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CN118006553A - 促进骨形成和血管生成的中性粒细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

促进骨形成和血管生成的中性粒细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118006553A
CN118006553A CN202410176798.9A CN202410176798A CN118006553A CN 118006553 A CN118006553 A CN 118006553A CN 202410176798 A CN202410176798 A CN 202410176798A CN 118006553 A CN118006553 A CN 118006553A
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Beijing Pinoden Dental Medical Technology Co ltd
Peking University School of Stomatology
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Abstract

本发明公开促进骨形成和血管生成的中性粒细胞及其制备方法和应用。其中该修复型中性粒细胞为CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+经物理电刺激诱导的细胞亚群，该修复型免疫细胞亚群经物理电刺激的诱导后能够发挥促进组织修复的功能。此外，本发明修复型中性粒细胞的制备工艺简单，操作简便，可以实现批量生产及临床上的推广应用。

Description

促进骨形成和血管生成的中性粒细胞及其制备方法和应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2023年2月28日提交的申请号为CN 202310174241.7，标题为“一种修复型中性粒细胞及其诱导活化方法和用途”的优先权，其内容通过引用整体并入本文中。
技术领域
本发明涉及免疫学和再生医学领域，具体地涉及促进骨形成和血管生成的中性粒细胞及其制备方法和应用。
背景技术
随着对免疫系统研究的深入，近几年通过免疫细胞调控组织再生修复已成为研究热点。有研究表明免疫反应是调控组织再生的重要因素。其中免疫细胞促进修复的作用被逐渐认识到。然而，目前对修复型免疫细胞的认识主要集中在巨噬细胞。而中性粒细胞被普遍认为是组织损伤发生时清除坏死组织，引发炎症反应的免疫细胞，对其促修复功能的研究较少，导致如何更好地利用免疫细胞的调控作用促进组织修复还不够清楚。修复型中性粒细胞对临床修复受损组织可能存在重要影响。
目前有研究人员利用巨噬细胞外泌体促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。不过，利用巨噬细胞外泌体可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化未经过动物实验验证，临床效果的稳定性难以保证。
此外，也有报道利用人羊膜间充质干细胞的免疫调节作用优化骨缺损微环境，促血管化骨再生的M2巨噬细胞聚集，分泌促血管新生和成骨活性因子，刺激内源性骨再生。不过，所使用的人羊膜间充质干细胞来源是无传染性疾病剖宫产新鲜胎盘组织，其来源少，且涉及到剖宫产患者的知情同意及伦理要求，因此其临床推广和应用受到限制。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种修复型中性粒细胞的分类、诱导活化方法及其用途。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的一个方面，提供一种促进血管生成的中性粒细胞或其分离物，所述中性粒细胞为CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+细胞亚群，其在物理电刺激诱导后促进血管生成。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进血管生成的中性粒细胞或其分离物，其中，所述血管生成包括下述性质之一：
(1)血管调控相关基因的表达量或相关蛋白的量升高；
(2)总管长度、连接点数量和管腔数目至少之一增多；
(3)血管延伸长度增加或出芽增多；
(4)血管管腔体积增大。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进血管生成的中性粒细胞或其分离物，其中，所述血管调控相关基因包括CXCL16、MMP9、VEGF、Proliferin和Osteopontin中的至少之一。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进血管生成的中性粒细胞或其分离物，其中，所述分离物包括细胞裂解物、分泌物，或其组分。
本发明的一个方面，提供一种用于促进血管生成的组合物，其包含本文所述的促进血管生成的中性粒细胞或其分离物。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于促进血管生成的组合物，其中，所述血管生成包括体外管腔生成、体内组织修复早期血管化或其成熟。
本发明的一个方面，提供本文所述的促进血管生成的中性粒细胞或其分离物在制备用于促进血管生成的组合物中的用途。
本发明的一个方面，提供一种体外促进血管生成的方法，其包括使本文所述的促进血管生成的中性粒细胞或其分离物在体外与细胞接触的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的体外促进血管生成的方法，其中，所述血管生成包括体外管腔生成。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进血管生成的中性粒细胞或其分离物的制备方法，其包括分离或筛选CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+细胞亚群的步骤，或通过基因工程手段在中性粒细胞内过表达CD54、CD274和GLUT1的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进血管生成的中性粒细胞或其分离物，其中，所述中性粒细胞分离自骨髓。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进血管生成的中性粒细胞或其分离物，其中，所述中性粒细胞分离自外周血。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进血管生成的中性粒细胞或其分离物，其中，所述物理电刺激为20μA-70μA。
