CN1181197C

CN1181197C - 在高pH下蛋白质的回收

Info

Publication number: CN1181197C
Application number: CNB008030650A
Authority: CN
Inventors: ÷˹��A��˹��ɭ; 梅斯·A·劳斯特森; ��M��ɭ; 柯伦·M·辛普森; J; 迈克尔·J·奥雷利
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-24
Publication date: 2004-12-22
Anticipated expiration: 2020-01-24
Also published as: EP1149160B1; ATE323759T1; WO2000043502A1; EP1149160A1; DE60027406D1; US6316240B1; JP2002534975A; DK1149160T3; AU2093100A; CN1337999A; DE60027406T2

Abstract

本发明涉及一种从培养液中回收糖苷酶或者肽酶的方法，所述酶在该培养液中是从不溶状态到溶解状态。

Description

在高pH下蛋白质的回收

发明领域：

背景技术：

由于显著量的目标蛋白不是处于溶解状态，可能会阻碍从培养液中回收该蛋白。

该问题可能发生在如下情况中，比如当目标蛋白结合在沉积物的成分上，同样地或者由于显著量的目标蛋白在从培养液中回收前已经沉淀或结晶。

目标蛋白与沉积物的结合是指该蛋白结合在培养基中的固形物上，比如细胞类的固形物或培养基中的其他固体成分。

在蛋白质的有效回收上，这是一个重要问题。

已经有几种方法可以解决或者减小该问题。

在许多情况下，低或不稳定的回收率被接受，其他情况下通过添加如下物质可消除这个问题，比如离子型或非离子型表面活性剂，盐类，消/去泡剂，醇类，目标酶的底物或其类似物。

在许多情况下这些技术是低效的，其他情况下，采取了复杂的步骤(如液-液分离系统)，这需要添加大量的(可能不只一种的)试剂。

在脂肪酶类的回收上可以找到这样的一些例子，脂肪酶很容易附着在发酵液中的固形物和/或在回收中可能用到的助滤剂上。

WO 97/23604描述了一种从发酵液中回收脂肪酶的方法。

所述方法的必要步骤包括非离子表面活性剂和醇的使用，这样得到的终产物含有微生物蛋白(优选脂肪酶)，所述非离子表面活性剂和所述醇。参见WO 97/23604的权利要求1。

EP 0574050A1描述了一种方法，用于从发酵液中回收疏水性产物，优选脂解酶(参见第3栏，47-50行)。该方法的必要步骤包括非离子表面活性剂和盐的一同使用。参见例如权利要求1。

生物技术杂志(Journal of biotechnology)，26(1992)111-142是一篇综述性文章，文章记述了关于脂肪酶不同纯化策略的现有技术。在129页提到脂肪酶的纯化通常受其溶解性问题的阻碍。该文章总结了现有技术对此问题的解决方案，其中包含着非常复杂的纯化策略，比如液-液提取，双水相提取，特异性膜加工和免疫纯化。

蛋白质在碱性溶液中的溶解已由WO 83/04418；EP 0 122 080；EP 0 331464；和EP 0 373 325中。

对于在回收发酵液前蛋白质出现沉淀或结晶，至今没有真正有效的方法。通常尝试使用大量的助溶剂(如尿素)。其他例子中采取了固-固分离技术，其中该沉淀或结晶的目标蛋白与发酵液中其他固体分离-这些分离经常是不可能的并且总是复杂的。

发明概述：

本发明要解决的问题是提供一个简单而有效的方法，用于从培养液中回收糖苷酶或者肽酶，其中显著量的目标糖苷酶或肽酶在培养液中不是处于溶解状态。

发明人的解决方案是：培养液中所含显著量的目标糖苷酶或肽酶因pH在7.5而没有处于溶解状态时，通过使用极端pH条件，即pH9.5-13，目标蛋白可以得到有效的回收。

