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CN118056006A - 用于细胞系鉴定和富集的转基因啮齿动物 - Google Patents

用于细胞系鉴定和富集的转基因啮齿动物 Download PDF

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CN118056006A
CN118056006A CN202280066823.7A CN202280066823A CN118056006A CN 118056006 A CN118056006 A CN 118056006A CN 202280066823 A CN202280066823 A CN 202280066823A CN 118056006 A CN118056006 A CN 118056006A
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nucleic acid
locus
immunoglobulin
acid construct
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CN202280066823.7A
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向平
魏巍
达维德·佩拉卡尼
延斯·鲁施曼
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Abel Hiller Biotech
Original Assignee
Abel Hiller Biotech
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Abstract

本公开内容提供了包含编码亲和标签、跨膜(TM)结构域和荧光报告蛋白的跨膜报告物盒的核酸构建体。在实施方案中，该核酸构建体被插入非人类哺乳动物细胞中的安全港基因座或免疫球蛋白恒定结构域基因座。在实施方案中，当跨膜报告物盒在细胞中表达时，亲和标签被展示在细胞表面上，而荧光报告蛋白位于细胞膜内。亲和标签和荧光报告蛋白的存在允许鉴定、分选和/或分离表达该核酸构建体的细胞。本公开内容还提供了用该核酸构建体修饰细胞和非人类生物体的方法的实施方案，以及使用所公开的方法产生的细胞和非人类生物体的实施方案。

Description

用于细胞系鉴定和富集的转基因啮齿动物
发明领域
本公开内容涉及核酸构建体、转基因啮齿动物、啮齿动物细胞系以及允许鉴定和富集特定细胞类型的方法，例如特定发育阶段的细胞、表达特定启动子的细胞或表达特定蛋白质诸如抗体的细胞。
发明背景
鉴定和富集被工程化以表达特定蛋白质或处于特定发育阶段的细胞是生物治疗学发展中的一个关键挑战。为了富集特定的细胞群体，常见的工作流程是生成单细胞悬浮液，用一组识别表面标志物的抗体对细胞混合物进行染色，并且然后使用基于磁性或流的方法分离细胞。然而，这一程序受到细胞类型特异性细胞表面标志物的现有知识以及识别这些标志物的抗体的特异性和可用性的限制。该程序通常导致富集后的感兴趣细胞的产量和纯度低于理想水平，在富集过程中有高比例的不需要的污染细胞和感兴趣细胞的损失。例如，鉴定Ig表达细胞的常用策略是基于已知的内源性谱系表面标志物，结合抗体染色和这些标志物的检测。
通常用于富集小鼠Ig表达细胞的抗体是抗CD19、抗CD138和抗Ig抗体。然而，这三种标志物在B细胞分化过程中的差异表达意味着并非所有群体都可以使用细胞表面标志物被有效富集。例如，CD19被认为是泛B细胞标志物(包括不表达Ig的B细胞祖细胞)，但其在抗体分泌细胞中的表达显著降低，并且因此它不能富集该有价值的群体。CD138被认为是浆细胞标志物，但也在一些不表达Ig的早期祖B细胞中表达。因此，这种标志物将富集这个不需要的群体。在B细胞发育过程中，前B细胞分化为未成熟B细胞后，它们开始在其细胞表面上展示Ig，因此可以使用Ig标志物捕获该群体。然而，成熟B细胞完全分化为浆细胞后，Ig表面表达丧失。因此，当使用这些标志物通过基于磁性的策略富集Ig表达细胞时(与基于流的分选相比，这提供了更好的规模和时间效率)，产生的富集的细胞群体通常包含非Ig表达B细胞的污染物，具有低效的富集和抗体分泌细胞的损失。
出于类似的原因，分离和富集表达组织特异性启动子的细胞系也是一个挑战。组织特异性在很大程度上由转录因子决定，这意味着细胞表面标志物可能无法用于以组织特异性方式表达蛋白质的细胞系的富集，或者可用的标志物可能不够特异性以提供有用的富集。
发明概述
在实施方案中，本公开内容提供了一种核酸构建体，其包含前导序列、LoxP-Stop-LoxP盒和编码亲和标签、跨膜(TM)结构域和荧光报告蛋白的跨膜报告物盒。在实施方案中，核酸构建体包含单链DNA、双链DNA、质粒或病毒载体。
在实施方案中，核酸构建体还包含分别与在非人类哺乳动物的安全港基因座内的第一靶序列和第二靶序列同源的第一同源臂和第二同源臂。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约15个核苷酸至约12000个核苷酸。
在核酸构建体的实施方案中，安全港基因座包括小鼠基因组中6号染色体上的Rosa26基因座或小鼠基因组中11号染色体上的Hipp11基因座。
在实施方案中，核酸构建体还包含启动子。在实施方案中，启动子包含哺乳动物启动子。在实施方案中，启动子包含CAG、CMV、EF1a、SV40、PGK1、Ubc或人类β肌动蛋白启动子。在实施方案中，前导序列包含分泌信号肽。在实施方案中，分泌信号肽包含IL-2前导序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:2)。
在核酸构建体的实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个至约18个串联重复序列，在重复之间带有标签接头。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的3个串联重复序列。在实施方案中，StrepII标签包含WSHPQFEK(SEQ ID NO:1)的8个氨基酸肽序列。在实施方案中，跨膜结构域包含疏水α-螺旋。
在核酸构建体的实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
在实施方案中，本公开内容提供一种产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法，该方法包括：(a)将本文描述的核酸构建体引入非人类哺乳动物细胞；和(b)将核酸酶引入非人类哺乳动物细胞，其中核酸酶在非人类哺乳动物细胞的基因组中的安全港基因座处引起单链断裂或双链断裂，其中核酸构建体通过同源重组在安全港基因座处被整合到非人类哺乳动物细胞的基因组中。
在该方法的实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的表达构建体。在实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的mRNA。在实施方案中，核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、巨核酸酶或成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)关联(Cas)蛋白和指导RNA(gRNA)。在实施方案中，gRNA包括靶向识别位点的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在实施方案中，CRISPR-Cas蛋白包含Cas9。
在该方法的实施方案中，非人类哺乳动物细胞是啮齿动物细胞。在实施方案中，啮齿动物细胞是大鼠细胞或小鼠细胞。在实施方案中，安全港基因座包括小鼠基因组中6号染色体上的Rosa26基因座或11号染色体上的Hipp11基因座。在实施方案中，非人类哺乳动物细胞是多能细胞。在实施方案中，多能细胞是非人类受精卵或非人类胚胎干(ES)细胞。在实施方案中，多能细胞是小鼠受精卵细胞或大鼠受精卵细胞。在实施方案中，多能细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞或大鼠胚胎干(ES)细胞。
在实施方案中，该方法还包括分离其中核酸构建体被整合到安全港基因座处的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。
在实施方案中，本公开内容提供了一种通过本文描述的产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法产生的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。
在该方法的实施方案中，该方法还包括将分离的细胞注射到囊胚中，并产生包含被整合到安全港基因座中的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物。在实施方案中，本公开内容提供了通过该方法产生的经遗传修饰的非人类转基因哺乳动物。在实施方案中，哺乳动物是啮齿动物。在实施方案中，啮齿动物是大鼠或小鼠。
在实施方案中，该方法还包括将包含被整合到安全港基因座中的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物与表达Cre重组酶的转基因非人类哺乳动物进行交配繁殖，以获得具有表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白的细胞的非人类哺乳动物。在实施方案中，包含被整合到安全港基因座的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物是包含被整合到Rosa26基因座的核酸构建体的小鼠，并且表达Cre重组酶的转基因非人类哺乳动物是小鼠。在实施方案中，包含被整合到安全港基因座的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物是包含被整合到Hipp11基因座的核酸构建体的小鼠，并且表达Cre重组酶的转基因非人类哺乳动物是小鼠。在实施方案中，转基因小鼠中的Cre表达是组织特异性的。在实施方案中，本公开内容提供了一种由该方法产生的经遗传修饰的非人类哺乳动物，其具有表达融合蛋白的细胞，该融合蛋白包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白。
在实施方案中，本公开内容提供了一种经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其包含含有被整合到安全港基因座中的本文描述的核酸构建体的基因组。在实施方案中，安全港基因座包括小鼠基因组中26号染色体上的Rosa26基因座或小鼠基因组中11号染色体上的Hipp11基因座。在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞是杂交瘤或永生化细胞。
在经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的实施方案中，细胞表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白。在实施方案中，亲和标签在非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，荧光报告蛋白被暴露在非人类哺乳动物细胞的胞质表面(cytosolic surface)上。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
在实施方案中，本公开内容提供了一种用于分离从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞的方法，该方法包括：(a)从本文描述的经遗传修饰的非人类哺乳动物获得细胞；(b)筛选从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞，以表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白；和(c)分离表达该融合蛋白的细胞。
在用于分离细胞的方法的实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)来筛选细胞。在实施方案中，亲和标签在经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，荧光报告蛋白被暴露在非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
在实施方案中，本公开内容还提供了一种包含接头、前导序列和编码亲和标签、跨膜结构域和荧光报告物的跨膜报告物盒的核酸构建体。
在实施方案中，核酸构建体包含单链DNA、双链DNA、质粒或病毒载体。在实施方案中，核酸构建体还包含分别与第一靶序列和第二靶序列同源的第一同源臂和第二同源臂。在实施方案中，第一靶序列位于免疫球蛋白恒定结构域基因座的上游，并且第二靶序列位于免疫球蛋白恒定结构域基因座的终止密码子的下游。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白κ恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白λ恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。
在核酸构建体的实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约15个核苷酸至约12000个核苷酸。在实施方案中，接头包含终止密码子和内部核糖体进入位点(IRES)。在实施方案中，接头包含蛋白酶识别位点和自裂解肽。在实施方案中，接头包含具有肽接头的渗漏终止密码子(leaky stop codon,LSC)、蛋白酶识别位点和自裂解肽。在实施方案中，蛋白酶识别位点包含弗林蛋白酶识别位点。在实施方案中，弗林蛋白酶识别位点包含编码Arg-X-Arg-Arg肽的核酸序列。在实施方案中，X是疏水性氨基酸。在实施方案中，X是亲水性氨基酸。在实施方案中，X是赖氨酸。在实施方案中，弗林蛋白酶识别位点包含编码X-Arg-X-Lys-Arg-X或X-Arg-X-Arg-Arg-X肽的核酸序列。在实施方案中，X是疏水性氨基酸。在实施方案中，疏水氨基酸是Gly、Ala、Ile、Leu、Met、Val、Phe、Trp或Tyr。在实施方案中，X是亲水性氨基酸。在实施方案中，亲水性氨基酸是赖氨酸。在实施方案中，自裂解肽包含2A自裂解肽。在实施方案中，渗漏终止密码子包含TGACTAG。在实施方案中，二肽接头包含Leu-Gly。
在核酸构建体的实施方案中，前导序列包含分泌信号肽。在实施方案中，分泌信号肽包含IL-2前导序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:2)。
在核酸构建体的实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个至约18个串联重复序列，在重复之间带有标签接头。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的3个串联重复序列。在实施方案中，StrepII标签包含WSHPQFEK(SEQ ID NO:1)的8个氨基酸肽序列。在实施方案中，跨膜结构域包含疏水α膜螺旋。
在核酸构建体的实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
在实施方案中，本公开内容提供一种产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法，该方法包括：(a)将本文描述的核酸构建体引入非人类哺乳动物细胞；和(b)将核酸酶引入非人类哺乳动物细胞，其中核酸酶在非人类哺乳动物细胞的基因组中的免疫球蛋白恒定结构域基因座处引起单链断裂或双链断裂，并且核酸构建体通过同源重组在免疫球蛋白恒定结构域基因座处被整合到非人类哺乳动物细胞的基因组中。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是κ轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是λ轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白恒定结构域基因座。