本发明的一个方面，提供一种促进骨形成的中性粒细胞或其分离物，所述中性粒细胞为CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+细胞亚群，其在物理电刺激诱导后促进骨形成。
在某些实施方案中，根据本发明所述的中性粒细胞或其分离物，其中，所述骨形成包括下述性质之一：
(1)骨再生或加快骨再生速度；
(2)新的骨骼的形成；
(3)骨体积分数增加；
(4)骨密度增加。
在某些实施方案中，根据本发明所述的中性粒细胞或其分离物，其中，所述骨形成进一步包括增加血管调控相关基因的表达量或相关蛋白的量。
在某些实施方案中，根据本发明所述的中性粒细胞或其分离物，其中，所述血管调控相关基因包括CXCL16、MMP9、VEGF、Proliferin和Osteopontin中的至少之一。
在某些实施方案中，根据本发明所述的中性粒细胞或其分离物，其中，所述分离物包括细胞裂解物、分泌物，或其组分。
在某些实施方案中，根据本发明所述的中性粒细胞或其分离物，其中，通过包括下述中的至少一种产生所述电刺激：带电基质、导电基质、直流电、交流电、脉冲电、磁电、压电或铁电活性材料。
本发明的一个方面，提供一种用于促进骨形成的组合物，其包含本文所述的促进骨形成的中性粒细胞或其分离物。
本发明的一个方面，提供根据本发明所述的促进骨形成的中性粒细胞或其分离物在制备用于促进骨形成的组合物中的用途。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进骨形成的中性粒细胞或其分离物的制备方法，其中，包括使用试剂分离或筛选CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+细胞亚群的步骤，或通过基因工程手段在中性粒细胞内过表达CD54、CD274和GLUT1的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进骨形成的中性粒细胞或其分离物的制备方法，其中，所述试剂包括抗体。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进骨形成的中性粒细胞或其分离物，其中，所述中性粒细胞分离自骨髓。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进骨形成的中性粒细胞或其分离物，其中，所述中性粒细胞分离自外周血。
在某些实施方案中，根据本发明所述的促进骨形成的中性粒细胞或其分离物，其中，所述物理电刺激为20μA-70μA。
本发明的一个方面，提供一种用于促进骨修复的细胞组合物，其包括免疫细胞或其分离物和/或内皮细胞或其分离物。
在某些实施方案中，根据本发明所述的细胞组合物，其中，所述免疫细胞为中性粒细胞。
在某些实施方案中，根据本发明所述的细胞组合物，其中，所述中性粒细胞为CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+，且经物理电刺激诱导活化的细胞亚群。
在某些实施方案中，根据本发明所述的细胞组合物，其中，由中性粒细胞或其分离物能够分泌或产生血管调控相关基因并进一步调控内皮细胞活化，进而促进骨相关细胞活化。
在某些实施方案中，根据本发明所述的细胞组合物，其中，所述内皮细胞为活化后的内皮细胞，所述活化后的内皮细胞具有下述性质中的至少一种：
(1)侵袭距离和发芽数增加；
(2)总管长度、连接点数量和管腔数目至少之一增多；
(3)血管延伸长度增加或出芽增多；
(4)血管管腔体积增大。
在某些实施方案中，根据本发明所述的细胞组合物，其中，所述血管调控相关基因包括CXCL16、MMP9、VEGF、Proliferin和Osteopontin中的至少之一。
在某些实施方案中，根据本发明所述的细胞组合物，其中，所述骨相关细胞的活化包括启动、促进或提高成骨细胞分泌骨钙素、成骨蛋白和/或细胞外基质，进而促进骨形成。
在某些实施方案中，根据本发明所述的细胞组合物，其中，所述骨相关细胞包括间充质干细胞、成骨细胞和/或骨细胞。
本发明的一个方面，提供一种用于促进骨形成的方法，所述方法包括由免疫细胞调控内皮细胞活化骨相关细胞的步骤。
本发明的一个方面，提供组合物在制备用于促进骨相关细胞活化或骨形成的药物中的用途，其中，所述组合物包括中性粒细胞或其分离物和/或内皮细胞或其分离物。
在某些实施方案中，根据本发明所述的细胞组合物，其中，所述中性粒细胞分离自骨髓。
在某些实施方案中，根据本发明所述的细胞组合物，其中，所述中性粒细胞分离自外周血。
在某些实施方案中，根据本发明所述的细胞组合物，其中，所述物理电刺激为20μA-70μA。
本发明还提供电刺激敷贴TESP，其能够激活CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+中性粒细胞亚群，从而促进血管生成和/或骨愈合。
在某些实施方案中，根据本发明所述的电刺激敷贴TESP，其中，包括无机铁电颗粒和压电高分子聚合物。
在某些实施方案中，根据本发明所述的电刺激敷贴TESP，其中，包括钛酸钡和P(VDF-TrFE)。
在某些实施方案中，根据本发明所述的电刺激敷贴TESP，其中，通过以下方法制备得到：用0.01-1mol/L的盐酸多巴胺水溶液对钛酸钡纳米颗粒进行表面修饰后，将多巴胺修饰的纳米颗粒嵌入P(VDF-TrFE)(70/30mol％)基质中，通过搅拌和超声处理将1-20％的BTO纳米颗粒和P(VDF-TrFE)溶液分散在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，形成稳定的混合物，然后将混合物浇铸到纳米复合膜中，并进行加热以蒸发溶剂，在室温下使用电晕极化处理纳米复合膜。
