CN118006586B - 一种生物酶转化制备人参皂苷Rh2的方法 - Google Patents

Abstract

本专利申请公开了一种生物酶转化制备人参皂苷Rh2的方法。该方法包括使用来源于Aminobacter sp.Gsoil204菌的糖苷酶(GenBank:AGA60126.1)和来源于Sphingopyxis alaskensis RB2256菌的β‑糖苷酶(GenBank:ABF52736.1)的糖苷酶组合物对人参皂苷Rb1进行催化反应，在一个反应体系中转化生成人参皂苷Rh2。反应后人参皂苷Rh2含量达到36％以、转化率达到60％以上，生成的酶催化产物成分较为单一，操作简单，易于放大生产，具有广阔的应用前景。

Description

一种生物酶转化制备人参皂苷Rh2的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以人参皂苷Rb1为原料、采用生物酶转化法制备人参皂苷Rh2的方法。

背景技术

人参皂苷是人参等草本植物发挥各种药理学作用的主导成分，其中原人参二醇类皂苷由达玛烷型三萜类皂苷组成，主要包括常见人参皂苷(如Rb1、Rb2、Rb3、Rd等)和稀有人参皂苷(Rg3、Rh2、CK等)，其表现出特定的药理活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗免疫、诱导细胞快速凋亡、抗衰老等。稀有皂苷与同类高含量常见人参皂苷相比，其皂苷元结构相同，只是糖基数目不同。因此，可以通过选择性水解高含量皂苷的糖基来制备稀有皂苷。

人参皂苷Rh2作为一种原人参二醇型人参皂苷，是人参皂苷Rb1在体内真正吸收和发挥作用的实体。现有研究发现Rh2可以通过诱导分化或凋亡，抑制多种肿瘤细胞的增殖与生长，并表现出低毒性的特点，是重要的肿瘤抑制物。

近年来，人参皂苷Rh2的制备研究由酸水解法、碱水解法、合成法逐渐向生物转化法过渡，其中糖苷酶生物转化法在生产过程中不使用大量的酸、碱，避免了转化后酸碱的处理弊端，反应条件温和，设备要求不高，容易放大，因此酶法制备人参皂苷Rh2是理想的制备方法。

然而，目前技术人员尚未开发出在一个反应体系中将人参皂苷Rb1直接转化为人参皂苷Rh2的方法。

发明内容

鉴于现有技术存在的上述技术难题，本发明的目的在于提供一种糖苷酶组合物、以及使用该糖苷酶组合物在一个反应体系中将人参皂苷Rb1直接转化为人参皂苷Rh2的方法。

为解决上述技术难题，本发明人进行了深入研究，发现将来源于Aminobactersp.Gsoil204菌的糖苷酶(GenBank:AGA60126.1)及来源于Sphingopyxis alaskensisRB2256菌的β-糖苷酶(GenBank:ABF52736.1)组合后可实现以人参皂苷Rb1为原料在一个反应体系中进行酶催化反应生成人参皂苷Rh2，并具有较高的转化率(60％以上)，从而完成了本发明。

即，本发明包括：

1.一种糖苷酶组合物，其包含糖苷酶1和糖苷酶2，其中所述糖苷酶1是来源于Aminobacter sp.Gsoil204菌的糖苷酶(GenBank:AGA60126.1)，所述糖苷酶2是来源于Sphingopyxis alaskensis RB2256菌的β-糖苷酶(GenBank:ABF52736.1)。

2.根据项1的糖苷酶组合物，其中，所述糖苷酶1和糖苷酶2的重量比为1：10～10：1。

3.根据项1或2的糖苷酶组合物作为催化剂的用途，所述催化剂用于以人参皂苷Rb1为原料、在一个反应体系中、通过酶促反应制备人参皂苷Rh2。

4.根据项3所述的用途，其中，所述酶促反应在一个反应体系中进行。

5.一种制备人参皂苷Rh2的方法，其中，以人参皂苷Rb1为原料，以根据项1所述的糖苷酶组合物作为催化剂，通过酶促反应制备人参皂苷Rh2。

6.根据项5所述的方法，其中，所述酶促反应在一个反应体系中进行。

7.根据项6所述的方法，其中，所述反应体系包括乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。

8.根据项6所述的方法，其中，所述反应体系的pH为4～5.5，优选为5。

9.根据项5所述的方法，其中，所述酶促反应的温度为35～50℃，优选为40℃。

本发明的有益效果是：1)本发明通过将两种来源不同的酶进行组合使用实现了在同一体系中将人参皂苷Rb1直接转化为稀有人参皂苷Rh2；2)两种酶的组合投量可以使人参皂苷Rh2含量达到36％以上，转化率达到60％以上；3)本发明提供的制备方法操作简单，生成的酶催化产物成分较为单一，易于放大生产，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例样品1反应后的高效液相检测图谱。

图2为实施例样品2反应后的高效液相检测图谱。

图3为人参皂苷Rh2标准品的高效液相检测图谱。

图4为实施例样品3反应后的高效液相检测图谱。

图5为实施例样品4反应后的高效液相检测图谱。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。

本实施例使用的来源于Aminobacter sp.Gsoil204菌的糖苷酶(GenBank:AGA60126.1，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示)和来源于Sphingopyxis alaskensisRB2256菌的β-糖苷酶(GenBank:ABF52736.1，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示)均为实验室自制。

