CN118079002A

CN118079002A - 抑制Rap1a基因表达的试剂在制备预防应激性情绪损伤的药物中的应用

Info

Publication number: CN118079002A
Application number: CN202410239916.6A
Authority: CN
Inventors: 钱令嘉; 谢方; 韦爱君; 赵云; 王雪; 孙兆炜
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2024-03-04
Filing date: 2024-03-04
Publication date: 2024-05-28

Abstract

本发明公开了抑制Rap1a基因表达的试剂在制备预防应激性情绪损伤的药物中的应用，涉及生物技术和医药领域。本发明成功构建了敲低Rap1a基因的腺相关病毒AAV‑shRap1a，通过小鼠实验证明，敲低Rap1a可以下调神经炎症因子的表达，进而可以通过减弱神经炎症来改善应激诱导的情绪损伤，从而起到对抗和治疗应激性情绪损伤的作用。本发明证实，抑制Rap1a基因表达的试剂可以用于制备治疗应激性情绪损伤的药物，同时本发明也为临床治疗应激性情绪损伤提供了理论依据。

Description

抑制Rap1a基因表达的试剂在制备预防应激性情绪损伤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医药领域，特别是涉及抑制Rap1a基因表达的试剂在制备预防应激性情绪损伤的药物中的应用。

背景技术

随着现代社会生活节奏的加快和社会竞争的加剧，多数人都处在不同程度的应激负荷之下。越来越多的研究显示，长期处于应激状态的人群，其抑郁的患病率明显高于普通人群。流行病学调查显示，应激是诱发情绪及认知功能异常的显著促发因素，情绪异常是最常见的严重精神疾病；是全球近16％人口的最常见的残疾原因。高水平应激激素可导致多个脑区出现结构和功能改变，包括海马体积缩小、椎体细胞树突棘数量减少、突触可塑性异常、齿状回神经发生受阻、前额叶皮层神经环路重塑、自发活动降低等，同时，应激也会损伤大脑的免疫系统，引起神经炎症性反应。但临床上针对应激激素为靶点的药物尚不能够有效地预防和治疗应激相关的情绪功能异常。

身体对压力源的反应取决于压力源的性质、强度和持续时间，形成了一条倒U型连续量化效应曲线。急性应激导致身体产生代偿性反应，如警觉性、敏感度增加；随着应激持续时间的增加，身体系统协调行动，维持体内平衡，从而主动适应应激源。进一步应激的累积效应会导致体内动态平衡的紊乱，导致病理生理损伤。这表明机体的功能在应激过程中发生了从适应到损伤的变化。

基因治疗是指将特定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。近些年，基因疗法在生物治疗领域取得了重大突破，作为递送基因疗法的有力工具，腺相关病毒(AAV)具有免疫原性地、安全性高、扩散性强等特点备受关注。以腺相关病毒为载体的药物可应用于包括恶性肿瘤在内的多种疾病的治疗。截止到目前，在ClinicalTrial.gov上已有164项干预临床试验中使用重组AAV载体。

Rap1a是Ras家族相关蛋白(Ras-related protein)，是一种小分子G蛋白，这些蛋白质的活性形式以瞬时GTP结合状态存在，介导细胞的一系列信号传导。Rap1a广泛分布于各种组织细胞中，与细胞的增殖、极性的形成、分化、粘附、血管重塑等多种生物学功能密切相关。目前还尚未见通过调控Rap1a基因来改善应激性情绪损伤的报道。

发明内容

本发明的目的是提供抑制Rap1a基因表达的试剂在制备预防应激性情绪损伤的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明证实，抑制Rap1a基因表达的试剂可以用于制备治疗应激性情绪损伤的药物，同时本发明也为临床治疗应激性情绪损伤提供了理论依据。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供抑制Rap1a基因表达的试剂在制备预防应激性情绪损伤的药物中的应用。

进一步地，所述试剂为敲低Rap1a基因的生物材料。

进一步地，所述生物材料为腺病毒。

进一步地，所述腺病毒的shRNA靶序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种预防应激性情绪损伤的药物，包括抑制Rap1a基因表达的试剂。

进一步地，所述试剂为敲低Rap1a基因的生物材料。

进一步地，所述生物材料为腺病毒。

进一步地，所述腺病毒的shRNA靶序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

本发明公开了以下技术效果：

本发明成功构建了敲低Rap1a基因的腺相关病毒AAV-shRap1a，通过小鼠实验证明，敲低Rap1a，可以下调神经炎症因子的表达，进而可以通过减弱神经炎症来改善应激诱导的情绪损伤，从而起到对抗和治疗应激性情绪损伤的作用。

本发明证实，抑制Rap1a基因表达的试剂可以用于制备治疗应激性情绪损伤的药物，同时本发明也为临床治疗应激性情绪损伤提供了理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为骨架载体的图谱；

