CN118006716B - 制备高表达且低o-糖基化水平的重组人白蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备高表达且低O‑糖基化水平的重组人白蛋白的方法，包括在发酵过程中至少采取一种措施提高蛋白表达速率、降低蛋白的O‑糖基化水平；具体包括S1、种子液制备；S2、分批发酵：将BSM培养基投入发酵罐，调节pH至5.0‑5.8、灭菌，待冷却后校正溶氧，设置温度28‑29.5℃和通气量，向培养基中加入已除菌的PTM1溶液，并再次调节培养基pH至5.0‑5.8；S3、甘油补料发酵：匀速流加甘油补料，发酵至30h以上；S4、甲醇补料发酵：流加甲醇补料，罐内PH值维持5.8‑6.0，温度降至24‑28℃，保持溶氧20％以上；S5、发酵产物离心，收集上清；本发明的方法可提供蛋白表达水平、减少蛋白O‑糖基化，所表达的重组蛋白含有极低水平的糖基化修饰。

Description

制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，属于医药领域。

背景技术

人血清白蛋白是人血浆中含量最丰富的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量约66.5kD。临床上广泛应用于失血创伤和烧伤等引起的休克、水肿或腹水等危重病症的治疗、以及低蛋白血症等。

此外，白蛋白本身不存在N糖基化位点，但是在其S/T位点上可能具有一定程度的O-糖基化。尤其是酵母表达体系的重组产品，基于表达体系自身特性通常会产生一定程度的甘露糖基化，具有潜在的免疫原性，在人体内易被清除，半衰期短。因此，迫切需要寻找能够调控酵母表达体系重组蛋白的O-糖基化修饰的方法。

目前对于酵母蛋白O-糖基化水平的控制主要通过基因工程手段来实现。中国专利CN200980105645.9提供了一种可用于生产低水平的O-糖基化蛋白的酵母菌株，制备方法是将编码内源伴侣蛋白的基因替换为伴侣蛋白哺乳动物同系物的基因并破坏或去除O-甘露糖基转移酶基因，和/或过表达内源或外源Ca2+ATP酶。中国专利201080030803.1提供了一种控制抗体的O-联糖基化的方法，所述方法通过修饰目的蛋白的核酸序列从而将选自S、T或Y并且受到O-联糖基化的至少一个氨基酸残基取代或缺失。但通过基因工程手段降低蛋白O-糖基化水平可能会对酵母的细胞活性和目的蛋白的功能性质产生负面影响，例如甘露糖基转移酶基因缺陷可能会影响细胞壁的完整性，进而导致细胞低活力。

综上所述，如何调控酵母蛋白的O-糖基化水平，是利用酵母表达系统生产重组人白蛋白的一大难点。

发明内容

本发明提供了一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，可提供蛋白表达水平、减少蛋白O-糖基化，所表达的重组蛋白含有极低水平的糖基化修饰。

为达此目的，本发明提供如下的技术方案：

本发明提供了一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，所述方法包括在发酵过程中至少采取一种措施提高蛋白表达速率、降低蛋白的O-糖基化水平；所述措施包括至少改变下列一种发酵条件：

1)诱导温度；

2)诱导pH；

3)诱导阶段溶氧量；

4)诱导时间点；

5)诱导物浓度；

6)诱导物补加方式；

7)诱导物补加流速。

在本实施例中，所述措施可以通过对诱导条件进行直接改变；也可以通过在分批发酵阶段改变发酵条件对诱导条件进行间接改变。

在本发明中，所述诱导时间点基于培养时间和/或培养参数而确定；所述诱导物补加方式可以是连续流加或不连续流加、单独流加或与其他碳源同时流加；所述诱导物补加流速可以是恒定流速、渐增流速、基于生物量或溶氧反馈而确定流速。

优选的，包括以下步骤：

S1、种子液制备：取保存菌种进行平板划线，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中28-30℃培养，待摇瓶种子OD600达到10-12时，作为上罐用种子液；

S2、分批发酵：将BSM培养基投入发酵罐，调节pH至5.0-5.8、灭菌，待冷却后校正溶氧，设置温度28-29.5℃和通气量，向培养基中加入已除菌的PTM1溶液，并再次调节培养基pH至5.0-5.8；通过取样口将发酵罐内培养基弃掉部分，将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧、设置转速，发酵期间通过调整转数和通气量维持溶氧20％以上；

S3、甘油补料发酵：当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油补料，发酵至30h以上，停止补加甘油；

S4、甲醇补料发酵：不添加任何碳源，以保证甘油完全耗尽；饥饿处理后，流加甲醇补料，罐内PH值维持5.8-6.0，温度降至24-28℃，实时监测各发酵参数，保持溶氧20％以上；