因此，本发明涉及从培养溶液回收目标糖苷酶或肽酶的方法，该培养溶液含有可产生目标糖苷酶或肽酶的细胞，并且在pH7.5下，其中少于80％的目标糖苷酶或肽酶在该培养溶液中处于溶解状态，该方法包括：

a)通过调节该培养液的pH到9.5-13，使目标糖苷酶或肽酶溶解；并且

b)将细胞与溶解了的产物相分离，得到含有目标糖苷酶或肽酶的溶液。

所述“培养液”在此指包含目标蛋白和产生该目标蛋白的细胞的溶液。该培养液可能含有其他任何成分，尤其是通常被用于细胞发酵的成分。按照本发明，培养液将优先指发酵培养液。

所述“培养液在pH7.5下，其中少于80％的目标糖苷酶或肽酶处于溶解状态”指本文要解决的主要问题，即当显著量的目标蛋白为不溶状态时回收该目标蛋白。

“培养液”是否符合此标准可由如下事实确定，培养液的上清液中目标蛋白浓度低于该培养溶液中目标蛋白总浓度的80％。上清液是水相培养液，可通过例如，在足以去除细胞的条件下离心而得到。

所述浓度指每一升中蛋白的量(干重)(如g/L)，或者是每一升中的蛋白活性。

所述“在pH7.5下”在此指上清液从pH7.5的培养溶液中分离(优选离心)得到。

上清液和培养液中的目标蛋白浓度可以随后在此pH7.5或另一pH下测定。

这取决于目标蛋白和培养液的特性，可以由技术人员的常识决定(可参见下面对此的进一步讨论)。

可以选择另一种表示为：

“培养液”符合本文标准的前提是：

Prot._Conc，sup./Prot._Conc.Cul-sol×100＜80，pH7.5；其中

Prot._Conc，sup.是培养液的上清液中目标蛋白浓度。

Prot. Conc.Cul-sol是该培养液中目标蛋白总浓度。

优选地，上清液中该目标蛋白的浓度在该培养液蛋白浓度中所占比率低于70％；更优选地低于55％，甚至40％；最优选地低于25％。

测定目标蛋白浓度的实际方法遵循在本领域熟知的标准方法，并依目标蛋白的特性而做调整。

当测定该培养液中酶的浓度时，所用方法当然应该在检测培养液中的目标蛋白浓度前使目标蛋白的不溶部分溶解。

有许多这样的为本领域所熟知的方法，例如疏水蛋白或沉淀蛋白的提取方法，该方法包括进行高倍稀释添加去污剂，尿素等。

依据上面列出的标准挑选特定的方法是技术人员的常识。

应在此提起注意的是，公开在WO 97/20921中的培养液没有一种符合这些标准，这是由于该公开文本中没有回收不溶状态下蛋白的方法。

因此，公开在WO 97/20921中的所有特定培养液的上清液中，目标蛋白浓度都高于该培养液中蛋白总浓度的80％。

正如在此描述的，本方法的一个优点就是调节pH到9.5-13可直接引起目标蛋白的溶解。

因此，通过简单的离心分离可以沉积固形物(例如细胞)，回收上清液，这样就可以将固形物与目标蛋白分离。在此描述的方法不用添加化合物，如：离子型/非离子型表面活性剂，盐类，消/去泡剂，特定的醇类，而这些都是在WO97/23604和EP 0574050A1中所提方法的必要步骤。

而且，正如本发明实施例1中说明的，此方法可以获得很高的目标蛋白终产率。

本发明的实施方案如下所述。

项1.一种从培养液中回收糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC 3.4)的方法，该培养液中含有能产生糖苷酶或肽酶的细胞，其中不到80％的所述糖苷酶或肽酶在pH7.5的该培养液中处于溶解状态，所述方法包括：

a)通过调整培养液的pH到9.5-13，使目标糖苷酶或肽酶溶解；

b)步骤a)中的培养液在调整pH之前，期间，或之后用一种或多种絮凝剂处理；和

c)将细胞与溶解态的所述糖苷酶或肽酶分离，得到含有所述糖苷酶或肽酶的溶液。

项2.项1中的方法，其中在pH7.5的该培养液中不处于溶解状态的所述糖苷酶或肽酶结合在该培养液中的固形物如细胞类固形物或者溶液中的其它固体成分上。

项3.项1中的方法，其中在pH7.5的该培养液中不处于溶解状态的目标糖苷酶或者肽酶在该培养液中沉淀和/或结晶。

项4.项1-3中任一项的方法，其中所述培养液的pH被调节到9.75-13；更优选地，pH被调节到10-13；更进一步优选的，pH被调节到10.25-13；最优选地，pH被调节到10.5-13。