制备方法如下：

1.表达菌株的构建

将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列翻译成基因序列并进行大肠杆菌宿主表达基因的密码子优化，优化后的基因序列送西安擎科基因有限公司进行全基因合成，并以NcoI及Xba I酶切位点连入pET28a质粒中。构建好的质粒转入大肠杆菌BL21DE3宿主中。

2.酶液制备

将构建的好的菌株接LB培养基，培养至OD₆₀₀至0.8-1之间，加入0.1mM的IPTG，降温至25℃进行诱导，诱导8h后收集菌体。将收集的菌体制备成200g/L的菌悬液在600W的功率下进行超声波破壁。离心取上清液即为酶液。实施例1：Aminobacter sp.Gsoil204菌的糖苷酶(GenBank:AGA60126.1)对人参皂苷Rb1的催化作用

称取2份适量的人参皂苷Rb1原料，其中一份直接加入乙酸钠缓冲液中，称为样品1，另一份和来源于Aminobacter sp.Gsoil204菌的糖苷酶的酶液以重量比1：1的比例混合加入至乙酸钠缓冲液中，称为样品2。上述两份样品均于pH＝5、40℃条件下进行酶促反应。6h后结束反应，离心，干燥沉淀，并进行液相检测，确定有无人参皂苷Rh2生成，并通过外标法计算生成Rh2的含量。

表1Aminobacter sp.Gsoil204菌的糖苷酶对人参皂苷Rb1的催化作用

样品1反应后的高效液相检测图谱如图1所示，样品2反应后的高效液相检测图谱如图2所示。作为参照，人参皂苷Rh2标准品的高效液相检测图谱如图3所示，人参皂苷Rh2标准品的保留时间为12.7min。由此可知，来源于Aminobacter sp.Gsoil204菌的糖苷酶单独基本上不能将人参皂苷Rb1原料转化生成人参皂苷Rh2。

实施例2Sphingopyxis alaskensis RB2256菌的β-糖苷酶(GenBank:ABF52736.1)对Rb1的催化反应

称取适量的人参皂苷Rb1原料和来源于Sphingopyxis alaskensis RB2256菌的β-糖苷酶的酶液，以重量比1：1的比例加入至乙酸钠缓冲液中，称为样品3。将其置于pH＝5、40℃条件下进行酶促反应，6h后结束反应，离心，干燥沉淀，进行液相检测，确定有无人参皂苷Rh2生成，并通过外标法计算生成Rh2的含量。

表2β-糖苷酶对人参皂苷Rb1的催化作用

样品3反应后的高效液相检测图谱如图4所示。由此可知，来源于Sphingopyxisalaskensis RB2256菌的β-糖苷酶单独基本上不能将人参皂苷Rb1原料转化生成人参皂苷Rh2。

实施例3糖苷酶组合物催化生成Rh2

取适量的来源于Aminobacter sp.Gsoil204菌的糖苷酶的酶液和来源于Sphingopyxis alaskensis RB2256菌的β-糖苷酶的酶液，分别以重量比1：1，10：1和1：10的比例进行组合，将其依次称为组合酶1，组合酶2和组合酶3。

分别称取三份适量的人参皂苷Rb1原料，将其依次与上述组合酶的酶液以重量比1：1的比例加入到乙酸钠缓冲液中，称为样品4，样品5，样品6。上述三份样品均于pH＝5、40℃的条件下进行酶促反应，6小时后结束反应，离心，干燥沉淀，进行液相检测，确定是否有人参皂苷Rh2生成，并通过外标法计算生成Rh2的含量。

表3组合酶对人参皂苷Rb1的催化作用

样品4反应后的高效液相检测图谱如图5所示。由此可知，上述组合酶能够在一个反应体系中将人参皂苷Rb1原料转化生成人参皂苷Rh2，且转化率均达到60％以上，人参皂苷Rh2含量均达到36％以上。

序列信息

SEQ ID NO：1

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Claims (9)

1.一种糖苷酶组合物，其包含糖苷酶1和糖苷酶2，其中所述糖苷酶1是来源于Aminobacter sp.Gsoil204菌的糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；所述糖苷酶2是来源于Sphingopyxis alaskensis RB2256菌的β-糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示；

其中，所述糖苷酶1和糖苷酶2的重量比为1：10～10：1。

2.根据权利要求1的糖苷酶组合物作为催化剂的用途，所述催化剂用于以人参皂苷Rb1为原料、在一个反应体系中、通过酶促反应制备人参皂苷Rh2。

3.一种制备人参皂苷Rh2的方法，其中，以人参皂苷Rb1为原料，以根据权利要求1所述的糖苷酶组合物作为催化剂，通过酶促反应制备人参皂苷Rh2。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酶促反应在一个反应体系中进行。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述反应体系包括乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述反应体系的pH为4～5.5。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述反应体系的pH为5。

8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酶促反应的温度为35～50℃。

9.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酶促反应的温度为40℃。