CN118126136B - 一种针对白细胞介素-6的d-蛋白抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对白细胞介素‑6的D‑蛋白抑制剂及其应用。所述D‑蛋白抑制剂具有：(1)SEQ ID No:1的氨基酸序列；或者(2)与SEQ ID No:1具有至少80％、例如，至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中构成所述D‑蛋白抑制剂的氨基酸除甘氨酸以外均为D构型。本发明的D‑蛋白抑制剂与白细胞介素‑6具有极强的亲和力，细胞实验数据显示其对白细胞介素‑6的抑制效果相较于现有技术有大幅提升，从细胞实验数据得出其半抑制浓度(IC₅₀)为纳摩尔级别，这使其更有利地被开发成白细胞介素‑6介导的相关疾病的治疗药物。

Description

一种针对白细胞介素-6的D-蛋白抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体地，涉及一种针对白细胞介素-6的D-蛋白抑制剂及其应用。

背景技术

多肽、抗体等生物大分子类药物相较于小分子类药物有着更好的生物活性和靶蛋白特异性，尤其在靶蛋白有大而平的疏水面时，小分子难以成药，只能由蛋白药物抑制。而多肽、蛋白类药物由L-氨基酸构成，也有着自身的诸多局限，如易被蛋白酶水解，且易引起免疫反应等。现亟需一种抗水解且不会引起免疫反应的蛋白类药物来填补L-蛋白类药物的空白。

D-蛋白类药物是与L-蛋白药物天然手性对称的蛋白，有不易引起免疫反应，无法被体内蛋白酶降解，易于化学修饰等特点，近年来受到关注，目前国外已有几款D-蛋白药物在临床试验有的已经上市。

自从1973年白细胞介素-6首次被发现以来，近50年的研究表明白细胞介素-6参与多种生物学事件，比如免疫调节、肿瘤生长、造血、应急反应等。而破坏白细胞介素-6与白细胞介素-6受体(IL-6R)和gp130形成六聚体是抑制白细胞介素-6信号通路的关键。然而，这种六聚体的结合界面过于复杂和广泛，使得用小分子来抑制其形成极具挑战性。白细胞介素-6有三个位置参与了六聚体复合物的形成，分别为site I、site IIa和site IIIa。其中site I是白细胞介素-6与白细胞介素-6受体结合的位点，其由A与C两根α-螺旋组成，siteIIa是由白细胞介素-6的A与C两根α-螺旋组成的接合面，负责与gp130结合，site IIIa是白细胞介素-6的α-螺旋束顶端的平面，与gp130结合。

Siltuximab(司妥昔单抗，美国强生，目前唯一被FDA批准的白细胞介素-6单抗)以及两个仍在临床试验的单克隆抗体Sirukumab和Clazakizumab都结合白细胞介素-6的siteI，此类单克隆抗体可以有效的通过抑制白细胞介素-6与其受体结合进而阻断其与膜蛋白gp130的结合而抑制下游信号通路。但白细胞介素-6目前已知有三种信号传递途径，分别为经典信号途径(classical-signaling)，反式信号途径(trans-signaling)和反式呈递(trans-presentation)。由于反式呈递是其中一个细胞以白细胞介素-6受体结合着白细胞介素-6同时被呈递出来用以结合相邻细胞膜上的gp130，所以此途径不受白细胞介素-6site I结合抗体的干扰。而针对白细胞介素-6site IIIa(Olokizumab)，或者是针对白细胞介素-6受体(Tocilizumab、Sarilumab和Vobarilizumab)，亦或者针对gp130(Olamkicept)都可以同时抑制此三条信号通路。截止2022年，尚未报道过有结合在白细胞介素-6site IIa的抗体。

由于白细胞介素-6参与众多免疫反应，因此每种针对抑制白细胞介素-6信号通路的药物都有一种或多种对应的治疗病症。例如最早开发的白细胞介素-6受体抑制药物Tocilizumab已通过临床试验的对症为：类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、多中心型Castleman病、巨细胞动脉炎、细胞因子释放综合征和高须动脉炎，另有成人Still综合症、Graves眼病、复发性多软骨炎以及强直性脊柱炎正处于第二至第三期临床。

其中，结合在白细胞介素-6上的单抗Siltuximab已通过FDA认证用于多中心型Castleman病，其用于治疗多发性骨髓瘤和淀粉样蛋白轻链淀粉样变性病的开发正处于临床二期试验，另有对症实体瘤、前列腺癌、转移性肾细胞癌和转移性肾癌均在临床一至二期试验。Sirukumab，olokizumab和Clazakizumab分别处于类风湿性关节炎临床试验的第三，第三和第二期。结合在gp130上的单抗Olamkicept则对症炎症性肠病，目前处于临床二期试验。

