CN118067908B - 一种用于非靶向代谢组学研究的靶向数据分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血清样本分析技术领域，具体提供了一种用于非靶向代谢组学研究的靶向数据分析方法，包括如下步骤：1.样本衍生化处理；2.数据采集；3.构建靶向数据分析表；4.从非靶向数据中提取靶向数据进行分析。本发明通过衍生化处理样本，生成具有规律的碎片离子，具有提高目标化合物的稳定性、提高离子化效率和质谱响应强度的有益效果。
Description
技术领域
本发明提供一种用于非靶向代谢组学研究的靶向数据分析方法，涉及血清样本分析技术领域。
背景技术
代谢组学是研究生物系统中所有代谢产物变化的一门学科，按照实验目的不同，分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学。靶向代谢组学是对目前已知的化合物进行分析，通过使用选择反应离子监测或多反应离子监测对微量代谢物准确定量。非靶向代谢组学通过对生物样本进行无偏向性地检测，检测覆盖面大于靶向代谢组学。由于生物样本通常具有复杂的基质，产生离子抑制效应会影响一些代谢物的电离，导致质谱响应低，影响代谢物检出，代谢物定量准确性较低。
近期新发展出一种拟靶向代谢组学分析方法，该方法通过使用两台质谱仪分别进行离子对获取和离子对扫描，保证检测覆盖面和定量准确性，完成该分析需要两台不同功能的质谱仪，方法编辑过程涉及分离方法转换、离子对通道信息整理等细节，不利于非专业领域人员操作。
发明内容
本发明提供一种用于非靶向代谢组学研究的靶向数据分析方法，解决了现有技术中质谱响应低、代谢物定量准确性低，拟靶向代谢组学分析方法操作复杂的技术问题。
本发明是这样实现的，包括如下步骤：
（1）样本处理
生物样本去除蛋白后，进行衍生化处理；
（2）数据采集
使用液质联用仪，通过数据非依赖型扫描模式进行数据采集，得到原始数据；
（3）构建靶向数据分析表
总结生物样本中代谢物类型及其对应的质谱图特征，所述质谱图特征包括特征中性丢失和特征碎片离子信息中的一种，参考数据库脂肪酸类化合物信息，获得生物体中存在的脂肪酸名称，根据所述质谱图特征，计算样本衍生化产物的母离子和子离子的质荷比，据此建立靶向数据分析列表。
（4）提取靶向数据进行分析
基于步骤（3）所述靶向数据分析列表中母离子和子离子的质荷比，对步骤（2）采集到的原始数据进行靶向数据提取，获取所述靶向数据分析列表中对应化合物的保留时间和峰面积信息，用于后续统计分析。
作为进一步地优选，步骤（1）中，生物样本去除蛋白是使用有机溶剂对生物样本进行蛋白沉淀，沉淀后高速离心，取上清，氮气吹干，所述衍生化处理是通过加入衍生化试剂和催化剂进行反应，衍生化后高速离心，取上清，氮气吹干。
作为进一步地优选，所述有机溶剂是甲醇。
作为进一步地优选，所述衍生化试剂是N-(3-氨基丙基)哌啶和4-氨基-1-苄基哌啶中的一种。
作为进一步地优选，所述催化剂是HATU和TEA。
作为进一步地优选，步骤（2）中，离心条件为离心力12000g，离心时间15min。
作为进一步地优选，步骤（2）中，液质联用仪的色谱参数如下：色谱柱为HypersilGOLD色谱柱，色谱柱50×2.1mm，1.9μm，柱温为40℃，流动相A为包含0.1%（v/v）甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.4mL/min，进样量为5μL；洗脱程序为：0-8分钟，8-20%B；8-15分钟，20-45%B；15-20分钟，45-85%B；20-25分钟，85-90%B；25-30分钟，90-95%B；30-35分钟，90%B，35-36分钟90-8%B；36-41分钟，8%B；
质谱参数如下：电离模式为ESI+，质量轴范围为m/z100-1500，毛细管电压为3.5kV，鞘气压力为50arb，辅助气压力为15arb，吹扫气压力为2arb，毛细管温度为300℃；全扫描分辨率为35000，串联质谱采集分辨率为17500，采集模式为DIA，隔离窗口为m/z20，NCE为25、35、45。
