’

对G256D定点突变的引物为：

正向引物：5’-CTGGTTGGATAAGAAGGACGAGAACAGCACGG-3’

反向引物：5’-CCTTCTTGACCAACCAGTCGATCAATTCCATCT-3’

对G256Y定点突变的引物为：

正向引物：5’-GACTGGTTGTATAAGAAGGACGAGAACAGCACGGTT-3’

反向引物：5’-GTCCTTCTTATACAACCAGTCGATCAATTCCATCTC-3’

对A297L定点突变的引物为：

正向引物：5’-TGGGTTCTTCGTTTTCCGAAAGGCGAGGAGCAAAA-3’

反向引物：5’-GGAAAACGAAGAACCCAGATGAAATTAACGTTGG-3’

对A297V定点突变的引物为：

正向引物：5’-ATCTGGGTTGTTCGTTTTCCGAAAGGCGAGGAG-3’

反向引物：5’-AAAACGAACAACCCAGATGAAATTAACGTT-3’

对F329W定点突变的引物为：

正向引物：5’-GATAAATGGGCACCGCAGCCGCGTATCCTG-3’

反向引物：5’-CTGCGGTGCCCATTTATCCAGAACACGGCC-3’

对P333A定点突变的引物为：

正向引物：5’-CAGGCTCGTATCCTGAATCACCCGAGCACGGG-3’

反向引物：5’-TTCAGGATACGAGCCTGCGGTGCGAATTTATCCA-3’

对N337A定点突变的引物为：

正向引物：5’-GCGTATCCTGGCTCACCCGAGCACGGGTGGTTT-3’

反向引物：5’-TGAGCCAGGATACGCGGCTGCGGTGCGAATTTAT-3’

对G343A定点突变的引物为：

正向引物：5’-CACGGGTGCTTTCATCAGCCATTGTGGTTGGA-3’

反向引物：5’-TGATGAAAGCACCCGTGCTCGGGTGATTCAGG-3’

对D358S定点突变的引物为：

正向引物：5’-AAAGCGTGTCTTTCGGCGTACCGATCATCGCC-3’

反向引物：5’-GCCGAAAGACACGCTTTCCATCACGCTGTTCC-3’

对I368F定点突变的引物为：

正向引物：5’-ATGCCGTTTCACCTGGACCAGCCTATGAACGC-3’

反向引物：5’-TCCAGGTGAAACGGCATGGCGATGATCGGTAC-3’

对I368L定点突变的引物为：

正向引物：5’-GCCATGCCGCTGCACCTGGACCAGCCTATGAAC-3’

反向引物：5’-GCCATGCCGCTGCACCTGGACCAGCCTATGAAC-3’

对L370F定点突变的引物为：

正向引物：5’-CCGATTCACTTTGACCAGCCTATGAACGCC-3’

反向引物：5’-AGGCTGGTCAAAGTGAATCGGCATGGC-3’

对M374L定点突变的引物为：

正向引物：5’-GACCAGCCTCTGAACGCCCGTCTGATCGTA-3’

反向引物：5’-ACGGGCGTTCAGAGGCTGGTCCAGGTGAAT-3’

表1

对M421A定点突变的引物为：

正向引物：5’-AGCGAAAGCTCGTGATATTTCCAAGAACCTGAAA-3’

反向引物：5’-TATCACGAGCTTTCGCTTTCAAGTTTTCACCG-3’

PCR目标质粒扩增反应体系为：10μM正向引物和反向引物各2μL；dNTP Mix 1μL；2×Max Buffer 25μL；模板质粒1μL；2U/50μL Super-Fidelity DNA聚合酶1μL，加灭菌水ddH₂O补足至50μL。

PCR目标质粒扩增反应条件：95℃预变性30s；30个循环(95℃变性15s；65℃退火15s；72℃延伸7min)；72℃彻底延伸5min；最后16℃保温。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶核酸电泳检测。