在该方法的实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的表达构建体。在实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的mRNA。在实施方案中，核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、巨核酸酶或成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)关联(Cas)蛋白和指导RNA(gRNA)。在实施方案中，gRNA包括靶向识别位点的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在实施方案中，CRISPR-Cas蛋白包含Cas9。
在该方法的实施方案中，非人类哺乳动物细胞是啮齿动物细胞。在实施方案中，啮齿动物细胞是大鼠细胞或小鼠细胞。在实施方案中，非人类哺乳动物细胞是多能细胞。在实施方案中，多能细胞是非人类胚胎干(ES)细胞。在实施方案中，多能细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞或大鼠胚胎干(ES)细胞。
在实施方案中，该方法还包括分离其中核酸构建体被整合到免疫球蛋白恒定结构域基因座处的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是κ轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是λ轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白恒定结构域基因座。
在实施方案中，本公开内容提供了一种通过本文公开的方法产生的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。
在实施方案中，该方法还包括将分离的细胞注射到囊胚中，并产生包含被整合到免疫球蛋白恒定结构域基因座中的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是κ轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是λ轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白恒定结构域基因座。在实施方案中，本公开内容提供了通过该方法产生的经遗传修饰的非人类转基因哺乳动物。
在实施方案中，本公开内容提供了一种经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其包含包含被整合到免疫球蛋白恒定结构域基因座中的本文描述的核酸构建体的基因组。在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞包含基因组，该基因组包含本文描述的被整合到免疫球蛋白恒定结构域基因座中的核酸构建体。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，轻链恒定结构域基因座是κ恒定结构域基因座。在实施方案中，轻链恒定结构域基因座是λ恒定结构域基因座。在实施方案中，恒定结构域基因座是重链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞从经免疫的哺乳动物获得。在实施方案中，该细胞是免疫球蛋白表达细胞。在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞表达免疫球蛋白κ轻链。
在表达免疫球蛋白的非人类哺乳动物细胞的实施方案中，该细胞是未成熟B细胞或未成熟B细胞的后代。在实施方案中，细胞是杂交瘤、干细胞或永生化细胞。
在表达免疫球蛋白的非人类哺乳动物细胞的实施方案中，该细胞表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白。在实施方案中，亲和标签在非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，荧光报告蛋白被暴露在非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。在实施方案中，荧光报告蛋白包括红色荧光蛋白(RFP)。在实施方案中，红色荧光蛋白是单体樱桃(mCherry)或串联二聚体番茄(tdTomato)。其他荧光蛋白是已知的，并且可用于本文描述的构建体。例如，参见Li等人.(2018)“Overview of the reportergenes and reporter mouse models”,Anim Models and Exp Med.1:29-35(doi.org/10.1002/ame2.12008)。
在表达免疫球蛋白的非人类哺乳动物细胞的实施方案中，融合蛋白的表达由内源性免疫球蛋白转录调节因子驱动。在实施方案中，内源性免疫球蛋白转录调节因子是内源性免疫球蛋白轻链转录调节因子。在实施方案中，内源性免疫球蛋白轻链转录调节因子包含启动子和小鼠轻链基因座中的其他顺式调节元件。在实施方案中，内源性免疫球蛋白κ轻链转录调节因子包含启动子和小鼠轻链基因座中的其他顺式调节元件。在实施方案中，内源性免疫球蛋白λ轻链转录调节因子包含启动子和小鼠轻链基因座中的其他顺式调节元件。在实施方案中，内源性免疫球蛋白转录调节因子是内源性免疫球蛋白重链转录调节因子。在实施方案中，内源性免疫球蛋白重链转录调节因子包含启动子和小鼠重链基因座中的其他顺式调节元件。
在实施方案中，本公开内容提供了一种用于鉴定从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的免疫球蛋白表达细胞的方法，该方法包括：(a)从本文描述的经遗传修饰的非人类哺乳动物获得细胞；(b)筛选从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞，用于表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白；和(c)基于融合蛋白的表达鉴定表达免疫球蛋白的细胞。
在该方法的实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)筛选细胞。在实施方案中，亲和标签在经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，荧光报告蛋白被暴露在非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。在实施方案中，荧光报告蛋白包括红色荧光蛋白(RFP)。在实施方案中，红色荧光蛋白是单体樱桃(mCherry)或串联二聚体番茄(tdTomato)。
在该方法的实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物已经用感兴趣的抗原免疫。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞表达免疫球蛋白轻链。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞表达免疫球蛋白κ轻链。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞表达免疫球蛋白λ轻链。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞表达免疫球蛋白重链。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞包括未成熟B细胞及其后代。
在实施方案中，该方法还包括分离从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞中表达的免疫球蛋白。在实施方案中，本公开内容提供了通过该方法获得的免疫球蛋白。
在实施方案中，本公开内容提供了一种产生治疗性或诊断性免疫球蛋白的方法，该方法包括：(i)克隆本文描述的免疫球蛋白的可变结构域；和(ii)产生包含在(i)中获得的可变结构域的治疗性或诊断性免疫球蛋白。
在实施方案中，本公开内容提供了一种产生单克隆抗体的方法，该方法包括：(i)从本文描述的经遗传修饰的非人类哺乳动物获得免疫球蛋白表达细胞；(ii)使(i)中获得的免疫球蛋白表达细胞永生化；和(iii)分离由永生化免疫球蛋白表达细胞表达的单克隆抗体或编码该单克隆抗体的核酸序列。在实施方案中，该方法还包括：(iv)克隆分离的单克隆抗体的可变结构域；和(v)产生包含克隆的可变结构域的治疗性或诊断性抗体。在实施方案中，本公开内容提供了通过该方法产生的治疗性或诊断性抗体。
附图简述
图1A-图1C是本文描述的条件报告核酸构建体的实施方案的构建和使用的示意图。如图1A示出的，在ROSA26基因座安全港位点插入核酸构建体。在图中，CAGGS代表CAG启动子，L代表前导序列，LoxP-Stop-LoxP盒如图所示排列，STX3代表Strep-II标签的三个串联重复序列，TM代表跨膜结构域，并且GFP代表绿色荧光蛋白报告物。图1B是用Cre switch品系和条件报告物品系进行杂交以形成组织特异性报告物小鼠品系的示意图。如示意性示出的，在用switch品系交配繁殖条件报告物品系后，cre重组酶去除报告物前面的终止密码子，以在cre表达细胞的细胞核内开启报告物的表达。结果，这些细胞被细胞表面上的亲和标签和细胞内荧光标志物永久标记。图1C是使用如本文描述的FACS或MACS如何分离从图1B所示的switch报告物品系分离的细胞的示意图。
图2是小鼠/大鼠IgK基因座的靶向策略的示意图。靶向后，标记盒在IgK基因的终止密码子处被敲入，并处于IgK基因座启动子的控制下(注意，下图中的LK是接头序列，详情见下文)。在图中，黑色矩形代表该区域的V和J区段；LK代表接头序列；L代表前导序列，STX3代表Strep-II标签的三个串联重复序列，TM代表跨膜结构域，并且GFP代表绿色荧光蛋白报告物。
图3是如本文描述的形成的IgK报告物小鼠的实施方案的形成示意图，以及使用如本文描述的FACS或MACS如何分离从小鼠分离的汇集的细胞的示意图。
发明详述
本公开内容提供了包含编码亲和标签、跨膜(TM)结构域和荧光报告蛋白的的跨膜报告物盒的核酸构建体的实施方案。在实施方案中，该核酸构建体被插入非人类哺乳动物细胞中的安全港基因座或免疫球蛋白恒定结构域基因座。在实施方案中，当跨膜报告物盒在细胞中表达时，亲和标签被展示在细胞表面上，并且荧光报告蛋白位于细胞膜内。亲和标签和荧光报告蛋白的存在允许鉴定、分选和/或分离表达该核酸构建体的细胞。本公开内容还提供了用该核酸构建体修饰细胞和非人类生物体的方法的实施方案，以及使用所公开的方法产生的细胞和非人类生物体的实施方案。
A.定义
除非另有定义，否则本文使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数，例如“一个(a)”或“一个(an)”，包括复数，例如“一个或更多个”或“至少一个”，并且术语“或”可以表示“和/或”，除非另有说明。术语“包括(including)”、“包含(includes)”和“包含(included)”不是限制性的。本文提供的任何类型的范围包括所描述的特定范围内的所有值和关于特定范围的端点的值。
如本文使用的，术语“约”用于修饰例如用于描述本发明的组合物中成分的量、浓度、体积、工艺温度、工艺时间、产量、流速、压力及其范围。“约”一词是指可能发生的数值变化，例如，通过用于制造化合物、组合物、浓缩物或制剂的典型测量和处理程序；由于这些程序中的疏忽错误；通过用于执行方法的起始材料或成分的制造、来源或纯度的差异，以及其他类似的考虑。术语“约”还涵盖由于具有特定初始浓度或混合物的制剂老化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的制剂而不同的量。在被术语“约”修改的情况下，本文所附的权利要求包括这种等同物。
一般来说，本文描述的结合细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交使用的命名和技术是本领域熟知且常用的那些。氨基酸可以通过其普遍已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号在本文被提及。同样地，核苷酸可以通过其通常可接受的单字母代码被提及。
如本文使用的，术语“多肽”或“蛋白质”可以互换使用，以指具有两个或更多个通过肽键相互连接的氨基酸残基的分子。术语“多肽”可以指抗体和其他非抗体蛋白质。非抗体蛋白包括但不限于蛋白，诸如酶、受体、细胞表面蛋白的配体、分泌蛋白和融合蛋白或其片段。多肽可以具有科学或商业价值，包括基于蛋白质的疗法。
如本文使用的，术语“抗体”和“免疫球蛋白”可以互换使用，并指包括至少一个结合结构域的多肽或多肽组，该结合结构域由多肽链折叠形成，多肽链具有三维结合空间，其内表面形状和电荷分布与抗原的抗原决定簇的特征互补。天然存在的抗体通常具有四聚体形式，具有两对多肽链，每对具有一条“轻”链和一条“重”链。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每个重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是一些恒定结构域(CH)。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并在其另一端具有恒定结构域(CL)，其中轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。轻链根据轻链恒定区的氨基酸序列分为λ链或κ链。根据重链恒定区的氨基酸序列，重链分为γ链、δ链、α链、μ链或ε链。
术语“抗原结合片段”或“免疫活性片段”指抗体的含有至少一个抗原结合位点并保留与抗原特异性结合的能力的片段。免疫球蛋白分子可以具有任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同种异型(例如Gm，例如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b或c)、Am、Em和Km(1、2或3))。亚同种型可以包括亚类，诸如在非人类哺乳动物如啮齿动物中发现的亚类，诸如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3。免疫球蛋白包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、从至少两种不同表位结合片段形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、CDR接枝的、人类抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、抗独特型(抗Id)抗体、胞内抗体及其期望的抗原结合片段，包括重组产生的抗体片段。可以重组产生的抗体片段的实例包括但不限于包括可变重链和轻链结构域的抗体片段，诸如单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段。抗体片段也可以包括表位结合片段或上述列举的任何抗体的衍生物。
术语“重组体”是指一种生物材料，例如核酸或蛋白质，已经被人工或合成(即非天然)改变或通过人干预产生。术语“重组抗体”是指通过重组DNA过程制备的抗体，包括例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，以及从重组、组合人类抗体文库分离的抗体。在实施方案中，重组抗体是重组人类抗体，其包括但不限于从具有人类免疫球蛋白基因的转基因动物分离的抗体或通过将人类免疫球蛋白基因序列剪接到另一个DNA序列中来制备的抗体。
本文使用的“编码序列”或“编码”所选多肽的序列是核酸分子，例如，当被置于适当的调控序列(或“控制元件”)的控制下时，该核酸分子在体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界通常由在5’(氨基)端处的起始密码子和在3’(羧基)端处的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于来自病毒的cDNA、原核或真核mRNA、来自病毒的基因组DNA序列或原核DNA，甚至合成DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3’。其他“控制元件”也可以与编码序列相关联。通过使用所选细胞优选的密码子来代表所需多肽编码序列的DNA拷贝，可以优化编码多肽的DNA序列在所选细胞中的表达。