项5.项1中的方法，其中絮凝剂是可溶性的铁和/或铝化合物，特别是氯化氢氧化铝的聚合物，水合氯化铝聚合物，或NaAlO₂。

项6.项1-5中任一项的方法，其中所述糖苷酶或肽酶是蛋白质工程变体。

项7.项1-6中任一项的方法，其中所述糖苷酶是淀粉酶或甘露聚糖酶。

项8.项1-6中任一项的方法，其中所述肽酶是蛋白酶。

项9.项1中的方法，其中步骤c)中培养液的pH在分离前被调节到更低(低于pH9.5)。

发明详述：

在含有可以产生糖苷酶或肽酶的细胞的培养液中，其中多于20％的目标蛋白，在pH7.5下，在该培养液中不是处于溶解状态(不溶状态)。

正如在上面背景部分描述的，培养液中的目标蛋白不是处于溶解状态是由于，比如目标蛋白与沉积物中的成分相结合，和/或是由于在从培养液中收集前显著量的目标蛋白已经沉淀或结晶。

目标蛋白与沉积物的结合是指蛋白结合在培养液中的固形物上，如细胞类的固形物，或溶液中的其他固体物质。

因此，在本发明的优选实施方案中涉及，

一种方法，其中有多于20％的在pH7.5下在该培养液中处于不溶状态的目标蛋白是与培养液中固形物相结合的目标蛋白，结合的固形物可以是细胞类的固形物或者培养液中其他固体物质；或

一种方法，其中多于20％的在pH7.5培养液中处于不溶状态的目标蛋白是在该培养液中沉淀或结晶的目标蛋白。

培养液通常由分批发酵中得到。

具体的发酵如何进行对本发明的回收方法而言相对不重要。

因此，发酵时间，pH或其他具体发酵条件可以按照为本领域熟知的方法进行。优选地，应调整发酵条件以获得最大的目标蛋白产率。

此外，该培养液可以是一种培养液的离心分离(离心)的级分。

所述“培养液的离心分离级分”指培养液被离心分离下来的部分，比如细胞，不溶物质，不溶的发酵产物。不溶的发酵产物可能包括没溶解的目标蛋白。

因此，在本发明的进一步实施方案中涉及到本发明的一种方法，其中的培养液是培养液的离心分离下来的部分。

在依照本文所述方法回收目标蛋白前，所述培养液的离心分离级分可以悬浮或稀释在水性溶液，如水中。可以依据技术人员常识进行上述悬浮或稀释。

此外，为技术人员所熟知的任何利于不溶蛋白溶解的其他试剂或组分都可以加入到培养液中。这些组分可以是那些能阻止目标蛋白的沉淀或结晶的成分。

这样的成分的例子有，盐类，钙，多元醇，去污剂，除泡剂，消泡剂，或目标蛋白的底物类似物/抑制剂。可参考WO 97/23604，EP 0574050A1或生物技术杂志，26(1992)，其中有这些适合成分的描述。

此外，这里所指的培养液优选含有化学成分确定的培养基的溶液。参见WO 98/37179中对这样的基本由化学成分确定的培养基组成的培养液的进一步描述。

pH的调整：

可以使用技术人员所熟知的任何合适策略进行培养液pH的调整。

如可以使用任何合适的碱进行pH调整。优选的碱有氢氧化钠，氢氧化钾和氢氧化铵，尤其是氢氧化钠。

优选地，依照本发明的步骤a)，培养液pH被调整到9.75-13；更优选地到pH10-13；进一步优选地到pH10.25-13；最优选地pH到10.5-13。

如上所述，培养液可以是从分批发酵中获得的。

因此，pH可以在发酵过程中已经作出调整，从而使这批发酵液具有本发明步骤a)设定的pH值。何时以及如何进行pH的调整在此描述的方法中并不重要。重要的是培养液的pH在所述范围内。