本发明还提供TESP在制备用于激活特异性neu1的电刺激骨愈合敷料中的用途，所述特异性neu1为CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+中性粒细胞亚群。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述TESP由包括压电或铁电活性材料制备得到。
本发明还提供电疗装置联合中性粒细胞亚群在制备用于促进血管生成和/或骨愈合的装置或系统中的用途，其中，所述电疗装置包括能够提供物理电刺激的模块或组件，其中，所述模块或组件设置为能够提供20μA-70μA的物理电刺激，从而活化中性粒细胞亚群，促进血管生成和/或骨愈合。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述中性粒细胞亚群为CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+的中性粒细胞亚群。
本发明的技术效果包括但不限于：
(1)本发明的具有修复功能的中性粒细胞亚群是首次被发现的能被电刺激诱导后发挥促修复功能的免疫细胞亚群，其在电学微环境的诱导下能够被激活细胞内的钙信号通路，进而发挥例如促进组织修复的功能。
(2)本发明的具有修复功能的中性粒细胞亚群在动物体内具有良好的促进血管化、促进成骨的作用，可用于组织修复治疗，很好的解决了目前临床上骨缺损修复效果不佳的问题。
(3)本发明的制备工艺简单，操作简便，可以实现批量生产及临床上的推广应用。
附图说明
图1示出了本发明的示例性“效应器”的级联反应。
图2示出了术后12周大鼠颅骨缺损区的代表性HE和Masson染色图。
图3-5示出了治疗性的电刺激敷贴(TESP)促进骨再生，并在早期骨再生过程中增加中性粒细胞浸润。
图6-7示出了TESP上调中性粒细胞表达趋化相关细胞因子。
图8-14示出了TESP诱导中性粒细胞促血管化功能促进骨再生。
图15-16示出了Neu1是独特的电响应中性粒细胞亚群，在电信号作用下被诱导出血管化特征。
图17示出了TESP诱导的Neu1中性粒细胞亚群促进体内血管再生和骨再生，其中，B和D个图中前2个柱为对照组CON，后两个柱为TESP组。
图18示出了TESP通过Ca2+/CaMKII信号通路激活Neu1促血管生成功能。
图19示出了人或小鼠衍生的Neu1能够响应TESP或直流电DC促进血管生成和骨生成。
图20示出了不同大小的直流电诱导的人Neu1或小鼠Neu1能够促进血管生成。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
除非另有说明，否则本文所述的中性粒细胞亚群是指表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+的细胞亚群(本文有时也简称为“Neu1”)，Neu2/3/4是指除表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+外的细胞亚群，例如包括但不限于表达CD45+Ly6G+CD54-CD274-GLUT1-等细胞亚群。
本发明中，术语“效应器”是指活化的特定中性粒细胞细胞亚群、诱导的内皮细胞(特别是指血管内皮细胞)以及成骨细胞之间的级联反应，并且这种级联反应最终导致或促进血管生成和骨形成，从而在组织修复中发挥重要作用。这种级联反应具有一定的顺序或发生次序，即，活化的中性粒细胞亚群首先分泌或产生血管调控相关蛋白和/或基因，随后活化血管内皮细胞，使得血管内皮细胞侵袭距离和发芽数增加、总管长度、连接点数量和管腔数目至少之一增多、血管延伸长度增加或出芽增多、血管管腔体积增大，血管内皮细胞活化进一步使得骨相关细胞活化，即导致包括间充质干细胞、成骨细胞和/或骨细胞的骨相关细胞启动、促进或提高成骨细胞分泌骨钙素、成骨蛋白和/或细胞外基质，最后上述成分经矿化，沉积后导致骨形成。在某些实施方案中，成骨细胞包括那些分泌骨钙素的细胞，本文有时也称为“OCN+细胞”，其中，骨钙素在骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的过程中分泌。
修复型中性粒细胞
本发明的一个方面，提供一种分离的修复型中性粒细胞，术语“分离的”当用于描述一个或多个中性粒细胞时是指已经从它们的天然环境中分离出来的一个或多个细胞，包括从细胞起源的对象(例如受试者)中分离，和/或从天然环境中的一种或多种其它组分(例如碎片、组织、组织聚集体和其它细胞)中分离。受试者是指脊椎动物，优选为哺乳动物，哺乳动物包括但不限于鼠类、猿、家畜、人等，优选为人。在体外获得或在体外培养的生物实体的中性粒细胞及其后代也涵盖在本发明的保护范围之内。
本发明中，中性粒细胞的来源不特别限定，其来源包括但不限于例如骨髓、血液(如外周血)、组织(如结缔组织)等。本发明还发现，来源于外周血的特定中性粒细胞细胞亚群同样能够作为修复型中性粒细胞，从而用于促进血管生成和促进骨形成。
在某些实施方案中，使用物理电刺激进行诱导本发明的特定中性粒细胞细胞亚群以促进血管生成，并发现此类中性粒细胞的刺激或活化能够激活细胞内的钙信号通路。本发明人发现仅分离出来的特定中性粒细胞细胞亚群(Neu1，状态)不具备促进血管生成功能，而提取分离出后经过电刺激诱导后则具有促进血管生成功能。本领域技术人员能够理解，也可以使用任何已知的材料和方法进行刺激或活化中性粒细胞细胞。活化后的此类细胞内升高的钙进一步与CaMK II结合激活下游通路，使血管调控相关基因的表达量升高，血管调控相关基因包括CXCL16、MMP9、VEGF、Proliferin和Osteopontin中的至少之一，优选上述所有基因的表达量或相关蛋白的量升高。本领域技术人员熟知如何确定相关基因的表达量或相关蛋白的量，例如使用特异性结合上述CXCL16、MMP9、VEGF、Proliferin和Osteopontin中的至少之一的抗体、探针，或能够扩增所述血管调控相关基因而设计的引物等。此外，本发明的中性粒细胞的促血管生成还体现在总管长度、连接点数量和管腔数目至少之一增多、新生血管芽侵袭距离或延伸长度增加或出芽增多、血管管腔体积增大。
