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CN118005913B - 一种具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118005913B CN202410424674.8A CN202410424674A CN118005913B CN 118005913 B CN118005913 B CN 118005913B CN 202410424674 A CN202410424674 A CN 202410424674A CN 118005913 B CN118005913 B CN 118005913B
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Abstract

本申请公开了一种具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物及其制备方法和应用，涉及生物医用材料技术领域。本申请的具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物由阳离子亲水段和螺旋疏水段构成；其中，所述阳离子亲水段是具有无规卷曲结构的阳离子聚合物；所述螺旋疏水段为能形成稳定α‑螺旋结构的聚氨基酸及其衍生物。如此，本申请提供的具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物，通过非螺旋的阳离子亲水段与具有螺旋结构疏水段的有效分离和组合，能够平衡与细胞膜之间的相互作用，不仅使其具有优异的细胞膜成孔能力，而且形成的孔具有可逆性，从而在提高药物递送效率的同时也提高了载体材料的安全性。

Description

一种具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物及其制备方法和应用。
背景技术
有效地将药物递送到特定的靶细胞或器官是生物治疗领域的一个关键挑战。为了实现这一目标，药物载体必须克服细胞膜这一天然屏障，以将具有治疗潜力的生物活性分子有效地传输至细胞内部。近年来，研究人员一直在探索使用各种纳米材料和高分子复合物来实现高效的药物递送、基因转染、蛋白质输送和细胞内分子成像等应用。然而，药物载体经常面临的一个主要障碍是细胞内吞作用导致的内涵体捕获，这会使药物在酸性溶酶体中被降解，从而降低递送效率和治疗效果。因此，开发安全能够安全有效地直接穿越细胞膜进入细胞的新型材料成为解决这一难题的重要研究方向。
在自然界，存在着一类特殊的蛋白质，如穿孔素和蜂毒肽，它们能够通过细胞膜成孔的机制实现自由的细胞内化。这些具有细胞膜成孔性能的蛋白质通常具有两亲性特征，在其结构的相对两侧分别呈现阳离子和疏水残基，从而对带负电的生物膜具有高亲和力。此外，无论是在溶液中还是在与细胞膜相互作用时，这类蛋白质经常呈现出螺旋二级结构。具有螺旋结构的阳离子多肽能够与细胞膜表面上的阴离子官能团相互作用，这种分子与膜的相互作用会导致膜的易位、不稳定或孔洞的形成，从而促进细胞的高效摄取。受此启发，科学家们已经开始探索利用物理或化学方法构建具有螺旋结构的阳离子多肽。然而，阳离子基团之间强烈的分子内电荷排斥作用会阻碍主链螺旋结构的形成和稳定，因此人工设计合成具有稳定螺旋结构的阳离子多肽存在巨大挑战。研究表明，可以通过延长侧链电荷基团和主链之间的距离来稳定阳离子多肽的螺旋结构，进而降低螺旋表面电荷密度来最小化侧链阳离子电荷间的排斥作用。基于此策略，CN111187340A公布了阳离子α-螺旋聚多肽；CN106589355A公布了一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料；US2023094088A1公布了一种具有高效基因递送能力的三维球形α-螺旋阳离子多肽及其制备方法和应用。然而，这一策略需要在氨基酸侧链引入特定的化学结构，从而带来额外的合成步骤和后续处理工艺。此外，这些阳离子螺旋多肽通常具有过高的膜活性，在提高入胞递送效率的同时不可避免地会造成细胞膜不可逆的成孔或破坏，进而导致细胞死亡。因此，本领域迫切需要开发一种新型的聚合物，能克服上述问题，通过细胞膜成孔的方式实现高效、安全的细胞内递送以及生物学应用。
发明内容
本申请的目的在于提供一种具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物及其制备方法和应用，通过阳离子亲水段与螺旋疏水段分离和有效组合的方式平衡与细胞膜之间的相互作用，从而实现细胞膜可逆成孔性能，以同时提高药物递送的效率和安全性，为解决现有阳离子螺旋多肽制备合成过程复杂繁琐及安全性问题提供了新思路。
为了实现上述目的，本申请实施例的技术方案是：
本申请的第一方面提供一种具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物由阳离子亲水段和螺旋疏水段构成；
其中，所述阳离子亲水段是具有无规卷曲结构的阳离子聚合物；
所述螺旋疏水段为能形成稳定α-螺旋结构的聚氨基酸及其衍生物。
结合第一方面优选地，所述嵌段共聚物为线形嵌段共聚物、星形嵌段共聚物、环形嵌段共聚物、梳形嵌段共聚物、（超）支化嵌段共聚物中的一种，所述阳离子亲水段的嵌段数m1≥1；和/或，所述螺旋疏水段的嵌段数m2≥1。
结合第一方面优选地，所述嵌段共聚物为线形嵌段共聚物时，所述嵌段数m1≤2、和/或m2≤2，且m1与m2之和为2~3，所述阳离子亲水段为含有伯胺、仲胺、叔胺、季胺、吡啶、咪唑鎓、胍盐、锍鎓离子和膦离子的聚合物中的至少一种；所述螺旋疏水段为聚苯丙氨酸、聚蛋氨酸、聚2-氨基异丁酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的至少一种。
结合第一方面优选地，所述嵌段共聚物为线形嵌段共聚物时，所述嵌段数m1≥2、且m2≥2，所述阳离子亲水段为含有伯胺、仲胺、叔胺、季胺、吡啶、咪唑鎓、胍盐、锍鎓离子和膦离子的聚合物中的至少一种；所述螺旋疏水段为聚丙氨酸、聚亮氨酸、聚苯丙氨酸、聚蛋氨酸、聚2-氨基异丁酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的至少一种。
结合第一方面优选地，所述嵌段共聚物为星形嵌段共聚物、环形嵌段共聚物、梳形嵌段共聚物、（超）支化嵌段共聚物时，所述阳离子亲水段为含有伯胺、仲胺、叔胺、季胺、吡啶、咪唑鎓、胍盐、锍鎓离子和膦离子的聚合物中的至少一种；所述螺旋疏水段为聚丙氨酸、聚亮氨酸、聚苯丙氨酸、聚蛋氨酸、聚2-氨基异丁酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的至少一种。
结合第一方面优选地，所述阳离子亲水段优选为含有仲胺、叔胺、季胺、吡啶、咪唑鎓、锍鎓离子的聚合物中的至少一种。
结合第一方面优选地，所述螺旋疏水段优选为聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的至少一种。
结合第一方面优选地，所述阳离子亲水段优选为含有仲胺、叔胺、季胺、胍盐、硫鎓离子的聚合物中的至少一种，螺旋疏水段优选为聚丙氨酸、聚亮氨酸、聚苯丙氨酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的至少一种。