专利CN116003530B中也公开了一种针对白细胞介素-6(IL-6)的D-蛋白抑制剂，然而其生物活性较低，成药性不足，因此仍需要开发一种生物活性得到改善的针对白细胞介素-6的抑制剂。

发明内容

本发明的技术目的是提供一种针对白细胞介素-6(IL-6)的D-蛋白抑制剂。

本发明的另一技术目的是提供一种药物组合物，其包含本申请的所述D-蛋白抑制剂。

本发明的另一技术目的是提供所述D-蛋白抑制剂在药物制备中的应用。

一方面，本发明提供一种针对白细胞介素-6的D-蛋白抑制剂，所述D-蛋白抑制剂具有：

(1)SEQ ID No:1的氨基酸序列；或者

(2)与SEQ ID No:1具有至少80％、例如，至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，

其中构成所述D-蛋白抑制剂的氨基酸除甘氨酸以外均为D构型。

在具体实施方式中，所述D-蛋白抑制剂的氨基酸序列选自SEQ ID No:1，SEQ IDNo:6、SEQ ID No:7、SEQ ID No:8。

在具体实施方式中，在上述情形(2)中，序列SEQ ID No:1中的任意1-10个氨基酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸被同类氨基酸所取代。

在具体实施方式中，所述D-蛋白抑制剂的二级结构如下：其由4条α-螺旋构成，第一条α-螺旋序列为SEQ ID No:2，第二条α-螺旋序列为SEQ ID No:3，第三条α-螺旋序列为SEQ ID No:4，第四条α-螺旋序列为SEQ ID No:5。

在具体实施方式中，所述D-蛋白抑制剂的二级结构序列为LHHHHHHHHHHHHLLLHHHHHHHHHHHHHHHHHLLLHHHHHHHHHH HHHHHLLHHHHHHHHHHHL。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述D-蛋白抑制剂以及药学上可接受的载体。

另一方面，本发明提供上述D-蛋白抑制剂及上述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。

在具体实施方式中，所述疾病为白细胞介素-6介导的相关疾病。

在具体实施方式中，所述疾病选自类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、多中心型Castleman病、巨细胞动脉炎、细胞因子释放综合征、高须动脉炎、成人Still综合症、Graves眼病、复发性多软骨炎和强直性脊柱炎。

又一方面，本发明提供上述D-蛋白抑制剂及上述药物组合物在制备白细胞介素-6体内示踪剂中的用途。

有益效果

1.本发明的D-蛋白抑制剂解决了L-蛋白易于被体内蛋白酶水解的问题。

2.本发明的D-蛋白抑制剂有着更好的热稳定性，有利于药物的运输和保存。

3.本发明的D-蛋白抑制剂显示出对白细胞介素-6极强的抑制活性，与白细胞介素-6的结合常数小于1E10^-8M，能够特异性结合人白细胞介素-6并阻断白细胞介素-6和gp130的相互作用，具备开发成白细胞介素-6免疫相关疾病的治疗药物的潜力。

4.本申请基于专利申请CN116003530B中数据和蛋白结构模型的数据进行多轮针对性的定向进化。本申请的D-蛋白抑制剂在热稳定性和蛋白酶解稳定性都保持原有的特性，但是细胞实验证实其抑制能力相较于前者有接近5000倍的提升，因此在技术效果方面相较于其取得了巨大的进步。

附图说明

图1：D-25367-EVO的化学合成，A为RP-HPLC洗脱曲线，B为D-25367-EVO质谱图，显示其测量分子量为7390.27道尔顿，计算分子量为7391.49道尔顿。

图2：D-25367-EVO热变温CD光谱图。

图3：D-25367-EVO与白细胞介素-6在分子筛Superdex 200Increase10/300column共迁移曲线(A)，以及SDS-PAGE胶图(B)，图中，上：白细胞介素-6单独；中：D-25367-EVO单独；下：D-25367-EVO和白细胞介素-6以1.1:1摩尔比的混合物。

图4：采用生物膜干涉实验测定D-25367-EVO与白细胞介素-6的结合常数。

图5：采用HEK-293T细胞验证D-25367-EVO对于由白细胞介素-6介导的下游信号通路表达的影响。图中每个柱状图的柱高为每三组实验的平均值，并用突出于柱高的细线显示每三组数据的方差。