本文使用的“由...编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中多肽序列或其一部分包含来自由该核酸序列编码的多肽的至少约3个至约5个氨基酸、至少约8个至约10个氨基酸或至少约15个至约20个氨基酸的氨基酸序列。还涵盖可用由该序列编码的多肽进行免疫学鉴定的多肽序列。
本文使用的“可操作地连接”指其中如此描述的组分被配置以执行它们的通常功能的元件布置。因此，当存在适当的酶时，可操作地连接到编码序列(例如，报告物表达盒)的给定启动子能够实现编码序列的表达。启动子或其他控制元件不需要与编码序列相邻，只要它们具有指导其表达的功能。例如，启动子序列和编码序列之间可存在其间的未翻译但已转录的序列，并且启动子序列仍然可被认为与编码序列“可操作地连接”。
本文使用的“载体”能够将基因序列转移到靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能够指导感兴趣的基因的表达并且可以将基因序列转移到靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达媒介物，以及整合载体。
本文使用的“表达盒”包含能够指导感兴趣的基因/编码序列表达的任何核酸构建体。这样的盒可以构建成“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”，以便将表达盒转移到靶细胞中。因此，该术语包括克隆和表达媒介物，以及病毒载体。
本文使用的“串联重复序列”是多于一个核苷酸(在核酸中)或多于一个氨基酸残基(在蛋白质中)的重复，其中重复在序列中彼此相邻。串联重复序列可以是连续的(即，重复之间没有其他核苷酸或残基)，或者串联重复序列可以被重复之间的一个或更多个核苷酸或残基分开。
本文使用的术语“表达载体”是指可用于转化或转染合适宿主细胞的任何合适的重组表达载体。本文使用的术语“宿主细胞”是指已将重组表达载体引入其中的细胞。术语“宿主细胞”不仅指引入表达载体的细胞(“亲本”细胞)，还指这种细胞的后代。因为修饰可能发生在后代中，例如，由于突变或环境影响，后代可能与亲代细胞不同，但仍被包括在术语“宿主细胞”的范围内。
本文使用的术语“转化”是指细胞中因吸收外源DNA而导致的可遗传改变。细胞转化的合适方法包括病毒感染、转染、接合(conjugation)、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。方法的选择通常取决于被转化细胞的类型和发生转化的环境(即体外、离体或体内)。这些方法的一般讨论可以在Ausubel等人,Short Protocolsin Molecular Biology,第三版,Wiley&Sons,1995中找到。
本文使用的“永生化细胞”是指一种类型的细胞，这种细胞通常不会无限增殖，但具有允许其逃避细胞衰老的突变，从而可以无限地继续经历细胞分裂。在实施方案中，永生化细胞系可以来源于肿瘤细胞系，或者可以来源于被操纵以允许细胞无限增殖的细胞系。
本文使用的“敲入”是指通过涉及在特定基因组位置插入异源DNA序列的遗传工程方法产生的转基因细胞或动物。一方面，通过同源重组插入异源DNA序列。一方面，使用CRISPR/Cas9系统插入异源DNA序列。一方面，异源DNA序列被插入到“安全港基因座”中。本文使用的“安全港基因座”是基因组中能够适应新遗传物质整合的位点，使得新的遗传元件的功能可预测，并且不会引起对宿主细胞或生物体构成风险的宿主基因组的改变。“敲入”包括在至少一个等位基因中包含异源DNA序列的后代。在实施方案中，通过向该基因座添加报告基因，可以追踪细胞的谱系。
本文使用的“异源”是指不是在细胞或动物中天然存在的核酸，或者是细胞或动物中天然存在但已经被改变或突变的核酸。
本文使用的“跨膜结构域”(TM结构域)指穿过细胞质膜的蛋白质的大体疏水区域。在实施方案中，TM结构域将构建体的细胞外部分连接到细胞内部分。在实施方案中，TM结构域连接细胞外亲和标签和细胞内荧光报告蛋白。TM结构域可以包括蛋白质的跨膜区、蛋白质的跨膜片段、人工疏水序列或其组合。在实施方案中，跨膜结构域是I型跨膜蛋白。在实施方案中，TM结构域包含一个或更多个α螺旋。在实施方案中，TM结构域包含一条或更多条β链。在实施方案中，跨膜结构域包括IgG跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域包括人类IgG跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域包括小鼠IgG跨膜结构域。
在实施方案中，跨膜结构域包括哺乳动物跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域包括小鼠蛋白Tmem53、Lrtm1或Nrg1的跨膜结构域。尽管本文提供了具体的实施例，但是其他跨膜结构域对于本领域技术人员来说将是明显的，并且可以结合本文描述的构建体使用。例如，参见Yu和Zhang(2013)“A simple method for predicting transmembraneproteins based on wavelet transform,”Int.J.Biol.Sci.9(1):22-33。
B.B细胞发育
在实施方案中，使用本文描述的方法鉴定和/或分离的细胞是B细胞。B细胞从骨髓中的造血干细胞(HSC)发育而来，在骨髓中它们经历几个阶段的抗原非依赖性发育，导致未成熟B细胞的产生。未成熟B细胞在其表面表达IgM(膜IgM表达)。未成熟的B细胞从骨髓迁移到脾脏，在那里它们分化为成熟的初始B细胞(表达膜IgM和IgD)。其中一些成熟的初始B细胞分化为记忆B细胞-长寿命和静止的细胞，能够在再次暴露于抗原时迅速激活，增殖并分化为浆细胞，以对抗新的感染。当初始或记忆B细胞被抗原激活时，它会增殖并分化为分泌抗体的细胞。
后来，当细胞完全成熟为浆细胞时，它们表达分泌型Ig，但失去Ig表面表达。在小鼠和大鼠中，大约99％的抗体表达细胞使用Igκ作为轻链。
在HSC被定向到B细胞谱系后，B细胞祖细胞经历一系列分化事件成为成熟的B细胞。
C.同源重组与位点特异性核酸酶
如本文描述的，本公开内容提供一种产生遗传修饰的非人类哺乳动物细胞和生物体的方法，其中该方法包括将核酸酶引入非人类哺乳动物细胞，其中核酸酶在被修饰细胞的基因组中的某个位置引起单链断裂或双链断裂。在实施方案中，这种单链断裂或双链断裂的修复导致核酸序列被整合到被修饰细胞的基因组中。在实施方案中，这种整合经由同源重组发生。
同源重组(HR)：同源重组允许在生物体基因组内的某个位点插入靶基因(基因靶向)。通过创建包含与靶向的基因组序列匹配的模板的DNA构建体，细胞内的HR过程可能会将构建体插入所需的位置。在胚胎干细胞上使用这种方法导致了转基因小鼠的开发，其靶向基因被敲除，即从基因组中移除，或被敲入，即添加到基因组中。
在本领域例如，如美国专利第5,474,896号；第5,792,632号；第5,866,361号；第5,948,678号；第5,948,678号；第5,962,327号；第6,395,959号；第6,238,924号；和第5,830,729号中描述了在双链断裂后使用HR进行基因敲入的方法，其在此通过引用并入本文。在美国专利第6,689,610号；第6,204,061号；第5,631,153号；第5,627,059号；第5,487,992号；及第5,464,764号中描述了同源重组的示例性方法，其各自通过引用并入本文。
在实施方案中，使用位点特异性核酸酶引入单链断裂或双链断裂。这样的核酸酶在本领域是已知的，并且本文提供了这样的核酸酶的实例。
锌指核酸酶：锌指核酸酶具有可以精确靶向DNA序列的DNA结合结构域。每个锌指可以识别所需DNA序列的部分，并且因此可以模块化装配以结合特定序列。结合结构域指导导致DNA中双链断裂的限制性核酸内切酶的切割。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)：转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)也包含DNA结合结构域和可以裂解DNA的核酸酶。DNA结合区包含氨基酸重复序列，每个重复序列识别所需靶向的DNA序列的单个碱基对。核酸酶导致DNA中双链断裂。
CRISPR/Cas：成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR关联蛋白(Cas)是一种基因组编辑方法，包含与Cas蛋白复合的指导RNA。指导RNA可以进行工程化设计，以通过简单的互补碱基配对匹配所需的DNA序列，这与锌指或TALEN所需的构建体装配不同。偶联的Cas将导致DNA中的双链断裂。在实施方案中，Cas蛋白包括Cas9。在实施方案中，Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas12a、Cas13、Cas14或CasΦ。在实施方案中，Cas蛋白包括Cas3、Cas8、Cas10、Cas11、Cas12、Cas12a、Cas13、Cas14或CasΦ。
D.Cre重组酶
Cre(Cre重组酶)是酪氨酸位点特异性重组酶(T-SSR)之一，包括翻转酶(Flp)和D6特异性重组酶(Dre)。发现它是从噬菌体P1的cre(环化重组酶)基因产生的38-kDa DNA重组酶。它识别称为loxP(x-over的基因座，P1)位点的特定DNA片段序列并介导两个loxP位点之间DNA序列的位点特异性缺失。loxP位点是一个34bp的序列，包含两个13bp的反向和回文重复序列以及8bp的核心序列。
如本文进一步描述的，适当地插入在前导序列和转基因编码报告物序列之间的loxP-侧翼“停止”序列(转录终止元件)阻断基因的表达。在用switch品系交配繁殖条件报告物品系后，cre重组酶去除报告物前面的终止元件，以在cre表达细胞的细胞核内开启报告物的表达。结果，这些细胞被细胞表面上的亲和标签和细胞内荧光标志物永久标记。该过程示意性地示于图1B中。
已经开发了数千种小鼠品系，其中Cre受组织特异性启动子控制。因此，Cre只在小鼠的特定组织中表达。如本文进一步描述的，通过与不同的switch品系交配繁殖，不同的感兴趣的细胞可以用报告蛋白标记，并用大规模基于磁性的方法或基于流的方法分离。
E.啮齿动物免疫球蛋白
与人类一样，小鼠和大鼠有五种抗体同种型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。每种同种型有不同的重链。同种型也可以称为类。幼稚B细胞产生IgM和IgD。在B细胞成熟过程中，通过同种型转换，成熟的B细胞将产生IgG、IgA或IgE同种型和亚类中的一种。不同的同种型在体内有不同的半衰期，从12小时到8天不等。
IgA、IgD和IgG的重链具有含有三个免疫球蛋白(Ig)结构域的恒定区。其他类型的重链可能具有不同数量的免疫球蛋白结构域。IgE和IgM的重链具有含有四个免疫球蛋白结构域的恒定区。经由转录过程中发生的选择性剪接事件，上述同种型的每个重链在C-末端区域具有膜结合型和分泌型。膜结合型mRNA在C-末端包含2个另外的外显子；因此，膜结合型重链的蛋白质更长，具有跨膜结构域和胞质C-末端尾。所有同种型的重链都有带有单一免疫球蛋白结构域的可变区。
每个轻链(κ或λ)具有一个恒定免疫球蛋白结构域和一个可变免疫球蛋白结构域。在大鼠和小鼠中，κ到λ之间的轻链使用大约是99比1，这意味着大约99％的抗体表达细胞表达κ轻链。鼠免疫球蛋白kappa(κ)轻链多基因家族包含恒定区基因座(Cκ)、4个连接区基因和大约95个κ可变(Vκ)区家族。
F.转基因动物
“转基因动物”是具有作为染色体外元件存在于其细胞的一部分中或稳定被整合到其种系DNA中(即，在其大部分或全部细胞的基因组序列中)的外源核酸序列的非人类动物，通常为哺乳动物。在本文的实施方案中，转基因动物包含外源核酸，该外源核酸是根据本领域公知的方法，通过对例如宿主动物的胚胎或胚胎干细胞进行遗传操作，而引入这种转基因动物的种系中的。在本文的实施方案中，转基因动物包含多于本文描述的核酸报告物构建体。在实施方案中，转基因动物包含一种或更多种编码由转基因动物产生的产物的另外的核酸，例如蛋白质，诸如酶或免疫球蛋白，或核酸，诸如DNA或RNA。在具体方面，本文的方法提供了包括所引入的部分人类免疫球蛋白区域以及编码本文描述的报告物构建体的核酸的转基因动物的创建。
在实施方案中，转基因动物是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在实施方案中，转基因啮齿动物包含具有人类免疫球蛋白序列的内源性小鼠免疫球蛋白区域，以产生用于药物发现目的的部分或完全人类抗体。这样的小鼠的实例包括例如美国专利第7,145,056号；第7,064,244号；第7,041,871号；第6,673,986号；第6,596,541号；第6,570,061号；第6,162,963号；第6,130,364号；第6,091,001号；第6,023,010号；第5,593,598号；第5,877,397号；第5,874,299号；第5,814,318号；第5,789,650号；第5,661,016号；第5,612,205号和第5,591,669号中描述的那些，其在此通过引用并入本文。在实施方案中，转基因啮齿动物是转基因小鼠，其基因组包含已被缺失并被工程化免疫球蛋白基因座可变区取代的完整内源性小鼠免疫球蛋白基因座可变区。这样的小鼠的实例包括在例如美国专利第10,881,084号和美国专利公布第2020/0190218号中描述的那些，其在此通过引用并入本文。在实施方案中，转基因小鼠被工程化以表达人类或部分人类抗体。在其他实施方案中，转基因小鼠被工程化以表达狗、马或牛抗体。这样的小鼠的实例包括例如在美国专利第10,793,829号、美国专利公布第2020/0308307号和第2021/0000087号和国际专利公布第WO2021/003152号中描述的那些，其在此通过引用并入本文。
G.细胞分选方法
荧光激活细胞分选(FACS)是一种特殊类型的流式细胞术。这种方法能够根据每个细胞的特定光散射和荧光特性，将细胞的异质混合物分选到两个或更多个容器中，一次一个细胞。使用为该技术设计的细胞分选仪器进行FACS。FACS提供了来自单个细胞的荧光信号的快速、客观和定量记录，以及特别感兴趣的细胞的物理分离。
在实施方案中，FACS通常如下进行。待分选细胞的悬浮液被夹带在狭窄、快速流动的液体流的中心。流的布置使得细胞之间相对于它们的直径有很大的间隔。振动机制导致细胞流分裂成单个液滴。对系统进行调整，使得每个液滴有多于一个细胞的可能性很低。就在流分裂成液滴之前，流通过荧光测量站，在那里测量每个细胞感兴趣的荧光特性。充电环被放置在流分裂成液滴的地方。基于紧接着的荧光强度测量，电荷被放置在环上，并且当液滴从流中破裂时，相反的电荷被捕获在液滴上。带电的液滴然后通过静电偏转系统下落，该系统根据液滴的电荷将液滴转移到容器中。在一些系统中，电荷被直接施加到流中，并且脱落的液滴保留与流相同符号的电荷。然后，在液滴脱落后，流回到中性，并对下一个液滴进行测量和分选。
磁激活细胞分选(MACS；Miltenyi Biotech)是一种通过细胞表面上的标志物分离细胞的方法。在实施方案中，MACS系统使用超顺磁性纳米颗粒和柱。超顺磁性纳米颗粒的数量级为100nm。纳米颗粒对靶向的细胞加标签，以便在柱内捕获它们。柱被放置在永久磁体之间，使得当磁性颗粒-细胞复合物穿过它时，加标签的细胞可以被捕获。磁性纳米颗粒在其表面涂有结合特定标志物的剂。表达标志物的细胞附接至磁性纳米颗粒。在孵育珠和细胞后，将溶液转移到强磁场中的柱中。附接至纳米颗粒的细胞(表达标志物)留在柱上，而其他细胞(不表达标志物)流过。
在实施方案中，使用在细胞表面上表达的亲和标签对细胞进行分选。本文描述了用于此目的的亲和标签。在这些实施方案中，可以使用本领域已知的方法使用结合亲和标签的亲和纯化柱或树脂对细胞进行分选。作为非限制性示例，当细胞在其表面上表达StrepII标签时，可以使用结合StrepII标签的树脂例如(IBALifesciences)捕获细胞，并因此分选细胞。
H.条件报告核酸构建体
在实施方案中，本文提供了一种核酸构建体，其包含前导序列、LoxP-Stop-LoxP盒和编码亲和标签、跨膜(TM)结构域和荧光报告蛋白的跨膜报告物盒。该核酸构建体的实施方案在本文中可称为“条件报告核酸构建体”。
在构建体的实施方案中，前导序列位于LoxP-Stop-LoxP盒的上游。在实施方案中，前导序列位于LoxP-Stop-LoxP盒的下游。
在实施方案中，LoxP-Stop-LoxP盒包含终止元件，例如导致翻译或转录终止的任何类型的序列。在实施方案中，终止元件包含一个或更多个SV40多腺苷酸化序列。