本发明将生物血清样品去除蛋白，对小分子化合物进行衍生化处理，衍生化技术使用具有特定官能团的衍生化试剂与目标化合物进行反应。衍生化后的产物在质谱分析时可生成具有规律的碎片离子。总结生物样本衍生化产物的质谱信息，例如特征中性丢失或特征碎片离子等质谱信息，并通过数据库检索获得目标化合物信息，然后根据质谱信息构建包含目标化合物母离子和子离子质荷比的靶向数据分析列表。采集模式选用DIA，可以在一次质谱分析中同时获得样本中所有物质的一级质谱（母离子）和串联质谱（子离子）信息，整合连续隔离窗口，可以减少同一时间共流出的离子数量，保证所采集的串联质谱图的质量，减少共流出化合物的干扰，采集的数据有助于后期靶向数据分析。根据构建的目标化合物列表，进行后续的靶向数据分析。本发明操作简便，数据兼容性好，适用性强，具有提高目标化合物的稳定性、提高离子化效率和质谱响应强度、简化拟靶向代谢组学分析方法的有益效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1和实施例2的流程示意图；
图2和图3分别是实施例1采集的辛酸和棕榈酸的串联质谱图；
图4和图5分别是实施例2采集的辛酸和棕榈酸的串联质谱图；
图6是实施例1的血清样本脂肪酸分布图；
图7是实施例2的血清样本脂肪酸分布图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围
实施例1
参阅图1，一种用于非靶向代谢组学研究的靶向数据分析方法，具体包括如下步骤：
（1）样本前处理：混合等体积的来自不同组别的血清样本制成质控（QC）血清样本，使用QC样本进行方法建立。血清样本中加入三倍体积量甲醇进行蛋白沉淀，离心（12000g，15分钟），上清氮气吹干，加入10μLN-(3-氨基丙基)哌啶作为衍生化试剂（1μL/mL），10μL 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU，10mg/mL）和10μL三乙胺（TEA，30μL/mL）作为催化剂，37℃环境下反应10分钟，取上清，吹干，乙腈复溶，离心（12000g，15分钟），上清供液质联用检测。
（2）数据采集：使用UHPLC-Q-Orbitrap质谱在DIA模式下进行样本检测。色谱参数如下：色谱柱为Hypersil GOLD色谱柱（50×2.1mm，1.9μm），柱温为40℃，流动相A为包含0.1%（v/v）甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.4mL/min，进样量为5μL；洗脱程序为：0-8分钟，8-20%B；8-15分钟，20-45%B；15-20分钟，45-85%B；20-25分钟，85-90%B；25-30分钟，90-95%B；30-35分钟，90%B，35-36分钟90-8%B；36-41分钟，8%B。质谱参数如下：采集模式为ESI+，质量轴范围为m/z100-1500，毛细管电压为3.5kV，鞘气压力为50arb，辅助气压力为15arb，吹扫气压力为2arb，毛细管温度为300℃. 全扫描分辨率为35000，串联质谱采集分辨率为17500，采集模式为DIA，隔离窗口为m/z20，NCE为25、35、45，DIA方法的包含列表参见表1。
表1.DIA方法的包含列表
| 110.300023 |
| 130.309118 |
| 150.318213 |
| 170.327308 |
| 190.336403 |
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| 290.381878 |
| 310.390973 |
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| 370.418258 |
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| 410.436448 |
| 430.445543 |
| 450.454638 |
| 470.463733 |
| 490.472828 |
| 510.481923 |
| 530.491018 |
| 550.500113 |
| 570.509208 |