S5、发酵结束，放罐，发酵产物离心，收集上清。

优选的，步骤S1的菌种为CBS7435-rHSA，CBS7435-rHSA菌株采用以下方法制备：

R1、设计并合成重组人白蛋白DNA序列，序列如SEQ ID NO.1所示；

R2、将序列连接到pPICZαA载体上，酶切位点为PmII和XbaI，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有zeocin的LB平板上，挑取单克隆转入含有zeocin的LB液体培养基中，重提质粒，经酶切鉴定和测序验证，表达质粒构建正确，命名为pPICZαA-rHSA；

R3、将质粒载体经Sac I酶切线性化后电转化入CBS7435感受态细胞中，将转化好的菌株涂布于含有zeocin的YPD抗性平板上，挑取阳性单克隆，获得重组人白蛋白表达菌株CBS7435-rHSA。

本发明中，SEQ ID NO.1为：

GACGCACATAAATCTGAAGTTGCACACCGTTTTAAGGACTTGGGTGAGGAAAATTTTAAAGCATTGGTCTTAATTGCCTTCGCACAGTATCTGCAGCAATGCCCCTTTGAAGATCACGTTAAATTAGTTAATGAGGTGACAGAATTTGCAAAGACTTGTGTTGCTGATGAATCTGCTGAGAATTGTGATAAATCACTGCATACGTTGTTTGGTGACAAGTTATGTACTGTGGCCACCTTACGAGAAACCTATGGCGAGATGGCTGATTGTTGTGCTAAGCAAGAGCCTGAAAGAAATGAATGTTTTCTACAGCATAAAGACGATAATCCAAACTTGCCTAGACTGGTGCGTCCAGAAGTTGACGTGATGTGTACCGCTTTTCACGATAATGAGGAAACCTTTTTGAAGAAGTACTTGTATGAGATCGCCCGTCGTCACCCATATTTCTATGCCCCAGAACTGCTGTTTTTCGCCAAGCGTTATAAAGCTGCTTTTACAGAGTGTTGCCAAGCTGCTGATAAGGCCGCATGCTTATTACCCAAGCTTGATGAGTTGAGAGATGAAGGCAAAGCCTCCTCCGCAAAACAAAGACTTAAATGTGCTTCTCTGCAGAAATTCGGTGAGAGAGCTTTCAAAGCTTGGGCAGTAGCAAGGCTAAGTCAGAGGTTTCCAAAAGCAGAATTCGCTGAGGTCTCTAAATTGGTTACCGATTTGACCAAGGTTCATACAGAATGCTGTCATGGTGATTTGTTGGAATGTGCAGATGACCGTGCTGATCTTGCAAAGTACATTTGTGAGAATCAGGACAGTATTTCTTCTAAGCTGAAGGAATGCTGCGAAAAGCCACTGCTTGAAAAAAGTCACTGCATCGCCGAGGTAGAAAACGATGAGATGCCAGCAGACTTGCCATCTCTTGCAGCAGACTTCGTTGAGTCAAAGGACGTCTGCAAAAATTACGCCGAAGCCAAAGATGTTTTTCTGGGTATGTTTCTGTACGAATACGCACGTAGACATCCAGACTACTCTGTAGTATTGTTGCTGAGGTTGGCTAAGACTTACGAGACCACTTTGGAGAAATGTTGTGCAGCTGCAGACCCACATGAATGTTATGCTAAAGTCTTTGATGAATTCAAACCTTTAGTCGAAGAGCCCCAAAACTTAATTAAGCAAAACTGTGAATTATTCGAACAGTTAGGTGAGTACAAGTTCCAGAATGCATTGCTAGTCCGTTATACTAAAAAAGTACCCCAAGTTTCAACCCCCACTTTAGTTGAGGTTTCCAGAAATTTGGGTAAGGTTGGTTCTAAATGCTGTAAGCACCCCGAGGCTAAAAGAATGCCATGTGCTGAGGATTATTTATCAGTAGTTCTAAACCAGCTATGTGTCCTTCATGAAAAAACTCCTGTCTCTGATAGGGTCACTAAATGTTGTACGGAGTCTTTAGTGAATAGACGACCTTGTTTTTCCGCTTTGGAAGTTGATGAGACTTACGTTCCTAAAGAGTTCAATGCCGAAACTTTTACCTTTCACGCTGATATCTGCACTTTATCTGAGAAGGAGCGTCAGATTAAGAAGCAAACCGCTCTTGTCGAGCTTGTTAAACATAAGCCTAAAGCTACAAAGGAACAATTGAAAGCCGTTATGGACGATTTTGCCGCTTTTGTTGAGAAGTGTTGCAAAGCTGACGATAAGGAGACTTGTTTCGCCGAAGAAGGCAAAAAACTGGTAGCAGCCTCACAAGCTGCTCTAGGTCTTTAA。

优选的，步骤S3和步骤S4之间，还包括混合补料发酵：甘油补料和甲醇补料同时流加，温度为24℃，pH调至5.85。

优选的，步骤S1和S2中，温度为28℃；步骤S2中，调节pH至5.0。

优选的，步骤S1中，步骤S2-S4，溶氧30％以上。

优选的，步骤S4中，流加甲醇补料的方法为：以10-12mL/h·L的恒定流速流加甲醇补料，或，先以3-5mL/h·L的初始速度流加甲醇补料，逐渐增大流速至10-12mL/h·L。

