CN1181185C - 存在碳源时日本酒曲霉对蛋白水解酶的表达 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种日本酒曲霉菌，它能够在有碳源存在时以至少像不存在碳源时相同的量表达蛋白水解酶。特别是本发明涉及以creA基因突变作为手段，以便在有碳源存在时增加广泛多种蛋白水解酶的量。

Description

存在碳源时日本酒曲霉对 蛋白水解酶的表达

本发明是关于日本酒曲霉菌，它们能够在有碳源存在时以至少像不存在碳源时相同的量表达蛋白水解酶。特别是本发明涉及以修饰creA基因产物的表达作为手段，以便在有碳源存在时增加广泛多种蛋白水解酶的量。

本领域的状况

可通过用酸、碱或酶水解降解蛋白质材料制备广泛用于食品工业的水解蛋白.至于用酸或碱处理蛋白质材料，已表明这种处理过程也会破坏水解过程中产生的必需氨基酸，因此降低最后产品的营养价值。另一方面，通过加入酶水解很难达到完全水解，以致水解蛋白中仍能含有相当多的肽。但是，取决于用于蛋白水解的蛋白质和酶成分的性质，可能导致所形成的肽有非常苦的味道，并且因此特别不受欢迎。

在取代化学或生物分离材料的某些方法中，微生物本身被用于这种目的。在这种情况下，可利用的蛋白质材料是在由微生物分泌的多种酶，如淀粉酶、蛋白酶、肽酶等的作用下被水解。

这类微生物中的一种是传统用于制备日本酒曲培养物的日本酒曲霉菌(见例如US 4,308,284)，这类霉菌包括例如曲霉属(Aspergillus)、根霉属和/或毛霉属(Mucor)微生物，特别是大豆曲霉、米曲霉、海枣曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉，米根霉、寡孢根霉、日本根霉、台湾根霉，Circinelloides毛霉、日本毛霉，灰绿青霉和褐色青霉青霉(penicillum)。

根据植物专用名词国际代码(ICBN)规则，曲霉属是一个无性属。这意着真正的曲霉菌只通过分生孢子梗进行无性繁殖。但是，在可通过子囊孢子有性繁殖的真菌也可发现典型的曲霉属分生孢子梗形态。某些曲霉菌分类学家因为他们不遵守ICBN术语规则而引起了混淆。他们试图对分类方案作多种修正以便构巢曲霉(Aspergillusnidulans)包括在此属之中，尽管实际上它的正确分类名称是Emericella nidulans(Samson，曲霉，生物学及工业应用，PP 355-390，Bennett to klich编著，Boston)。实际上可认为这种被称为构巢曲霉的微生物不属于曲霉属本身。

在EP 0 417 481中描述了一种用于生产发酵的大豆酱的方法，其中是通过将日本酒曲培养物与煮过的大豆和烘热的小麦混合物相混合来制备日本酒曲。然后用日本酒曲培养物发酵过程中产生的酶在水悬液中，45℃-60℃将所获得的日本酒曲水解3-8小时，进一步通过对此水解的日本酒曲悬液加入氯化钠制备moromi，使此moromi发酵，然后挤压，将所得到的液体施行巴斯德灭菌并使之澄清。

EP 0 429 760描述了一种生产调味剂的方法，其中制备了一种富含蛋白质原料的水悬液，通过用蛋白酶在pH6.0-11.0水解此悬液而使蛋白质溶解，在pH4.6-6热处理此悬液，随后用日本酒曲培养物的酶催熟。

类似地，欧洲专利申请96 201 923.8也描述了一种生产肉调味香料的方法，其中制备了一种含有蔬菜蛋白质原料和蔬菜碳水化合物原料的混合物，该混合物初始至少含有45％干物质，将该混合物与日本酒曲培养物共温育，并加入了一种或几种用于肉食品传统发酵过程的其它微生物，温育此混合物直至形成肉调味香料。

然而，涉及使用不同微生物的所有这些方法也显示出蛋白质原料未被完全水解的缺点，而为了达到基本完全水解使此原料与微生物一起较长时间的温育，可能导致形成有害的代谢付产物。

因此，本领域需要尽可能地改善这些水解方法。然而对日本酒曲法的最佳化和进一步发展过程受到了严重的阻碍，因为缺乏关于所涉及水解酶性质，它们的调节以及过程参数对它们的表达和活性影响的知识，影响参数包括例如温看、pH、水中溶性和盐浓度。