本申请的第二方面提供一种第一方面所述的具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物的制备方法，包括：
以阳离子化合物单体为原料，通过聚合反应制备得到阳离子聚合物；其中，阳离子聚合物的分子量Mn为1000~25000；
以阳离子聚合物为原料，通过引发氨基酸及其衍生物的小分子开环聚合制备得到嵌段共聚物；
和/或，与螺旋疏水段偶联、接枝反应，制备得到嵌段共聚物；其中，聚氨基酸及其衍生物的聚合度n为10~100。
本申请的第三方面提供一种第一方面所述的具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物用于自组装体、生物传感、药物递送或疾病诊断中的应用。
与现有技术相比，本申请实施例的优点或有益效果至少包括：
本申请所提供的嵌段共聚物，一方面，通过非螺旋的阳离子亲水段与具有螺旋结构的疏水段的有效分离和组合，能够平衡与细胞膜之间的相互作用，不仅具有优异的细胞膜成孔能力，而且形成的孔具有可逆性，从而在提高药物递送的效率的同时也提高了载体材料的安全性；另一方面，相较于一些传统的阳离子螺旋多肽依赖于精细的结构设计和复杂的化学手段以稳定主链螺旋结构和实现细胞膜成孔性能，本申请选用现有通用的阳离子聚合物，通过其与设计的疏水螺旋段组合和协同增效，就可实现高效的细胞膜成孔，避免了复杂的合成步骤和后续处理工艺，为细胞膜成孔领域带来了不同的可能性；第三方面，不同于现有的载体材料，包括一些常用的阳离子聚合物，大多通过包载治疗药物并以内吞的方式进入细胞，本申请提供的嵌段共聚物以其独特的细胞膜可逆成孔的作用机制，介导生物活性分子通过渗透作用直接进入细胞发挥作用，从而有效地避免了生物活性分子被溶酶体捕获和降解，显著提高了药物递送效率和生物利用度；此外，通过这种方式递送的生物活性分子种类不受限制，为其应用带来了更广阔的潜力；第四方面，与现有阳离子螺旋和细胞膜成孔材料需要复杂、繁琐且高成本的设计合成技术相比，本申请所提供的嵌段共聚物结构清晰，制备过程简单快速，显著降低了合成和生产成本，提高了其临床转化潜力。此外，该结构中的阳离子亲水段和螺旋疏水段具有更丰富的选择多样性及可修饰性，使得该共聚物能够在不同的生物医学应用场景下精确调控其性能与功能；第五方面，本申请所提供的嵌段共聚物在自组装、生物传感、药物传递、疾病诊断和治疗等方面具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1为实施例3制备的嵌段共聚物自组装体的粒径大小及分布；
图2为实施例3制备的嵌段共聚物自组装体的透射电镜图；
图3为实施例3制备的嵌段共聚物自组装体的圆二色谱图；
图4为实施例1、5制备的嵌段共聚物自组装体与细胞作用后细胞膜完整性的激光共聚焦照片；
图5为实施例4制备的嵌段共聚物自组装体的递送性能的激光共聚焦照片；
图6为部分实施例制备的嵌段共聚物自组装体的递送性能的定量图；
图7为实施例9制备的嵌段共聚物自组装体的入胞机制的激光共聚焦照片；
图8为实施例12制备的嵌段共聚物自组装体的生物相容性的定量图；
图9为实施例7制备的嵌段共聚物自组装体的体外抗肿瘤结果图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请作进一步地详细描述，所描述的实施例不应视为对本申请的限制，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。
在以下的描述中，涉及到“一些实施例”，其描述了所有可能实施例的子集，但是可以理解，“一些实施例”可以是所有可能实施例的相同子集或不同子集，并且可以在不冲突的情况下相互结合。除非另有定义，本申请实施例所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请实施例的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本申请实施例所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的，不是旨在限制本申请。
在本实施例以下描述中，术语“包括”、“包含”、“具有”和“含有”等均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
需要说明的是，本申请实施例中的所有原料/试剂均可在市场上购买或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备获得；本申请实施例中的术语“和/或”仅用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B表示单独存在A、单独存在B、同时存在A和B的三种情况，其中，A、B可以为单数或复数，字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本实施例以下描述中，术语“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项（个）”或其类似表达是指的这些项中的任意组合，包括单项（个）或复数项（个）的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项（个）”，或，“a，b和c中的至少一项（个）”，均可以表示：a，b，c，a-b（即a和b），a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。
本领域技术人员应当理解，在本申请实施例以下描述中，序号的先后并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本领域技术人员应当理解，在本申请实施例中的数值范围应理解为还具体公开该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值和陈述范围内的中间值以及其他任何陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本申请内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的技术/科学术语具有本申请所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本申请仅描述优选的方法和材料，但在本申请的实施例或测试例中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通常引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本申请书的内容为准。
需要说明的是，本申请实施例中的所有原料和/或试剂均是在市场上购买或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备获得。
第一方面，本申请实施例提供一种具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物由阳离子亲水段和螺旋疏水段构成；