在实施方案中，LoxP-Stop-LoxP盒包含导致转录终止的序列侧翼的两个LoxP位点。在实施方案中，LoxP-Stop-LoxP盒包含导致转录终止的LoxP侧翼的多腺苷酸化序列。在实施方案中，多腺苷酸化信号是SV40、hGH、BGH或rbGlob多腺苷酸化信号。在实施方案中，LoxP-Stop-LoxP盒包含多腺苷酸化序列的LoxP-侧翼三重重复序列。在实施方案中，LoxP-Stop-LoxP盒包含多腺苷酸化序列的LoxP-侧翼双重重复序列。在实施方案中，LoxP-Stop-LoxP盒包含LoxP-侧翼单个多腺苷酸化序列。
在实施方案中，LoxP-Stop-LoxP盒包含SV40多腺苷酸化序列的LoxP-侧翼三重重复序列。在实施方案中，LoxP-Stop-LoxP盒包含SV40多腺苷酸化序列的LoxP-侧翼双重重复序列。在实施方案中，LoxP-Stop-LoxP盒包含LoxP-侧翼的单个SV40多腺苷酸化序列。
在实施方案中，终止元件包含一个或更多个导致翻译终止的终止密码子。在实施方案中，LoxP-Stop-LoxP盒包含LoxP-侧翼终止密码子。在实施方案中，终止密码子是TAG、TAA或TGA。
在实施方案中，核酸构建体包含单链DNA、双链DNA、质粒或病毒载体。在实施方案中，核酸构建体是线性DNA。在实施方案中，核酸构建体是环状DNA。
在实施方案中，核酸构建体还包含与非人类哺乳动物基因组中的第一靶序列和第二靶序列同源的第一同源臂和第二同源臂。同源区域允许使用本文描述的和本领域已知的方法将核酸构建体被整合到非人类哺乳动物的基因组中。在实施方案中，核酸构建体还包含分别与在非人类哺乳动物的安全港基因座内的第一靶序列和第二靶序列同源的第一同源臂和第二同源臂。
在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约15个核苷酸至约12000个核苷酸。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约30个核苷酸至约11000个核苷酸。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约50个核苷酸至约10000个核苷酸。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约100个核苷酸至约7500个核苷酸。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约200个核苷酸至约5000个核苷酸。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约300个核苷酸至约2500个核苷酸。
在实施方案中，安全港基因座是基因组中能够适应新遗传物质整合的任何位点，使得新遗传元件的功能可预测，并且不会引起对宿主细胞或生物体构成风险的宿主基因组的改变。在实施方案中，安全港基因座是小鼠安全港基因座。在实施方案中，安全港基因座是大鼠安全港基因座。在实施方案中，安全港基因座包括小鼠基因组中6号染色体上的Rosa26基因座。在实施方案中，安全港基因座包括小鼠基因组中11号染色体上的Hipp11基因座。
在实施方案中，使用内源性启动子表达核酸构建体。在实施方案中，使用位于安全港基因座的内源性启动子表达核酸构建体。
在实施方案中，核酸构建体还包含启动子。在实施方案中，启动子是哺乳动物组成型启动子。在实施方案中，启动子是人类启动子。在实施方案中，启动子是小鼠启动子。在实施方案中，启动子是大鼠启动子。在实施方案中，启动子是病毒启动子。在实施方案中，启动子包括CAG启动子。在实施方案中，启动子包含CAG、CMV、EF1a、SV40、PGK1、Ubc或人类β肌动蛋白启动子。
在实施方案中，前导序列包含分泌信号肽。在实施方案中，分泌信号肽是IL-2前导序列。在实施方案中，分泌信号肽是人类OSM、VSV-G小鼠Igκ、人类IgG2 H、BM40、Secrecon、人类IgKVIII、CD33、tPA、人类糜蛋白酶原、人类胰蛋白酶原-2、人类IL-12或人类血清白蛋白信号肽。在实施方案中，分泌信号肽包含IL-2前导序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ IDNO:2)。本领域技术人员将理解，可以使用本领域已知的算法例如位于www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的SignalP-5.0服务器和位于www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/的SecretomeP 2.0服务器来预测信号肽。
核酸构建体的亲和标签可用于随后分离或纯化由该构建体表达的蛋白质。在实施方案中，亲和标签包括StrepII、六聚组氨酸、FLAG、HA、Myc、VA、GST、β-GAL、MBP或VSV-G标签。在实施方案中，亲和标签包括标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包括标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17或约18个串联重复序列。
在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签的串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17或约18个串联重复序列。在实施方案中，串联重复序列在重复序列之间具有标签接头。在实施方案中，接头是二肽或三肽。在实施方案中，标签接头是二肽Ser-Ala。
在实施方案中，StrepII标签包含WSHPQFEK(SEQ ID NO:1)的8个氨基酸肽序列。在实施方案中，亲和标签包括WSHPQFEKSAWSHPQFEKSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:3)。
由跨膜报告物盒编码的跨膜结构域允许亲和标签呈现在表达核酸构建体的细胞表面上。在实施方案中，跨膜结构域包含疏水α-螺旋。在实施方案中，跨膜结构域包括IgG跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域包括人类IgG1跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域包括小鼠IgG跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域包括小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG2c跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域包括小鼠蛋白Tmem53、Lrtm1或Nrg1的跨膜结构域。
荧光报告蛋白允许检测表达核酸构建体的细胞。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白或橙色荧光蛋白。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。在实施方案中，荧光报告蛋白包括红色荧光蛋白(RFP)。在实施方案中，红色荧光蛋白是单体樱桃(mCherry)或串联二聚体番茄(tdTomato)。
在实施方案中，核酸构建体是图1A中示意性示出的核酸构建体，其中CAGGS代表CAG启动子，L代表前导序列，LoxP-Stop-LoxP盒如图所示排列，STX3代表Strep-II标签的三个串联重复序列，TM代表跨膜结构域，并且GFP代表绿色荧光蛋白报告物。
I.产生条件报告物修饰的细胞和生物体的方法
在实施方案中，本文提供了一种产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法，该方法包括：
(a)将本文描述的条件报告核酸构建体引入非人类哺乳动物细胞；和
(b)将核酸酶引入非人类哺乳动物细胞，其中核酸酶在非人类哺乳动物细胞的基因组中的安全港基因座处引起单链断裂或双链断裂，其中核酸构建体通过同源重组在安全港基因座处被整合到非人类哺乳动物细胞的基因组中。
在实施方案中，核酸酶引起双链断裂。在实施方案中，核酸酶引起单链断裂(例如，切口)。
可以使用本领域已知的方法将核酸酶引入细胞。在实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的表达构建体。在实施方案中，经由注射或电穿孔引入表达构建体。在实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的质粒。在实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的病毒载体。在实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的mRNA。在实施方案中，mRNA包含一个或更多个修饰的碱基。在实施方案中，mRNA被封装在脂质纳米颗粒中。在实施方案中，质粒、病毒载体或mRNA的引入经由注射或电穿孔进行。在实施方案中，引入核酸酶包括将核酸酶蛋白直接引入细胞。在实施方案中，经由注射或电穿孔将核酸酶蛋白直接引入细胞。
在实施方案中，核酸酶是本文描述的核酸酶。在实施方案中，核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、巨核酸酶或成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)关联(Cas)蛋白和指导RNA(gRNA)。在实施方案中，gRNA包括靶向识别位点的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA (tracrRNA)。在实施方案中，CRISPR-Cas蛋白包含Cas9。在实施方案中，Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas12a、Cas13、Cas14或CasΦ。在实施方案中，CRISPR-Cas蛋白包括Cas3、Cas8、Cas10、Cas11、Cas12、Cas12a、Cas13、Cas14或CasΦ。
在实施方案中，非人类哺乳动物细胞来自科学研究中使用的哺乳动物。在实施方案中，非人类哺乳动物细胞是啮齿动物细胞。在实施方案中，啮齿动物细胞是大鼠细胞或小鼠细胞。
在实施方案中，安全港基因座是能够适应新遗传物质整合的任何基因座，使得新遗传元件的功能可预测，并且不会引起对宿主细胞或生物体构成风险的宿主基因组的改变。在实施方案中，安全港基因座是小鼠安全港基因座。在实施方案中，安全港基因座是大鼠安全港基因座。在实施方案中，安全港基因座包括6号染色体上的Rosa26基因座。在实施方案中，安全港基因座包括小鼠基因组中11号染色体上的Hipp11基因座。
在实施方案中，非人类哺乳动物细胞是多能细胞。在实施方案中，多能细胞是非人类受精卵。在实施方案中，多能细胞是小鼠受精卵。在实施方案中，多能细胞是大鼠受精卵。在实施方案中，多能细胞是非人类胚胎干(ES)细胞。在实施方案中，多能细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞或大鼠胚胎干(ES)细胞。
在实施方案中，将本文描述的核酸构建体注射给受精卵。在实施方案中，将核酸构建体注射到受精卵的原核中。在实施方案中，将微注射的受精卵植入假怀孕雌性啮齿动物的输卵管中。在实施方案中，假怀孕的雌性啮齿动物是小鼠。在实施方案中，假怀孕的雌性啮齿动物是大鼠。在实施方案中，植入的受精卵发育成胎儿并出生以提供经遗传修饰的非人类哺乳动物。在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物是小鼠。在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物是大鼠。
在实施方案中，产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法还包括分离其中核酸构建体被整合到安全港基因座的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。
在实施方案中，本文还提供了一种通过上述产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法产生的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。在实施方案中，非人类哺乳动物是啮齿动物。在实施方案中，非人类哺乳动物是小鼠或大鼠。
在产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法的实施方案中，该方法还包括用于产生转基因非人类哺乳动物的步骤。在实施方案中，该方法还包括将分离的细胞注射到囊胚中，并产生包含被整合到安全港基因座中的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物。
在实施方案中，本公开内容提供了一种通过这种方法产生的遗传修饰的非人类哺乳动物。在实施方案中，转基因哺乳动物是啮齿动物。在实施方案中，啮齿动物是大鼠或小鼠。
在产生转基因非人类哺乳动物的方法的实施方案中，该方法还包括将包含被整合到安全港基因座中的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物与表达Cre重组酶的转基因非人类哺乳动物进行交配繁殖，以获得具有表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白的细胞的非人类哺乳动物。
在该方法的实施方案中，包含被整合到安全港基因座的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物是包含被整合到Rosa26基因座的核酸构建体的小鼠，并且表达Cre重组酶的转基因非人类哺乳动物是小鼠。
在该方法的实施方案中，包含被整合到安全港基因座的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物是包含被整合到Hipp11基因座的核酸构建体的小鼠，并且表达Cre重组酶的转基因非人类哺乳动物是小鼠。
在实施方案中，表达Cre重组酶的转基因非人类哺乳动物在组织特异性启动子的控制下表达Cre重组酶。在实施方案中，表达Cre重组酶的转基因非人类哺乳动物在启动子的控制下表达Cre重组酶，该启动子仅在细胞发育期间的特定时间有活性。
在实施方案中，转基因非人类哺乳动物是Cre switch品系小鼠，例如，在小鼠基因组信息学数据库：www.informatics.jax.org/home/recombinase中发现的Cre switch品系。在实施方案中，Cre switch品系小鼠是Blimp1-CreERT2小鼠品系。作为非限制性的实例，这个Blimp1-CreERT2可用于与上述经遗传修饰的非人类哺乳动物交配繁殖，以标记表达Blimp1转录因子的成浆细胞和浆细胞。在实施方案中，Cre switch品系小鼠是JchaincreERT2小鼠品系。在实施方案中，JchaincreERT2小鼠可以与本文描述的经遗传修饰的非人类转基因哺乳动物交配繁殖，以更特异性地标记包括所有免疫球蛋白同种型的浆细胞。在实施方案中，Cre switch品系小鼠是Xbp1小鼠品系。在实施方案中，Cre switch品系小鼠是Irf4小鼠品系。
在实施方案中，转基因小鼠中的Cre表达是组织特异性的。在实施方案中，转基因小鼠中的Cre表达对细胞发育状态是特异性的。
在实施方案中，产生转基因非人类哺乳动物的方法，包括将包含被整合到安全港基因座中的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物与表达Cre重组酶的转基因非人类哺乳动物进行交配繁殖，以获得具有表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白的细胞的非人类哺乳动物，如图1B中的示意图所示地进行。使用该方法产生的转基因非人类哺乳动物的功能如图1B所示。转基因在组织特异性启动子没有活性的细胞中是沉默的，因为终止序列保留在构建体中。当组织特异性启动子被表达时，表达的Cre切除终止序列，导致转基因被表达。
在实施方案中，本文提供了一种通过上述方法产生的经遗传修饰的非人类哺乳动物，其具有表达融合蛋白的细胞，该融合蛋白包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白。
J.条件报告物修饰的细胞
在实施方案中，本文提供了一种经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其包含的基因组含有本文描述的被整合到安全港基因座的条件报告核酸构建体。在细胞的实施方案中，安全港基因座包括小鼠基因组中26号染色体上的Rosa26基因座。在细胞的实施方案中，安全港基因座包括小鼠基因组中11号染色体上的Hipp11基因座。