将DpnI 1μL加入至确定已突变的PCR扩增产物中，后将反应体系置于37℃恒温反应1～2h，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45～90s，冰上放置2min，加入600μL LB培养基，37℃摇床200rpm 45min，取全部菌液均匀涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上，37℃过夜培养。挑取平板上2个单菌落，接入LB液体培养基中，9h后保存菌液甘油管并测序，将测序结果正确的菌液甘油管涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上，摇管活化提取质粒，将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中。

表1.突变位点的参数分析

实施例3突变体酶的发酵诱导

将糖基转移酶LbUGT突变体分别涂布在含50μg/L卡那霉素的LB固体平板(NaCl10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L)上，置于37℃培养箱过夜恒温培养。次日，从平板上挑选单菌落至装有5mL LB液体培养基(含50μg/L卡那霉素)的摇管中，在37℃，200rpm摇床中过夜培养作为种子液。种子液按照1％(v:v)接种量转接到100mL的TB培养基中(含50μg/L卡那霉素和0.1μg/L乳糖)。放置在摇床中37℃，200rpm，振荡培养。2h后，将温度调至25℃，继续培养20-22h。

收集发酵液并冷冻离心(4℃，7000rpm，6min)，弃上清得到菌泥，用磷酸钾缓冲液冲洗两遍。再加入适量磷酸钾缓冲液，放置在冰水混合物中，用超声破碎仪超声破碎菌体，参数设置为Ф6，300W，30min。再用冷冻离心机离心，参数设置为4℃，8000rpm，30min，取上清即为粗酶液，放置4℃冰箱保存待用。

实施例4野生酶与单点突变体酶的酶活及产量检测

将模拟计算参数优于原始菌株的单点突变体进行酶活及产量检测，评估单点突变的效果。

糖基转移酶酶活测定方法为：在3mL的酶催化反应体系中加入1mM底物甜茶苷，2mMUDPG，粗酶0.5mg，再用100mM，pH 7.2磷酸钾缓冲液补充。反应条件是30℃，200rpm取样时间为0min、20min、30min。样品处理：取500μL，水浴95℃灭活5min灭活，待HPLC检测。酶活定义(U)：1分钟内转化生成1μmol产物所需的酶量为1个酶活单位。以野生酶酶活为100％，求得其它突变酶的相对酶活。

催化反应体系(20mL)：底物甜茶苷40g/L，蔗糖120g/L，粗酶10mg/mL，缓冲100mMpH 7.2磷酸钾缓冲。催化反应条件为37℃，200rpm。水浴95℃灭活取样，样品稀释至40倍，待HPLC检测分析。

通过酶活及产量检测显示单点突变体的酶活及产量均优于原始菌株，酶活提升6-89％，产量提高0.1-5.7g/L具体数据见表2。

表2.野生型与单点突变体的相对酶活与Rub2G产率(反应24h)

实施例6野生酶与双点组合突变体的酶活及产量检测

将提升效果最佳的突变体M374L与其它正向单点突变进行叠加突变，评估双点组合突变的突变效果。

双点组合突变的方法：以突变体M374L(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)为模版DNA进行快速突变：对M374L/V31L、M374L/V36A、M374L/A48P、M374L/S104A、M374L/Q127P、M374L/L143F、M374L/S152A、M374L/N175Y、M374L/G195D、M374L/G225L、M374L/G256D、M374L/G256Y、M374L/A297L、M374L/A297V、M374L/F329W、M374L/P333A、M374L/N337A、M374L/G343A、M374L/D358S、M374L/I368F、M374L/I368L、M374L/L370F、M374L/M421A定点突变的引物同实施例2中相应单点定点突变的引物。

PCR目标质粒扩增反应体系及PCR目标质粒扩增反应条件同实施例2、糖基转移酶酶活测定方法同实施例4。

催化反应体系(20mL)：底物甜茶苷40g/L，蔗糖120g/L，粗酶10mg/mL，缓冲100mMpH7.2磷酸钾缓冲。催化反应条件为37℃，200rpm。水浴95℃灭活取样，样品稀释至40倍，待HPLC检测分析。