其中，所述阳离子亲水段是具有无规卷曲结构的阳离子聚合物；
所述螺旋疏水段为能形成稳定α-螺旋结构的聚氨基酸及其衍生物。
本申请所提供的嵌段共聚物，一方面，通过非螺旋的阳离子亲水段与具有螺旋结构的疏水段的有效分离和组合，能够平衡与细胞膜之间的相互作用，不仅具有优异的细胞膜成孔能力，而且形成的孔具有可逆性，从而在提高药物递送的效率的同时也提高了载体材料的安全性；另一方面，相较于一些传统的阳离子螺旋多肽依赖于精细的结构设计和复杂的化学手段以稳定主链螺旋结构和实现细胞膜成孔性能，本申请选用现有通用的阳离子聚合物，通过其与设计的疏水螺旋段组合和协同增效，就可实现高效的细胞膜成孔，避免了复杂的合成步骤和后续处理工艺，为细胞膜成孔领域带来了不同的可能性；第三方面，不同于现有的载体材料，包括一些常用的阳离子聚合物，大多通过包载治疗药物并以内吞的方式进入细胞，本申请提供的嵌段共聚物以其独特的细胞膜可逆成孔的作用机制，介导生物活性分子通过渗透作用直接进入细胞发挥作用，从而有效地避免了生物活性分子被溶酶体捕获和降解，显著提高了药物递送效率和生物利用度。此外，通过这种方式递送的生物活性分子种类不受限制，为其应用带来了更广阔的潜力；第四方面，与现有阳离子螺旋和细胞膜成孔材料需要复杂、繁琐且高成本的设计合成技术相比，本申请所提供的嵌段共聚物结构清晰，制备过程简单快速，显著降低了合成和生产成本，提高了其临床转化潜力；此外，该结构中的阳离子亲水段和螺旋疏水段具有更丰富的选择多样性及可修饰性，使得该共聚物能够在不同的生物医学应用场景下精确调控其性能与功能；第五方面，本申请所提供的嵌段共聚物在自组装、生物传感、药物传递、疾病诊断和治疗等方面具有巨大的应用潜力。
具体实施例中，本申请实施例的所述嵌段共聚物优选为线形嵌段共聚物、星形嵌段共聚物、环形嵌段共聚物、梳形嵌段共聚物、（超）支化嵌段共聚物中的一种，所述阳离子亲水段的嵌段数优选为m1≥1；和/或，所述螺旋疏水段的嵌段数优选为m2≥1。
具体实施例中，本申请实施例的嵌段共聚物优选为线形嵌段共聚物时，所述嵌段数m1≤2、和/或m2≤2，且m1与m2之和优选为2~3，所述阳离子亲水段为含有伯胺、仲胺、叔胺、季胺、吡啶、咪唑鎓、胍盐、锍鎓离子和膦离子的聚合物中的一种；进一步地，优选为含有仲胺、叔胺、季胺、吡啶、咪唑鎓、锍鎓离子的聚合物中的一种。
其中，该些阳离子聚合物能够快速地通过静电作用与细胞膜上带负电的脂质分子相互结合。
所述螺旋疏水段为聚苯丙氨酸、聚蛋氨酸、聚2-氨基异丁酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的一种；进一步地，优选为聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的一种。
其中，该些聚氨基酸及其衍生物能够自发地形成稳定的疏水α-螺旋结构，进而通过疏水作用扰动细胞膜，并与阳离子亲水段协同作用，在细胞膜上形成可逆的瞬时孔。
具体实施例中，本申请实施例的嵌段共聚物优选为线形嵌段共聚物时，所述嵌段数m1≥2、且m2≥2，所述阳离子亲水段为含有伯胺、仲胺、叔胺、季胺、吡啶、咪唑鎓、胍盐、锍鎓离子和膦离子的聚合物中的一种；进一步地，优选为含有仲胺、叔胺、季胺、胍盐、硫鎓离子的聚合物中的一种；
需要说明的是，该些阳离子聚合物能够与细胞膜通过有效的静电作用相互结合，其无规卷曲的结构又不会产生强大的生物毒性。
所述螺旋疏水段为聚丙氨酸、聚亮氨酸、聚苯丙氨酸、聚蛋氨酸、聚2-氨基异丁酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的一种；进一步地，优选为聚丙氨酸、聚亮氨酸、聚苯丙氨酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的一种。
需要说明的是，该些聚氨基酸及其衍生物能够形成稳定的疏水α-螺旋结构，这种刚性的疏水结构可以与阳离子亲水段产生增效，促进细胞的高效摄取与易位，又避免因疏水作用太强而导致细胞膜的溶解破裂。
具体实施例中，本申请实施例的嵌段共聚物优选为星形嵌段共聚物、环形嵌段共聚物、梳形嵌段共聚物、（超）支化嵌段共聚物时，所述阳离子亲水段为含有伯胺、仲胺、叔胺、季胺、吡啶、咪唑鎓、胍盐、锍鎓离子和膦离子的聚合物中的一种；进一步地，优选为含有仲胺、叔胺、季胺、胍盐、硫鎓离子的聚合物中的一种。
需要说明的是，该些带有较强正电荷的阳离子亲水段，与细胞膜通过静电作用相互结合的同时，广泛存在于一些结构简单的化合物或聚合物中，不需要复杂的物理化学手段来获取，便于对其进行修饰改性，以具有多功能化的性能，实现多功能化的应用。
所述螺旋疏水段为聚丙氨酸、聚亮氨酸、聚苯丙氨酸、聚蛋氨酸、聚2-氨基异丁酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的一种；进一步地，优选为聚丙氨酸、聚亮氨酸、聚苯丙氨酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的一种。
需要说明的是，该些聚氨基酸及其衍生物形成α-螺旋结构的倾向性更强，结构稳定性更好，其氨基酸或衍生物单体简单易得，来源广泛，并且可通过多种化学反应方式形成聚合物。
第二方面，本申请实施例提供一种第一方面所述的具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物的制备方法，包括：
以阳离子化合物单体为原料，通过聚合反应制备得到阳离子聚合物；其中，阳离子聚合物的分子量Mn为1000~25000；
以阳离子聚合物为原料，通过引发氨基酸及其衍生物的小分子开环聚合制备得到嵌段共聚物；
和/或，与螺旋疏水段偶联、接枝反应，制备得到嵌段共聚物；其中，聚氨基酸及其衍生物的聚合度n为10~100。
第三方面，本申请实施例提供一种第一方面所述的具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物用于自组装体、生物传感、药物递送或疾病诊断中的应用。
下面将结合具体实施例对本申请的技术方法作进一步地阐述。
实施例1
本实施例1提供一种聚精氨酸-聚苯丙氨酸线形双嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备磺酰基-L-精氨酸环内羧酸酐（Pbf-L-Arg-NCA）
向350 mL反应瓶中依次加入10 g磺酰基-L-精氨酸（Pbf-Arg）、200 mL四氢呋喃（THF）、15 mL环氧丙烷（PO），磁力搅拌均匀后，迅速加入6.3 g三光气并立即密封容器，25℃反应至溶液澄清，固体全部消失。将反应混合物在冰浴中冷却，添加70 mL的冷水淬灭过量的三光气，室温下用50 mL×2乙酸乙酯萃取混合物，将合并的有机相用饱和食盐水洗涤，并用无水MgSO4干燥，旋转蒸发除去溶剂后，正己烷/四氢呋喃中结晶纯化粗产物3次，真空干燥，即得产物Pbf-L-Arg-NCA，其产率为75%。
（2）制备苯丙氨酸环内羧酸酐（L-Phe-NCA）