优选的，步骤S4中，将溶氧与甲醇补料偶联，偶联相关性为反向相关，临界值为20-30％，即溶氧高于临界值时开启补料，溶氧低于临界值时停止，甲醇补料的工作周期为10-15s。

优选的，每20L的BSM培养基包括以下组分：85％磷酸534 -600mL，二水合硫酸钙18.6 -20g，硫酸钾364 -400g，二水合硫酸镁298-320g，氢氧化钾82.6-100g，甘油800-850g；每500mL的PTM1溶液包括以下组分：五水硫酸铜3-5g，碘化钾0.044-0.1g，一水合硫酸锰1.5 -2g，二水合钼酸钠0.1-0.2g，硼酸0.01 -0.03g，氯化钴0.25-0.35g，氯化锌10-12g，七水合硫酸亚铁32.5 -35g，生物素0.1 -0.2g，硫酸2.5-3.0mL；每500mL的YPD包括以下组分：酵母提取物5 -10g，蛋白胨10 -20g，葡萄糖10-20g。

优选的，甘油补料包括：甘油、纯化水、消泡剂和PTM1；甲醇补料包括：甲醇、消泡剂。

进一步优选的，

YPD：酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，定容至500mL，高压蒸汽灭菌；若制备固体培养基添加2％琼脂粉；

PTM1：五水硫酸铜3g，碘化钾0.044g，一水合硫酸锰1.5g，二水合钼酸钠0.1g，硼酸0.01g，氯化钴0.25g，氯化锌10g，七水合硫酸亚铁32.5g，生物素0.1g，硫酸2.5mL，定容至500mL，过滤除菌；

BSM：85％磷酸534mL，二水合硫酸钙18.6g，硫酸钾364g，二水合硫酸镁298g，氢氧化钾82.6g，甘油800g，定容至20L；

甘油补料：甘油4200g，纯化水2800g，消泡剂0.2mL/L，PTM1 80mL，混合并装入10L储瓶中进行灭菌；

甲醇补料：甲醇20L，过滤除菌；消泡剂0.2mL/L，灭菌后溶入已除菌的甲醇中。

优选的，采用氨水调节pH。

优选的，一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，包括以下步骤：

S1.制备种子液

取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，置于28℃培养2-3d，挑取生长良好的单菌落接种于10mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养约24h。取5mL上述培养物继续扩大培养，接种于500mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。

S2.分批发酵

将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至5.0，121℃灭菌30min，待冷却后校正溶氧0％，设置温度28℃，通气量20L/min，罐压0.05Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至5.0。通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子泵入发酵罐，校正溶氧100％，设置转速300rpm。溶氧控制模式选择“转速联动”，发酵期间通过调整转数(300rpm-1000rpm)和通气量维持溶氧30％以上。

S3.甘油补料发酵

待溶氧突增，转速突降时，进入甘油补料发酵阶段，将甘油补料以15mL/h·L的流速进行流加，罐内参数要求不变。

S4.甲醇补料发酵：

发酵至36h(湿重约达285g/L)停止补加甘油，溶氧迅速回升，进入甲醇补料发酵阶段。1h内罐内不添加任何碳源，以保证甘油完全耗尽，此时将温度降至24℃，pH调至5.85。饥饿处理后，以3-5mL/h·L的初始速度流加甲醇补料，逐渐增大流速至10-12mL/h·L，实时监测各发酵参数，根据溶氧量调整甲醇流速(停补甲醇后1min内DO值上升幅度大于10％，说明碳源受限，反之说明甲醇过量)，期间保持溶氧20％以上。发酵至132h结束，放罐。发酵产物8000rpm离心20分钟，收集上清，储存于-20℃。

优选的，一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，包括以下步骤：

S1.制备种子液

取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，置于28℃培养2-3d，挑取生长良好的单菌落接种于10mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养约24h。取5mL上述培养物继续扩大培养，接种于500mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。

S2.分批发酵

将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至5.0，121℃灭菌30min，待冷却后校正溶氧0％，设置温度28℃，通气量20L/min，罐压0.05Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至5.0。通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子泵入发酵罐，校正溶氧100％，设置转速300rpm。溶氧控制模式选择“转速联动”，发酵期间通过调整转数(300rpm-1000rpm)和通气量维持溶氧30％以上。

S3.甘油补料发酵

待溶氧突增，转速突降时，进入甘油补料发酵阶段，将甘油补料以15mL/h·L的流速进行流加，罐内参数要求不变。

S4.混合补料发酵

发酵至30h(湿重约达242g/L)进入混合补料阶段，甘油补料和甲醇补料同时流加，此时将温度降至24℃，pH调至5.85。

S5.甲醇补料发酵

混合补料流加2小时后进入甲醇补料期，解除溶氧—转速偶联，将溶氧与甲醇补料偶联，偶联相关性为反向相关，临界值为30％，即溶氧高于临界值时开启补料，溶氧低于临界值时停止，甲醇补料的工作周期为10s。发酵至132h结束，放罐。发酵产物8000rpm离心20分钟，收集上清，储存于-20℃。