回收期间如本发明所述进行了调整的pH应优选维持一段时间，这取决于目标蛋白的特性，特别是蛋白质的稳定性。

这也就是说，如果目标蛋白在高pH下相对不稳定，应依照此处的描述优先调整pH使蛋白溶解；再依照本发明的第一部分b)项较快地回收已溶解的蛋白；接着马上调节pH到一个蛋白质可以较长时间稳定的值，或者可以选择首先调整到高pH值，接着在分离前在蛋白溶解后马上调整pH到较低值。

相反地，如果目标蛋白在高pH相对较为稳定，依照本发明第一部分条款a)的描述调整了的pH可以维持相对长的时间。

如何根据要回收的目标蛋白的特性优化维持此调整后pH的时间长短是技术人员的常识。

此外，在此要解决的主要问题，即要对显著量处于不溶状态的目标蛋白进行回收时，如果目标蛋白的表达产量相对较高尤为突出。

所以，在本发明的优选实施方案中优选培养液中目标蛋白的表达量至少达到2g蛋白(干重)/kg培养基；优选至少3g蛋白(干重)/kg培养基；更优选至少5g蛋白(干重)/kg培养基；最优选至少10g蛋白(干重)/kg培养基。

能够生产目标蛋白的细胞：

能够生产目标蛋白的细胞原则上可以是任何细胞，比如微生物细胞，植物细胞或者动物细胞。

这里优先指微生物细胞，特别是细菌或真菌细胞。本发明特别适合于细菌细胞。

细菌细胞优先指芽孢杆菌细胞，真菌细胞优先指丝状真菌细胞，例如曲霉属或镰刀菌属的丝状真菌细胞。

絮凝剂的使用：

优选地，在本发明的步骤a)中的培养液可以进一步用一种或多种絮凝剂处理。

在实际的pH调整之前，期间或之后，可以在培养液和/或发酵液/发酵培养基中加入絮凝剂。

絮凝剂为本领域所熟知，均特别用于提供一种蛋白质溶液(例如在此所指的含有能产生目标蛋白的细胞的培养液)，此溶液特别适于离心，过滤，或膜浓缩/过滤，使所述蛋白的流通量和蛋白质纯度都得以提高。

优选地，絮凝剂是可溶性的铁和/或铝化合物。

这些作为絮凝剂的可溶性的铁和/或铝化合物的使用由WO 96/38469得知。

然而，在WO 96/38469公开内容的第7页，第13-14行，写着“保持发酵液pH4-9之间是重要的”。

因此，WO 96/38469的公开内容描述了一种培养液，其必要条件是pH在4-9之间，这样的pH范围超出了本发明中回收方法的pH范围。

优选地，以每升培养液0.02mol-1.2mol铝/铁化合物处理培养液，更优选地，用每升培养液0.04mol-1.0mol铝/铁化合物处理培养液。

依照本发明任何可溶性铁或铝的化合物或它们的任何混合物均可使用，例如Al₂(SO₄)₃，NaAlO₂，K₂Al₂O₄，Al(NO₃)₃，AlCl₃，醋酸铝，甲酸铝，Fe₂(SO₄)₃，甲酸铁，醋酸铁，甲酸亚铁，和醋酸亚铁。

优选的化合物是氯化氢氧化铝(aluminiumhydroxychloride)聚合物(例如从Boliden得到的EKOFLOCK)，水合氯化铝聚合物(来自Calgon公司)，或NaAlO₂。

稳定剂：

依照本发明在某些情况下优选加入稳定剂(这样目标蛋白能提高对高pH值的耐受性)或加入蛋白酶抑制剂(这样目标蛋白不会降解)。可以使用的蛋白酶抑制剂可以是硼酸或boronic acid，特别是在WO 96/41859中描述的4-甲酰基-苯基-boronic acid。

将细胞与溶解的产物分离并得到含目标蛋白的溶液：

依照本发明步骤b)的分离可参照任一已知的标准方法。

这样的方法可能是一种或多种固/液分离技术，例如离心，过滤，或微滤。

目标蛋白：

本发明的方法可用于回收任何目标蛋白。

优选地，目标蛋白是一种酶，特别是糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC 3.4)；(EC-编号依照国际生物化学和分子生物学命名委员会推荐的酶命名法(1992))。特别优选的酶选自淀粉酶(特别是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1))，纤维素酶(EC3.2.1.4)，乳糖酶(EC 3.2.1.108)，木葡聚糖酶，甘露聚糖酶(mannanase)(EC 3.2.1.25)和蛋白酶；特别选自淀粉酶，甘露聚糖酶和蛋白酶。此组优选酶在回收中经常由于沉淀和/或结晶而出现问题。