在实施方案中，细胞是杂交瘤。在实施方案中，细胞是干细胞。在实施方案中，干细胞是胚胎干细胞。在实施方案中，干细胞是成体干细胞。在实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞。在实施方案中，干细胞是围产期干细胞。在实施方案中，细胞是永生化细胞。
在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白。在实施方案中，亲和标签在非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。本文描述了可以在非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达的亲和标签的实例。
在实施方案中，亲和标签包括StrepII、六聚组氨酸、FLAG、HA、Myc、VA、GST、β-GAL、MBP或VSV-G标签。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17或约18个串联重复序列。
在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17或约18个串联重复序列。在实施方案中，串联重复序列在重复序列之间具有标签接头。在实施方案中，接头是二肽或三肽。在实施方案中，标签接头是二肽Ser-Ala。
在实施方案中，StrepII标签包含WSHPQFEK(SEQ ID NO:1)的8个氨基酸肽序列。在实施方案中，亲和标签包含WSHPQFEKSAWSHPQFEKSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:3)。
在实施方案中，荧光报告蛋白被暴露在非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。
在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白或橙色荧光蛋白。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。在实施方案中，荧光报告蛋白包括红色荧光蛋白(RFP)。在实施方案中，红色荧光蛋白是单体樱桃(mCherry)或串联二聚体番茄(tdTomato)。
K.分离条件报告物修饰的细胞的方法
在实施方案中，本文提供了一种用于分离从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞的方法，该方法包括：
(a)从本文描述的经遗传修饰的条件报告物非人类哺乳动物获得细胞；
(b)筛选从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞，用于表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白；和
(c)分离表达融合蛋白的细胞。
在用于分离细胞的方法的实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)来筛选细胞。在用于分离细胞的方法的实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)来筛选细胞。在用于分离细胞的方法的实施方案中，通过磁激活细胞分选(MACS)来筛选细胞。FACS和MACS的技术在本领域是已知的，并且在本文的别处描述。在实施方案中，使用FACS或MACS的细胞分离在图1C中示意性示出。在分离细胞的方法的实施方案中，如本文描述的，使用在细胞表面上表达的亲和标签来分离细胞。在使用亲和标签分离细胞的实施方案中，使用本领域已知方法使用结合亲和标签的亲和柱或亲和树脂分离细胞。
在实施方案中，亲和标签在经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。
在实施方案中，亲和标签包括StrepII、六聚组氨酸、FLAG、HA、Myc、VA、GST、β-GAL、MBP或VSV-G标签。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17或约18个串联重复序列。
在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17或约18个串联重复序列。在实施方案中，串联重复序列在重复序列之间具有标签接头。在实施方案中，接头是二肽或三肽。在实施方案中，标签接头是二肽Ser-Ala。
在实施方案中，StrepII标签包含WSHPQFEK(SEQ ID NO:1)的8个氨基酸肽序列。在实施方案中，亲和标签包含WSHPQFEKSAWSHPQFEKSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:3)。
在实施方案中，荧光报告蛋白被暴露在非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。
在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白或橙色荧光蛋白。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。在实施方案中，荧光报告蛋白包括红色荧光蛋白(RFP)。在实施方案中，红色荧光蛋白是单体樱桃(mCherry)或串联二聚体番茄(tdTomato)。
L.免疫球蛋白报告核酸构建体
在实施方案中，本文提供了一种核酸构建体，其包含接头、前导序列和编码亲和标签、跨膜结构域和荧光报告物的跨膜报告物盒。该核酸构建体的实施方案在本文中可称为“免疫球蛋白报告核酸构建体”。
在实施方案中，核酸构建体包含单链DNA、双链DNA、质粒或病毒载体。在实施方案中，核酸构建体是线性DNA。在实施方案中，核酸构建体是环状DNA。
在实施方案中，核酸构建体还包含与非人类哺乳动物基因组中的第一靶序列和第二靶序列同源的第一同源臂和第二同源臂。同源区域允许使用本文描述的和本领域已知的方法将核酸构建体整合到非人类哺乳动物的基因组中。在实施方案中，核酸构建体还包含第一同源臂和第二同源臂，它们分别与非人类哺乳动物中免疫球蛋白基因座内的第一靶序列和第二靶序列同源，所述非人类哺乳动物中免疫球蛋白基因座例如免疫球蛋白可变结构域基因座或免疫球蛋白恒定结构域基因座或两者之间。在实施方案中，核酸构建体还包含第一同源臂和第二同源臂，它们分别与非人类哺乳动物中免疫球蛋白恒定结构域基因座内的第一靶序列和第二靶序列同源。
在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂分别与第一靶序列和第二靶序列同源，其中第一和第二靶序列位于免疫球蛋白恒定结构域基因座的侧翼。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是κ轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是λ轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白恒定结构域基因座。
在实施方案中，第一靶序列位于免疫球蛋白恒定结构域基因座的上游，并且第二靶序列位于免疫球蛋白恒定结构域基因座的终止密码子的下游。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白κ恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白λ恒定结构域基因座。
在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白恒定结构域基因座。
在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约15个核苷酸至约12000个核苷酸。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约30个核苷酸至约11000个核苷酸。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约50个核苷酸至约10000个核苷酸。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约100个核苷酸至约7500个核苷酸。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约200个核苷酸至约5000个核苷酸。在实施方案中，第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约300个核苷酸至约2500个核苷酸。
在一些实施方案中，接头包含终止密码子和内部核糖体进入位点(IRES)。在实施方案中，其中接头包含蛋白酶识别位点和自裂解肽。在实施方案中，接头包含具有肽接头、蛋白酶识别位点和自裂解肽的渗漏终止密码子(LSC)。
本文描述了蛋白酶识别位点的实施方案。在实施方案中，蛋白酶识别位点包含弗林蛋白酶识别位点。在实施方案中，弗林蛋白酶识别位点包含编码Arg-X-Arg-Arg肽的核酸序列。在实施方案中，X是疏水性氨基酸。在实施方案中，X是亲水性氨基酸。在实施方案中，X是赖氨酸。在实施方案中，典型地，弗林蛋白酶识别位点包含编码肽X-Arg-X-Lys-Arg-X或X-Arg-X-Arg-Arg-X的核酸序列。在实施方案中，X是疏水性氨基酸。在实施方案中，疏水氨基酸包括Gly、Ala、Ile、Leu、Met、Val、Phe、Trp或Tyr。在实施方案中，X是亲水性氨基酸。在实施方案中，亲水性氨基酸是赖氨酸。在实施方案中，弗林蛋白酶识别位点包含编码肽Arg-Lys-Arg-Arg的核酸序列。在实施方案中，弗林蛋白酶识别位点包含编码肽Arg-Arg-Arg-Arg的核酸序列。在实施方案中，弗林蛋白酶识别位点包含编码肽Arg-Arg-Lys-Arg的核酸序列。在实施方案中，弗林蛋白酶识别位点包含编码肽Arg-Lys-Lys-Arg的核酸序列。在实施方案中，正好在弗林蛋白酶位点之前的赖氨酸残基被缺失。在实施方案中，弗林蛋白酶识别位点是如Fang等人,Molecular Therapy 15(6):1153-1159(2007)中描述的弗林蛋白酶识别位点，其通过引用并入本文。
在实施方案中，蛋白酶是内切蛋白酶。在实施方案中，蛋白酶是哺乳动物内切蛋白酶。在实施方案中，蛋白酶是在包含核酸构建体的细胞中内源性表达的内切蛋白酶。在实施方案中，蛋白酶识别位点包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、谷氨酰内肽酶或中性内肽酶识别位点。
本文描述了自裂解肽的实施方案。在实施方案中，自裂解肽包含2A自裂解肽。在实施方案中，自裂解肽包含T2A(EGRGSLLTCGDVEENPGP；SEQ ID NO:4)、P2A(ATNFSLLKQAGDVEENPGP；SEQ ID NO:5)、E2A(QCTNYALLKLAGDVESNPGP；SEQ ID NO:6)或F2A(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP；SEQ ID NO:7)自裂解肽。
本文描述了渗漏终止密码子的实施方案。在实施方案中，编码渗漏终止密码子的序列包括TGACTAG。在实施方案中，编码渗漏终止密码子的序列包括TGACGG。在实施方案中，编码渗漏终止密码子的序列包括TAGCAATTA。在实施方案中，编码渗漏终止密码子的序列包括TAGCAATCA。在实施方案中，编码渗漏终止密码子的序列包含TGACTA。
在接头包含渗漏终止密码子的实施方案中，渗漏终止密码子允许密码子的一些通读，导致跨膜报告物盒被表达。在实施方案中，渗漏密码子的通读转录发生在约5％的时间。在实施方案中，渗漏密码子的通读转录发生在约1％至约10％的时间。在实施方案中，当通读转录不发生时，免疫球蛋白以其内源性形式表达，并且跨膜报告物盒不表达。
在实施方案中，接头是肽接头，例如长度为2个至24个残基的氨基酸链。在实施方案中，肽接头是二肽接头。在实施方案中，接头是三肽接头。在实施方案中，接头长度为四个氨基酸。在实施方案中，接头包含Leu-Gly。在实施方案中，接头包含Gly-Ser-Gly。在实施方案中，接头包含Leu-Gly-Ser-Gly。在实施方案中，接头包含约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个或约10个氨基酸残基。在实施方案中，肽接头包含4个至24个氨基酸残基。在实施方案中，肽接头包含5个至20个氨基酸残基。在实施方案中，肽接头包含7个至15个氨基酸残基。
在实施方案中，前导序列还包含分泌信号肽。在实施方案中，分泌信号肽是IL-2前导序列。在实施方案中，分泌信号肽是人类OSM、VSV-G小鼠Igκ、人类IgG2 H、BM40、Secrecon、人类IgKVIII、CD33、tPA、人类糜蛋白酶原、人类胰蛋白酶原-2、人类IL-2或人类血清白蛋白信号肽。在实施方案中，分泌信号肽包含IL-2前导序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:2)。本领域技术人员将理解，可以使用本领域已知的算法来预测信号肽，例如位于/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的SignalP-5.0服务器和位于www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/的SecretomeP 2.0服务器。
核酸构建体的亲和标签可用于随后分离或纯化由该构建体表达的蛋白质。在实施方案中，亲和标签包括StrepII、六聚组氨酸、FLAG、HA、Myc、VA、GST、β-GAL、MBP或VSV-G标签。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17或约18个串联重复序列。
在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约个1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17或约18个串联重复序列。在实施方案中，串联重复序列在重复序列之间具有标签接头。在实施方案中，标签接头是二肽或三肽。在实施方案中，标签接头是二肽Ser-Ala。在实施方案中，标签接头包括(G4S)2接头(GGGGSGGGGS；SEQ ID NO:8)。在实施方案中，标签接头是(G4S)2接头(GGGGSGGGGS；SEQ ID NO:8)。
在实施方案中，StrepII标签包含WSHPQFEK(SEQ ID NO:1)的8个氨基酸肽序列。在实施方案中，亲和标签包含WSHPQFEKSAWSHPQFEKSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:3)。
由跨膜报告物盒编码的跨膜结构域允许亲和标签呈现在表达核酸构建体的细胞表面。在实施方案中，跨膜结构域包含疏水α-螺旋。在实施方案中，跨膜结构域是IgG跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域是人类IgG1跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域包括小鼠IgG跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域包括小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG2c跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域是小鼠蛋白Tmem53、Lrtm1或Nrg1的跨膜结构域。
荧光报告蛋白允许检测表达核酸构建体的细胞。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白或橙色荧光蛋白。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。在实施方案中，荧光报告蛋白包括红色荧光蛋白(RFP)。在实施方案中，红色荧光蛋白是单体樱桃(mCherry)或串联二聚体番茄(tdTomato)。
在实施方案中，核酸构建体是图2中示意性示出的用于整合到轻链κ恒定区中的特定实施方案的核酸构建体，其中黑色矩形代表该区域的V和J区段；LK代表接头序列；L代表前导序列，STX3代表Strep-II标签的三个串联重复序列，TM代表跨膜结构域，并且GFP代表绿色荧光蛋白报告物。在其他实施方案(未示出)中，核酸构建体被整合到轻链λ恒定区或重链恒定区中。
M.产生免疫球蛋白报告物修饰的细胞和生物体的方法