依次将5 g苯丙氨酸（Phe）、75 mL THF、10 mL PO加入到120 mL反应瓶中，磁力搅拌均匀，迅速加入4.5 g三光气并立即密封容器，25℃反应至溶液澄清，固体全部消失。反应混合物在冰浴中冷却，添加70 mL的冷水搅拌淬灭过量的三光气，室温下用50 mL×2乙酸乙酯萃取混合物，将合并的有机相用饱和食盐水洗涤，并用无水MgSO4干燥，旋转蒸发除去溶剂后，正己烷/四氢呋喃中结晶纯化粗产物3次，真空干燥，即得产物L-Phe-NCA，其产率为72%。
（3）制备聚磺酰基精氨酸（PEG-P(Pbf)Arg-NH2）
将1.84 g引发剂聚乙二醇胺（PEG-NH2）溶于NaHCO3水溶液中，加入2 g Pbf-L-Arg-NCA，冰水浴下反应12 h，将反应得到的水溶液转移至截留分子量为3500（MWCO 3500）的透析袋中，去离子水透析2天，冷冻干燥得到产物PEG-P(Pbf)Arg-NH2，其产率为75%。
（4）制备聚磺酰基赖氨酸-聚苯丙氨酸（PEG-P(Pbf)Arg-PPhe）
将PEG-P(Pbf)Arg-NH2（2 g）溶于二氯甲烷（DCM，27.55 mL）中，再加入pH=7的BCP缓冲液（0.1 mol/L硼酸，0.025 mol/L柠檬酸，0.05 mol/L磷酸三钠）0.8 ml，超声乳化30min备用；之后，将L-Phe-NCA（1.93 g）溶于DCM（27.55mL）中，两者混合，磁力搅拌反应2h，反应结束后，用无水乙醚/正己烷（v/v=1:1）结晶纯化粗产物3次，真空干燥即得产物PEG-P(Pbf)Arg-PPhe，其产率为74%。
（5）制备聚精氨酸-聚苯丙氨酸（PEG-PArg-PPhe）
将PEG-P(Pbf)Arg-PPhe（2 g）溶于20 mL三氟乙酸（TFA），氩气保护下，室温搅拌反应1 h，将反应所得的混合物旋转蒸发除去TFA后，用冰乙醚沉淀纯化粗产物3次，将所得的产物溶于无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF），随后转移至MWCO 3500的透析袋中，去离子水透析2天，冷冻干燥即得产物 PEG-PArg-PPhe（聚精氨酸分子量Mn=4700；苯丙氨酸聚合度n=30；阳离子嵌段数m1=1；疏水螺旋嵌段数m2=1），其产率为80%。
实施例2
本实施例2提供一种聚赖氨酸-聚苄基半胱氨酸线形多嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备聚（Boc）赖氨酸-聚苄基半胱氨酸（P(Boc)Lys-P(Bn)Cys）多嵌段共聚物
取Boc-L-Lys-NCA（2.0 g）溶于20 mL无水DMF中，随后加入引发剂正己胺（97 µL），氩气保护下37℃反应3天，反应进行至第3天时，将预先溶有苄基半胱氨酸环内羧酸酐（Bn-L-Cys-NCA）的无水DMF溶液（1.94 g，20 mL）通过注射器快速注入体系中继续反应3天，待反应至第3天时，再将溶有Boc-L-Lys-NCA的无水DMF溶液（2.0 g，20 mL）通过注射器注入继续反应，以此循环得到不同嵌段数的P(Boc)Lys-P(Bn)Cys多嵌段共聚物，待最终反应结束后，在冰乙醚中沉淀纯化粗产物3次，真空干燥得到产物P(Boc)Lys-P(Bn)Cys多嵌段共聚物，其产率为65%。
（2）制备聚赖氨酸-聚苄基半胱氨酸（PLys-P(Bn)Cys）多嵌段共聚物
将上述制备的P(Boc)Lys-P(Bn)Cys多嵌段共聚物（2 g）溶于20 mL TFA，氩气保护下，室温搅拌反应1 h，将反应所得的混合物旋转蒸发除去TFA后，用冰乙醚沉淀粗产物3次，将所得的粗产物再次溶于DMF，随后转移至MWCO 3500的透析袋中，去离子水透析2天，冷冻干燥后，即得PLys-P(Bn)Cys多嵌段共聚物（聚赖氨酸分子Mn=1300；苄基半胱氨酸聚合度n=10；阳离子嵌段数m1=3；疏水螺旋嵌段数m2=3），其产率为80%。
实施例3
本实施例3提供一种PLys-P(Bn)Cys多嵌段共聚物自组装体的制备方法，具体步骤如下：
取实施例2所得的PLys-P(Bn)Cys多嵌段共聚物10 mg溶于1 mL DMF中，以30 s/d的速度缓慢滴加到快速搅拌的去离子水（9 mL）中，滴加完毕后，继续搅拌30 min；然后将液体转移到MWCO 3500的透析袋中，去离子水透析2天，将所得液体离心（3500r/min），过滤（0.45 μm），定容，得到PLys-P(Bn)Cys多嵌段共聚物自组装体溶液。
实施例4
本实施例4提供一种四臂聚乙二醇-季铵盐修饰聚半胱氨酸-聚亮氨酸星形嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备四臂聚乙二醇-胆固醇修饰聚半胱氨酸（G4-PEG-P(Chol)Cys-NH2）
将胆固醇修饰的半胱氨酸环内羧酸酐（Chol-L-Cys-NCA，3.5 g）用30 mL无水THF溶解，然后将四臂聚乙二醇（G4-PEG-HN2，1 g）的无水THF（10 mL）加入反应体系中，氩气保护下37℃反应3天，将混合溶液进行浓缩后用冰乙醚沉淀纯化3次，得到浅黄色固体产物G4-PEG-P(Chol)Cys-NH2，其产率为75%。
（2）制备四臂聚乙二醇-胆固醇修饰聚半胱氨酸-聚亮氨酸（G4-MPEG-P(Chol)Cys-PLeu）
取亮氨酸环内羧酸酐（L-Leu-NCA，2.0 g）溶于20 mL无水DMF，随后通过注射器加入预先溶有G4-MPEG-P(Chol)Cys-NH2的无水DMF溶液（1.5 g，15 mL），氩气保护条件下37℃反应3天，反应结束后，在冰乙醚中沉淀纯化3次，真空干燥，即得产物G4-PEG-P(Chol)Cys-PLeu，其产率为69%。
（3）制备四臂聚乙二醇-季铵盐修饰聚半胱氨酸-聚亮氨酸（G4-PEG-P(Q-Chol)Cys-PLeu）
将50 mg G4-MPEG-P(Chol)Cys-PLeu用10 mL无水THF溶解，然后将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵（25 mg）溶于5mL的冰醋酸中，将前述溶液通过注射器缓慢加入反应体系中，37℃下反应24 h，随后再加入25 mg的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，继续反应24 h，反应结束后，将其转移至MWCO 3500透析袋中，去离子水透析2天，冷冻干燥即得产物G4-MPEG-P(Q-Chol)Cys-PLeu（季铵盐修饰聚半胱氨酸分子量Mn=4600；亮氨酸聚合度n=40；阳离子嵌段数m1=2；疏水螺旋嵌段数m2=1），其产率为70%。
实施例5
本实施例5提供一种聚酰胺胺-聚苄酯天冬氨酸-聚精氨（超）支化嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备聚酰胺胺-聚苄酯天冬氨酸（PAMAM-P(Bn)Asp-NH2）
将引发剂聚酰胺胺（PAMAM，Mn=3000，2 g）超声加热溶于20 mL无水DMF中，随后通过注射器将预先溶有天冬氨酸-4-苄酯环内羧酸酐（Bn-L-Asp-NCA，2.0 g）的无水DMF溶液加入反应体系中，氩气保护条件下37℃下反应3天，反应结束后，将混合液在冰乙醚中沉淀纯化3次，真空干燥即得产物PAMAM-P(Bn)Asp-NH2，其产率为78%。