图2为含干扰片段的质粒图谱；

图3为AAV-shRap1a注射和CUMS干预的实验流程图；

图4为检测各组的病毒基因表达与脑内感染的结果；其中，A为病毒基因表达量检测结果；B为Westernblotting检测结果；

图5为实时荧光定量PCR法分别检测各组小鼠海马区小胶质细胞M1型极化标志物CD80、CD86基因表达水平的结果；

图6为检测各组小鼠海马区炎症因子的表达水平的结果；其中，A为实时荧光定量PCR检测结果；B为ELISA试剂盒检测结果；

图7为使用糖水偏好实验、强迫游泳实验、悬尾实验、旷场实验、高架十字迷宫实验及水迷宫实验对各组小鼠的情绪功能进行评估的结果；其中，A-F分别为糖水偏好实验、强迫游泳实验、悬尾实验、旷场实验、高架十字迷宫实验及水迷宫实验的结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1构建敲低Rap1a的腺相关病毒载体AAV-shRap1a

1.病毒载体构建

合成shRNA1(Rap1a)，然后退火合成双链，再通过同源重组(或者T4 DNA连接)的方法组装，将双链片段构建入骨架载体，转化E.coli Stbl3感受态细胞，用菌落PCR对转化子进行筛选，阳性克隆送测序(测序引物为载体上U6通用引物)，经序列比对确定阳性克隆，得到病毒载体。

其中，本实施例使用的骨架载体的图谱如图1所示，含干扰片段的质粒图谱和信息分别如图2和表1所示。

表1质粒信息

shRNA1(Rap1a)：GCAGGAACCGAGCAATTTACA(SEQ ID NO.1)。

实施例2腺相关病毒包装

1.准备质粒

将pHelper(携带腺病毒来源的基因)、pAAV-RC(携带AAV复制和衣壳基因)质粒和实施例1构建得到的病毒载体进行大量抽提，备用。

2.AAV-293细胞培养

2.1AAV-293细胞复苏

1)预热培养基

2)从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。用70％酒精擦拭消毒后，移至超净工作台。

3)吸出细胞悬液加入3mL培养基中，再加入5mL培养基稀释，轻柔吹散。

4)1000rpm，3min离心收集细胞。

5)用培养基重悬细胞接种。

2.2AAV-293细胞传代(10cm皿为例)

1)弃去旧培养液，加入10mL灭菌PBS，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS。

2)加入1mL胰酶消化液，消化到细胞变圆开始脱落。

3)加入2mL完全培养基终止消化，并将皿底细胞吹打成单细胞。

4)按需要离心重悬计数接种，或混匀细胞直接分到新的培养瓶中，继续培养。

2.3AAV-293细胞冻存

1)取培养2天生长旺盛的细胞，根据2.2的传代步骤将细胞消化并吹打成单细胞。

2)1000rpm，3min离心收集细胞。

3)加入PBS重悬细胞，计数。

4)1000rpm，3min离心收集细胞。

5)用冻存培养基再悬浮细胞至2×10⁶个/mL，然后分装细胞悬液到2mL冷冻管，1mL/管。

6)将小管置于程序降温盒然后将盒子放入-80℃冷冻过夜，第二天转移冻存细胞的小管到液氮中长期保存。

3.细胞转染

1)接种AAV-293细胞于10cm皿，48h后用于转染，转染时汇合度达到70～80％。

2)转染前1h取出细胞培养板，去除原有细胞培养基，加入10mL的Opti-MEM培养基。

3)制备转染试剂和质粒的复合物

a.将待转染的病毒载体质粒32μg(pHelper：pAAV-RC：实施例1构建得到的病毒载体＝1：1：1)溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μL，轻轻混匀，静置5min。

b.将转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μL，轻轻混匀，静置5min。

c.将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。

4)取出细胞皿，将上面配好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养板中。

5)6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10mL新鲜完全培养基培养。

4.病毒收获及纯化

1)转染60h后，使用细胞刮将细胞刮下，并收集到离心管。

2)1500g 4℃离心5min，将细胞沉淀重悬在9mL的lysis buffer中，将培养液收集至500mL瓶中。

3)取细胞裂解液置于液氮中冷冻3min，37℃水浴，反复冻融3-4次。

4)加入250U的benzonase，混匀后37℃孵育1h。

5)加入NaCl至终浓度为150mM，混匀后37℃孵育30min。

6)2500g室温离心10min，取上清弃去沉淀。

7)将离心后的上清倒入步骤2)中收集的上清中，加入PEG8000和NaCl至终浓度分别为8％和0.5M，4℃过夜。

8)12000rpm，4℃离心1.5h，弃掉上清，沉淀用10mLPBS重悬。

9)将重悬后的病毒原液加入到装有碘克沙醇的超速离心管中，(碘克沙醇的浓度分别为15％、25％、40％、60％)63000rpm，8℃离心2h。

10)用10mL注射器抽出40％层样品装入透析袋中，4℃透析，16h换透析液，每次使用2L缓冲液。

11)收集透析后的样品AAV-shRap1a，使用超滤管进行浓缩。

5.滴度测定

1)准备标准品：用质粒标准品，计算标准品的浓度，稀释至1E+8个/μL，梯度稀释，直至1E+3个/μL，共6个梯度。

2)准备样品：碱裂解：取5μL浓缩后的病毒样品，加入NaOH至终浓度为1M，55℃水浴30min后加入HCL中和，加入纯水或1×PBS稀释10倍。

3)在每个反应孔中加入反应液18μL，然后加入2μL的模板；

4)通过定量PCR检测基因组中AAV载体的基因组拷贝数来测定AAV-shRap1a的病毒滴度。本实施例测得AAV-shRap1a的病毒滴度为2×10¹²vectorgenome(V.G.)/mL。