从Katz等，基因150(1994)，287-292已知，对于真菌Emericellanidulans，其蛋白水解酶的表达和分泌受到包括碳降解产物抑制作用、氮和硫代谢产物抑制作用在内的至少三种一般控制环路的支配，此种微生物天生地利用这些水解酶提供其繁殖所需要的氮、硫和碳源。

这三种调控环路确保基质中可利用的氮、碳和硫源，按照它们氮、能量和硫的产生顺序地被利用。已发现氮代谢产物的抑制作用也由Emericella nidulans中areA基因产物施加的(Arst等分子和普通遗传26(1973)111-141)，而对于其它的真菌，推测可能有其它一些基因负责此功能。实际上已被研究的绝大多数真菌似乎都具有行使这种功能的areA同源基因。

在以米曲霉进行的麦麸发酵过程中，只有使葡萄糖浓度降低至某一阈值之下才能检测出蛋白水解活性。这些观察结果表明蛋白质的存在并不诱发米曲霉中蛋白水解酶的任何表达，但似乎仅仅被碳去抑制。在使用大豆日本酒曲的发酵过程中，发现由于淀粉酶活性释放了大量的葡萄糖，最后将导致对蛋白酶-编码基因的碳分解代谢物抑制作用。

因此有必要改进水解蛋白质的方法，以便导致高程度的蛋白水解作用，并获得具有极好感官特性的水解产物。

发明概述

通过提供属于曲霉、根霉、毛霉或青霉属的日本酒曲霉实现了此目标，这种日本酒曲霉的蛋白水解活性不被碳抑制。

按照本发明，已对该微生物中creA基因的表达进行了修饰，以致其基因产物将形成一种多肽，此多肽表现出对引起阻断蛋白酶转录的DNA序列降低的结合亲和性或者完全没有结合亲和性。

在另一优选的实施方案中，通过某种方式对creA基因的合成进行了修饰，以致相应的基因产物基本上不被转录或完全不被转录，或者不被翻译成功能性产物。例如通过将一个构建体导入此微生物的基因组可实现此目的，此物建体可导致产生creA反义m RNA而因此阻碍creA基因翻译成功能性多肽。另一方面还可将一些突变导入creA基因，以致不发生任何转录，最后，还可使creA基因完全缺失，以致在有碳源存在时不会发生抑制作用。

借助于经典的技术可以获得导致微生物具有所需性状的突变，例如借助于突变法和选择法，或者使用基因工程技术可对creA基因实现选择性突变。

此外，还可以使creA突变与areA基因产生增加的特性相结合，areA基因对蛋白酶的产生是一种阳性刺激物。

发明详述

在附图中：

图1是λGem 12克隆的限制性酶切图谱。编码区位于被亚克隆进入pUC19的4.3KB PstI-SpHI片段上。

理论上，在creA基因内产生减小或者甚至中断其基因产物对相应DNA序列结合的突变将导致麦麸日本酒曲中更早地开始产生蛋白酶，结果形成较高的蛋白酶产量，并因此导致蛋白酶分泌增加。大豆日本酒曲中creA突变理论上也应减弱对蛋白酶产生的碳分解代谢物抑制作用，并应导致较高的蛋白酶产量。

在基因130(1993)241-245中，Drysdale等还曾报导，在构巢曲霉中creA基因及其二侧序列的缺失可导致致死性表型。因此推测，除了起蛋白质抑制剂的作用之外creA还有其它能维持生命的调节作用，没有creA微生物就不能够生长繁殖。

与这种一般性信念不同，本发明惊人地发现实际上有可能产生可生存的creA突变体，这种突变体甚至在有碳源存在时也能够表达广泛多种不同的蛋白水解酶。为了实现此目标，采用了如下的程序。

推测creA突变体可作为areA抑制基因突变面被分离出。areA基因是与广泛多种蛋白水解多肽转录激活有关的几种基因中的一种。areA基因由细胞内谷氨酰胺是否存在来控制，细胞内谷氨酰胺实际上代表一种氮依赖性控制。