（2）制备聚酰胺胺-聚苄酯天冬氨酸-聚精氨酸（PAMAM-P(Bn)Asp-PArg）
将上述PAMAM-P(Bn)Asp-NH2超声溶于20 mL无水DMF中，随后将预先溶于无水DMF中的精氨酸环内羧酸酐（L-Arg-NCA，1 g）通过注射器加入反应体系中，氩气保护下37℃反应3天，待反应结束后，将混合液在冰乙醚中沉淀纯化3次，真空干燥即得产物PAMAM-P(Bn)Asp-PArg（苄酯天冬氨酸聚合度n=25；聚精氨酸分子量Mn=6500），其产率为74%。
实施例6
本实施例6提供一种聚（Boc）赖氨酸接枝壳聚糖的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备N-邻苯二甲酰壳聚糖
将1 g壳聚糖（Chi-6k）和2.76 g邻苯二甲酸酐分散在200 mL无水DMF中，90℃下搅拌反应8 h。反应结束后，将溶剂蒸发，50 mL无水乙醇沉淀，随后将沉淀过滤，用水、乙醇和乙醚连续洗涤，最后真空干燥，即得产物，其产率为53%。
（2）制备N-邻苯二甲酰基-6-O-三苯甲基壳聚糖
将三苯基氯甲烷（3.06 g）和N-邻苯二甲酰壳聚糖（1 g）溶于20 mL无水吡啶中，在90℃下搅拌反应24 h，将溶剂蒸发后，用乙醇和乙醚洗涤产物，其产率为60%。
（3）制备6-O-三苯甲基壳聚糖（Tr-Chi）
将N-邻苯二甲酰基-6-O-三苯甲基壳聚糖（1 g）和18 mL的水肼（50wt%）在氩气保护下100℃搅拌溶在35 mL去离子水中，反应15 h，反应结束后，滤出悬浮液，用水、乙醇、乙醚洗涤产物，其产率为85%。
（4）制备聚（Boc）赖氨酸接枝6-O-三苯甲基壳聚糖共聚物（Tr-Chi-P(Boc)Lys）
将Tr-Chi（1 g）和Boc-L-Lys-NCA（1 g）溶解在30 mL无水N,N-二甲基乙酰胺（DMAc）中，室温反应3天。将混合液在冰乙醚中沉淀纯化3次，真空干燥即得产物Tr-Chi-P(Boc)Lys（6-O-三苯甲基壳聚糖分子量Mn=6000；Boc赖氨酸聚合度n=100），其产率为72%。
实施例7
本实施例7提供一种聚苯丙氨酸-季铵盐修饰聚赖氨酸接枝葡聚糖的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备氧化葡聚糖（O-Dex）
氧化的葡聚糖（O-Dex）是通过将葡聚糖与等摩尔的高碘酸钾在水中反应，用DOWEX-1阴离子交换树脂（乙酸盐形式）纯化，用去离子水透析，最后冻干得到。
（2）制备聚苯丙氨酸-聚赖氨酸接枝氧化葡聚糖（PPhe-PLys-O-Dex）
5 h内将O-Dex（1 g）的100 mL去离子水溶液缓慢加入到含有等摩尔量的聚苯丙氨酸-聚赖氨酸（PPhe-PLys）的碱性缓冲溶液（50 mL，0.1 M硼酸盐，pH=11）中，将混合物在室温下搅拌反应24 h，加入过量的硼氢化钠（1 g），室温下继续搅拌48 h，将得到的淡黄色溶液转移至MWCO 3500透析袋中，去离子水透析2天，冷冻干燥，即得产物PPhe-PLys-O-Dex，其产率为50%。
（3）制备聚苯丙氨酸-季铵盐修饰聚赖氨酸接枝葡聚糖（PPhe-P(Q)Lys-Dex）
将PPhe-PLys-O-Dex（2 g）溶于100 mL去离子水中，加入400 mg氢氧化钠（NaOH），磁力搅拌溶液并加热至60℃，加入24 mL缩水甘油基三甲基氯化铵（GTMAC），60℃下反应4h，待反应结束，混合物冷却并转移到MWCO 12000透析袋中，去离子水透析2天，冷冻干燥后，得到产物PPhe-P(Q)Lys-Dex（葡聚糖的分子量Mn=10000；季铵盐修饰聚赖氨酸的分子量Mn=2000；苯丙氨酸聚合度n=20；阳离子嵌段数m1=3；疏水螺旋嵌段数m2=2），其产率为85%。
实施例8
本实施例8提供一种聚乙二醇-线性聚乙烯亚胺-聚叔丁基二甲基谷氨酸线形嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备聚乙二醇-线性聚乙烯亚胺（PEG-LPEI）
将100 μL乙醇胺溶于5 mL去离子水中，然后用同步加速器X射线（4-30 keV，105Gy/s）在室温下辐照5 min，将得到的混合溶液转移至MWCO3500透析袋中，去离子水透析2天，冷冻干燥获得产物PEG-LPEI，其产率为70%。
（2）制备聚乙二醇-聚线性乙烯亚胺-聚叔丁基二甲基谷氨酸（PEG-LPEI-P(TBS)Glu）
将上述产物PEG-LPEI（2.0 g）溶于20 mL无水DMF中，将预先溶有叔丁基二甲基谷氨酸环内羧酸酐（TBS-L-Glu-NCA，1 g）的无水DMF溶液通过注射器快速加入反应体系中，氩气保护下37℃反应3天，待反应结束后，将混合液在冰乙醚中沉淀纯化3次，真空干燥后，得到产物PEG-LPEI-P(TBS)Glu（线性聚乙烯亚胺分子量Mn=25000；叔丁基二甲基谷氨酸聚合度n=10），其产率为74%。
实施例9
本实施例9提供一种聚2-氨基异丁酸-聚丙烯酰胺的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)丙-2-基氧基)乙基)-三氟乙酰胺
将三乙胺（TEA，2.06 g）和1,1′-(2,2′-(丙烷-2,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二脲（2.2 g）溶于10 mL无水甲醇中,接着三氟乙酸乙酯（1.93 g）同样溶于10 mL无水甲醇中，并将所得混合物缓慢滴加到前述原料的冰溶液中，将反应混合物在冰浴下搅拌反应6 h，然后用3×30 mL二氯甲烷萃取混合物，有机层合并蒸发，最后将产物用硅胶色谱法纯化，得到白色固体产物，其产率为45%。
（2）制备N-(2-(2-(2-(2-(三氟乙酰氨基)乙氧基)丙-2-基氧基)乙基)丙烯酰胺
将TEA（2.19 g）和上述步骤1所得产物（1.40g）溶于10 mL二氧六环中，并将混合溶液保持在冰浴中，在10 mL二氧六环中制备丙烯酰氯溶液（0.98 g），并缓慢加入到前述原料的溶液中，搅拌反应10 min，用3×100mL乙酸乙酯提取产物，然后用硅胶色谱法梯度纯化，得到黄色油状产物，其产率为69%。
（3）制备聚2-氨基异丁酸-聚丙烯酰胺
将聚2-氨基异丁酸（0.1 g）溶于2 mL无水甲醇中，在高真空下蒸发甲醇30 min，将所得溶液溶解在10 mL无水DMF中，随后加入0.73 g上述步骤2所得产物和0.23 g TEA，将所得混合物在45℃下搅拌反应5天，无水乙醚沉淀纯化3次，真空干燥后，得到产物聚2-氨基异丁酸-聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺分子量Mn=5000；2-氨基异丁酸聚合度n=60；阳离子嵌段数m1=1；疏水螺旋嵌段数m2=2），其产率为78%。
实施例10
本实施例10提供一种树枝状聚乙烯亚胺偶联聚乙二醇-聚苄氧羰基赖氨酸（超）支化嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备聚乙二醇-聚苄氧羰基赖氨酸偶联物（P(Cbz)Lys-PEG-VS）