与现有技术相比，应用本发明的技术方案的有益效果及显著进步在于：

1、本发明的制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，无需破坏或去除任何糖基转移酶基因，避免了由于糖基转移酶基因缺陷可能对细胞完整性造成的负面影响；且无需缺失或替换含有糖基化位点的氨基酸残基，所表达的重组蛋白与天然蛋白氨基酸序列完全相同；

2、本发明的制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，可操作性强，得到的重组人白蛋白糖基化水平极低，且蛋白表达量较高。

附图说明

为更清楚地说明本发明的技术方案，以下将对本发明的实施例使用的附图进行简单介绍。

图1为实施例1-5和对比例1-2的发酵过程中的湿重；

图2为实施例1-5和对比例1-2的蛋白表达量；

图3为实施例1-5和对比例1-2的蛋白平均表达速率。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明。实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

为了更充分理解本发明，以下对本发明中的专业词汇进行解释说明。

本发明的“重组蛋白”：是应用了重组DNA或重组RNA的技术从而获得的蛋白质。体外重组蛋白的生产主要包括四大系统：原核蛋白表达，哺乳动物细胞蛋白表达，酵母蛋白表达及昆虫细胞蛋白表达。生产的蛋白在活性和应用方法方面均有所不同。根据自身的下游运用选择合适的蛋白表达系统，提高表达成功率。

本发明的“培养基”：是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。不同培养基可根据实际需要，添加一些自身无法合成的化合物，即生长因子。

本发明的“发酵”：是指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。发酵有时也写作酦酵，其定义由使用场合的不同而不同。通常所说的发酵，多是指生物体对于有机物的某种分解过程。发酵是人类较早接触的一种生物化学反应，如今在食品工业、生物和化学工业中均有广泛应用。其也是生物工程的基本过程，即发酵工程。对于其机理以及过程控制的研究，还在继续。

本发明的“菌种”：是用于发酵过程作为活细胞催化剂的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。来源于自然界大量的微生物，从中经分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产。

本发明的“蛋白表达速率”：表示单位时间内蛋白质的分泌表达量，本发明中用“蛋白平均表达速率”来表征，即在诱导发酵过程中蛋白质的平均分泌速率，可通过计算蛋白质最大表达量与表达时间的比值来确定，单位以g/L·h表示。其中，蛋白表达时间以诱导物添加时间为起点，以蛋白质表达量达到峰值的时间为终点。

本发明的“诱导物”：是指可以直接或间接与一种诱导型启动子相互作用并因此促进所述启动子开始表达的物质。

本发明的“培养物”：是经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体培养基的统称。

本发明的“分批发酵”：是指在灭菌后的培养基中，接种以某种活的生产菌，而不再向发酵液加入或移出任何物质(如果是需氧微生物，则需不断供入氧气)的培养方式。也就是说，除了不断进行通气(好氧发酵)和为调节发酵液的pH而加入酸碱溶液外，与外界没有其它物料交换，所用培养基在发酵开始前一次性加入。

本发明的“补料发酵”：是指由额外的培养基提供的发酵培养。在本发明中“甘油补料发酵”阶段流加甘油，“混合补料发酵”阶段甲醇和甘油同时流加，“甲醇补料发酵”阶段流加甲醇。

本发明中所用重组人白蛋白表达菌株CBS7435-rHSA为自行构建，本发明中所有实施例均采用上述菌种进行发酵培养，其构建方法包括如下步骤：

S1、设计并合成重组人白蛋白DNA序列，序列如SEQ ID NO.1所示；

S2、将优化后的序列连接到pPICZαA载体上，酶切位点为PmII和XbaI，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有zeocin的LB平板上，挑取单克隆转入含有zeocin的LB液体培养基中，重提质粒，经酶切鉴定和测序验证，表达质粒构建正确，命名为pPICZαA-rHSA；

S3、将质粒载体经Sac I酶切线性化后电转化入CBS7435感受态细胞中，将转化好的菌株涂布于含有zeocin的YPD抗性平板上，挑取阳性单克隆，获得重组人白蛋白表达菌株CBS7435-rHSA。