通过酶活及产量检测显示双点组合突变体的酶活及产量均优于原始菌株，酶活提升218-487％，产量提高7.3-21.3g/L具体数据见表3。

表3.野生型与双点组合突变体的相对酶活与Rub2G产率(反应24h)

实施例7野生酶与三点突变体的酶活、产量及半衰期检测

将提升效果较佳的双点组合突变体M371L/V31L、M374L/G343A、M374L/I368L与V31L、S104A、G225L、G256D、G343A、M421A进行叠加突变，评估三点组合突变的突变效果。

三点组合突变的方法：

以M371L/V31L(核苷酸序列为SEQ ID NO:8)为模版DNA进行快速突变：

对M374L/V31L/G225L定点突变的引物：

正向引物：5’-CTTCAGCCTTCTGTCTAACTGGAAAGTTGTTCCG-3’

反向引物：5’-TAGACAGAAGGCTGAAGTAATCAATGTACTTCGCC-3’

对M374L/V31L/G256D定点突变的引物为：

正向引物：5’-CTGGTTGGATAAGAAGGACGAGAACAGCACGG-3’

反向引物：5’-CCTTCTTGACCAACCAGTCGATCAATTCCATCT-3’

对M374L/V31L/G343A定点突变的引物为：

正向引物：5’-CACGGGTGCTTTCATCAGCCATTGTGGTTGGA-3’

反向引物：5’-TGATGAAAGCACCCGTGCTCGGGTGATTCAGG-3’

以M374L/G343A(核苷酸序列为SEQ ID NO:9)为模版DNA进行快速突变：

对M374L/G343A/S104A定点突变的引物为：

正向引物：5’-GAAAATGGCCAAGCCGAATTTCAGCAAGATCC-3’

反向引物：5’-TCGGCTTGGCCATTTTCAGAGCCTTTTGCAGA-3’

对M374L/G343A/M421A定点突变的引物为：

正向引物：5’-AGCGAAAGCTCGTGATATTTCCAAGAACCTGAAA-3’

反向引物：5’-TATCACGAGCTTTCGCTTTCAAGTTTTCACCG-3’

以M374L/I368L(核苷酸序列为SEQ ID NO:10)为模版DNA进行快速突变：

对M374L/I368L/V31L定点突变的引物为：

正向引物：5’-TTTGAACCTGGCCAAGAAGCTGGTCGACCGCG-3’

反向引物：5’-TCTTGGCCAGGTTCAAAAACGGGCTAATATGACC-3’

对M374L/I368L/G343A定点突变的引物为：

正向引物：5’-CACGGGTGCTTTCATCAGCCATTGTGGTTGGA-3’

反向引物：5’-TGATGAAAGCACCCGTGCTCGGGTGATTCAGG-3’

PCR目标质粒扩增反应体系为：10μM正向引物和反向引物各2μL；dNTP Mix 1μL；2×Max Buffer 25μL；模板质粒1μL；2U/50μL Super-Fidelity DNA聚合酶1μL，加灭菌水ddH₂O补足至50μL。

PCR目标质粒扩增反应条件：95℃预变性30s；30个循环(95℃变性15s；65℃退火15s；72℃延伸7min)；72℃彻底延伸5min；最后16℃保温。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶核酸电泳检测。

将DpnI 1μL加入至确定已突变的PCR扩增产物中，后将反应体系置于37℃恒温反应1～2h，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45～90s，冰上放置2min，加入600μL LB培养基，37℃摇床200rpm 45min，取全部菌液均匀涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上，37℃过夜培养。挑取平板上2个单菌落，接入LB液体培养基中，9h后保存菌液甘油管并测序，将测序结果正确的菌液甘油管涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上，摇管活化提取质粒，将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中。