本发明中，活化后的中性粒细胞不仅促进血管生成，并且进一步促进骨形成，优选地，骨形成包括但不限于下述情况：(1)骨再生或加快骨再生速度；(2)新的骨骼的形成；(3)骨体积分数增加；(4)骨密度增加。
本发明的中性粒细胞进一步包括其分离物，分离物的实例包括但不限于其细胞裂解物(例如包含的核酸物质，如RNA)、分泌物(例如多肽、蛋白、脂类、细胞因子、外泌体等)，或其组分。在某些实施方案中，本发明对分泌物进行进一步的研究发现，中性粒细胞的分泌物能够促进促血管化细胞因子(包括VEGF)表达，促进内皮细胞的体外成血管，并促进骨形成。
本发明中，物理电刺激的实例包括但不限于压电材料、铁电材料或直流电、交流电、电磁场等提供的电刺激信号。在某些实施方案中，可以由电疗装置提供直接物理电刺激，电疗装置可以采用本领域已知的电疗仪器，其至少包括能够提供稳定电流的模块或组件，从而输出20μA-70μA，优选20μA-60μA，还优选20μA-55μA，进一步优选20μA-50μA，例如20μA、22μA、24μA、26μA、28μA、30μA、32μA、34μA、36μA、38μA、40μA、42μA、44μA、46μA、48μA、50μA或期间范围内任意数值的电刺激，本发明通过实验证明了采用上述电疗装置，能够活化中性粒细胞亚群，促进血管生成和/或骨愈合。可以理解的是，这样的电疗装置可以是以植入或半植入式或非半植入式的方式进行电刺激。此外，电疗装置也可以具有一定的频率、幅度或脉宽以达到与活化细胞亚群和/或激活的内皮细胞联合治疗的目的，电疗装置可以通过刺激本文的活化细胞亚群和/或激活的内皮细胞共同执行修复功能，或者促进、增强或提高电疗装置本身所能达到的骨修复或成血管功能。
在某些实施方案中，所述电疗装置包括电刺激提供装置，其提供具有振幅和持续时间的刺激信号，以及刺激控制装置，其电连接至操作元件，刺激控制装置包括电源和刺激信号发生电路。组成电疗装置的组件包括但不限于单片机、D/A转换器、可编程定时器、刺激脉冲合成、功率放大器、变压器、刺激电流检测及显示部件、过载保护装置等。
在某些实施方案中，所述电疗装置可以包括脉冲电信号发生装置，其产生一定频率、电压或脉冲的脉冲电磁场。
在某些实施方案中，所述电疗装置可以利用化学反应将化学能转换为电能，其实例包括但不限于如干电池、蓄电池等。在某些实施方案中，所述电疗装置可以包括直流发电机，从而通过机械运动或其他形式的能量转换，将机械能转换为直流电能，包括但不限于如电动机、发电机等。在某些实施方案中，所述电疗装置可以包括整流器，从而将交流电通过二极管或电容器整流后，变成单向的直流电。
在某些实施方案中，使用基于压电材料的物理电刺激进行刺激活化细胞亚群，其包括以下步骤：
(1)制备复合膜材料，其包含钛酸钡纳米颗粒或修饰的钛酸钡纳米颗粒和铁电高分子聚合物P(VDF-TrFE)；
(2)筛选特定中性粒细胞亚群，首先使小鼠骨髓细胞与特异性抗体低温孵育，其中所述特异性抗体携带荧光基团，然后通过流式细胞仪分选得到表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+中性粒细胞亚群；
(3)使步骤(1)中的所述复合膜材料与步骤(2)中的中性粒细胞接触并培养，从而激活细胞内的钙信号通路；
在另外的示例性实施方案中，可以先对来源小鼠骨髓的中粒细胞进行刺激或活化，再通过流式分选得到表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+中性粒细胞亚群，其中，所述中性粒细胞能够激活细胞内的钙信号通路，并进一步促进血管生成。
本发明的步骤(1)中，将钛酸钡纳米颗粒或修饰的钛酸钡纳米颗粒与铁电压电高分子聚合物P(VDF-TrFE)分散于有机溶液后进行浇铸成膜，在室温下电晕极化处理，得到本发明的复合膜材料。有机溶剂不特别限定，优选非质子极性溶剂，其实例包括但不限于N,N-二甲基甲酰胺、甲苯、三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇和乙酸乙酯中的一种或多种，特别优选N,N-二甲基甲酰胺。
可以理解的是，制备的复合膜材料可以作为专用于培养和/或筛选中性粒细胞的培养基材和/或筛选基材，并且所述基材还可以包括用于培养或筛选中性粒细胞所需的必要成分(例如抗体、缓冲液、抗生素等)和培养装置，例如培养皿。
本发明的步骤(2)中，使骨髓细胞与筛选抗体低温孵育，筛选抗体均为市售产品，所述抗体能够结合中性粒细胞表面或内部的下述蛋白：CD45、Ly6G、CD54、CD274和GLUT1。上述抗体产品的实例包括但不限于：FITC-CD54、PE-CD274、APC/Cy7-CD45、PE/Cy7-Ly-6G、GLUT1。孵育之后进一步包括与二抗的低温孵育。低温是指0-10℃的温度，优选为4℃。随后通过流式细胞术分选得到表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+中性粒细胞亚群。
本发明的步骤(3)中，将复合膜材料与中性粒细胞亚群接触并培养1-24h，优选2-20h，还优选4-10h，进一步优选6h。培养条件为在含有5-15％胎牛血清、0.5-1.2％的青链霉素的RPMI-1640培养基中，在5％ CO2，30-40℃下进行培养，温度优选为35-37℃。
本发明的上述方法进一步使用直流电诱导中性粒细胞亚群0.2-5h，优选诱导0.5-4h，还优选诱导0.8-2h，最优选诱导1h。可以理解的是，本领域技术人员可以选择基于压电材料的物理电刺激诱导或直流电诱导，或者二者可以先后进行诱导，例如直流电诱导发生在基于压电材料的物理电刺激的诱导之后，或直流电诱导与基于压电材料的物理电刺激进行的诱导同时进行。
修复型中性粒细胞的制备方法
本发明的一个方面，提供修复型中性粒细胞的制备方法，包括下述中的至少一种：
(1)诱导中性粒细胞表达CD54、CD274和GLUT1的步骤，如何诱导中性粒细胞表达CD54、CD274和GLUT1是本领域已知的，例如使用诱导剂或诱导物直接进行诱导；或者
(2)使中性粒细胞过表达CD54、CD274和GLUT1的步骤，例如将携带上述蛋白的编码基因的核酸构建体导入载体，经转化后过表达CD54、CD274和GLUT1；或者
(3)从例如外周血或骨髓细胞分离修复型中性粒细胞的步骤，例如使用本文所述的特异性结合CD54、CD274和GLUT1的抗体，然后使用本领域已知的分离技术进行分离，例如使用流式细胞仪进行分选。