其中，SEQ ID NO.1为：

GACGCACATAAATCTGAAGTTGCACACCGTTTTAAGGACTTGGGTGAGGAAAATTTTAAAGCATTGGTCTTAATTGCCTTCGCACAGTATCTGCAGCAATGCCCCTTTGAAGATCACGTTAAATTAGTTAATGAGGTGACAGAATTTGCAAAGACTTGTGTTGCTGATGAATCTGCTGAGAATTGTGATAAATCACTGCATACGTTGTTTGGTGACAAGTTATGTACTGTGGCCACCTTACGAGAAACCTATGGCGAGATGGCTGATTGTTGTGCTAAGCAAGAGCCTGAAAGAAATGAATGTTTTCTACAGCATAAAGACGATAATCCAAACTTGCCTAGACTGGTGCGTCCAGAAGTTGACGTGATGTGTACCGCTTTTCACGATAATGAGGAAACCTTTTTGAAGAAGTACTTGTATGAGATCGCCCGTCGTCACCCATATTTCTATGCCCCAGAACTGCTGTTTTTCGCCAAGCGTTATAAAGCTGCTTTTACAGAGTGTTGCCAAGCTGCTGATAAGGCCGCATGCTTATTACCCAAGCTTGATGAGTTGAGAGATGAAGGCAAAGCCTCCTCCGCAAAACAAAGACTTAAATGTGCTTCTCTGCAGAAATTCGGTGAGAGAGCTTTCAAAGCTTGGGCAGTAGCAAGGCTAAGTCAGAGGTTTCCAAAAGCAGAATTCGCTGAGGTCTCTAAATTGGTTACCGATTTGACCAAGGTTCATACAGAATGCTGTCATGGTGATTTGTTGGAATGTGCAGATGACCGTGCTGATCTTGCAAAGTACATTTGTGAGAATCAGGACAGTATTTCTTCTAAGCTGAAGGAATGCTGCGAAAAGCCACTGCTTGAAAAAAGTCACTGCATCGCCGAGGTAGAAAACGATGAGATGCCAGCAGACTTGCCATCTCTTGCAGCAGACTTCGTTGAGTCAAAGGACGTCTGCAAAAATTACGCCGAAGCCAAAGATGTTTTTCTGGGTATGTTTCTGTACGAATACGCACGTAGACATCCAGACTACTCTGTAGTATTGTTGCTGAGGTTGGCTAAGACTTACGAGACCACTTTGGAGAAATGTTGTGCAGCTGCAGACCCACATGAATGTTATGCTAAAGTCTTTGATGAATTCAAACCTTTAGTCGAAGAGCCCCAAAACTTAATTAAGCAAAACTGTGAATTATTCGAACAGTTAGGTGAGTACAAGTTCCAGAATGCATTGCTAGTCCGTTATACTAAAAAAGTACCCCAAGTTTCAACCCCCACTTTAGTTGAGGTTTCCAGAAATTTGGGTAAGGTTGGTTCTAAATGCTGTAAGCACCCCGAGGCTAAAAGAATGCCATGTGCTGAGGATTATTTATCAGTAGTTCTAAACCAGCTATGTGTCCTTCATGAAAAAACTCCTGTCTCTGATAGGGTCACTAAATGTTGTACGGAGTCTTTAGTGAATAGACGACCTTGTTTTTCCGCTTTGGAAGTTGATGAGACTTACGTTCCTAAAGAGTTCAATGCCGAAACTTTTACCTTTCACGCTGATATCTGCACTTTATCTGAGAAGGAGCGTCAGATTAAGAAGCAAACCGCTCTTGTCGAGCTTGTTAAACATAAGCCTAAAGCTACAAAGGAACAATTGAAAGCCGTTATGGACGATTTTGCCGCTTTTGTTGAGAAGTGTTGCAAAGCTGACGATAAGGAGACTTGTTTCGCCGAAGAAGGCAAAAAACTGGTAGCAGCCTCACAAGCTGCTCTAGGTCTTTAA

以下实施例的所用培养基制备方法如下：

YPD：酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，定容至500mL，高压蒸汽灭菌；若制备固体培养基添加2％琼脂粉。

PTM1：五水硫酸铜3g，碘化钾0.044g，一水合硫酸锰1.5g，二水合钼酸钠0.1g，硼酸0.01g，氯化钴0.25g，氯化锌10g，七水合硫酸亚铁32.5g，生物素0.1g，硫酸2.5mL，定容至500mL，过滤除菌。

BSM：85％磷酸534mL，二水合硫酸钙18.6g，硫酸钾364g，二水合硫酸镁298g，氢氧化钾82.6g，甘油800g，定容至20L。

甘油补料：甘油4200g，纯化水2800g，消泡剂0.2mL/L，PTM1 80mL，混合并装入10L储瓶中进行灭菌。

甲醇补料：甲醇20L，过滤除菌；消泡剂0.2mL/L，灭菌后溶入已除菌的甲醇中。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。

实施例1

1.1、制备种子液

取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，置于28℃培养2-3d，挑取生长良好的单菌落接种于10mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养约24h。取5mL上述培养物继续扩大培养，接种于500mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。

1.2、分批发酵

将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至5.0，121℃灭菌30min，待冷却后校正溶氧0％，设置温度28℃，通气量20L/min，罐压0.05Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至5.0。通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子泵入发酵罐，校正溶氧100％，设置转速300rpm。溶氧控制模式选择“转速联动”，发酵期间通过调整转数(300rpm-1000rpm)和通气量维持溶氧30％以上。