图6：L-25367-EVO和D-25367-EVO的蛋白酶解实验的SDS-PAGE胶图。

图7：D-25367-EVO与gp130的竞争性实验结果。

图8：L-25367-combo-4对于D-白细胞介素-6的生物膜干涉实验的实验结果。

图9：L-25367-100-11对于D-白细胞介素-6的生物膜干涉实验的实验结果。

图10：L-25367-100-13对于D-白细胞介素-6的生物膜干涉实验的实验结果。

图11：L-25367-EVO对于D-白细胞介素-6的生物膜干涉实验的实验结果。

具体实施方式

术语

在本申请中，术语“D-蛋白抑制剂”是指构成所述蛋白的所有氨基酸除甘氨酸以外，均为D构型。

在本申请中，在二级结构序列中，字母“L”表示无规则区域，字母“H”表示α-螺旋。

在本申请中，术语“药学上可接受的载体”是指本领域技术人员已知的任何种类的固体、半固体或惰性流体赋形剂、填充剂、封装或配方辅助材料。

在本申请中，术语“治疗有效量”是指药物组合物中所含的本发明的D-蛋白抑制剂的量足以达到预期目的。

下文中通过具体实施例来详细描述本发明以使本领域的技术人员更好地理解本发明，然而这些实施例并不用于限制本发明的范围。

制备实施例1

以下通过具体实施例来详细描述本申请的针对白细胞介素-6的D-蛋白抑制剂(下文命名为D-25367-EVO)的制备过程。

D-25367-EVO通过标准Fmoc固相肽合成(Fmoc SPPS)制备，并由Liberty blue微波多肽合成仪(CEM Corporation)自动合成。实验所用Rink Amide AM树脂(载量为0.27mmol/g或0.55mmol/g，采购自天津南开和成科技有限公司。实验所用的氨基酸衍生物购买江苏申琅生物科技有限公司(中国南通)。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三异丙基硅烷(TIPS)、三氟乙酸(TFA)和硫代茴香醚购自J&K Scientific Ltd.(北京)。N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)和2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)购自上海泰坦科技有限公司。1,2-乙二硫醇(EDT)购自TCI(Shanghai,China)Development Co.,Ltd。哌啶购自国药化学试剂有限公司，乙醚购自现代东方(北京)科技发展有限公司，乙腈购自Mallinckrodt Baker,Inc.。

首先，将Rink Amide AM树脂在90℃下用含有10％哌啶和0.1M Oxyma的DMF溶液去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基团1分钟。然后，用DMF洗涤树脂3次。将树脂(0.25mmol)，4倍当量Fmoc保护的氨基酸(0.2mM，5ml，溶于DMF)，4倍当量Oxyma(1mM，1ml，溶于DMF)，以及4倍当量DIC(0.5mM，2ml，溶解在DMF中)混合并在微波加热下在90℃下偶联2分钟。在程序结束时，以切割液(TFA/TIPS/硫代茴香醚/水/EDT，体积比为82.5:5:5:5:2.5，vol/vol/vol/vol)切割3小时，从树脂上裂解肽段。然后将溶液在氮气搅拌下浓缩，用冷的乙醚沉淀，然后离心并倒出上清液，重复3次。所得沉淀物是粗肽，随后以HPLC(高效液相色谱)进一步提纯得到D-25367-EVO(氨基酸序列：GEEEVIEYLTREFKDDPELVRLLREAIEGLLKAGEDPEIVEMLIESLIHITGN PRVAVKLAKEYA(SEQ ID No:1))。反相HPLC在Shimadzu Prominence HPLC上进行。A泵流动相为乙腈(0.1％ TFA)，B泵流动相为去离子水(0.1％ TFA)。将粗制的多肽溶于含50％乙腈和0.1％ TFA的水中，用0.22μm的过滤器过滤，纯化后的溶液冻干，得到纯的多肽粉末，将其命名为D-25367-EVO。D-25367-EVO的HPLC和质谱检测结果如图1所示。

测试实施例1：D-25367-EVO的结构鉴定

D-25367-EVO的二级结构由圆二色光谱仪(Chirascan V100/AppliedPhotophysics)测得。CD光谱测试了260至180nm区间，分别测试开始时25℃，升温至95℃和降回25℃时的三条CD曲线，升温幅度为2℃/min。D-25367-EVO测试浓度为0.2mg/ml溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)。

结果如图2所示。结果表明，在25℃，95℃和重回25℃时均能显示出在208和222nm处有正峰，为典型的D型手性的α-螺旋二级结构。经进一步分析，D-25367-EVO由4根α-螺旋构成，第一条α-螺旋序列为SEQ ID No:2(EEEVIEYLTREF)，第二条α-螺旋序列为SEQ ID No:3(PELVRLLREAIEGLLKA)，第三条α-螺旋序列为SEQ ID No:4(PEIVEMLIESLIHIT)，第四条α-螺旋序列为SEQ ID No:5(PRVAVKLAKEY)，因此其二级结构序列为LHHHHHHHHHHHHLLLHHHHHHHHHHHHHHHHHLLLHHHHHHHHHH HHHHHLLHHHHHHHHHHHL。