在EP 97111 387.2中详述了一种areA无效突变体米曲霉NF2(CNCM 1882)，已表明这种曲霉突变体在含有0.2％大豆蛋白和50mM葡萄糖的极限基本培养基(见下面)上不能够生长，该专利在此被引入作为参考。同样的突变体在小麦面筋日本酒曲中也不能生长。

在areA无效突变体中，areA基因产物不再刺激蛋白酶编码基因的转录，导致此微生物表现出蛋白酶分泌减少。

此外，存在碳源如葡萄糖、果糖或蔗糖时，creA基因产物抑制蛋白酶编码基因的转录，最终导致areA无效突变体不能够利用蛋白作为氮源。因而，带有有效creA基因的areA无效突变体将不能够在这样的环境中生长和繁殖。

为了分离出creA突变体，可以在上述的培养基中(0.2％大豆蛋白，50mM葡萄糖)使米曲霉的areA无效突变体经受诱变剂的作用，例如紫外线照射、用EMS(乙基甲磺酸盐)、甲基甲磺酸盐，或者DMSO、亚硝基胍等处理。

理论上在至少某些能够生长在此培养基上的菌落中，其creA基因已发生了突变，以致它的基因产物不能行使其正常的作用，因此能够在这种培养基(见上面)中生长。

然后可以分析这种菌落存在的蛋白水解活性增加，通过测定在creA控制之下的一些酶的活性可实现此目的，这些酶包括例如醇脱氢酶、淀粉酶、乙酰胺酶等等。

例如，可以对生长在上述参照培养基上的菌落研究其对Fluor-乙酸盐的超敏感性。在野生型菌株活性的creA蛋白在有葡萄糖存在时可阻止诱导乙酸盐利用酶。在此条件下Fluor-乙酸盐不被代谢利用。然而对于creA突变体，其中的creA基因产物没有继承其固有的功能，因此这些乙酸盐利用酶都以基本上组成型方式被转录了。结果，Fluor-乙酸盐将被转变成为对此微生物有毒的化合物。可看见的结果是，在creA基因内具有突变，致使其基因产物基本无效的菌株将不能生长在含有Fluor-乙酸盐和碳源的培养基中。

根据它们在有碳源存在时对烯丙醇的超敏感性也可鉴别creA突变体。在野生型菌株，活性的creA蛋白正常情况下阻止诱导醇脱氢酶，这种酶将上述底物氧化成一种对此微生物有毒的化合物酮acreoline。在抑制性条件下即存在碳源时，烯丙醇正常地将不被氧化成毒性化合物，因为creA行使了它抑制醇脱氢酶转录的固有功能。但是，对于其CreA基因不再有功能的突变体，醇脱氢酶基本上组成型表达，即使存在碳源也使此霉菌因acreoline而中毒。

除了通过诱变剂和选择所需的性状对areA无数突变体进行上述随机诱变之外，还可以借助于基因工程技术以适合的方式修饰creA基因。

为此，可以将一个构建体掺入此霉菌的基因组，此物建体含有对creA被转录成为反义RNA的DNA序列。借助于例如在Maniatis，实验室手册，冷泉港，1992中所述的，本领域熟知的技术可以实现此目的。这种方案具有如下优点：以适当的方式通过使其转录取决于已知对给定系统诱发转录的特定分子是否存在，可控制反义RNA本身的作用。克隆给定DNA片段以及启动子的载体和诱导它们的方法是本领域熟知的，并可以在例如上述Maniatis的著作中找到。

进而可按这样一种方式修饰creA基因，以致使它的基因产物基本上或者甚至完全无效。通过将某些突变导入此DNA序列可实现此目的，就使相应的多肽丧失其通过例如结合于相应的调节DNA序列而行使其调节作用的能力。而且，还可以使creA基因部分或者甚至完全缺失，以致在存在碳源时完全不发生表达。

现已发现，尽管亲缘关系不同，但使用含有构巢曲霉的相应基因编码区的DNA序列作探针，并在杂交过程中采用低严格条件也可分离出米曲霉的creA基因。

由于采用了低严格条件，最初分离出了许多不同的菌落，以后通过增加条件的严格性将它们排除。

在分离出严格杂交菌落的DNA之后，可将完整的米曲霉creA基因置于4.3KB PstI-SphI片段，可将它克隆进入适当的载体如质粒或病毒载体并进行测序。在后面SEQ ID NO I中显示了所获得的这种序列。