将聚苄氧羰基聚赖氨酸（P(Cbz)Lys）溶解在含有过量TEA的无水DMF中。接着将N-羟基琥珀酰亚胺-乙烯基砜聚乙二醇（NHS-PEG-VS）同样溶于无水DMF，随后立即混合，室温下反应2 h，向反应溶液中加入冰乙醚，使偶联物以白色沉淀析出，真空干燥沉淀后，得到产物P(Cbz)Lys-PEG-VS偶联物，其产率为50%。
（2）制备树枝状聚乙烯亚胺偶联聚乙二醇-聚苄氧羰基赖氨酸（BPEI-PEG-P(Cbz)Lys）
将过量的P(Cbz)Lys-PEG-VS偶联物与pH=9.0碳酸钠缓冲液中的树枝状聚乙烯亚胺（BPEI）溶液混合，并在室温下反应过夜。通过透析分离冷冻干燥后，得到最终产物BPEI-PEG-P(Cbz)Lys（树枝状聚乙烯亚胺分子量Mn=1200；苄氧羰基赖氨酸聚合度n=40），其产率为65%。
实施例11
本实施例11提供一种六臂聚酰胺胺-聚苯丙氨酸星形嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备六臂乙烯基封端聚酰胺胺
将N，N′-亚甲基双丙烯酰胺（MBA，3.083 g）溶于20 mL甲醇/水（2/1，v/v）混合物中，然后加入溶于另外10 mL相同混合溶剂的1-（2-氨基乙基）哌嗪（AEPZ，1.291 g），50℃下剧烈搅拌进行聚合，直到剩下25%的总乙烯基。
（2）制备六臂聚酰胺胺-聚苯丙氨酸（G6-PAMAM-PPhe）
将聚苯丙氨酸（2.265g）加入步骤1的反应溶液中，并在45℃下搅拌反应150 h。浓缩后，在丙酮中沉淀，40℃下真空干燥，得到淡黄色粉末G6-PAMAM-PPhe（六臂聚酰胺胺分子量Mn=5000，苯丙氨酸聚合度n=80；阳离子嵌段数m1=1；疏水螺旋嵌段数m2=1），其产率为91.4%。
实施例12
本实施例12提供一种聚赖氨酸-聚二甲酯天冬氨酸形双嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备聚赖氨酸-4-叠氮苯胺（PDL）
聚赖氨酸（PLys）、N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDAC）和4-叠氮基苯胺，混合溶于在20 mL去离子水中，反应物摩尔比为EDAC:PLL=40:1，4-叠氮苯胺:EDAC=4:1，4℃下黑暗环境中反应4 h。将所得的混合物通过MWCO 500纤维素酯膜（Spectrum）透析以除去未反应的物质，得到产物PDL。
（2）制备聚赖氨酸-聚二甲酯天冬氨酸（PLys-P(OMe)Asp）
将聚赖氨酸-4-叠氮苯胺（PDL）溶解在6 mL磷酸盐缓冲液中，并将分散液加入到0.12 g聚二甲酯天冬氨酸（P(OMe)Asp）粉末中，随后将P(OMe)Asp/PDL溶液置于聚苯乙烯培养皿（Falcon）中，并在距离紫外光源（BlakRay灯，型号B100 AP，波长∼360nm，100 W）约5 cm处照射2 min，聚赖氨酸-聚二甲酯天冬氨酸彻底洗涤5次以除去未结合的反应性P(OMe)Asp，冷冻干燥，得到产物PLys-P(OMe)Asp（聚赖氨酸分子量Mn=6400；二甲酯天冬氨酸聚合度n=50；阳离子嵌段数m1=1；疏水螺旋嵌段数m2=1）。
实施例13
本实施例13提供一种四臂聚酰胺胺-聚丙氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸线形多嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备乙酰化的四臂聚酰胺胺树枝状大分子（G4-PAMAM-NHAC）
将TEA（0.11 mL）和四臂聚酰胺胺（G4-PAMAM-NH2，172 mg）溶于无水甲醇（10 mL）中，加入过量的乙酸酐（0.08 mL）,将所得混合物在室温下搅拌反应24 h，减压蒸发甲醇，并将所得残留物溶解在2 mL去离子水中，随后转移至MWCO 2000透析袋中，在去离子水透析2天，冷冻干燥，得到乙酰化的G4-PAMAM-NHAC树枝状大分子，其产率为72%。
（2）制备四臂聚酰胺胺-聚丙氨酸（G4-PAMAM-PAla）
将G4-PAMAM-NHAC（2 g）超声加热溶于20 mL无水DMF中，随后通过注射器将预先溶有丙氨酸环内羧酸酐单体（Ala-NCA，2.0 g）的无水DMF溶液快速加入反应体系中，氩气保护下37℃反应3天，待反应结束后，将混合液在冰乙醚中沉淀纯化3次，真空干燥，即得产物G4-PAMAM-PAla，其产率为75%。
（3）制备四臂聚酰胺胺-聚丙氨酸-聚乙二醇（G4-PAMAM-PAla-PEG-COOH）
双（2-羧乙基）聚乙二醇（15 mg）和G4-PAMAM-PAla（83 mg）溶解在DCM（5 mL）和DMSO（5 mL）的混合溶剂中，室温搅拌反应10 min后，N-（3-二甲氨基丙基）-N-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC HCl，1 mg）和4-（甲基氨基）吡啶（DMAP，0.5 mg）加入到反应混合物中，室温下再搅拌反应36 h，减压除去溶剂，将残留物溶解在去离子水中，并使用Spectra/Por透析膜（MWCO 6000），去离子水透析纯化2天，接着使用水作为洗脱剂通过Sephadex G10色谱柱后冻干，进一步纯化后，得到白色固体产物G4-PAMAM-PAla-PEG-COOH，其产率为69%。
（4）制备四臂聚酰胺胺-聚丙氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸（G4-PAMAM-PAla-PEG-PLys）
将TEA（0.2 mL）和聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（22 mg）溶于无水DMSO（3 mL）中，将反应混合物进一步用无水DCM（5 mL）稀释，然后加入G4-PAMAM-PAla-PEG-COOH（22 mg），室温下搅拌反应15 min，向反应混合物中加入HCl（1.5 mg）和PLys（0.5 mg）,将所得溶液在室温下再搅拌反应36 h，滤去副产物碳二亚胺脲，减压除去溶剂，将残留物溶解在水中，并使用Spectra/Por透析膜（MWCO 10000），去离子水中透析纯化2天，使用水作为洗脱剂并通过Sephadex G10色谱柱后冻干，进一步纯化后，得到白色固体G4-PAMAM-PAla-PEG-PLys，其产率为72%。
（5）制备四臂聚酰胺胺-聚丙氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸（G4-PAMAM-PAla-PEG-PLys-PLeu）
将G4-PAMAM-PAla-PEG-PLys（2 g）超声加热溶于20 mL无水DMF中，随后通过注射器将预先溶有Ala-NCA单体（2.0 g）的无水DMF溶液快速加入反应体系中，氩气保护下37℃反应3天，待反应结束后，将混合液在冰乙醚中沉淀纯化粗产物3次，真空干燥后，即得产物G4-PAMAM-PAla-PEG-PLys-PLeu（四臂聚酰胺胺分子量Mn=2000，丙氨酸聚合度n=60；聚赖氨酸分子量Mn=12800；亮氨酸聚合度n=40；阳离子嵌段数m1=2；疏水螺旋嵌段数m2=2），其产率为73%。
实施例14