对于中性粒细胞的分类方法，可以使用试剂检测中性粒细胞表面或内部标志蛋白或其mRNA，试剂包括生物大分子和/或小分子试剂，大分子试剂包括但不限于能够特异性结合CD54、CD274和GLUT1的抗体，小分子试剂包括但不限于能够特异性结合CD54、CD274和GLUT1基因的探针，和/或能够扩增其的引物。
进一步可以通过鉴定标志物CD45、Ly6G来鉴定所述中性粒细胞。
本发明还提供一种活化修复型中性粒细胞的方法，包括使用电学材料刺激本文所述的修复型中性粒细胞的步骤。电学材料的类型不特别限定，只要其具有电学性能或压电活性即可，上述材料可参见例如CN115252872A、CN114904054A、CN104208754A、CN115286883A和CN115282345A，它们通过引用整体并入本文。
用于促进血管生成以及骨形成的组合物的制备方法
本发明还提供一种用于促进血管生成以及骨形成的组合物的制备方法，包括分离或筛选特定中性粒细胞的步骤，或通过基因工程手段在中性粒细胞内过表达CD54、CD274和GLUT1的步骤，其中分离或筛选包括使用试剂检测中性粒细胞表面或内部标志蛋白或其mRNA的步骤，试剂包括生物大分子和/或小分子试剂，大分子试剂包括但不限于能够特异性结合CD54、CD274和GLUT1的抗体，小分子试剂包括但不限于能够特异性结合CD54、CD274和GLUT1基因的探针，和/或能够扩增其的引物。基因工程的方法不特别限定，本领域技术人员知道如何进行过表达CD54、CD274和GLUT1，例如将上述基因片段导入表达载体，转化至细胞后过表达CD54、CD274和GLUT1。进一步可以通过鉴定标志物CD45、Ly6G来鉴定所述中性粒细胞。
促进血管生成及骨形成的方法
本发明还提供一种促进血管生成以及骨形成的方法，包括将中性粒细胞或分离物与骨组织接触的步骤。可以采用电学材料或基因工程手段刺激或活化本文所述的中性粒细胞。在某些实施方案中，使用电学材料来提供物理电刺激，电学材料的类型不特别限定，只要其具有电学性能或压电活性即可。
在示例性实施方案中，本发明的电学材料包括铁电高分子聚合物和无机铁电材料。本发明中，无机铁电材料的实例包括但不限于钛酸钡、钛酸锶钡、钛酸锶、铁酸铋、铌酸钾钠和铌酸锂中的一种或多种。
本发明中，铁电高分子聚合物不特别限定，包括聚偏氟乙烯或其共聚物，其实例包括但不限于聚偏二氟乙烯、聚偏氟乙烯-六氟丙烯和聚偏氟乙烯-三氟乙烯和聚乳酸。
实施例1
一、实验方法
1、电学材料
实施例中使用治疗性的电刺激敷贴(本文简称为“TESP”)，不具有电刺激信号的对照材料为CON。
2、动物实验
本发明使用7周龄的雄性SD大鼠和C57BL/6小鼠。实验方案经北京大学动物保护与使用委员会批准(LA2020290)。为了研究TESP对骨缺损的治疗效果，建立了大鼠颅骨缺损模型。通过腹膜内注射麻醉大鼠，然后暴露背颅骨。随后在每只大鼠的颅顶骨中心制造两个临界尺寸的全层骨缺损(直径5mm)。然后纳米复合膜(TESP组)或非极化的纳米复合膜(CON组)覆盖骨缺损。
为了探索中性粒细胞对体内血管生成和骨生成的影响，使用了一种特异性的中性粒细胞抑制剂-paquinimod。在颅骨缺损手术后，TESP组腹腔注射paquinimod，对照组腹腔注射生理盐水，持续4天。在植入后1、2、4、8和12周，取大鼠颅骨样品，多聚甲醛中固定。
CT扫描
使用微型CT扫描仪扫描骨组织样本并分析骨体积。使用Scanco软件处理图像并进行建立3D重建。
3、流式细胞术和中性粒细胞亚群的分选
收集C57BL/6小鼠的骨髓细胞并与以下初级抗体孵育：FITC-CD54(BioLegend，YN1/1.7.4)、PE-CD274(BioLegend，MIH7)、APC/Cy7-CD45(BioLegend，30-F11)、PE/Cy7-Ly-6G(BioLegend，1A8)、Glut(HUABIO，SA0377)。然后洗涤细胞，并与第二抗体Alexa Fluor647(Abcam)在孵育。随后，用7-AAD(7-AAD；eBioscience)排除死细胞。通过流式细胞仪分选和分析细胞，并使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。
外周血(PB)采集自临床健康志愿者(PKUSSIRB-202388084)。红细胞(RBC)裂解后，将PB与以下一抗孵育30min：APC-eFluor-780-CD11b(eBioscience；ICRF44)、PE-Cyanine7-CD66b(eBiocience；G10F5)、FITC-CD54(eBioscience，RR1/1)、APC-CD274(eBioscience，MIH1)、GLUT1(Invitrogen，SA0377)。然后，用PBS洗涤细胞，并与二抗Alexa Fluor 594(Abcam)在4℃孵育30分钟。随后，用7-氨基-放线菌素D(7-AAD；eBioscience)在室温处理5分钟以排除死细胞。通过流式细胞仪FACS Aria 2或Aria Sorp对细胞进行分选和分析，并使用FlowJo软件分析数据。
为了研究Neu1(即本发明的中性粒细胞亚群)在体内的促血管生成和促成骨功能，建立了小鼠颅骨缺损模型。创建两个直径为3mm的临界尺寸全层骨缺损以研究促血管生成功能，并创建一个直径为1或者3mm的全层骨缺损以研究促成骨功能。为了评估新血管形成，在术后2周或4周用Microfil(MV-112，Flow Tech，Inc.，Carver，MA)进行微血管灌注。
4、组织学分析
将大鼠颅骨(术后2、4、8和12周)脱钙，石蜡包埋，进行CT分析和组织形态学分析。制备组织切片并进行苏木精-伊红(H&E)和Masson三色染色。使用相机拍摄图像。
5、细胞培养和条件培养基样品的收集
HUVECs购自ScienCell Research Laboratories，并在内皮细胞培养基(ECM；1001；ScienCell Research Laboratories)中培养。
通过ATRA(sigma，R2625)处理HL-60细胞分化成粒细胞样细胞(命名为HL-60衍生的中性粒细胞，简称为H-中性粒细胞)。在RPMI-1640(proce cell)中培养H-中性粒细胞或流式分选的中性粒细胞。所有细胞都在37℃含5％ CO2的湿化培养箱中培养。