在对此DNA序列的分析中，可发现一个潜在性开放读框，此读框可产生具有被鉴定为如下SEQ ID NO II氨基酸序列的多肽。

然后可将如此被鉴定的DNA序列用于将特定的变突导入creA基因。通过如下方法可实现此目的：例如在适当的载体如高拷贝数载体pUC或M13中克隆此片段；缺失部分编码序列或在读框内引入终止密码子；以及将修饰过的creA基因导入areA突变体如米曲霉NF2(CNCM1882)。然后可以在含有蛋白质(即0.2％大豆)和50mM葡萄糖的极限基本培养基(见下面)上，根据它们的生长能力选择creA-areA双重突变体，而areA突变体将不能生长。

在确定野生型背景中适当修饰的构建体被有效地转移时使用了一种标记如抗性基因，在分离出具有所需特性的creA突变体之后可以从霉菌的基因组删除这种抗性基因。用于克隆、将突变和/或缺失导入给定的基因、以及将DNA序列导入微生物的技术是本领域已知的，并且可以参考Maniatis等的同上著作。

下面的实施例将对本发明作进一步说明。

菌株和质粒

用于扩增creA基因的构巢曲霉G332(pabaA1，yA2，xprD1)是通过Dr.A.J.Clutterbuck从Glesgow基因保存中心获得。米曲霉TK3(af1R1，omA1)是从洛桑Nestle菌株收集研究中心获得。米曲霉NF1(PyrG1)是米曲霉TK3的尿苷营养缺陷型衍生株，已通过定向破坏使其中编码乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶的PyrG基因失活。米曲霉NF2(CNCM 1882)是areA被破坏的突变体，来源于如在EP 97111378.2中所描述的米曲霉NF1。

载体lambda Gem-12是从Promega获得，pUC19(yanisch-PerronC，Vieire，J.和Messing.J.改进的M13噬菌体克隆载体和宿主菌株：M13mp18和pUC19的核苷酸序列)是从美国新英格兰Biolabs公司获得。

培养基

基本培养基(MM)每升含有1.5g KH₂PO₄(Merck，Darmstadr，FRG)，0.5g MgSO₄·7H₂O(Merck，Darmstadt，FRG)，0.5g KCl(Merck)。为了选择突变体，对MM加入了50mM葡萄糖(Merck，Jar-mstadt，FRG)，0.2％大豆蛋白(蛋白质技术国际组织)和2％惰性琼脂。在含有0.08％脱氧胆酸钠(Fluka，Buchs，瑞士)和0.2％大豆蛋白作唯一碳源和氮源的MM上，或者在含有1％脱脂牛奶(Difco)和2％惰性琼脂(Difco)的MM上进行蛋白酶的培养板测定。

实施例1

分离creA突变体

为了分离出与蛋白水解活性产生有关的creA突变体，如在EP97111378.2中所述制造了areA无效突变体。进而紫外线照射108个米曲霉NF2(CNCM1882)的分生孢子，并种植在含有0.2％大豆蛋白，50mM葡萄糖和2％惰性琼脂(Difco)的极限基本培养基上。选择出孢子形成的四个集落，定名为NF14-NF17，发现它们在存在50mM葡糖糖时对15mM烯丙醇敏感，表明这四个突变体是creA突变体。而且显示在存在葡萄糖时NF14-NF17能分泌蛋白酶。

实施例2

分离creA基因

在低严格条件(55℃，5×SSC，1％SDS)下，以包含构巢曲霉creA基因编码区的1.3KB PCR产物筛选GEM 12中米曲霉TK3(同上述)的基因组文库。

繁殖总共100个阳性克隆，并通过增加温度至大约60℃在稍微增加严格度的条件下再次与此探针杂交。按下面分离出了三个最强杂交克隆。

从作为7.3KB Bam HI片段的Gem 12亚克隆米曲霉creA基因。通过DNA印迹分析表明其编码区定位在已亚克隆进入pUC19的4.3KBPstI-SphI片段上，产生了pNFF212，并对此片段进行了完全测序。在下面给出了米曲霉creA基因的核苷酸序列和所推断的氨基酸序列。对在推定的启动子区中适合CREA DNA-结合位点SYGRGG共有序列(Kulmburg等，1993)的基元序列下面加单线并以粗体字标示。对CREA蛋白(Dowzer等1989)中包含DNA-结合的C₂H₂锌指区的区域下面加双线并以粗体字标志。