实施例3

本发明以慢性不可预见性温和刺激(CUMS)应激模型为例，但AAV-shRap1a的应用不仅限于该应激模型，还包括其他应激模型导致的情绪损伤的治疗。

1.实验分组和方法

本发明通过脑立体定位注射技术分别将AAV-shRap1a(1.3μL)和AAV-shRap1a-sc(1μL，该病毒为空白对照，无敲低Rap1a基因作用)病毒注射入小鼠海马中，并分别进行CUMS干预和正常饲养，分别记为Ctrl-sc(AAV-shRap1a-sc+正常饲养)、Ctrl-shRap1a(AAV-shRap1a+正常饲养)、CUMS-sc(AAV-shRap1a-sc+CUMS干预)和CUMS-shRap1a(AAV-shRap1a+CUMS干预)四组。其中AAV-shRap1a注射和CUMS干预的实验流程图如图3所示。造模6周后进行病毒效果验证，结果见图4。

CUMS干预的方法：①夜间照明12h，②避光12h，③潮湿垫料12h，④去除垫料12h，⑤禁食12h，⑥禁水12h，⑦冰泳3min(4℃)，⑧束缚6h，⑨笼具摇晃(70r/min)2h，⑩足底电击5min(0.2mA)。其中束缚采用自制小鼠束缚笼具，为50mL的圆柱形离心管，束缚笼具上开小孔以方便小鼠呼吸。应激模式是随机生成的，以模拟日常生活中的随机应激模式。每天挑选使用两种不同的应激源组合，相同的应激模式3天内不重复使用。除了定期清理笼子外，对照组动物不受干扰。

2.检测AAV-shRap1a颅内注射治疗对应激性情绪损伤的改善作用

为了检测大鼠海马小胶质细胞M1型极化标志物水平，使用实时荧光定量PCR法分别检测4组小鼠海马区小胶质细胞M1型极化标志物CD80、CD86基因表达水平的变化，结果见图5，结果显示，慢性应激小鼠海马小胶质细胞M1型极化标志物CD80、CD86基因表达水平明显升高，应激条件下敲低Rap1a可下调M1型极化标志物CD80、CD86基因表达水平。

用实时荧光定量PCR法分别检测4组小鼠海马区炎症因子的基因表达水平，用ELISA试剂盒来检测小鼠海马区IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌情况，结果见图6，结果显示，慢性应激小鼠海马炎症因子基因表达水平及分泌水平明显升高，敲低Rap1a可下调应激小鼠海马炎症因子的基因及分泌水平。

使用行为学实验：糖水偏好实验、强迫游泳实验、悬尾实验、旷场实验、高架十字迷宫实验及水迷宫实验，对四组小鼠的情绪功能进行评估，结果见图7。糖水偏好实验结果提示：应激小鼠糖水偏爱率下降，敲低Rap1a可改善应激小鼠的糖水偏好率；强迫游泳实验提示：应激小鼠强迫游泳不动时间延长，敲低Rap1a可减少应激小鼠的不动时间；悬尾实验结果提示：应激小鼠悬尾不动时间延长，敲低Rap1a可减少应激小鼠的不动时间；旷场实验结果提示：应激小鼠旷场的运动总距离明显下降，敲低Rap1a可延长应激小鼠再旷场的运动总距离；高架十字迷宫实验结果提示：应激小鼠进入开放臂的时间及距离明显下降，敲低Rap1a可增加应激小鼠进入开放臂的时间及距离；水迷宫实验结果提示：应激小鼠穿越平台次数明显下降及寻台潜伏期延长，敲低Rap1a可改善小鼠的穿越平台次数及寻台潜伏期。

综上所述，本实施例通过小鼠实验，证明敲低Rap1a可改善应激小鼠的情绪损伤及学习记忆功能。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.抑制Rap1a基因表达的试剂在制备预防应激性情绪损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为敲低Rap1a基因的生物材料。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物材料为腺病毒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述腺病毒的shRNA靶序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种预防应激性情绪损伤的药物，其特征在于，包括抑制Rap1a基因表达的试剂。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述试剂为敲低Rap1a基因的生物材料。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述生物材料为腺病毒。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述腺病毒的shRNA靶序列如SEQ ID NO.1所示。

9.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。