1.3、甘油补料发酵

待溶氧突增，转速突降时，进入甘油补料发酵阶段，将甘油补料以15mL/h·L的流速进行流加，罐内参数要求不变。

1.4、甲醇补料发酵

发酵至30h(湿重约达235g/L)停止补加甘油，溶氧迅速回升，进入甲醇补料发酵阶段。1h内罐内不添加任何碳源，以保证甘油完全耗尽。饥饿处理后，以10mL/h·L的流速流加甲醇补料，此时将pH调至6.0，其他参数不变，实时监测各发酵参数，保持溶氧30％以上。发酵至132h结束，放罐。发酵产物8000rpm离心20分钟，收集上清，储存于-20℃。

实施例2

2.1、制备种子液

取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，置于28℃培养2-3d，挑取生长良好的单菌落接种于10mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养约24h。取5mL上述培养物继续扩大培养，接种于500mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。

2.2、分批发酵

将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至5.0，121℃灭菌30min，待冷却后校正溶氧0％，设置温度28℃，通气量20L/min，罐压0.05Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至5.0。通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子泵入发酵罐，校正溶氧100％，设置转速300rpm。溶氧控制模式选择“转速联动”，发酵期间通过调整转数(300rpm-1000rpm)和通气量维持溶氧30％以上。

2.3、甘油补料发酵

待溶氧突增，转速突降时，进入甘油补料发酵阶段，将甘油补料以15mL/h·L的流速进行流加，罐内参数要求不变。

2.4、甲醇补料发酵

发酵至30h(湿重约达238g/L)停止补加甘油，溶氧迅速回升，进入甲醇补料发酵阶段。1h内罐内不添加任何碳源，以保证甘油完全耗尽，此时将温度降至25℃，pH调至6.0。饥饿处理后，以3-5mL/h·L的初始速度流加甲醇补料，逐渐增大流速至10-12mL/h·L，实时监测各发酵参数，根据溶氧量调整甲醇流速(停补甲醇后1min内DO值上升幅度大于10％，说明碳源受限，反之说明甲醇过量)，期间保持溶氧20％以上。发酵至132h结束，放罐。发酵产物8000rpm离心20分钟，收集上清，储存于-20℃。

实施例3

3.1、制备种子液

取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，置于28℃培养2-3d，挑取生长良好的单菌落接种于10mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养约24h。取5mL上述培养物继续扩大培养，接种于500mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。

3.2、分批发酵

将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至5.0，121℃灭菌30min，待冷却后校正溶氧0％，设置温度28℃，通气量20L/min，罐压0.05Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至5.0。通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子泵入发酵罐，校正溶氧100％，设置转速300rpm。溶氧控制模式选择“转速联动”，发酵期间通过调整转数(300rpm-1000rpm)和通气量维持溶氧20％以上。

3.3、甘油补料发酵

待溶氧突增，转速突降时，进入甘油补料发酵阶段，将甘油补料以15mL/h·L的流速进行流加，罐内参数要求不变。

3.4、甲醇补料发酵

发酵至30h(湿重约达228g/L)停止补加甘油，溶氧迅速回升，进入甲醇补料发酵阶段。1h内罐内不添加任何碳源，以保证甘油完全耗尽。饥饿处理后，以10mL/h·L的恒定流速流加甲醇补料，此时将温度降至25℃，pH调至5.85，实时监测各发酵参数，保持溶氧20％以上。发酵至132h结束，放罐。发酵产物8000rpm离心20分钟，收集上清，储存于-20℃。

实施例4

4.1、制备种子液

取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，置于28℃培养2-3d，挑取生长良好的单菌落接种于10mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养约24h。取5mL上述培养物继续扩大培养，接种于500mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。

4.2、分批发酵

将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至5.0，121℃灭菌30min，待冷却后校正溶氧0％，设置温度28℃，通气量20L/min，罐压0.05Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至5.0。通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子泵入发酵罐，校正溶氧100％，设置转速300rpm。溶氧控制模式选择“转速联动”，发酵期间通过调整转数(300rpm-1000rpm)和通气量维持溶氧30％以上。

4.3、甘油补料发酵

待溶氧突增，转速突降时，进入甘油补料发酵阶段，将甘油补料以15mL/h·L的流速进行流加，罐内参数要求不变。

4.4、甲醇补料发酵

发酵至36h(湿重约达285g/L)停止补加甘油，溶氧迅速回升，进入甲醇补料发酵阶段。1h内罐内不添加任何碳源，以保证甘油完全耗尽，此时将温度降至24℃，pH调至5.85。饥饿处理后，以3-5mL/h·L的初始速度流加甲醇补料，逐渐增大流速至10-12mL/h·L，实时监测各发酵参数，根据溶氧量调整甲醇流速(停补甲醇后1min内DO值上升幅度大于10％，说明碳源受限，反之说明甲醇过量)，期间保持溶氧20％以上。发酵至132h结束，放罐。发酵产物8000rpm离心20分钟，收集上清，储存于-20℃。