-1120 CTGCAGTTCCAGTTTCTACCCCGTAAATCCCTATCAACTTAGTCCG CCCCACATTCTTTT  -1061

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1280 AACGTTTCTAGCCTGGTGCGGCTGCGAAACCCTTTCAATGTATAAAGTTTTGGGCTCAAA     1339

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1340 AAAAATTCTTGACTGTCATACGCGCTACGAAACGAATAGACTTTGTGCATTTACAGTGCG     1399

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1940 CGACATGCATGATACATGCGTACGTACATACACTAATAGTAGTCACAGACCAGTTCATCA     1999

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2120 ATTGTTCGTCACTCAGCTGTGGACGTGGCTCCAGTCAAGTTGTGAATTATGATAGGGTAT     2179

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2840 GGCGGAAGGTCTCACCGGCCAGGAGATATTAGAAGACGATGGAACGGGCGCGCTCGTCGT     2899

2900 CCCGCCGTCCCGCCCTGCTCGGCAATATCATCACCATACCTATATCTGTCTGTTCTATAT     2959

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3020 CTTCCGAACCCACGAACCACCGCGAACAGCCCGATGCCCTCTATGTCCGGGTGAGCGGTT     3079

3080 CAGCGACACCCCCGAACAGAAAGGATGGGATCGCATGC                           3117

实施例3

对creA基因的基因修饰：

在此DNA序列中，在位置+226-228和+229-231导入终止密码子，将编码二肽TyrLys的序列TACAAG改变成了TAGTAG(终止终止)，如在快速变换方案(Stratagene，Basel)中所描述的，使用寡核苷酸序列CTTCCCCGTCCA TAGTAGTGTCCCCTGTG和它的互补序列CACAGGGGACA CTACTATGGACGGGGAAG，通过定点诱变将此突变导入pNFF212。

这种突变将导致截去此DNA结合锌指功能区creA基因产物的N-末端。通过将此构建体导入A.oyrzae NF2(CNCM1882，EP97111378.2)，在含有0.2％大豆蛋白和50mM葡萄糖，以2％惰性琼脂固化的MM平板上培养此微生物时，可直接选择creA-areA双重突变体。

实施例4

对creA基因的修饰

进而可按如下方法从此霉菌基因组中删除creA基因。用EcoRI部分地消化pNFF212，并从琼脂糖凝胶中回收此线性分子。去磷酸化并连接于来自pNFF38(A.Doumas，Pvan den Broek，M.Affolter，M.Mornod(1998)对来自日本酒曲霉米曲霉的脯氨酰基二肽基肽酶基因(dppIV)的特征鉴定，应用与环境微生物学64，4809-4815)的1843bp构巢曲霉pyrG片段，产生了pNFF234。在pNFF234中，creA编码区被功能性构巢曲霉pyrG基因中断，截去了紧靠此DNA结合的锌指区下游的基因产物。

为了获得creA突变体，用BstXI消化pNFF234，并通过转化将它导入米曲霉NF1。在不含尿苷的MM上选择出原代转化体，并在有50mM葡萄糖存在时筛选它们对烯丙醇和Fluor-乙酸盐的超敏感性。然后通过DNA印迹分析或PCR测定敏感转化体是否存在所需的基因取代。

实施例5

对表达的测定

为了进一步证明creA基因中的突变，进行了如下几种测定。

1)淀粉酶测定：

使实施例1中获得的菌株生长在含有1％淀粉和50mM葡萄糖作碳源的极限基本培养基(同上述)上。在这些条件下，其中的淀粉酶被葡萄糖抑制的野生型菌株当用KI溶液染色时将不产生染色环。与此相反，creA突变体将产生染色环，因为淀粉酶的表达不再被葡萄糖抑制。