H-中性粒细胞或分选的中性粒细胞亚群在TESP或CON膜上培养，收集细胞培养物上清液用于随后的实验。
为了研究钙内流在TESP-Neu1的促血管生成功能中的作用，使用了特异性CaMKII抑制剂KN93(MedChemExpress)。将分选的Neu1在TESP上培养，在RPMI-1640(proce cell)中培养6小时，其中添加或不添加KN93。然后将培养基替换为RPMI-1640。收集细胞培养上清液用于随后的实验。
6、体外管腔形成试验
24孔板中进行实验。用每孔250μL Matrigel包被。然后，将孔板置于培养箱中使基质胶固化。接下来，将HUVECs铺在基质胶上。最后，24孔板在5％ CO2空气培养箱中于37℃孵育。4小时和8小时后在共聚焦显微镜下观察到管状结构。使用Image Pro Plus软件对相对总小管长度、连接点数目和每个视野的小管数目进行量化，以评估小管形成。
7、体外细胞球出芽试验
明胶甲基丙烯酰凝胶用于包埋过夜产生的HUVEC细胞球。随后进行光固化并加入条件培养基。12小时后，细胞球已经充分出芽。然后，使用Image Pro Plus软件对细胞侵袭距离和出芽数量进行数字定量。分析了每个实验组大约10个细胞球。
8、单细胞(10X)RNA测序和预处理数据
单细胞RNA-seq文库是在Chromium平台(10X Genomics)上制备和进行。使用cellranger count(2.0版)将原始数据与大鼠参考基因组进行比对。使用Seurat 3in R进行单细胞数据分析(包括质量控制、数据标准化、降维、聚类检测)。
9、Smart-seq2 RNA测序和预处理数据
将Neu1和Neu2/3/4分别分选并汇集在一起，进一步与裂解组分和核糖核酸酶抑制剂一起孵育。然后使用Smart-Seq2方法进行文库制备。然后，使用Illumina Hiseq平台上加载的合格文库进行PE150测序。
有用的Perl脚本用于从原始数据中删除包含适配器的读取，以获得干净的数据。然后从UCSC(http://Hg download.SOE.ucsc.edu/golden path/gal gal 4)下载参考基因和基因组注释文件，用Bowtie2 v2.2.3构建参考基因组库，使用TopHat v2.0.12将干净的数据映射到参考基因组上。转录组数据分析基于Tophat软件进行。将阅读片段拆分成图谱参考，以达到识别外显子-外显子剪接位点的目的。
10、差异表达基因分析以及表面蛋白表达分析
差异表达基因通过使用“Wilcox检验”在Seurat中运行“FindAllMarkers”功能进行识别。表面标记列表从细胞表面蛋白图谱(http://wlab.ethz.ch/cspa/)下载。
11、功能富集分析(GO)分析
为了阐明每个聚类的特征基因的生物学意义，使用R中的ClusterProfiler软件包对每个聚类的差异基因进行GO分析。
12、材料共培养、尾静脉回输移植试验以及原位植入实验
为了研究Neu1群体的电响应潜力和促血管生成能力，使用CD45.2小鼠作为Neu1细胞和Neu2/3/4细胞的供体(CD45.2背景)。将FACS分选的Neu1细胞或Neu2/3/4细胞铺在RPMI1640(proce cell)培养基中的TESP或CON膜上。共培养后收集细胞，然后通过尾静脉注射入8周龄雄性受体小鼠(CD45.2背景)。受体预处理两个临界大小的全层骨缺损(1mm直径)，缺损区用CON膜覆盖。
为了研究Neu1的促血管生成和促骨生成功能是否可以通过直流电(DC)诱导，收集DC或TESP诱导的Neu1并将其包埋在Gelma(Corning)中，然后原位植入小鼠颅骨缺损部位。每组植入的细胞数量相等。
如前所述，分别在移植后2周和12周检测血管生成和骨再生。
13、酶联免疫吸附法(ELISA)
如前所述收集细胞培养上清液。购买CXCL1(Solarbio，SEKH-0065)、CXCL3(FineTest，EH3179)、CCL3(Solarbio，SEKH-0246)、MMP9(FineTest，EH0238)和VEGF(Solarbio，SEKH-0052，SEKM-0039)ELISA试剂盒，以及小鼠血管生成阵列试剂盒(R&D系统公司，ARY015)，并根据各自制造商的说明进行ELISA测定。
14、免疫组织化学
CT分析后，将大鼠颅骨脱钙三周。然后，将组织样品包埋在石蜡中(大块组织学)并制备样品切片。随后，将样品脱蜡、脱水并在微波炉中进行抗原修复处理。然后用PBS洗涤载玻片，封闭后用一抗孵育。然后，PBS洗涤并在室温下用二抗孵育。缓冲液加热样品来彻底洗脱一抗和二抗。以同样的方式，两种抗原被不同的荧光团标记。细胞核最终被DAPI染色。图像在共聚焦激光扫描显微镜(徕卡)下拍摄。使用的初级抗体如下：CD34(Abcam)和OCN(Proteintech)。
15、钙内流检测
研究Neu1细胞内的钙内流是否由TESP引起。使用荧光钙探针Fluo-4对细胞进行染色，并监测细胞内钙信号。简言之，将分选的Neu1细胞培养在TESP膜上，用Fluo-4在37℃避光染色，洗涤，然后悬浮在RPMI1640培养基中。然后，用Aria Sorp(BD Biosciences)测量荧光。在共聚焦显微镜下捕捉图像，并通过Image J软件进行定量分析。
16、统计分析
结果表示为平均值±SD或平均值±SEM。两个样本使用非配对双尾t检验，非正态分布数据使用Mann-Whitney检验，两个以上样本组使用单因素方差分析。p＜0.05具有统计学意义(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)。
二、结果
图1示出了本发明的示例性“效应器”的级联反应。其中使用治疗性电刺激贴片(TESP)以覆盖临界尺寸的骨缺损模型。在骨再生的早期，TESP通过趋电性将更多的中性粒细胞(Neu1，中性粒细胞CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+的细胞亚群)募集到缺损区。这些募集的中性粒细胞高表达趋化因子，如CXCL3、CCL3和CXCL1，并通过分泌VEGFA等细胞因子促进血管生成来加速骨再生。
图2中的示出了术后12周大鼠颅骨缺损区的代表性HE(a图)和Masson染色图像(b图)，提示TESP促进了骨再生。(MC:骨髓腔。FT:纤维样组织。NB:新形成的骨骼。OT:骨样组织。MT:矿化组织)