在实施方案中，本文提供了一种产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法，该方法包括：
(a)将本文描述的免疫球蛋白报告核酸构建体引入非人类哺乳动物细胞；和
(b)将核酸酶引入非人类哺乳动物细胞，其中核酸酶在非人类哺乳动物细胞的基因组中的免疫球蛋白恒定结构域基因座处引起单链断裂或双链断裂，并且核酸构建体通过同源重组在免疫球蛋白恒定结构域基因座处被整合到非人类哺乳动物细胞的基因组中。
在实施方案中，核酸酶引起双链断裂。在实施方案中，核酸酶导致单链断裂(例如，切口)。
可以使用本领域已知的方法将核酸酶引入细胞。在实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的表达构建体。在实施方案中，经由注射或电穿孔引入表达构建体。在实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的质粒。在实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的病毒载体。在实施方案中，引入核酸酶包括引入编码核酸酶的mRNA。在实施方案中，mRNA包含一个或更多个修饰的碱基。在实施方案中，mRNA被封装在脂质纳米颗粒中。在实施方案中，质粒、病毒载体或mRNA的引入经由注射或电穿孔进行。在实施方案中，引入核酸酶包括将核酸酶蛋白直接引入细胞。在实施方案中，经由注射或电穿孔将核酸酶蛋白直接引入细胞。
在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白κ恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白λ恒定结构域基因座。一方面，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。
在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白恒定结构域基因座。
在实施方案中，核酸酶是本文描述的核酸酶。在实施方案中，核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、巨核酸酶或成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)关联(Cas)蛋白和指导RNA(gRNA)。在实施方案中，gRNA包括靶向识别位点的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在实施方案中，CRISPR-Cas蛋白包含Cas9。在实施方案中，Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas12a、Cas13、Cas14或CasΦ。在实施方案中，CRISPR-Cas蛋白包括Cas3、Cas8、Cas10、Cas11、Cas12、Cas12a、Cas13、Cas14或CasΦ。
在实施方案中，非人类哺乳动物细胞来自在科学研究中使用的哺乳动物。在实施方案中，非人类哺乳动物细胞是啮齿动物细胞。在实施方案中，啮齿动物细胞是大鼠细胞或小鼠细胞。
在实施方案中，非人类哺乳动物细胞是多能细胞。在实施方案中，多能细胞是非人类受精卵。在实施方案中，多能细胞是小鼠受精卵。在实施方案中，多能细胞是大鼠受精卵。在实施方案中，多能细胞是非人类胚胎干(ES)细胞。在实施方案中，多能细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞或大鼠胚胎干(ES)细胞。
在实施方案中，将本文描述的核酸构建体注射给受精卵。在实施方案中，将核酸构建体注射到受精卵的原核中。在实施方案中，将微注射的受精卵植入假怀孕的雌性啮齿动物的输卵管中。在实施方案中，假怀孕的雌性啮齿动物是小鼠。在实施方案中，假怀孕的雌性啮齿动物是大鼠。在实施方案中，植入的受精卵发育成胎儿并出生以提供经遗传修饰的非人类哺乳动物。在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物是小鼠。在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物是大鼠。
在实施方案中，产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法还包括分离其中核酸构建体被整合到免疫球蛋白恒定结构域基因座处的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。
在实施方案中，本文还提供了通过上述产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法产生的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。在实施方案中，非人类哺乳动物是啮齿动物。
在产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法的实施方案中，该方法还包括用于产生转基因非人类哺乳动物的步骤。在实施方案中，该方法还包括将遗传编辑材料注射到受精卵中或将工程化分离的细胞注射到囊胚中，并产生包含被整合到免疫球蛋白恒定结构域基因座的核酸构建体的转基因非人类哺乳动物。
在实施方案中，本公开内容提供了一种通过这种方法产生的经遗传修饰的非人类转基因哺乳动物。在实施方案中，转基因哺乳动物是啮齿动物。在实施方案中，啮齿动物是大鼠或小鼠。
N.免疫球蛋白报告物修饰的细胞
在实施方案中，本文提供了一种经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其包含含有本文描述的被整合到免疫球蛋白恒定结构域基因座中的免疫球蛋白报告核酸构建体的基因组。
在细胞的实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白κ恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白λ恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。
在细胞的实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。在实施方案中，免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白恒定结构域基因座。
在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞获取自经免疫的哺乳动物。在实施方案中，经免疫的哺乳动物是啮齿动物。在实施方案中，经免疫的哺乳动物是小鼠或大鼠。
在实施方案中，该细胞是免疫球蛋白表达细胞。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞是未成熟B细胞或未成熟B细胞的后代。在实施方案中，细胞是杂交瘤、干细胞或永生化细胞。在实施方案中，干细胞是胚胎干细胞。在实施方案中，干细胞是成体干细胞。在实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞。在实施方案中，干细胞是围产期干细胞。
在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞表达免疫球蛋白κ轻链。在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞表达免疫球蛋白λ轻链。在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞表达免疫球蛋白重链。
在实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白。在实施方案中，亲和标签在非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。本文描述了可以在非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达的亲和标签的实例。
在实施方案中，亲和标签包括StrepII、六聚组氨酸、FLAG、HA、Myc、VA、GST、β-GAL、MBP或VSV-G标签。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个或约18个串联重复序列。
在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个或约18个串联重复序列。在实施方案中，串联重复序列在重复序列之间具有标签接头。在实施方案中，标签接头是二肽或三肽。在实施方案中，标签接头是二肽Ser-Ala。
在实施方案中，StrepII标签包含WSHPQFEK(SEQ ID NO:1)的8个氨基酸肽序列。在实施方案中，亲和标签包含WSHPQFEKSAWSHPQFEKSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:3)。
在实施方案中，荧光报告蛋白被暴露在非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。
在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白或橙色荧光蛋白。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。在实施方案中，荧光报告蛋白包括红色荧光蛋白(RFP)。在实施方案中，红色荧光蛋白是单体樱桃(mCherry)或串联二聚体番茄(tdTomato)。
在细胞的实施方案中，融合蛋白的表达由内源性免疫球蛋白转录调节因子驱动。在实施方案中，内源性免疫球蛋白转录调节因子是内源性免疫球蛋白轻链转录调节因子。在实施方案中，内源性免疫球蛋白轻链转录调节因子包含启动子和小鼠轻链基因座中的其他顺式调节元件。在实施方案中，内源性免疫球蛋白转录调节因子是内源性免疫球蛋白重链转录调节因子。在实施方案中，内源性免疫球蛋白重链转录调节因子包含启动子和小鼠重链基因座中的其他顺式调节元件。
O.用于鉴定免疫球蛋白报告物修饰的细胞的方法
在实施方案中，本文提供了一种用于鉴定从经遗传修饰的免疫球蛋白报告物非人类哺乳动物获得的免疫球蛋白表达细胞的方法，该方法包括：
(a)从本文描述的经遗传修饰的免疫球蛋白报告物非人类哺乳动物获得细胞；
(b)筛选从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞，以表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白；和
(c)基于融合蛋白的表达鉴定免疫球蛋白表达细胞。
在用于分离细胞的方法的实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)来筛选细胞。在用于分离细胞的方法的实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)来筛选细胞。在用于分离细胞的方法的实施方案中，通过磁激活细胞分选(MACS)来筛选细胞。FACS和MACS的技术在本领域是已知的，并且在本文的别处描述。在实施方案中，图3中示意性示出了从免疫球蛋白报告物修饰的啮齿动物获得细胞、汇集细胞和使用FACS或MACS分离细胞的示例过程。在分离细胞的方法的实施方案中，如本文描述的，使用在细胞表面表达的亲和标签来分离细胞。在使用亲和标签分离细胞的实施方案中，使用本领域已知方法使用结合亲和标签的亲和柱或亲和树脂分离细胞。
在实施方案中，亲和标签在经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。
在实施方案中，亲和标签包括StrepII、六聚组氨酸、FLAG、HA、Myc、VA、GST、β-GAL、MBP或VSV-G标签。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个或约18个串联重复序列。
在实施方案中，亲和标签包括StrepII标签。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个至约18个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约2个至约15个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约3个至约10个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的3个串联重复序列。在实施方案中，亲和标签包含StrepII标签的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个或约18个串联重复序列。在实施方案中，串联重复序列在重复之间具有标签接头。在实施方案中，标签接头是二肽或三肽。在实施方案中，标签接头是二肽Ser-Ala。
在实施方案中，StrepII标签包含WSHPQFEK(SEQ ID NO:1)的8个氨基酸肽序列。在实施方案中，亲和标签包含WSHPQFEKSAWSHPQFEKSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:3)。
在实施方案中，荧光报告蛋白被暴露在非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。
在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白或橙色荧光蛋白。在实施方案中，荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。在实施方案中，荧光报告蛋白包括红色荧光蛋白(RFP)。在实施方案中，红色荧光蛋白是单体樱桃(mCherry)或串联二聚体番茄(tdTomato)。
在该方法的实施方案中，经遗传修饰的非人类哺乳动物已经用感兴趣的抗原免疫。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞表达免疫球蛋白κ轻链。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞表达免疫球蛋白λ轻链。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞表达免疫球蛋白重链。在实施方案中，免疫球蛋白表达细胞包括未成熟B细胞及其后代。
在实施方案中，该方法还包括分离从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞中表达的免疫球蛋白。在实施方案中，本文提供了通过该方法获得的免疫球蛋白。
在实施方案中，本文提供了一种产生治疗性或诊断性免疫球蛋白的方法，该方法包括：
(i)克隆本文公开的免疫球蛋白的可变结构域；和
(ii)产生包含在(i)中获得的可变结构域的治疗性或诊断性免疫球蛋白。
在实施方案中，本文还提供了一种产生单克隆抗体的方法，该方法包括：
(i)从本文公开的经遗传修饰的非人类哺乳动物获得免疫球蛋白表达细胞；
(ii)使(i)中获得的免疫球蛋白表达细胞永生化；和
(iii)分离由永生化免疫球蛋白表达细胞表达的单克隆抗体，或编码该单克隆抗体的核酸序列。
在实施方案中，该方法还包括：
(iv)克隆分离的单克隆抗体的可变结构域；和
(v)产生包含克隆的可变结构域的治疗性或诊断性抗体。
在实施方案中，本文提供了通过上述方法产生的治疗性或诊断性抗体。
P.通过引用并入
本文提及的全部参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等，以及其中提及的参考文献，在它们尚未被引用的程度，在此通过引用以其整体并入本文。
工作实施例
实施例1.免疫球蛋白标记盒及靶向载体的构建
步骤1：通过连接组分序列形成连续的盒来装配跨膜标记盒。在该实施例中，标记盒包含编码接头、前导序列、具有标签接头的Strep-II标签的三个重复序列(WSHPQFEKSAWSHPQFEKSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:3))、跨膜结构域和绿色荧光蛋白(GFP)的序列，如图2中示意性示出的。
三种不同的接头选择是：
选择1：LSL-弗林蛋白酶-2A。该接头包含渗漏终止密码子、Leu-Gly接头序列、弗林蛋白酶识别和裂解位点以及2A自裂解肽。这种设计的优点是将IgK的大部分保持在其内源性形式。由于渗漏终止密码子仅允许约5％的转录通读，StrepII-标签-GFP的表达水平仅为总IgK的5％。因此，在某些情况下，这种设计可能是StrepII-标签-GFP将以太低的水平表达，而不能使用FACS/MACS有效地富集这种细胞。