2)乙酰胺酶测定。

当生长在含有乙酰胺和葡萄糖作碳源的极限基本培养基(同上述)时，还可以测定菌株的乙酰胺酶活性。在这些条件下野生型菌株不产生乙酰胺酶活性，而creA突变体能产生。

3)透明环的产生

在含有1％脱脂牛奶和50mM葡萄糖的极限基本培养基培养板上(开始培养板显得混浊)，30℃二天之后，creA突变体表现出透明环，而野生型菌株不显示。

                               序列表

<110>Societé des Produits Nestlé

<120>creA-基因

<130>80050

<140>

<141>

<150>99 104 923.0

<151>1999-03-11

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>4238

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>1

ctgcagttcc agtttctacc ccgtaaatcc ctatcaactt agtccgcccc acattctttt 60

ttttttttcc tttttttttc gctcccggtc agagtgatag tgggatttat tacacaccgt 120

gcgtggtcga agaacgacac ggaagaagcc ccggaagacg ccttctctag gcaacaaatg 180

attgtactct tatgatactc aatacggtag aaaatagaga attgagatac gaaagctgac 240

tcatcagaac agaataaggg gaatttttga ttagcaaata acaataataa ttatacaaaa 300

aaacaaataa aaaaatttag gggactcccc acccgctgta atcctgggtg tatctcaaag 360

caaagcaggc gatctggggg gagcacgttc tttttttttc ttttctcttt tttctatttt 420

tttttttttt tttattttag gtctatgcct ttttttttct tttccttttt tttttttttt 480

tttgcccccc gataattctc cccacacata ggacatactt tttttttttt tccttccact 540

cccttcaagg tctccgattc cgataacccc ctctaccagt tcgccctgcc tttttctctc 600

ccctcccccg aagctccatt tctctcttct tcccctccat tcctcattct tcctcttccg 660

tatttccttt atatgctcct atccccagac catttctcca gatttctctc tctttcccct 720

ctctcccttt cgacaaattg ttgcttgact acatccatct cgggttacct acttacagta 780

ccaattccgg atatactcta tcccacccat caccacattc cataacagcg ccctttcatt 840

gggaaagtca ctcttccttg aaattggtta catcgcggac catcgtacct tctttaatcg 900

caaggcttgt gatactcttg cggtgctcgt tcatcaacta gtactttgcc aagagcaagt 960

ctccgtcttg tcgggtggtg atcgactctc cccgatttac ctacccctgt tgcgacgaat 1020

cctgattcgc ctcggctcgt cagcccttcc gagcttccct taagtacagg cttcgtcccc 1080

tctttagctg cactcctcgg tgctaggtta ggacgagtca catgccacca ccggcttctt 1140

cagtggattt caccaatctg ctgaaccctc agaataacga gactggttct gcaccttcca 1200

cgccagtgga tagctccaag gctccctcta ccccgtccag tactcagtcc aactctacca 1260

tggcctcgtc tgttagctta ctaccgcccc tcatgaaggg tgctcgtccc gcaacggaag 1320

aagcgcgcca ggatcttccc cgtccataca agtgtcccct gtgtgatcgc gccttccatc 1380

gtttggagca ccagaccaga catattcgca cacatacggg tgaaaagcca cacgcttgcc 1440

agttcccggg ctgcacaaaa cgctttagtc gctctgacga gctgacacgc cactcaagaa 1500

ttcacaacaa ccccaactcc aggcggagta acaaggcaca tctggccgct gccgctgccg 1560

ctgccgctgc cggacaagag aatgcaatgg taaatgtgac caacgcgggc tcgttgatgc 1620

ccccgcccac aaagcctatg acccgctctg cgcctgtctc tcaggttgga tctccggatg 1680

tctcccctcc gcactccttc tcgaactatg ccggtcacat gcgttccaat ctgggaccat 1740

atgctcgcaa caccgagcgg gcgtcctcgg gaatggatat caatctactt gccaccgctg 1800

catctcaggt tgagcgtgat gaacaacatt ttgggttcca cgctggtcca cgtaatcacc 1860

atttgttcgc ctcgcgtcac cacaccggtc gtggcctgcc ttccctttca gcgtacgcca 1920

tctcgcacag catgagccgt tctcactttc acgaggacga ggatggttac actcatcgcg 1980

tcaagcgctc aaggcctaac tcaccaaact cgaccgctcc gtcctcaccg actttctctc 2040

acgactctct ttccccaacg ccagaccaca ctccgttggc aacccctgct cattcgccac 2100

gcttgaggtc attgggatct agcgaactcc accttccttc gattcgccat ctgtccctcc 2160

atcacacccc tgcccttgct ccaatggagc cccagccgga aggccccaac tattacagtc 2220