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| 1450.909387 |
| 1470.918482 |
| 1490.927577 |
参阅图2和图3，步骤（2）得到串联质谱图，以辛酸和棕榈酸为代表进行展示，选用辛酸和棕榈酸作为代表，目的是展示衍生化之后的产物有规律性的特征，辛酸和棕榈酸是碳链长度不同的脂肪酸，为了说明质谱特征不是偶然现象，是普遍存在的。
（3）构建靶向数据分析列表，经N-(3-氨基丙基)哌啶衍生化后，得到的衍生化产物在串联质谱检测时，可以得到固定分子量为85.09Da的中性丢失。根据固定分子量为85.09Da的中性丢失这一质谱特征，计算得衍生化产物的母离子和子离子质荷比。通过LIPID MAPS数据库检索获得理论存在的所有脂肪酸名称（Molecule name）及分子式，计算得衍生化产物全部母离子和子离子质荷比，构建脂肪酸类物质的靶向数据分析列表，靶向数据分析列表参见表2。例如C2:0的分子式为C2H4O2，N-(3-氨基丙基)哌啶的分子式为C8H18N2，二者发生反应后脱水生成C10H20N2O，可以计算质子化的衍生化产物质荷比为185.1648（Precursor m/z），根据质谱分析结果可知该离子会在质谱分析时产生分子量为85.09Da的中性丢失，其分子式为C5H11N，所以可以计算其碎片离子（C5H9NO）的质荷比为100.0757（Product m/z）。
表2 使用N-(3-氨基丙基)哌啶作为衍生化试剂的靶向数据分析列表
Skyline软件可识别表2的列表形式。
（4）提取靶向数据信息。将表2信息导入Skyline软件进行靶向数据提取，Skyline软件根据靶向数据分析列表中记录的母离子和子离子质荷比信息，参阅图6，从步骤（2）获得样本原始数据中提取符合要求的化合物，然后获取对应化合物的保留时间、峰面积等信息，用于后续统计分析。
实施例2
一种用于非靶向代谢组学研究的靶向数据分析方法，参阅图1，具体包括如下步骤：
（1）样本前处理：混合等体积的来自不同组别的血清样本制成质控（QC）血清样本，使用QC样本进行方法建立。血清样本中加入三倍体积量甲醇进行蛋白沉淀，离心（12000g，15分钟），上清氮气吹干，依次加入10μL4-氨基-1-苄基哌啶（1μL/mL），10μL HATU（10mg/mL）和10μL TEA（30μL/mL），37℃下反应10分钟，上清吹干，乙腈复溶，离心（12000g，15分钟），上清供液质联用检测。
（2）数据采集：使用UHPLC-Q-Orbitrap质谱在DIA模式下进行样本检测。色谱参数如下：色谱柱为Hypersil GOLD色谱柱（50×2.1mm，1.9μm），柱温为40℃，流动相A为包含0.1%（v/v）甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.4mL/min，进样量为5μL；洗脱程序为：0-8分钟，8-20%B；8-15分钟，20-45%B；15-20分钟，45-85%B；20-25分钟，85-90%B；25-30分钟，90-95%B；30-35分钟，90%B，35-36分钟90-8%B；36-41分钟，8%B。质谱参数如下：质量轴范围为m/z100-1500，毛细管电压为3.5kV，鞘气压力为50arb，辅助气压力为15arb，吹扫气压力为2arb，毛细管温度为300℃. 全扫描分辨率为35000，串联质谱分辨率为17500，采集模式为DIA，隔离窗口为m/z20，NCE为25、35、45，DIA方法的包含列表如表1所示。参阅图4和图5，步骤（2）得到辛酸和棕榈酸的串联质谱图。
（3）构建靶向数据分析列表，经4-氨基-1-苄基哌啶衍生化后，得到的衍生化产物在串联质谱检测时，得到固定质荷比为m/z91.05的碎片离子，根据这一质谱特征，获得其母离子和子离子质荷比，通过LIPID MAPS数据库检索获得理论存在的所有脂肪酸名称及分子式，获得全部母离子和子离子质荷比，构建脂肪酸类物质的靶向数据分析列表，靶向数据分析表见表3。例如C2:0的分子式为C2H4O2，4-氨基-1-苄基哌啶的分子式为C12H18N2，二者发生反应后脱水生成C14H20N2O，可以计算质子化的衍生化产物质荷比为233.1648（Precursor m/z），根据质谱分析结果可知该离子会在质谱分析时产生质荷比为m/z91.05的碎片离子（Product m/z）。