图3-5示出了TESP促进骨再生，并在早期骨再生过程中增加中性粒细胞浸润。其中图3的(a)TESP植入大鼠骨缺损后12周的代表性CT图。虚线代表缺陷边界。(b)TESP组的相对骨体积分数(BV/TV)和骨密度(BMD)显著高于对照组。图4上半部分的t-SNE图展示CON组(左)以及TESP组(右)的免疫细胞群体。图4下图每个细胞群体在不同时间点的相对分布比例。图5上图为不同时间点髓系细胞和淋系细胞的相对分布比例。图5下图为髓系细胞中每个细胞亚群的百分比，提示TESP促进骨再生，并在早期(day 3)骨再生过程中增加中性粒细胞的比例。
图6-8示出了TESP募集的中性粒细胞促进骨再生。其中图6的(a)骨缺损第3天中性粒细胞top20差异基因表达热图。(b)骨缺损第3天TESP组中性粒细胞高表达趋化相关基因的小提琴图。(c)GSEA图显示骨缺损第3天TESP组的嗜中性粒细胞中富集的趋化相关信号通路。图7的ELISA实验展示TESP组的嗜中性粒细胞的培养上清液中CXCL3、CCL3和CXCL1水平显著高于对照组，n＝3。图8的(a)手术后12周大鼠颅盖的代表性CT图像。虚线代表缺陷边界。(b)在术后12周，与TESP组相比，抑制剂组的新形成骨的体积显著较低，n＝7。(c)术后12周大鼠颅骨缺损的代表性Masson染色图像显示，抑制剂组骨缺损区表现出不完整的非成熟的骨组织修复，TESP组的骨缺损区被成熟骨组织完整修复。(MC:骨髓腔。FT:纤维样组织。注意:新形成的骨骼。OT:骨样组织；MT:矿化组织)。
图9-14示出了TESP诱导中性粒细胞的促血管生成以及骨生成功能。其中图9中的(a)小提琴图显示血管生成相关基因在手术后第3天的TESP组的中性粒细胞中上调。(b)ELISA分析显示，与对照组相比，TESP中MMP9和VEGF的表达水平更高，n＝3。图10和图11的上图在材料诱导的中性粒细胞的条件培养基中HUVECs的2D和3D细胞球出芽实验。图10的下图对小管形成的定量分析显示，在TESP组中，血管的相对总管长、连接点数目和小管数目增加，n＝3。图11的下图对3D发芽血管生成的定量分析显示TESP组增加了侵袭距离和发芽数(n＝10)。图12上栏的左图手术后第7天的代表性免疫组织化学染色图显示施用中性粒细胞抑制剂后CD34+血管内皮细胞的数量减少。虚线表示骨缺损区域。图12上栏的右图与TESP组相比，在施用中性粒细胞抑制剂组中CD34的相对荧光强度显著降低，n＝20。图12的下图显示中性粒细胞抑制剂导致新血管形成减少的代表性CT图像。虚线表示缺陷边界。图13定量分析显示在i中用中性粒细胞抑制剂导致血管体积减少。图14左图为术后8周大鼠颅骨缺损的代表性免疫组织化学染色图。中性粒细胞抑制剂显著降低了CD34+和OCN+细胞数量。虚线表示指示的组织。图14右图中性粒细胞抑制剂明显降低了CD34和OCN的相对荧光强度，n＝20。提示，中性粒细胞抑制剂显著抑制了TESP促血管促成骨的作用。
图15-16示出了Neu1是能够促进血管生成的独特的电响应中性粒细胞亚群。其中图15的(a)t-SNE图展示了四种嗜中性粒细胞亚群(Neu1，Neu2，Neu3，Neu4)。(b)血管生成(GO:BP)通路富集的直方图，显示TESP组的Neu1中血管生成通路的富集程度高于其他亚群。(c)每个亚群的血管生成分数的箱线图，显示TESP组中Neu1的血管生成相关性打分显著高于其他亚群，提示TESP组中Neu1具有促血管生成能力。(d)小提琴图显示，与对照组相比，TESP组中Neu1的血管生成得分更高。(e)手术后第3天，TESP增加了Neu1亚群的比例。图16的(a)气泡图显示每个中性粒亚群中高表达的细胞表面标志基因。(b)t-SNE显示CD274、Icam1和Slc2a1在Neu1亚群中富集。(c)ELISA实验证明TESP显著促进Neu1分泌VEGF。
图17示出了TESP诱导的Neu1中性粒细胞促进体内血管再生和骨再生。(A)手术后2周小鼠颅骨微纤维灌注血管系统的代表性显微CT图像。虚线表示骨缺损区域(直径：3mm)。(B)A中新生血管体积的定量分析n＝9。(C)手术后12周小鼠颅骨的代表性显微CT图像。虚线表示骨缺损区域(直径：1mm)。(D)C中新骨体积(BV)和骨密度(BMD)(n≥6)的定量分析(**p<0.01，***p<0.001，****p<0.001)。
图18示出了TESP通过Ca2+/CaMKII信号通路激活Neu1促血管生成功能。其中图18的(a)naive Neu1和Neu2/3/4之间的差异表达基因热图，提示naive Neu1高表达电压相关离子通道的基因。(b)每个亚群中Fluo-4(钙探针)的代表性免疫荧光图像。虚线表示细胞。(c)b中Fluo-4荧光强度的定量分析，提示电诱导后的Neu1细胞内钙浓度显著升高，n＝50。(d)每个亚群中Fluo-4(钙探针)的代表性流式分析。(e)在d中Fluo-4荧光强度的定量分析，提示电诱导后的Neu1细胞内钙浓度显著升高，n＝3。(f)血管生成相关蛋白的ELISA检测，对分别使用或者不使用钙信号通路抑制剂KN93处理的TESP-neu1细胞的培养上清液进行检测。(g)所示血管调控相关基因的表达水平的定量分析，提示钙信号通路抑制剂显著抑制了TESP诱导后的neu1的促血管再生能力，n＝4。(h)管腔形成实验和(j)3D细胞球出芽血管生成(j)实验示意图。(i)对h中的总管长度、连接点数目和小管数目进行定量分析(n＝3)，提示钙信号通路抑制剂显著抑制了TESP诱导后的neu1的促血管再生能力。(k)对j的侵袭距离和新生血管芽数量的定量分析(n≥9)，提示钙信号通路抑制剂显著抑制了TESP诱导后的neu1的促血管再生能力。
实施例2
HUVEC在内皮细胞培养基中培养。将HL-60细胞与ATRA(Sigma，R2625，1μmol/L)孵育5天，以分化为粒细胞样细胞(命名为HL-60衍生的中性粒细胞)。将HL-60衍生的中性粒细胞(H-中性粒细胞)和分选的小鼠-Neu1(mNeu1)、小鼠-Neu2/3/4(mNeu2/3/4)、人-Neu1和人-Neu2/3/4[hNeu2/3/4]在补充有FBS和青霉素/链霉素溶液的RPMI-1640(Procell)中培养。所有细胞均在37℃、含5％ CO2的湿润培养箱中培养。