ccagccagtc tcatggtccc acaatcagcg atatcatgtc cagacccgac ggaacacagc 2280

gtaaactgcc cgttccacag gttcccaagg tcgcggtgca agatatgctg aaccccagcg 2340

ctgggttttc gtcggtttcc tcatcgacga ataactctgt cgcaggaaat gatttggcag 2400

aacgtttcta gcctggtgcg gctgcgaaac cctttcaatg tataaagttt tgggctcaaa 2460

aaaaattctt gactgtcata cgcgctacga aacgaataga ctttgtgcat ttacagtgcg 2520

tggttcatgg gcatccttgg tgtcggctgg ctttctttgc ttactttgtt cgagtatact 2580

tttgcgaggc gtccatagtg atagacgggt gggatattct tgtggctttt tccgtgcttg 2640

ttcgattctc ccctttcgct ctccttgaaa aatacctttc ttatcctata accatttgtt 2700

tcattatccc aatgggaatt ggctctacag ctcttattca ttttgtctac tcctctcctg 2760

aggcccagtc ccctgataat tccgggctct accatataca tttcatttcg actatgtcag 2820

tttccgcttc gatttagacc tcgagcagga cgagagggtt ccgaaagaaa atacaaacaa 2880

aaattatagt aatctgcgtt tactttggca taatacagta gtcattagtt gaggtaggca 2940

taatctggat gtctaaccat cacttgccct aacctcctac catctgctgc tagtatttgt 3000

cttacccgaa acccaattca acgagataga tggattgacg aataacaatt tgttgtccag 3060

cgacatgcat gatacatgcg tacgtacata cactaatagt agtcacagac cagttcatca 3120

catcctggtc tcgggtattc agatacggaa atgcgtaaga ttggaagggt ctaagaaaaa 3180

gcaaagaaaa aggaaaagtt aacactggct ggcgctctct ttccatctct gatcaatgtt 3240

attgttcgtc actcagctgt ggacgtggct ccagtcaagt tgtgaattat gatagggtat 3300

tgttgacttg acaagttgat cttgatggaa tcaaatcttc tccccgccag attctgacgc 3360

ttgaggctct cggatcgaat gaacaacttt tcgcaccaca tcaaccggtt gccgcgtgat 3420

gctggagaca aaccgaccca aacgtcacgg tcacacggag gatacgtttg ctagagccag 3480

ctgatacccc aagagacaag aaggtaaagg tcgcaaaaat cttttcaata agatggcatc 3540

ttccccccac caacccttaa ccattctcct ttcaagctgt gttgccccgc tttggtgcat 3600

gggcttgggt agtgcggtcg caaaactact aatttaatga ccgactgctg ctgctttttc 3660

actcgccgct cacggactaa gcatgtggga acaggatcgc cccgtcacta tttcagatcg 3720

tgtcgtatca aggtgttcgc ccggtgctgc tggcacgaac gccggccatc caagatcatt 3780

gttctcattc aaaccgggcg gcttacgtct agccgcggac gtaagcacga agagtgtgtg 3840

tagtggtggg agtgaagccg ttgccgaaac catgccgtcc tccacggccg tcccgtcgtt 3900

atcaagcgac gctgcctccg cttcatcctc atcagcgggt gtatctctgg agacaagatg 3960

ggcggaaggt ctcaccggcc aggagatatt agaagacgat ggaacgggcg cgctcgtcgt 4020

cccgccgtcc cgccctgctc ggcaatatca tcaccatacc tatatctgtc tgttctatat 4080

cttagattgt caccacacct tcgacgatgt cgagcaatgg aagactcacg ttctgagcca 4140

cttccgaacc cacgaaccac cgcgaacagc ccgatgccct ctatgtccgg gtgagcggtt 4200

cagcgacacc cccgaacaga aaggatggga tcgcatgc                         4238

<210>2

<211>431

<212>PRT

<213>米曲霉

<400>2

Met Pro Pro Pro Ala Ser Ser Val Asp Phe Thr Asn Leu Leu Asn Pro

  1               5                  10                  15

Gln Asn Asn Glu Thr Gly Ser Ala Pro Ser Thr Pro Val Asp Ser Ser

             20                  25                  30

Lys Ala Pro Ser Thr Pro Ser Ser Thr Gln Ser Asn Ser Thr Met Ala

         35                  40                  45

Ser Ser Val Ser Leu Leu Pro Pro Leu Met Lys Gly Ala Arg Pro Ala

     50                  55                  60

Thr Glu Glu Ala Arg Gln Asp Leu Pro Arg Pro Tyr Lys Cys Pro Leu

 65                  70                  75                  80