糖基转移酶酶活测定方法为：在3mL的酶催化反应体系中加入1mM底物甜茶苷，2mMUDPG，粗酶0.5mg，再用100mM，pH 7.2磷酸钾缓冲液补充。反应条件是30℃，200rpm取样时间为0min、20min、30min。样品处理：取500μL，水浴95℃灭活5min灭活，待HPLC检测。酶活定义(U)：1分钟内转化生成1μmol产物所需的酶量为1个酶活单位。

半衰期检测方法为：在37℃水浴条件下将野生酶与突变体酶进行不同时间的孵育，并测定酶活，绘制半衰期曲线并求得半衰期时间，酶活检测方案同上。

催化反应体系(20mL)：底物甜茶苷40g/L，蔗糖120g/L，粗酶10mg/mL，缓冲100mMpH 7.2磷酸钾缓冲。催化反应条件为37℃，200rpm。水浴95℃灭活取样，样品稀释至40倍，待HPLC检测分析。

通过酶活及产量检测显示三点组合突变体的酶活及产量均优于原始菌株，酶活提升568-774％，半衰期延长9-19.4h(见表4)。而等催化反应进行72h时Rub2G产量提高22.7-30.8g/L具体数据见表5。

表4.野生型与三点组合突变体的相对酶活与半衰期

表5.野生型与三点组合突变体Rub2G产率

Claims (10)

1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体其氨基酸序列是在对应于SEQ IDNO:1的M371位点突变为L。

2.一种糖基转移酶突变体，所述突变体具有催化甜茶苷生成Rub2G的活性，其氨基酸序列是在SEQ ID NO:1的M374L/V31L、M374L/V36A、M374L/A48P、M374L/S104A、M374L/Q127P、M374L/L143F、M374L/S152A、M374L/N175Y、M374L/G195D、M374L/G225L、M374L/G256D、M374L/G256Y、M374L/A297L、M374L/A297V、M374L/F329W、M374L/P333A、M374L/N337A、M374L/G343A、M374L/D358S、M374L/I368F、M374L/I368L、M374L/L370F、M374L/M421A中任意一种突变位点组合。

3.一种糖基转移酶突变体，所述突变体具有催化甜茶苷生成Rub2G的活性，其氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1的M374L/V31L/G225L、M374L/V31L/G256D、M374L/V31L/G343A、M374L/V31L/I368L、M374L/S104A/G343A、M374L/G343A /I368L、M374L/G343A /M421A中任意一种突变位点组合。

4.编码权利要求1-3中任一项所述糖基转移酶突变体的核酸序列。

5.一种重组质粒，该重组质粒连接有权利要求4所述的糖基转移酶突变体的核酸序列。

6.一种重组细胞，该重组细胞包含有权利要求5所示的重组质粒或权利要求4所述的糖基转移酶突变体的核酸序列。

7.权利要求1~3中任意一项所述的糖基转移酶突变体在催化合成Rub2G中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1）构建含双酶共表达的重组菌株：将糖基转移酶LbUGT的突变体的基因与蔗糖合酶基因共同构建至质粒中得到重组质粒；

2）将重组质粒转化到宿主菌中，得到含双酶共表达体系的重组菌株；

3）将重组菌株活化，转接到TB诱导培养基中，添加诱导剂诱导培养，低温离心并收集菌体，菌体重悬于适量缓冲液并破碎，离心收集上清液即为粗酶液；

4）Rub2G的催化合成：在催化反应体系中加入甜茶苷，蔗糖和粗酶液，反应5-100h，高温灭活，离心得上清即为Rub2G。

9.根据权利要求书8所述的应用，其特征在于，所述诱导剂的终浓度为0.02-1 g/L,诱导时间为4-50 h。

10.根据权利要求书8所述的应用法，其特征在于，甜茶苷的浓度为1-500 g/L；蔗糖浓度为1-1500 g/L；粗酶添加量为0.1-1000 g/L。