表3 使用4-氨基-1-苄基哌啶作为衍生化试剂的靶向数据分析列表
（4）提取靶向数据信息：将表4的信息导入Skyline软件进行靶向数据提取，参阅图7，Skyline软件会根据表中记录的母离子和子离子质荷比信息提取在样本原始数据中符合要求的化合物，然后获取对应化合物的保留时间、峰面积等信息，用于后续统计分析。
实验例1
健康大鼠作为健康组，大脑中动脉栓塞（MCAO）诱导的缺血性中风模型大鼠作为模型组，进行血清样本分析。运用实施例1的方法，对健康组和模型组的血清样本分别进行分析。得到血清中脂肪酸类化合物的分布，然后对提取的色谱峰进行积分，导出数据集用于统计分析，脂肪酸在不同组别中的变化情况如表4所示。
表4 不同脂肪酸在健康组和模型组大鼠血清样本中的变化情况
| 名称 | 模型组 vs 健康组 | 名称 | 模型组 vs 健康组 |
| C13:0 | ↑* | C22:6 | ↑ |
| C14:0 | ↑** | C22:4 | ↑*** |
| C15:0 | ↑** | C8:0 | ↓ |
| C16:1 | ↑ | C9:0 | ↓ |
| C16:0 | ↑*** | C10:0 | ↑* |
| C17:0 | ↑*** | C11:0 | ↓ |
| C18:4 | ↑** | C12:0 | ↑** |
| C18:3 | ↑** | C20:0 | ↓ |
| C18:2 | ↑*** | C21:0 | ↓* |
| C18:1 | ↑** | C22:1 | ↑ |
| C18:0 | ↑** | C22:0 | ↓ |
| C19:0 | ↑*** | C23:0 | ↓** |
| C20:5 | ↑** | C24:1 | ↓ |
| C20:4 | ↑*** | C24:0 | ↓* |
| C20:3 | ↑* | C25:0 | ↓** |
| C20:1 | ↑* | C26:0 | ↓* |
* p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
从表4可以看出，相比于健康组大鼠，模型组大鼠血清中脂肪酸的含量发生了变化，提示这些脂肪酸的合成和代谢与MCAO有密切的关系。运用实施例1的方法通过对生物体内脂肪酸全面分析，有助于研究者从脂肪酸代谢及其参与调控的信号通路中寻找缺血性中风治疗的药物靶点。
实验例2
健康大鼠作为健康组，大脑中动脉栓塞（MCAO）诱导的缺血性中风模型大鼠作为模型组，运用实施例2的方法对两组大鼠的血清样本进行分析。参阅图7，得到血清中脂肪酸类化合物的分布，然后对提取的色谱峰进行积分，导出数据集用于统计分析，脂肪酸在不同组别中的变化情况如表5所示。
表5 不同脂肪酸在健康组和模型组大鼠血清样本中的变化情况
| 名称 | 模型组 vs 健康组 | 名称 | 模型组 vs 健康组 |
| C13:0 | ↑* | C22:6 | ↑ |
| C14:0 | ↑* | C22:4 | ↑** |
| C15:0 | ↑** | C8:0 | ↓ |
| C16:1 | ↑ | C9:0 | ↓ |
| C16:0 | ↑*** | C10:0 | ↑** |
| C17:0 | ↑*** | C11:0 | ↓ |
| C18:4 | ↑** | C12:0 | ↑** |
| C18:3 | ↑*** | C20:0 | ↓ |
| C18:2 | ↑** | C21:0 | ↓* |
| C18:1 | ↑** | C22:1 | ↑ |
| C18:0 | ↑*** | C22:0 | ↓ |
| C19:0 | ↑*** | C23:0 | ↓** |
| C20:5 | ↑** | C24:1 | ↓ |
| C20:4 | ↑*** | C24:0 | ↓** |
| C20:3 | ↑** | C25:0 | ↓* |
| C20:1 | ↑* | C26:0 | ↓* |