Cys Asp Arg Ala Phe His Arg Leu Glu His Gln Thr Arg His Ile Arg

                 85                  90                  95

Thr His Thr Gly Glu Lys Pro His Ala Cys Gln Phe Pro Gly Cys Thr

            100                 105                 110

Lys Arg Phe Ser Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Ser Arg Ile His

        115                 120                 125

Asn Asn Pro Asn Ser Arg Arg Ser Asn Lys Ala His Leu Ala Ala Ala

    130                 135                 140

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gln Glu Asn Ala Met Val Asn

145                 150                 155                 160

Val Thr Asn Ala Gly Ser Leu Met Pro Pro Pro Thr Lys Pro Met Thr

                165                 170                 175

Arg Ser Ala Pro Val Ser Gln Val Gly Ser Pro Asp Val Ser Pro Pro

            180                 185                 190

His Ser Phe Ser Asn Tyr Ala Gly His Met Arg Ser Asn Leu Gly Pro

        195                 200                 205

Tyr Ala Arg Asn Thr Glu Arg Ala Ser Ser Gly Met Asp Ile Asn Leu

    210                 215                 220

Leu Ala Thr Ala Ala Ser Gln Val Glu Arg Asp Glu Gln His Phe Gly

225                 230                 235                 240

Phe His Ala Gly Pro Arg Asn His His Leu Phe Ala Ser Arg His His

                245                 250                 255

Thr Gly Arg Gly Leu Pro Ser Leu Ser Ala Tyr Ala Ile Ser His Ser

            260                 265                 270

Met Ser Arg Ser His Phe His Glu Asp Glu Asp Gly Tyr Thr His Arg

        275                 280                 285

Val Lys Arg Ser Arg Pro Asn Ser Pro Asn Ser Thr Ala Pro Ser Ser

    290                 295                 300

Pro Thr Phe Ser His Asp Ser Leu Ser Pro Thr Pro Asp His Thr Pro

305                 310                 315                 320

Leu Ala Thr Pro Ala His Ser Pro Arg Leu Arg Ser Leu Gly Ser Ser

                325                 330                 335

Glu Leu His Leu Pro Ser Ile Arg His Leu Ser Leu His His Thr Pro

            340                 345                 350

Ala Leu Ala Pro Met Glu Pro Gln Pro Glu Gly Pro Asn Tyr Tyr Ser

        355                 360                 365

Pro Ser Gln Ser His Gly Pro Thr Ile Ser Asp Ile Met Ser Arg Pro

    370                 375                 380

Asp Gly Thr Gln Arg Lys Leu Pro Val Pro Gln Val Pro Lys Val Ala

385                 390                 395                 400

Val Gln Asp Met Leu Asn Pro Ser Ala Gly Phe Ser Ser Val Ser Ser

                405                 410                 415

Ser Thr Asn Asn Ser Val Ala Gly Asn Asp Leu Ala Glu Arg Phe

            420                 425                 430

Claims (7)

1.一种属于曲霉属或青霉属的日本酒曲霉，其中它的蛋白水解活性不被碳抑制，并且creA基因被突变使得其基因产物无功能，其中areA基因过度表达。

2.权利要求1的日本酒曲霉，其中的creA基因不被转录为能够被翻译成功能性多肽的mRNA。

3.权利要求1的日本酒曲霉，其中已使其creA基因缺失。

4.权利要求1的日本酒曲霉，它是NF14，即米曲霉I-2165。

5.一种产生蛋白水解酶的方法，包括在霉菌表达蛋白水解酶的条件下在存在碳源的适当生长培养基中培养权利要求1-4的任一项的日本酒曲霉，并任选地以浓缩物形式分离出此酶。

6.权利要求1-4的任一项的日本酒曲霉用于水解含蛋白质原料的用途。

7.权利要求6的用途，与氨酰基脯氨酸二肽酶和/或提供氨酰基脯氨酸二肽酶活性的微生物组合。

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