选择2：弗林蛋白酶-2A。该接头包含弗林蛋白酶识别和裂解位点以及2A自裂解肽。这种接头的优点是它确保了StrepII-标签-GFP的高表达，但这种表达水平在某些情况下可能对细胞有毒。
选择3：终止密码子IRES(内部核糖体进入位点)。该接头包含终止密码子，后跟IRES，它允许报告基因作为一种独立于免疫球蛋白的蛋白质被转录。IRES提供了介于上述两种策略之间的StrepII-标签-GFP表达水平。
步骤2：将来自步骤1的构建体连接到具有靶向啮齿动物Igκ(IgK)基因组区域的终止密码子的同源侧翼区域的靶向载体中。可用于敲入的载体包括pUC18、pUC19和pBluescript II KS+。该载体将在IgK的终止密码子处敲入StrepII-标签-GFP标记盒，如图2中示意性示出的。
可选地，合成的单链DNA可以合成为带有在标记盒的每一侧的200bp-500bp同源性定义区域，以形成合成的靶向盒。这种合成的靶向盒构建体可以使用CRISPR靶向系统直接掺入。
实施例2.Strep II-标签和GFP表达水平的体外评价
为了确保StrepII-标签-GFP的表达水平与下游应用相容，使用啮齿动物B细胞系用靶向载体进行体外实验，以评估StrepII-标签-GFP的表达水平以及IgK的表达水平。将选择为下游应用提供最高IgK表达水平以及尚好的StrepII-标签和GFP水平的载体进行进一步研究。分泌的抗体将经由生化测量进行定量，诸如Octet。细胞表面展示的抗体将通过流式分析检测。简而言之，细胞将与荧光标记的抗免疫球蛋白抗体在4℃孵育30min；将使用流式细胞仪测量荧光信号。为了确保标记盒在IgK基因座的表达不会干扰IgK功能，将使用啮齿动物B细胞系进行体外试验，以鉴定理想的接头序列。
实施例3.IgK报告物啮齿动物品系的产生
用靶向载体转化小鼠胚胎干细胞，以经由同源重组在IgK终止密码子处插入标记盒。为了提高IgK终止密码子处靶向敲入的效率，将使用CRISPR/Cas9系统。设计并合成靶向基因组中IgK终止密码子周围邻近区域的sgRNA组分，随后与Cas9酶装配以形成RNP复合体，并用同源重组修复(HDR)模板一起作为单链DNA或载体共注射到受精的卵母细胞或胚胎干细胞中。同源重组将使含有标记盒的供体片段在由Cas9引起的靶向双链断裂后被整合到基因座中。将经过成功重组(通过southern印迹分析和PCR确定)的胚胎干细胞显微注射到囊胚中以产生转基因小鼠。
从转基因小鼠获得mAb表达细胞，并评估标记效率。简而言之，抗体表达细胞将经由FACS使用传统的流式标志物进行分离。将细胞与荧光标记的抗免疫球蛋白抗体在4℃孵育30min。使用流式细胞仪测量荧光信号。
实施例4.条件报告物标记盒及靶向载体的构建
步骤1：通过连接组分序列形成连续的盒来装配跨膜标记盒转基因。标签盒包含CAG启动子、前导序列、LoxP-Stop-LoxP盒、Strep-II标签的三个串联重复序列、跨膜结构域和绿色荧光蛋白(GFP)，如图1A中示意性示出的。
步骤2：将来自步骤1的构建体连接到具有靶向ROSA26基因组区域的内含子1的同源侧翼区域的靶向载体中。在ROSA26基因的第一个内含子内的Xba1限制性位点插入剪接受体(SA)序列，随后插入DNA盒。该载体将敲入安全港ROSA26基因座中的StrepII-标签-GFP标记盒，如图1A中示意性示出的。
可选地，合成的单链DNA可以合成为带有在标记盒的每一侧的200bp-500bp同源性定义区域，以形成合成的靶向盒。这种合成的靶向盒构建体可以使用CRISPR靶向系统被直接整合到ROSA26的内含子1中。
实施例5.条件报告物啮齿动物品系的产生
用转基因靶向载体转化小鼠胚胎干细胞，以经由同源重组在ROSA26的内含子1插入标记盒。作为一种替代方法，在ROSA26的内含子1处靶向敲入CRISPR/Cas9系统。靶向基因组中ROSA26的内含子1的sgRNA组分被设计和被合成，随后与Cas9酶装配以形成RNP复合物，并与同源重组修复(HDR)模板一起作为单链DNA或载体共注射或电穿孔到受精卵母细胞或胚胎干细胞中。同源重组将使含有标记盒的供体片段在由Cas9引起的靶向双链断裂后整合到基因座中。将经过成功重组(通过southern印迹分析和PCR确定)的胚胎干细胞显微注射到囊胚中以产生转基因小鼠。
将含有整合的转基因的小鼠与Cre switch品系小鼠杂交，Cre switch品系小鼠具有受感兴趣的组织特异性启动子控制的Cre。在一种实施方案中，Cre switch品系小鼠是Blimp1-CreERT2小鼠品系，其在浆母细胞和浆细胞中表达的Blimp1启动子的控制下表达Cre。在另一种实施方案中，switch品系小鼠是JchaincreERT2小鼠。
实施例6.从受精卵产生报告物啮齿动物品系
将实施例1或实施例3描述的载体直接注射到小鼠受精卵中。将载体显微注射到受精卵(受精的小鼠卵母细胞)的原核中。由此产生的胚胎被植入假孕雌性的输卵管中，并允许其发育至足月。胚胎被排出到小鼠的输卵管中，并用伤口夹闭合伤口。在第18-21天检查小鼠是否产下活的后代。使用上述方法分析新生小鼠跨膜标记构建体的表达。
序列
序列标识 SEQ ID NO:
Strep-II标签 WSHPQFEK 1
IL-2前导序列 MYRMQLLSCIALSLALVTNS 2
Step-II亲和标签 WSHPQFEKSAWSHPQFEKSAWSHPQFEK 3
T2A肽 EGRGSLLTCGDVEENPGP 4
P2A肽 ATNFSLLKQAGDVEENPGP 5
E2A肽 QCTNYALLKLAGDVESNPGP 6
F2A肽 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP 7
(G4S)2接头 GGGGSGGGGS 8
。

Claims (145)

1.一种核酸构建体，包含前导序列、LoxP-Stop-LoxP盒和编码亲和标签、跨膜(TM)结构域和荧光报告蛋白的跨膜报告物盒。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含单链DNA、双链DNA、质粒或病毒载体。
3.根据权利要求1所述的核酸构建体，还包含分别与非人类哺乳动物的安全港基因座内的第一靶序列和第二靶序列同源的第一同源臂和第二同源臂。
4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其中所述第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约15个核苷酸至约12000个核苷酸。
5.根据权利要求3或4所述的核酸构建体，其中所述安全港基因座包括小鼠基因组中6号染色体上的Rosa26基因座或小鼠基因组中11号染色体上的Hipp11基因座。
6.根据权利要求1所述的核酸构建体，还包含驱动所述前导序列表达的启动子。
7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其中所述启动子包含哺乳动物启动子。
8.根据权利要求16所述的核酸构建体，其中所述启动子包含CAG、CMV、EF1a、SV40、PGK1、Ubc或人类β肌动蛋白启动子。
9.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述前导序列包含分泌信号肽。
10.根据权利要求9所述的核酸构建体，其中所述分泌信号肽包含所述IL-2前导序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:2)。
11.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述亲和标签包含StrepII标签。
12.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述亲和标签包含StrepII标签的串联重复序列。
13.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述亲和标签包含StrepII标签的约1个至约18个串联重复序列，在重复序列之间具有标签接头。
14.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述亲和标签包含StrepII标签的3个串联重复序列。
15.根据权利要求19至22中任一项所述的核酸构建体，其中所述StrepII标签包含WSHPQFEK(SEQ ID NO:1)的8个氨基酸肽序列。
16.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述跨膜结构域包含疏水α-螺旋。
17.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述荧光报告蛋白包含绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
18.一种产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求1-17中任一项所述的核酸构建体引入所述非人类哺乳动物细胞；和
(b)将核酸酶引入所述非人类哺乳动物细胞，其中所述核酸酶在所述非人类哺乳动物细胞的基因组中的安全港基因座处引起单链断裂或双链断裂，其中所述核酸构建体通过同源重组在所述安全港基因座处被整合到所述非人类哺乳动物细胞的基因组中。
19.根据权利要求18所述的方法，其中引入所述核酸酶包括引入编码所述核酸酶的表达构建体。
20.根据权利要求18所述的方法，其中引入所述核酸酶包括引入编码所述核酸酶的mRNA。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、巨核酸酶或成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)关联(Cas)蛋白和指导RNA(gRNA)。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述gRNA包含靶向识别位点的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述CRISPR-Cas蛋白包含Cas9。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述非人类哺乳动物细胞是啮齿动物细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述啮齿动物细胞是大鼠细胞或小鼠细胞。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述安全港基因座包括小鼠基因组中6号染色体上的Rosa26基因座或11号染色体上的Hipp11基因座。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述非人类哺乳动物细胞是多能细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述多能细胞是非人类受精卵或非人类胚胎干(ES)细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述多能细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞、大鼠胚胎干(ES)细胞、小鼠受精卵或大鼠受精卵。
30.根据权利要求18至29中任一项所述的方法，还包括分离其中所述核酸构建体被整合到所述安全港基因座处的所述经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。
31.一种经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，由根据权利要求18至30中任一项所述的方法产生。
32.根据权利要求30所述的方法，还包括将所分离的细胞注射到囊胚中，并产生包含被整合到所述安全港基因座中的所述核酸构建体的转基因非人类哺乳动物。
33.根据权利要求32所述的方法产生的经遗传修饰的非人类转基因哺乳动物。
34.根据权利要求33所述的经遗传修饰的非人类转基因哺乳动物，其中所述哺乳动物是啮齿动物。
35.根据权利要求34所述的经遗传修饰的非人类转基因哺乳动物，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
36.根据权利要求32所述的方法，还包括将包含被整合到所述安全港基因座中的所述核酸构建体的所述转基因非人类哺乳动物与表达Cre重组酶的转基因非人类哺乳动物进行交配繁殖，以获得具有表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白的细胞的非人类哺乳动物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中包含被整合到所述安全港基因座中的所述核酸构建体的所述转基因非人类哺乳动物是包含被整合到Rosa26基因座中的所述核酸构建体的小鼠，并且其中表达Cre重组酶的所述转基因非人类哺乳动物是小鼠。
38.根据权利要求36所述的方法，其中包含被整合到所述安全港基因座中的所述核酸构建体的所述转基因非人类哺乳动物是包含被整合到Hipp11基因座中的所述核酸构建体的小鼠，并且其中表达Cre重组酶的所述转基因非人类哺乳动物是小鼠。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述转基因小鼠中的Cre表达是组织特异性的。
40.一种经遗传修饰的非人类哺乳动物，所述经遗传修饰的非人类哺乳动物具有由权利要求37或38所述的方法产生的细胞，所述细胞表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白。
41.一种经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，包含含有被整合到安全港基因座中的权利要求1至17中任一项所述的核酸构建体的基因组。
42.根据权利要求41所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述安全港基因座包括小鼠基因组中26号染色体上的Rosa26基因座或小鼠基因组中11号染色体上的Hipp11基因座。
43.根据权利要求41或42所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述细胞是杂交瘤、干细胞或永生化细胞。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白。
45.根据权利要求44所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述亲和标签在所述非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。
46.根据权利要求45所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述亲和标签包含StrepII标签。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述荧光报告蛋白被暴露在所述非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。
48.根据权利要求47所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
49.一种用于分离从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞的方法，所述方法包括：
(a)从权利要求40的经遗传修饰的非人类哺乳动物获得细胞；
(b)筛选从所述经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞，以表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白；和
(c)分离表达所述融合蛋白的细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)筛选所述细胞。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述亲和标签在所述经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述亲和标签包括StrepII标签。