尤其优选目标蛋白质(优选目标酶)通过DNA重组技术产生的蛋白质工程变体。

这是由于在回收这些变体时能多次出现意想不到问题，比如沉淀或结晶。

这些蛋白质工程变体可以是，例如蛋白酶或淀粉酶的变体，特别是提高了疏水性和/或降低了在培养液中的溶解性的变体。

优选地，目标蛋白应该是在5摄氏度，pH9.5下孵育20分钟后，有至少80％的残余活性的蛋白；更优选地，应在5摄氏度，pH10.0下孵育20分钟后，有至少80％的残余活性的蛋白；最优选地，应在5摄氏度，pH11下孵育20分钟后，有至少80％的残余活性的蛋白。

实施例1：

对WO96/23873所述α 淀粉酶变体进行发酵生产。

发酵后，在显微镜(400×)下可以看到培养液中有酶结晶。

培养液中α 淀粉酶活性经测定为100％。

培养液在pH7.5下离心。

离心后，上清液中α 淀粉酶活性为20.4％。

溶解的/(溶解的+不溶的)的关系式因此是(参见第4页)：

(Prot._Conc，sup./Prot._Conc.Cul-sol)*100＜80)＝20.4％/100％*100＝20.4，(远低于80的限度)。

絮凝：

如下的化学剂添加到(在搅拌状况下)两个各100g的培养样品中：

200％水；1％CaCl₂·2H₂O；0.2％NaAlO₂；0.3％Superfloc C 521和0.3％Superfloc A130。在添加这些化学物质时，一个样品保持pH7.5，第二个保持在pH10.5-pH在7.5/10.5保持10分钟；温度为室温(接近20℃)。

接着两个样品进行离心，测定上清部分中α 淀粉酶的活性产率：

实验1(pH7.5)产率：＝45％

实验2(pH10.5)产率：＝80％

上述实验清楚地表明对样品的碱性处理可以显著提高产物产率。

Claims

1.一种从培养液中回收糖苷酶，EC 3.2，或肽酶，EC 3.4，的方法，该培养液中含有能产生糖苷酶或肽酶的细胞，其中不到80％的所述糖苷酶或肽酶在pH7.5的该培养液中处于溶解状态，所述方法包括：

a)通过调整培养液的pH到9.5-13之间的一个pH值，使目标糖苷酶或肽酶溶解；

b)步骤a)中的培养液在调整pH之前，期间，或之后用可溶性的铁和/或铝化合物处理；和

2.权利要求1中的方法，其中在pH7.5的该培养液中不处于溶解状态的所述糖苷酶或肽酶结合在该培养液中的固形物上。

3.权利要求2的方法，其中固形物是细胞类固形物或者溶液中的其它固体成分。

4.权利要求1中的方法，其中在pH7.5的该培养液中不处于溶解状态的目标糖苷酶或者肽酶在该培养液中沉淀和/或结晶。

5.权利要求1的方法，其中所述培养液的pH被调节到9.75-13。

6.权利要求5中的方法，其中pH被调节到10-13。

7.权利要求6中的方法，其中pH被调节到10.25-13。

8.权利要求7中的方法，其中pH被调节到10.5-13。

9.权利要求1的方法，其中絮凝剂是氯化氢氧化铝的聚合物，水合氯化铝聚合物，或NaAlO₂。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述糖苷酶或肽酶是蛋白质工程变体。

11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述糖苷酶是淀粉酶或甘露聚糖酶。

12.权利要求10的方法，其中所述糖苷酶是淀粉酶或甘露聚糖酶的蛋白质工程变体。

13.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述肽酶是蛋白酶。

14.权利要求10的方法，其中所述肽酶是蛋白酶的蛋白质工程变体。

15.权利要求1中的方法，其中步骤c)中培养液的pH在分离前被调节到低于pH9.5。