本实施例14提供一种聚赖氨酸-聚丙氨酸线形多嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备氨基酸乙烯基单体
以叔丁氧羰基丙氨酸（Boc-L-Ala-OH）为例，将Boc-L-Ala-OH（6.0 g）溶于无水DCM（50 mL）中，随后将二环己基碳二亚胺（DCC，5.13 g）和4-二甲氨基吡啶（DMAP，0.28 g）添加到体系中。然后在冰水浴下，搅拌将甲基丙烯酸2-羟乙酯（HEMA，3.24 g）缓慢滴加到反应混合物中，反应30 min，随后转移至室温下继续反应24 h，抽滤除去不溶性N，N′-二环己基脲（DCU），在滤液中再加入80 mL去离子水，然后用120 mL无水DCM萃取4次，有机层进一步用NaHCO3洗涤3次并用无水NaSO4干燥，通过旋蒸除去溶剂，以己烷/乙酸乙酯为流动相（v/v）通过硅胶柱层析进一步纯化，得到无色液体氨基酸乙烯基单体Boc-Ala-HEMA，其产率为93%。以叔丁氧羰基赖氨酸为原料制备Boc-Lys-HEMA的过程类似。
（2）制备聚（Boc）赖氨酸（P(Boc-Lys-HEMA)-macroCTA）
将氨基酸乙烯基单体（0.50 g），4-氰基-4-（十二烷基硫代羰基）硫基戊酸（CDP，10.7 mg）、2,2′-偶氮二异丁腈（AIBN，8.7 mg）溶于11 mL无水DMF中，氩气保护下70℃反应，最后通过在冰水浴中冷却并将溶液暴露在空气中来淬灭聚合，接着将溶液用丙酮稀释，在丙酮/己烷中沉淀纯化粗产物3次，真空干燥，即得产物P(Boc-Lys-HEMA)-macroCTA，其产率为78%。
（3）制备聚（Boc）赖氨酸-聚（Boc）苯丙氨酸（P(Boc)Lys-P(Boc)Ala）多嵌段共聚物
Boc-Ala-HEMA（0.143 g）、P(Boc-Lys-HEMA)-macroCTA（0.11 g）、AIBN（5.9mg）溶于10 mL无水DMF中，氩气保护下70℃反应，到预定时间后，将反应瓶在冰水浴中冷却，并根据需要用丙酮稀释反应混合物，最后，在丙酮/己烷中沉淀纯化粗产物3次，室温下真空干燥，得到淡黄色固体，其产率为75%。如此循环，得到P(Boc)Lys-P(Boc)Ala多嵌段共聚物。
（4）制备聚赖氨酸-聚苯丙氨酸（PLys-PAla）多嵌段共聚物
在DCM中使用TFA去除嵌段共聚物侧链的Boc保护基团，得到具有游离伯胺基团的聚合物，将P(Boc)Lys-P(Boc)Phe多嵌段共聚物（50 mg）加入1 mL的无水DCM中搅拌10 min，以确保混合物均匀，然后在冰水浴条件下滴加0.5 mL TFA，并保持搅拌反应2 h，在冰乙醚中沉淀纯化3次，真空干燥得到PLys-PAla多嵌段共聚物（聚赖氨酸分子量Mn=1940；丙氨酸聚合的n=15；阳离子嵌段数m1=5；疏水螺旋嵌段数m2=5），其产率为80%。
对比例1
本对比例提供一种聚乙二醇-聚（D, L）丙交酯-聚精氨酸三嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）活化聚乙二醇-聚（D, L）丙交酯（PEG-PLA-PNP）
将4-硝基苯氯甲酸酯（PNP，118 mg）、嘧啶（64 μL）在0°C下溶于6 mL无水DCM中；然后将溶有聚乙二醇-聚（D，L）丙交酯（1 g）的无水DCM溶液（2 mL）通过注射器迅速注入反应体系，在0 °C下搅拌30分钟，随后转移至室温，氩气保护下搅拌反应2天；反应结束后，在冰乙醚中沉淀纯化粗产3次，减压干燥得到产物PEG-PLA-PNP，其产率为66%。
（2）制备聚乙二醇-聚（D, L）丙交酯-聚精氨酸（PEG-PLA-R15）
将PEG-PLA-PNP（660 mg）、聚精氨酸（R15-NH2，140 mg）、TEA（26 μL）溶于10 mL无水DMF，氩气保护下，室温反应2天。将反应所得溶液通过MWCO 3500透析袋，去离子水透析2天，冷冻干燥，即得产物PEG-PLA-R15（聚精氨酸分子量Mn=2360），其产率为70%。
对比例2
本对比例提供一种去铁胺接枝聚乙二醇-聚苄酯谷氨酸双嵌段共聚物的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备聚乙二醇-聚苄酯谷氨酸（PEG-PBLG）
采用大分子引发剂PEG-NH2引发Bn-L-Glu-NCA开环聚合法制备聚乙二醇-聚苄酯谷氨酸。将Bn-L-Glu-NCA (8.32 g)溶于40 mL无水DMF，然后，通过注射器将溶有PEG-NH2的无水DMF溶液加入体系中，氩气保护下，37 ℃搅拌反应3天，在冰乙醚中沉淀纯化粗产物3次，真空干燥即得产物（PEG-PBLG），其产率为70%。
（2）制备去铁胺接枝聚乙二醇-聚苄酯谷氨酸（PEG-PBLG-DFO）
将PEG-PBLG与去铁胺（DFO）通过氨解反应制备接枝DFO的聚乙二醇-聚苄酯谷氨酸。将PEG-PBLG (0.5 g)和DFO（0.48 ~ 0.90 g）溶于无水DMF/甲醇（v:v=1:1）混合溶剂中，氩气保护下滴入TEA（0.15-0.27 g）后，45 ℃下继续反应48 h，反应所得溶液通过透析袋（MWCO 3500），去离子水透析2天，冷冻干燥，即得产物PEG-PBLG-DFO（聚苄酯谷氨酸聚合度n=20；DFO接枝数为6），其产率为65%。
对比例3
本对比例提供一种阳离子α-螺旋多肽的制备方法，具体步骤如下：
（1）制备1,2-二棕榈酰氧基-3-氨基丙烷（DPAP）
将N-（2,3-二羟丙基）氨基甲酸叔丁酯（1.6 g）和棕榈酸（4.6 g）溶解在100 mL无水DCM中；然后将1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC HCl，10 g）和4-二甲氨基吡啶（DMAP，0.5 g）加入到反应体系中；在室温下搅拌48 h后，停止反应，分别用30 mL×2稀盐酸、30 mL×2盐水和30 mL去离子水洗涤有机相；然后将得到的有机相用无水Na2SO4干燥，过滤后，旋蒸除去DCM，得白色粗品；然后用碱性氧化铝柱层析纯化粗品，得到N-Boc-1-亚氨基-2,3-二棕榈酰氧基丙烷；最后，在冰水浴中用TFA：DCM（1:6）对Boc进行脱保护，在冰乙醚中沉淀后，真空干燥，得到产物DPAP，其产率为36%。
（2）制备γ-烯丙基-L-谷氨酸环内羧酸酐（ALG-NCA）
将谷氨酸（L-Glu，20 g）和烯丙醇（50 mL）置于浸泡在冰水中的烧瓶中，搅拌10分钟后，将8 mL硫酸（98%）滴加到烧瓶中。继续搅拌24 h后，将混合物缓慢倒入100 mL水中（提前溶有27 g碳酸氢钠）中和硫酸；然后，在-20℃下放置过夜，待出现大量沉淀，过滤得粗品，用甲醇重结晶；最后，真空干燥后得到γ-烯丙基-L-谷氨酸酯环内羧酸酐，其产率为45%。
将γ-烯丙基-L-谷氨酸酯环内羧酸酐（10 g）和三光气（5.4 g）置于干燥的三口烧瓶中，随后加入200 mL无水THF，氩气保护下，50℃下搅拌反应10 min后，溶液澄清，20 min后，将溶液倒入1000 mL冰己烷中，并在-20 ℃下储存过夜，弃去上清液后，将粗产物溶于200 mL冷乙酸乙酯中，然后用50 mL×2的冰水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，真空除去乙酸乙酯。最后，得到黄色粘稠油状ALG-NCA，其产率为64%。