此实验结果还证明了D-25367-EVO有良好的热稳定性，与专利申请CN116003530B中公开的D-蛋白抑制剂一致。

测试实施例2：D-25367-EVO与白细胞介素-6的结合分析

D-25367-EVO与白细胞介素结合分析分别使用了分析型分子筛色谱柱共迁移实验和生物膜干涉技术。

分析型分子筛色谱柱法

将D-25367-EVO和白细胞介素-6单独或两者摩尔比为1.1:1混合物，以同等物质的量的蛋白过柱(Superdex 200Increase 10/300column)，然后洗脱样品经SDS-PAGE跑胶验证D-25367-EVO与作为靶蛋白的白细胞介素-6发生共迁移。

结果如图3所示。从图3可以看出，当白细胞介素-6与D-25367-EVO混合后，复合物的出峰位置要先于各单体出峰，意味着复合物的体积更大。且从胶图可以对应复合物处峰为二者的复合物。

生物膜干涉技术(Octet RED96e/ForteBio)

生物膜干涉技术使用Octet仪器，使用特异性结合生物素的SA(链霉亲和素)探针来结合生物素化的L-或D-白细胞介素-6。对于D-白细胞介素-6，在合成的时候，在蛋白的氨基端连接一个生物素分子。而L-白细胞介素-6的生物素化是基于氨基端的一个Avi标签，通过生物素连接酶将生物素与L-白细胞介素-6连接。

实验流程为：

(1)基线1：SA探针浸于含有万分之二Tween-20的磷酸生理盐水缓冲液，pH7.4(以下简写成PBST)60秒，

(2)固化：将生物素化的白细胞介素-6在PBST中稀释，终浓度为10μg/ml，将SA探针浸于此溶液120秒；

(3)封闭：(封闭液为10μg/ml生物素的PBST溶液)，将SA探针浸于封闭液60秒，

(4)基线2：浸于PBST 60秒，

(5)结合：浸于由PBST稀释的L或者D-25367-EVO溶液，分别在不同浓度10，5，2.5，1.25，0.63nM下600秒，

(6)解离：浸于PBST 600秒，

(7)测得白细胞介素-6与D-25367-EVO的结合常数为3.03±0.04nM(参见图4)。

从图4可以看出，本申请的D-蛋白抑制剂与L-白细胞介素-6表现3.03±0.04nM的结合常数，相对于专利CN116003530B中公开的结合常数(28.3nM)提升了近十倍。

测试实施例3：D-25367-EVO细胞活性实验

白细胞介素-6介导的JAK-STAT信号通路已经被证明可以使用的测量人胎盘分泌型碱性磷酸酶表达来定量的测定信号通路。

在本实验中，将含有PhCMV-hIL-6R-pA(SEQ ID NO：9)(40ng)、PhCMV-hSTAT3-pA(SEQ ID NO：10)(40ng)和PhSTAT3-SEAP(分泌型碱性磷酸酶)-pA(SEQ ID NO：11)(20ng)转染进1×10⁴个HEK-293T细胞中表达分泌型碱性磷酸酶以感应胞外白细胞介素-6。将转染的细胞与不同浓度的D-25367-EVO和人白细胞介素-6在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培养基中，在37℃和5％二氧化碳的培养箱中孵育48小时。之后将细胞培养上清液热灭活(65℃，30分钟)，并将80μl上清液与120μl底物溶液[100μl两倍浓度的分泌型碱性磷酸酶检测缓冲液，其含有20mmol高精氨酸，1mmol氯化镁，21％(体积/体积)二乙醇胺pH 9.8以及20μl含有120mmol对硝基苯磷酸的底物溶液]混合。通过测量细胞培养基中分泌型碱性磷酸酶的产生来评估白细胞介素-6信号传导。使用SynergyH1混合多模酶标仪(BioTek仪器公司)在波长405nm(37℃)处记录吸光度，单位为酶活单位U/L。

结果如图5所述，从图中可以看出D-25367-EVO可以显著抑制白细胞介素-6介导的信号通路。

从图5可以看出，本申请的D-蛋白抑制剂的半数抑制浓度为1nM左右，相较CN116003530B中的半数抑制浓度提升接近5000倍，在此次实验中，与市面上唯一FDA批准的白细胞介素-6的单克隆抗体药物司妥昔单抗(siltuximab)的药效已经比较接近，因此，相较于现有技术公开的D-蛋白抑制剂更具有实用价值和开发价值。