实施例5

5.1、制备种子液

取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，置于28℃培养2-3d，挑取生长良好的单菌落接种于10mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养约24h。取5mL上述培养物继续扩大培养，接种于500mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。

5.2、分批发酵

将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至5.0，121℃灭菌30min，待冷却后校正溶氧0％，设置温度28℃，通气量20L/min，罐压0.05Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至5.0。通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子泵入发酵罐，校正溶氧100％，设置转速300rpm。溶氧控制模式选择“转速联动”，发酵期间通过调整转数(300rpm-1000rpm)和通气量维持溶氧30％以上。

5.3、甘油补料发酵：

待溶氧突增，转速突降时，进入甘油补料发酵阶段，将甘油补料以15mL/h·L的流速进行流加，罐内参数要求不变。

5.4、混合补料发酵：

发酵至30h(湿重约达242g/L)进入混合补料阶段，甘油补料和甲醇补料同时流加，此时将温度降至24℃，pH调至5.85。

5.5、甲醇补料发酵：

混合补料流加2小时后进入甲醇补料期，解除溶氧—转速偶联，将溶氧与甲醇补料偶联，偶联相关性为反向相关，临界值为30％，即溶氧高于临界值时开启补料，溶氧低于临界值时停止，甲醇补料的工作周期为10s。发酵至132h结束，放罐。发酵产物8000rpm离心20分钟，收集上清，储存于-20℃。

对比例1

6.1、制备种子液

取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，置于30℃培养2-3d，挑取生长良好的单菌落接种于10mL YPD液体培养基，于30℃、220rpm培养约24h。取5mL上述培养物继续扩大培养，接种于500mL YPD液体培养基，于30℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。

6.2、分批发酵

将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至6.0，121℃灭菌30min，待冷却后校正溶氧0％，设置温度30℃，通气量20L/min，罐压0.05Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至6.0。通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子泵入发酵罐，校正溶氧100％，设置转速300rpm。溶氧控制模式选择“转速联动”，发酵期间通过调整转数(300rpm-1000rpm)和通气量维持溶氧20％以上。

6.3、甘油补料发酵

待溶氧突增，转速突降时，进入甘油补料发酵阶段，将甘油补料以15mL/h·L的流速进行流加，罐内参数要求不变。

6.4、甲醇补料发酵

发酵至30h(湿重约达207g/L)停止补加甘油，溶氧迅速回升，进入甲醇补料发酵阶段。1h内罐内不添加任何碳源，以保证甘油完全耗尽。饥饿处理后，以10mL/h·L的恒定流速流加甲醇补料，罐内参数要求不变，实时监测各发酵参数，保持溶氧20％以上。发酵至132h结束，放罐。发酵产物8000rpm离心20分钟，收集上清，储存于-20℃。

对比例2

7.1、制备种子液

取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，置于28℃培养2-3d，挑取生长良好的单菌落接种于10mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养约24h。取5mL上述培养物继续扩大培养，接种于500mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。

7.2、分批发酵

将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至6.0，121℃灭菌30min，待冷却后校正溶氧0％，设置温度28℃，通气量20L/min，罐压0.05Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至6.0。通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子泵入发酵罐，校正溶氧100％，设置转速300rpm。溶氧控制模式选择“转速联动”，发酵期间通过调整转数(300rpm-1000rpm)和通气量维持溶氧20％以上。

7.3、甘油补料发酵

待溶氧突增，转速突降时，进入甘油补料发酵阶段，将甘油补料以15mL/h·L的流速进行流加，罐内参数要求不变。

7.4、甲醇补料发酵

发酵至30h(湿重约达219g/L)停止补加甘油，溶氧迅速回升，进入甲醇补料发酵阶段。1h内罐内不添加任何碳源，以保证甘油完全耗尽。饥饿处理后，以10mL/h·L的恒定流速流加甲醇补料，罐内参数要求不变，实时监测各发酵参数，保持溶氧20％以上。发酵至132h结束，放罐。发酵产物8000rpm离心20分钟，收集上清，储存于-20℃。

实施例6

在上述实施例1-5和对比例1-2发酵过程中每6h间隔取样，测量湿重，结果如图1所示。

在上述实施例1-5和对比例1-2发酵36h后开始测定蛋白表达量，每6h间隔取样进行白蛋白定量，结果如图2所示。

由于实施例1-5和对比例1-2中蛋白表达量达到最大值时的发酵时间不同，以最大表达量与诱导表达时间的比值来表征蛋白平均表达速率，结果如图3所示。

上述结果表明，通过改变发酵条件，各实验组(实施例1-5)蛋白平均表达速率与对照组(对比例1-2)相比均有提高，其中实施例4和实施例5蛋白平均表达速率最大，分别为对比例1的3.6倍和3.7倍。