* p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
从表中5可以看出，相比于健康组大鼠，模型组大鼠血清中的脂肪酸的含量发生了变化，提示这些脂肪酸的合成和代谢与MCAO有密切的关系。实施例2的方法通过对生物体内脂肪酸全面分析，有助于研究者从脂肪酸代谢及其参与调控的信号通路中寻找缺血性中风治疗的药物靶点。
本发明将生物血清样品去除蛋白，对小分子化合物进行衍生化处理，衍生化技术使用具有特定官能团的衍生化试剂与目标化合物进行反应。衍生化后的产物在质谱分析时可生成具有规律的碎片离子。总结生物样本衍生化产物的质谱信息，例如特征的中性丢失碎片或特征碎片离子等信息，并通过数据库检索获得目标化合物信息，然后根据质谱信息构建包含目标化合物母离子和子离子质荷比的靶向数据分析列表。采集模式选用DIA，可以在一次质谱分析中同时获得样本中所有物质的一级质谱（母离子）和串联质谱（子离子）信息，整合连续隔离窗口，可以减少同一时间共流出的离子数量，保证所采集的串联质谱图的质量，减少共流出化合物的干扰，采集的数据有助于后期靶向数据分析。根据构建的目标化合物列表，进行后续的靶向数据分析。本发明操作简便，数据兼容性好，适用性强，具有提高目标化合物的稳定性、提高离子化效率和质谱响应强度、简化拟靶向代谢组学分析方法的有益效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于非靶向代谢组学研究的靶向数据分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）样本处理：
生物样本去除蛋白后，加入衍生化试剂和催化剂进行衍生化处理，所述衍生化试剂是N-(3-氨基丙基)哌啶和4-氨基-1-苄基哌啶中的一种，所述催化剂是HATU和TEA，37°C环境下反应10分钟，衍生化后高速离心，取上清，氮气吹干；
（2）数据采集：
使用液质联用仪，通过数据非依赖型扫描模式进行数据采集，得到原始数据；
液质联用仪的色谱参数如下：色谱柱为Hypersil GOLD色谱柱，50×2.1mm，1.9 μm，柱温为40℃，流动相A为包含0.1%（v/v）甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.4mL/min，进样量为5μL；洗脱程序为：0-8分钟，8-20%B；8-15分钟，20-45%B；15-20分钟，45-85%B；20-25分钟，85-90%B；25-30分钟，90-95%B；30-35分钟，90%B，35-36分钟90-8%B；36-41分钟，8%B；
质谱参数如下：电离模式为ESI+，质量轴范围为m/z100-1500，毛细管电压为3.5kV，鞘气压力为50arb，辅助气压力为15arb，吹扫气压力为2arb，毛细管温度为300℃；全扫描分辨率为35000，串联质谱采集分辨率为17500，采集模式为DIA，隔离窗口为m/z20，NCE为25、35、45；
（3）构建靶向数据分析表：
总结生物样本中目标代谢物类型及其对应的质谱图特征，所述质谱图特征包括特征中性丢失和特征碎片离子信息中的一种，参考数据库脂肪酸类化合物信息，获得生物体中存在的脂肪酸名称，根据所述质谱图特征，计算样本衍生化产物的母离子和子离子的质荷比，据此建立靶向数据分析列表；
（4）提取靶向数据进行分析：
基于步骤（3）中所述靶向数据分析列表中母离子和子离子的质荷比，对步骤（2）采集到的原始数据进行靶向数据提取，获取所述靶向数据分析列表中对应化合物的保留时间和峰面积信息，用于后续统计分析。
2.根据权利要求1所述的一种用于非靶向代谢组学研究的靶向数据分析方法，其特征在于，步骤(1)中，生物样本去除蛋白是使用有机溶剂对生物样本进行蛋白沉淀，沉淀后高速离心，取上清，氮气吹干。
3.根据权利要求2所述的一种用于非靶向代谢组学研究的靶向数据分析方法，其特征在于，所述有机溶剂是甲醇。
4.根据权利要求2所述的一种用于非靶向代谢组学研究的靶向数据分析方法，其特征在于，步骤（2）中，离心条件为离心力12000g，离心时间15min。
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