测试实施例4：D-25367-EVO蛋白酶的水解实验

在蛋白酶解实验中，蛋白浓度为0.2mg/ml，分别在胰蛋白酶和胃蛋白酶溶液中37℃孵育，同时以D-25367-EVO的手性镜像多肽L-25367-EVO(氨基酸序列相同但由L-氨基酸构成)为对照。实验中，胰蛋白酶和胃蛋白酶的最终浓度均为2.2mg/ml，并在孵育6和20小时时取样，用SDS-PAGE跑胶验证。

结果请见图6。从图6可以看出，本申请的D-25367-EVO不易被蛋白酶水解，显示出良好的体内稳定性。因此，本申请的D-蛋白抑制剂在蛋白酶稳定性方面与专利CN116003530B中表现一致。

测试实施例5：D-25367-EVO与gp130的竞争性实验

本实验原理基于生物膜干涉实验，将带有AVI标签的人源gp130固化在SA探针上，然后检测gp130与含有不同的白细胞介素-6组分的溶液是否发生结合(实验步骤参照测试实施例2中所描述的具体过程)。实验过程中将白细胞介素-6与白细胞介素-6受体(IL-6R)的胞外区先组成复合物，用于模拟血液循环中存在的可溶性白细胞介素-6受体(sIL-6R)与白细胞介素-6形成的复合物。然后通过加入不同浓度的D-25367-EVO抑制剂来抑制白细胞介素-6和白细胞介素-6受体(IL-6R)的胞外区复合物10nM与gp130形成六原复合物的可能性。实验中的对照组为未添加抑制剂的负对照，以及添加有司妥昔单抗10nM的正对照。实验步骤与测试实施例2描述一致。

结果见图7。从图7可以看出，本申请的D-25367-EVO能模拟血液中捕获可溶性白细胞介素-6受体(sIL-6R)与白细胞介素-6形成的复合物，且药效与司妥昔单抗接近。

测试实施例6：位点保护分析

在蛋白质工程中，Schumacher等人,1996,Science 271:1854-1857,Chang等人,2015,Angew Chem Int Ed Engl 54：11760-11764,Zhou等人，2020，Angew Chem Int EdEngl 59：15114-15118，Marinec等人，2021，ACS Chem Biol 16：548-556，等大量文献已经证实D型多肽或蛋白的筛选或优化需要先通过L型的药物库针对D型靶蛋白进行筛选，然后再通过手性转换获得有功能的D型药物。因此，以下通过L-蛋白抑制剂的生物膜干涉实验结果来说明本申请涉及的D-蛋白抑制剂突变的可能性和可行性。

在对于现有专利CN116003530B多轮针对性的优化过程中，发明人还发现几个突出的优化版本(L-25367-combo-4：SEQ ID NO：6，L-25367-100-11：SEQ ID NO：7，L-25367-100-13：SEQ ID NO：8)，都有着与L-25367-EVO相近的理化性质，对其进行生物膜干涉实验(实验步骤参照测试实施例2中所描述的具体过程)。

图8-图10分别示出L-25367-EVO的不同改造氨基酸序列的天然手性(L-型)抑制剂对于D-白细胞介素-6的生物膜干涉实验的实验结果，图11示出L-25367-EVO(作为对照组)对于D-白细胞介素-6的生物膜干涉实验的实验结果。图8-11的实验结果证明，虽然存在部分序列差异，但不影响其与靶蛋白的结合。

Claims (4)

1.一种针对白细胞介素-6的D-蛋白抑制剂，所述D-蛋白抑制剂的氨基酸序列为：SEQID No:1，

其中，构成所述D-蛋白抑制剂的氨基酸除甘氨酸以外均为D构型。

2.根据权利要求1所述的D-蛋白抑制剂，其中，所述D-蛋白抑制剂的二级结构如下：其由4条α-螺旋构成，第一条α-螺旋序列为SEQ ID No:2，第二条α-螺旋序列为SEQ ID No:3，第三条α-螺旋序列为SEQ ID No:4，第四条α-螺旋序列为SEQ ID No:5。

3.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1或2所述的D-蛋白抑制剂以及药学上可接受的载体。

4.如权利要求1或2所述的D-蛋白抑制剂或如权利要求3所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病为白细胞介素-6介导的相关疾病，并且所述疾病选自类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、多中心型Castleman病、巨细胞动脉炎、细胞因子释放综合征、高须动脉炎、成人Still综合症、Graves眼病、复发性多软骨炎和强直性脊柱炎。