实施例7

将上述实施例1-5和对比例1-2得到的发酵液纯化后采用硫酸苯酚法进行糖蛋白定量。以减压干燥至恒重的甘露糖作为对照品，配制不同浓度对照溶液，与适当稀释的供试品按照硫酸苯酚法显色并测定吸光度，以吸光度和对照品浓度拟合标准曲线并求得样品甘露糖的含量，样品的总蛋白含量按照凯氏定氮法测定，最后计算样品中甘露糖含量在总蛋白中的比例[W/W，甘露糖mg·g(Pro)^-1]，结果如表1所示。

表1硫酸苯酚法测定重组人白蛋白中甘露糖含量

由表1结果可知，诱导条件的改变影响了重组人白蛋白的甘露糖基化水平。使用CORREL函数对蛋白平均表达速率与重组人白蛋白中甘露糖含量之间的相关系数进行计算，所得到相关系数为-0.9311，呈强负相关性，说明本发明的方法提高蛋白表达速率可以降低重组人白蛋白的O-糖基化水平。

申请人声明，在上述说明书的描述过程中：

术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。

最后应说明的是：

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；

尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，所述方法为通过提高蛋白表达速率，进而降低重组人白蛋白的O-糖基化水平，包括以下步骤：

S1、种子液制备：取保存菌种进行平板划线，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中28-29.5℃培养，待摇瓶种子OD600达到10-12时，作为上罐用种子液；

S2、分批发酵：将BSM培养基投入发酵罐，调节pH至5.0-5.8、灭菌，待冷却后校正溶氧，设置温度28-29.5℃和通气量，向培养基中加入已除菌的PTM1溶液，并再次调节培养基pH至5.0-5.8；通过取样口将发酵罐内培养基弃掉部分，将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧、设置转速，发酵期间通过调整转数和通气量维持溶氧20％以上；

S3、甘油补料发酵：当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油补料，发酵至30h以上，停止补加甘油；

S4、甲醇补料发酵：不添加任何碳源，以保证甘油完全耗尽；饥饿处理后，流加甲醇补料，罐内PH值维持5.8-6.0，温度降至24-28℃，实时监测各发酵参数，保持溶氧20％以上；

S5、发酵结束，放罐，发酵产物离心，收集上清；

步骤S1的菌种为CBS7435-rHSA。

2.如权利要求1述的一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，CBS7435-rHSA菌株采用以下方法制备：

R1、设计并合成重组人白蛋白DNA序列，序列如SEQ ID NO.1所示；

R2、将序列连接到pPICZαA载体上，酶切位点为PmII和XbaI，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有zeocin的LB平板上，挑取单克隆转入含有zeocin的LB液体培养基中，重提质粒，经酶切鉴定和测序验证，表达质粒构建正确，命名为pPICZαA-rHSA；

R3、将质粒载体经Sac I酶切线性化后电转化入CBS7435感受态细胞中，将转化好的菌株涂布于含有zeocin的YPD抗性平板上，挑取阳性单克隆，获得重组人白蛋白表达菌株CBS7435-rHSA。

3.如权利要求1述的一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，步骤S3和步骤S4之间，还包括混合补料发酵：甘油补料和甲醇补料同时流加，温度为24℃，pH调至5.85。

4.如权利要求1或3所述的一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，步骤S1和S2中，温度为28℃；步骤S2中，调节pH至5.0。

5.如权利要求4所述的一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，步骤S1中，步骤S2-S4，溶氧30％以上。

6.如权利要求1所述的一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，步骤S4中，流加甲醇补料的方法为：以10-12mL/h·L的恒定流速流加甲醇补料，或，先以3-5mL/h·L的初始速度流加甲醇补料，逐渐增大流速至10-12mL/h·L。

7.如权利要求1或3所述的一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，步骤S4中，将溶氧与甲醇补料偶联，偶联相关性为反向相关，临界值为20-30％，即溶氧高于临界值时开启补料，溶氧低于临界值时停止，甲醇补料的工作周期为10-15s。

8.如权利要求1所述的一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，

每20L的BSM培养基包括以下组分：85％磷酸534-600mL，二水合硫酸钙18.6-20g，硫酸钾364-400g，二水合硫酸镁298-320g，氢氧化钾82.6-100g，甘油800-850g；

每500mL的PTM1溶液包括以下组分：五水硫酸铜3-5g，碘化钾0.044-0.1g，一水合硫酸锰1.5-2g，二水合钼酸钠0.1-0.2g，硼酸0.01-0.03g，氯化钴0.25-0.35g，氯化锌10-12g，七水合硫酸亚铁32.5-35g，生物素0.1-0.2g，硫酸2.5-3.0mL；

每500mL的YPD包括以下组分：酵母提取物5-10g，蛋白胨10-20g，葡萄糖10-20g。

9.如权利要求8所述的一种制备高表达且低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，甘油补料包括：甘油、纯化水、消泡剂和PTM1；甲醇补料包括：甲醇、消泡剂。