在TESP或CON膜上培养H-中性粒细胞或分选的小鼠-Neu1(mNeu1)、小鼠-Neu2/3/4(mNeu2/3/4)、人-Neu1(hNeu1)和人-Neu2/3/4[hNeu2/3/4]6小时。用DC诱导来自小鼠或人的分离的中性粒细胞亚群1小时，以表征Neu 1的普遍反应。收集细胞培养上清液用于随后的实验。人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)购自Cyagen Biosciences，并在含有10％(v/v)FBS和1％(v/v)青霉素/链霉素的α-MEM(Procell)中培养。
结果如图19所示，(A)示出了DC刺激的示意图。(B)示出了在小鼠-Neu1的条件培养基中HUVEC血管生成。箭头表示连接点和管腔。(C)B中血管生成的定量分析显示了TESP或DC处理的mNeu1组中增加的相对总管长、连接点数目和管腔数目，n＝3。(D)示出了手术后2周的小鼠颅盖的代表性显微CT图像。虚线表示缺陷边界(直径：3mm)。(E)示出了新生血管体积的定量分析，以D表示，n＝10。(F)示出了小鼠颅盖在手术后12周的代表性显微CT图像。虚线表示缺陷边界(直径：3mm)。(G)示出了F中新骨体积(BV)(n＝10)和骨矿物质密度(BMD)(n＝10)的定量分析。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)。(H)为人Neu1富集策略的示意图。(I)示出了HUVEC在人-Neu1条件培养基中血管生成。箭头表示连接点和管腔。(J)I中血管生成的定量分析显示了在TESP或DC处理的hNeu1组中增加的相对总管长度、连接点数目和管腔数目，n＝3。(K)为hBMSC的代表性免疫荧光图像。(L)示出了在TESP或DC处理的hNeu1组中RUNX2的平均强度显着高于CON-hNeu1组，n＝12。(****p＜0.0001)。
图20示出了不同大小的直流电诱导的人Neu1或小鼠Neu1能够促进血管生成，(A)在小鼠-Neu1条件培养基中HUVEC的血管生成。箭头表示连接点和管腔。(B)A中血管生成的定量分析显示了TESP组中增加的相对总管长度、连接点数目和管腔数目，n＝3。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.一种促进血管生成和/或骨形成的中性粒细胞或其分离物，其特征在于，所述中性粒细胞为CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+细胞亚群，其在物理电刺激诱导后促进血管生成。
2.根据权利要求1所述的促进血管生成和/或骨形成的中性粒细胞或其分离物，其特征在于，所述血管生成包括下述性质之一：
(1)血管调控相关基因的表达量或相关蛋白的量升高；
(2)总管长度、连接点数量和管腔数目至少之一增多；
(3)血管延伸长度增加或出芽增多；
(4)血管管腔体积增大；
(5)体外管腔生成、体内组织修复早期血管化或其成熟；
优选地，所述骨形成包括下述性质之一：
(1)骨再生或加快骨再生速度；
(2)新的骨骼的形成；
(3)骨体积分数增加；
(4)骨密度增加；
(5)促进骨相关细胞活化；
优选地，所述骨形成进一步包括增加血管调控相关基因的表达量或相关蛋白的量；
优选地，所述骨相关细胞包括间充质干细胞、成骨细胞和/或骨细胞；
优选地，所述血管调控相关基因包括CXCL16、MMP9、VEGF、Proliferin和Osteopontin中的至少之一。
3.根据权利要求2所述的促进血管生成和/或骨形成的中性粒细胞或其分离物，其特征在于，所述分离物包括细胞裂解物、分泌物，或其组分。
4.根据权利要求1-3任一项所述的促进血管生成和/或骨形成的中性粒细胞或其分离物，其特征在于，通过选自带电基质、导电基质、直流电、交流电、脉冲电、磁电、压电和铁电活性材料中的至少一种产生所述电刺激；
优选地，所述电刺激为20μA-70μA。
5.一种用于促进血管生成和/或骨形成的组合物，其特征在于，其包含权利要求1-4任一项所述的中性粒细胞或其分离物。
6.一种体外促进血管生成的方法，其特征在于，使权利要求1-4任一项所述的中性粒细胞或其分离物在体外与细胞接触的步骤；
优选地，所述血管生成包括体外管腔生成。
7.根据权利要求1-4任一项所述的中性粒细胞或其分离物的制备方法，其特征在于，包括使用试剂分离或筛选CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+细胞亚群的步骤，或通过基因工程手段在中性粒细胞内过表达CD54、CD274和GLUT1的步骤；
优选地，所述中性粒细胞分离自骨髓；
优选地，所述中性粒细胞分离自外周血；
优选地，所述试剂包括抗体。
8.根据权利要求1-4任一项所述的中性粒细胞或其分离物的用途，其特征在于，所述用途包括：制备用于促进血管生成的药物，或制备用于促进骨形成的组合物中的用途。
9.TESP在制备用于激活包含权利要求1-4任一项所述的中性粒细胞或其分离物的电刺激骨愈合敷料中的用途；
优选地，所述TESP包括无机铁电颗粒和压电高分子聚合物；
优选地，所述TESP包括包括钛酸钡和P(VDF-TrFE)；
优选地，其通过以下方法制备得到：用0.01-1mol/L的盐酸多巴胺水溶液对钛酸钡纳米颗粒进行表面修饰后，将多巴胺修饰的纳米颗粒嵌入P(VDF-TrFE)(70/30mol％)基质中，通过搅拌和超声处理将1-20％的BTO纳米颗粒和P(VDF-TrFE)溶液分散在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，形成稳定的混合物，然后将混合物浇铸到纳米复合膜中，并进行加热以蒸发溶剂，在室温下使用电晕极化处理纳米复合膜；
优选地，所述物理电刺激包括压电材料、铁电材料，或者直流电、交流电、电磁场提供的电刺激信号，还优选地，所述物理电刺激为20μA-70μA的电流刺激。
10.电疗装置联合中性粒细胞亚群在用于制备促进血管生成和/或骨愈合的装置或系统中的用途，其特征在于，所述电疗装置包括能够提供物理电刺激的模块或组件，其中，所述模块或组件设置为能够提供20μA-70μA的物理电刺激，从而活化中性粒细胞亚群，促进血管生成和/或骨愈合，其中，所述中性粒细胞亚群为权利要求1-4任一项所述的中性粒细胞或其分离物。
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