53.根据权利要求49所述的方法，其中所述荧光报告蛋白被暴露在所述非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
55.一种核酸构建体，包含接头、前导序列和编码亲和标签、跨膜结构域和荧光报告物的跨膜报告物盒。
56.根据权利要求55所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含单链DNA、双链DNA、质粒或病毒载体。
57.根据权利要求56所述的核酸构建体，还包含分别与第一靶序列和第二靶序列同源的第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一靶序列和第二靶序列位于免疫球蛋白恒定结构域基因座的侧翼。
58.根据权利要求56所述的核酸构建体，其中所述第一靶序列位于免疫球蛋白恒定结构域基因座的上游，并且所述第二靶序列位于所述免疫球蛋白恒定结构域基因座的终止密码子的下游。
59.根据权利要求58所述的核酸构建体，其中所述免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。
60.根据权利要求59所述的核酸构建体，其中所述免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白κ恒定结构域基因座。
61.根据权利要求59所述的核酸构建体，其中所述免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白λ恒定结构域基因座。
62.根据权利要求58所述的核酸构建体，其中所述免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。
63.根据权利要求62所述的核酸构建体，其中所述免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。
64.根据权利要求57至63中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一同源臂和第二同源臂各自独立地包含约15个核苷酸至约12000个核苷酸。
65.根据权利要求55所述的核酸构建体，其中所述接头包含终止密码子和内部核糖体进入位点(IRES)。
66.根据权利要求55所述的核酸构建体，其中所述接头包含蛋白酶识别位点和自裂解肽。
67.根据权利要求55所述的核酸构建体，其中所述接头包含具有肽接头的渗漏终止密码子(LSC)、蛋白酶识别位点和自裂解肽。
68.根据权利要求66或67所述的核酸构建体，其中所述蛋白酶识别位点包含弗林蛋白酶识别位点。
69.根据权利要求68所述的核酸构建体，其中所述弗林蛋白酶识别位点包含编码肽Arg-X-Arg-Arg的核酸序列，其中X是疏水性氨基酸或亲水性氨基酸。
70.根据权利要求68所述的核酸构建体，其中所述弗林蛋白酶识别位点包含编码肽X-Arg-X-Lys-Arg-X或X-Arg-X-Arg-Arg-X的核酸序列，其中X是疏水性氨基酸或亲水性氨基酸。
71.根据权利要求69或70所述的核酸构建体，其中所述疏水性氨基酸是Gly、Ala、Ile、Leu、Met、Val、Phe、Trp或Tyr，或者其中所述亲水性氨基酸是赖氨酸。
72.根据权利要求66或67所述的核酸构建体，其中所述自裂解肽包含2A自裂解肽。
73.根据权利要求67所述的核酸构建体，其中所述渗漏终止密码子包含TGACTAG。
74.根据权利要求67所述的核酸构建体，其中所述肽接头包含Leu-Gly。
75.根据权利要求55至74中任一项所述的核酸构建体，其中所述前导序列包含分泌信号肽。
76.根据权利要求75所述的核酸构建体，其中所述分泌信号肽包含IL-2前导序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:2)。
77.根据权利要求55至76中任一项所述的核酸构建体，其中所述亲和标签包含StrepII标签。
78.根据权利要求77所述的核酸构建体，其中所述亲和标签包含StrepII标签的串联重复序列。
79.根据权利要求77所述的核酸构建体，其中所述亲和标签包含StrepII标签的约1个至约18个串联重复序列，在重复序列之间具有标签接头。
80.根据权利要求77所述的核酸构建体，其中所述亲和标签包含StrepII标签的3个串联重复序列。
81.根据权利要求77至80中任一项所述的核酸构建体，其中所述StrepII标签包含TrpSer His Pro Gln Phe Glu Lys的8个氨基酸肽序列(SEQ ID NO：XX)。
82.根据权利要求55至81中任一项所述的核酸构建体，其中所述跨膜结构域包含疏水α-螺旋。
83.根据权利要求55至82中任一项所述的核酸构建体，其中所述荧光报告蛋白包含绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
84.一种产生经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：
(a)将根据权利要求55至83中任一项所述的核酸构建体引入所述非人类哺乳动物细胞；和
(b)将核酸酶引入所述非人类哺乳动物细胞，其中所述核酸酶在所述非人类哺乳动物细胞的基因组中的免疫球蛋白恒定结构域基因座处引起单链断裂或双链断裂，并且所述核酸构建体通过同源重组在所述免疫球蛋白恒定结构域基因座处被整合到所述非人类哺乳动物细胞的基因组中。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白κ恒定结构域基因座。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白λ恒定结构域基因座。
88.根据权利要求84所述的方法，其中所述免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。
90.根据权利要求84至89中任一项所述的方法，其中引入所述核酸酶包括引入编码所述核酸酶的表达构建体。
91.根据权利要求84至89中任一项所述的方法，其中引入所述核酸酶包括引入编码所述核酸酶的mRNA。
92.根据权利要求84至89中任一项所述的方法，其中所述核酸酶包含锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、巨核酸酶或成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)关联(Cas)蛋白和指导RNA(gRNA)。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述gRNA包含靶向识别位点的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。
94.根据权利要求92所述的方法，其中所述CRISPR-Cas蛋白包含Cas9。
95.根据权利要求84至94中任一项所述的方法，其中所述非人类哺乳动物细胞是啮齿动物细胞。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述啮齿动物细胞是大鼠细胞或小鼠细胞。
97.根据权利要求84至96中任一项所述的方法，其中所述非人类哺乳动物细胞是多能细胞。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述多能细胞是非人类受精卵或非人类胚胎干(ES)细胞。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述多能细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞、大鼠胚胎干(ES)细胞、小鼠受精卵或大鼠受精卵。
100.根据权利要求84至99中任一项所述的方法，还包括分离其中所述核酸构建体被整合到所述免疫球蛋白恒定结构域基因座处的所述经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。
101.根据权利要求84至100中任一项所述的方法产生的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞。
102.根据权利要求101所述的方法，还包括将所分离的细胞注射到囊胚中，并产生包含被整合到所述免疫球蛋白恒定结构域基因座中的所述核酸构建体的转基因非人类哺乳动物。
103.一种经遗传修饰的非人类转基因哺乳动物，由权利要求101所述的方法产生。
104.一种经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，包含含有被整合到免疫球蛋白恒定结构域基因座中的权利要求55至83中任一项所述的核酸构建体的基因组。
105.根据权利要求104所述的经遗传修饰的非人类细胞，其中所述恒定结构域基因座是轻链恒定结构域基因座。
106.根据权利要求105所述的经遗传修饰的非人类细胞，其中所述轻链恒定结构域基因座是κ恒定结构域基因座。
107.根据权利要求105所述的经遗传修饰的非人类细胞，其中所述轻链恒定结构域基因座是λ恒定结构域基因座。
108.根据权利要求104所述的经遗传修饰的非人类细胞，其中所述恒定结构域基因座是重链恒定结构域基因座。
109.根据权利要求108所述的经遗传修饰的非人类细胞，其中所述免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。
110.根据权利要求104至109中任一项所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述免疫球蛋白表达细胞获自经免疫的哺乳动物。
111.根据权利要求104至110中任一项所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述细胞是免疫球蛋白表达细胞。
112.根据权利要求104所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物，其中所述经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞表达免疫球蛋白κ轻链。
113.根据权利要求104至112中任一项所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述免疫球蛋白表达细胞是未成熟B细胞或未成熟B细胞的后代。
114.根据权利要求104至112中任一项所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述细胞是杂交瘤、干细胞或永生化细胞。
115.根据权利要求104至114中任一项所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白。
116.根据权利要求115所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述亲和标签在所述非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。
117.根据权利要求116所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述亲和标签包含StrepII标签。
118.根据权利要求115至117中任一项所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述荧光报告蛋白被暴露在所述非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。
119.根据权利要求118所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
120.根据权利要求115所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述融合蛋白的表达由内源性免疫球蛋白转录调节因子驱动。
121.根据权利要求120所述的经遗传修饰的非人类细胞，其中所述内源性免疫球蛋白转录调节因子是内源性免疫球蛋白轻链转录调节因子。
122.根据权利要求121所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述内源性免疫球蛋白轻链转录调节因子包含启动子和所述小鼠轻链基因座中的其它顺式调节元件。
123.根据权利要求120所述的经遗传修饰的非人类细胞，其中所述内源性免疫球蛋白转录调节因子是内源性免疫球蛋白重链转录调节因子。
124.根据权利要求123所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞，其中所述内源性免疫球蛋白重链转录调节因子包含启动子和所述小鼠重链基因座中的其它顺式调节元件。
125.一种用于鉴定从经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的免疫球蛋白表达细胞的方法，所述方法包括：
(a)从权利要求103所述的经遗传修饰的非人类哺乳动物获得细胞；
(b)筛选从所述经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞，以表达包含亲和标签、跨膜结构域和荧光报告蛋白的融合蛋白；和
(c)基于所述融合蛋白的表达鉴定免疫球蛋白表达细胞。
126.根据权利要求125所述的方法，其中通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)筛选所述细胞。
127.根据权利要求125所述的方法，其中所述亲和标签在所述经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞的细胞表面上表达。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述亲和标签包括StrepII标签。
129.根据权利要求125所述的方法，其中所述荧光报告蛋白被暴露在所述非人类哺乳动物细胞的胞质表面上。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述荧光报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
131.根据权利要求125至130中任一项所述的方法，其中所述经遗传修饰的非人类哺乳动物已经用感兴趣的抗原免疫。
132.根据权利要求125至131中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白表达细胞表达免疫球蛋白κ轻链。
133.根据权利要求125至132中任一项所述的方法，其中编码所述融合蛋白的基因被整合到免疫球蛋白恒定结构域基因座中的细胞基因组上。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白κ恒定结构域基因座。
136.根据权利要求134所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链恒定结构域基因座是免疫球蛋白λ恒定结构域基因座。
137.根据权利要求133所述的方法，其中所述免疫球蛋白恒定结构域基因座是免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定结构域基因座是γ、δ、α、μ或ε免疫球蛋白重链恒定结构域基因座。
139.根据权利要求125至138中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白表达细胞包括未成熟B细胞及其后代。
140.根据权利要求125至139中任一项所述的方法，还包括分离从来自经遗传修饰的非人类哺乳动物获得的细胞中表达的免疫球蛋白。
141.一种免疫球蛋白，由权利要求140所述的方法获得。
142.一种产生治疗性或诊断性免疫球蛋白的方法，所述方法包括：
(i)克隆权利要求141所述的免疫球蛋白的可变结构域；和
(ii)产生包含在(i)中获得的所述可变结构域的治疗性或诊断性免疫球蛋白。
143.一种产生单克隆抗体的方法，所述方法包括：
(i)从权利要求103的经遗传修饰的非人类哺乳动物获得免疫球蛋白表达细胞；
(ii)使(i)中获得的免疫球蛋白表达细胞永生化；和
(iii)分离由永生化免疫球蛋白表达细胞表达的单克隆抗体或编码所述单克隆抗体的核酸序列。
144.根据权利要求143所述的方法，所述方法还包括：
(iv)克隆所分离的单克隆抗体的可变结构域；和
(v)产生包含所克隆的可变结构域的治疗性或诊断性抗体。
145.一种治疗性或诊断性抗体，由权利要求144所述的方法产生。
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