（3）制备1,2-二棕榈酰氧基-3-氨丙基-聚（γ-烯丙基-L-谷氨酸酯）（DPAP-PALG）
将DPAP（1.0 g）溶解在250 mL无水THF中，之后快速加入溶解在150 mL无水THF中的γ-烯丙基-L-谷氨酸 N-羧酸酐（ALG-NCA，9.4 g），氩气保护下，室温搅拌反应72 h后，通过旋蒸除去溶剂，将粗产物重新溶于DMF中，然后通过透析袋（MWCO 2000）在去离子水中避光透析2天，冷冻干燥，即得DPAP-PALG白色粉末，其产率为69%。
（4）制备阳离子螺旋多肽（ACPP）
将DPAP-PALG（1.1 g）、半胱胺盐酸盐（2.4 g）和Irgacure®2959光引发剂（0.24g）溶解在DMF/H2O（80 mL/5 mL）混合溶剂中。将溶液用氩气鼓泡20 min以除去体系中的氧气，然后将烧瓶密封，紫外线（ʎ=365 nm，15mW/cm2）辐照30 min，随后在室温下搅拌反应48h，用透析袋（MWCO 3500）将混合物在去离子水中透析2天；最后，冷冻干燥，得到产物ACPP，其产率为86%。
采用动态光散射（DLS）测定所制得的自组装体粒径，如图1所示，其结果为143 nm；采用透射电镜（TEM）对自组装体的形貌进行表征，结果如图2所示，所制得的自组装体为囊泡结构。利用圆二色谱仪对自组装体的二级构象进行测试，结果如图3所示，所制得的自组装体具有无规卷曲和α-螺旋的混合结构。
为了验证上述实施例1和5制备的嵌段共聚物自组装体与细胞共培养一段时间后细胞膜的完整性。嵌段共聚物自组装体和4T1细胞连续培养4 h，接着用荧光染料Dio对细胞膜染色，随后借助激光共聚焦显微镜观察，结果如图4所示，图4为实施例1、5制备的嵌段共聚物自组装体作用后细胞膜完整性的激光共聚焦照片；其中，a表示实施例1所得自组装体的结果图，b表示实施例5所得自组装体的结果图。
从图4中可知，所选实施例1、5制备的嵌段共聚物与细胞共培养4 h后，细胞膜的形状完整，轮廓清晰，这说明在嵌段共聚物与细胞膜相互作用形成瞬时孔的过程中，并不会对细胞膜造成显著的破坏，从而保证了细胞膜的完整性，为药物递送过程的生物安全提供了保障。
为了验证实施例4制备的四臂聚乙二醇-季铵盐修饰聚半胱氨酸-聚亮氨酸星形嵌段共聚物的递送性能，对实施例4制备的自组装体利用荧光物质FITC标记后与4T1细胞共培养2 h，随后进行递送性能表征，结果如图5所示，图5为实施例4制备的星形嵌段共聚物自组装体的递送性能的激光共聚焦照片；其中，a表示实施例4所得的自组装体与细胞连续孵育2h后的结果图；b表示自组装体被洗净后继续培养2 h后的结果图。
本申请实施例中，其中一组选择实施例4所制备的嵌段共聚物自组装体并利用荧光物质FITC标记后和细胞膜不透的荧光小分子碘化吡啶（PI）一起与4T1细胞连续培养2 h。另外一组先将嵌段共聚物自组装体单独与4T1细胞培养2 h，接着将自组装体洗净，30 min后加入PI继续培养2 h，随后通过激光共聚焦来观察自组装体和PI的入胞情况。
从图5中可知，实施例4制备的嵌段共聚物自组装体与PI一起和细胞共培养时，PI能够高效地进入细胞，说明嵌段共聚物具有细胞膜成孔作用，能介导细胞膜不透的荧光物质以分子渗透的方式进入细胞；相对地，将嵌段共聚物自组装体洗净30 min后，再加入PI与细胞共培养，此时PI无法进入细胞。这说明嵌段共聚物在细胞膜上形成的孔洞具有可逆性，能够自行恢复，从而避免对细胞膜产生不可逆的破坏，提高了药物递送的安全性。
为了验证上述实施例制备的嵌段共聚物自组装体细胞膜成孔性能，选择部分实施例和对比例进行性能测试。首先对所选各实施例和对比例自组装体利用荧光物质FITC标记并与PI一起和4T1细胞共培养4 h后进行荧光定量分析，荧光定量图如图6所示；图6中a：实施例2，b：实施例8，c：实施例6，d：实施例14，e：实施例13，f：实施例11，g，实施例7，h：实施例10，i：对比例1，j：对比例2。
从图6中可知，上述实施例制备的嵌段共聚物均具有细胞膜成孔能力，均可介导PI通过所形成的瞬时孔进入细胞。相对地，只有阳离子嵌段的PEG-PLA-R15（对比例1）和只有螺旋结构的PEG-PBLG-DFO（对比例2），因二者不具备细胞膜成孔性能，无法介导PI通过瞬时孔洞进入细胞。
为了验证上述实施例制备的嵌段共聚物自组装体的入胞机制，对实施例9制备的嵌段共聚物自组装体进行性能测试，结果如图7所示，图7为实施例9制备的嵌段共聚物自组装体的入胞机制的激光共聚焦照片；其中，a为实施例9所得嵌段共聚物的结果图；b、c分别为对比例1和2的结果图。
本申请实施例中，选择实施例9所得嵌段共聚物自组装体，通过标记细胞内的溶酶体并评估其与嵌段共聚物的荧光共定位的情况，来监测嵌段共聚物被溶酶体捕获的程度。
从图7中可知，实施例9所得的嵌段共聚物自组装体在与细胞培养2 h后，只有极少数被溶酶体捕获，显示出少量的荧光共定位。然而，只具有阳离子嵌段的PEG-PLA-R15（对比例1）和只具有螺旋结构的PEG-PBLG-DFO（对比例2），其二者的荧光却与溶酶体荧光大量重叠，这说明对比例1制备的阳离子聚合物和对比例2制备的螺旋聚合物均被困在溶酶体中无法进入胞质。不仅如此，对比例1、2的荧光强度也很大程度上弱于实施例9所制备的嵌段共聚物。以上结果说明，实施例9所制备的嵌段共聚物具有优异的入胞性能，并通过细胞膜成孔的方式进入细胞，不会被溶酶体捕获降解，大大提高了递送效率。
为了验证上述实施例12制备的嵌段共聚物自组装体的生物相容性，利用CCK-8细胞毒性检测试剂盒来评估细胞的存活率，结果如图8所示，图8为实施例12制备的嵌段共聚物自组装体的生物相容性的定量图；其中，a表示实施例12所得嵌段共聚物自组装体的结果图，b表示阳离子螺旋多肽ACPP（对比例3）的结果图。从左到右聚合物的浓度依次为10、50、100、200、300 µg/mL。
本申请实施例中，选择实施例12所得嵌段共聚物自组装体与3T3细胞共培养24 h，利用CCK-8细胞毒性检测试剂盒来评估细胞的存活率，绘制出3T3细胞随嵌段共聚物组装体浓度变化的存活率定量图。
从图8中可知，实施例12所制备的嵌段共聚物对细胞存活率影响较小，不同浓度的嵌段共聚物处理后细胞的存活率均在85%以上。但是，对比例3制备的阳离子螺旋的多肽ACPP却显示出浓度依赖的高细胞毒性，其在300 µg/mL浓度下的细胞存活率低于50%。这说明实施例12所制备的嵌段共聚物相比于阳离子螺旋多肽具有更好的生物安全性。
为了验证上述实施例7制备的嵌段共聚物自组装体在的体内药物递送和抗肿瘤性能，对实施例7制备的嵌段共聚物自组装体进行性能测试，结果如图9所示，图9为实施例7制备的嵌段共聚物自组装体的体内抗肿瘤结果图；其中，a为生理盐水组的结果图，b为自由RNase A组的结果图；c为实施例7所得自组装体的结果图。
本申请实施例中，选择核糖核酸酶A（RNase A）作为递送的治疗药物模型来评估体内抗肿瘤效果。将实施例7所制备的嵌段共聚物+RNase A、自由RNase A、生理盐（Saline）注射到接种了4T1细胞的荷瘤小鼠体内，对不同时间的肿瘤体积进行测量。在开始给药后的第15天，将小鼠人道处死，并将肿瘤剥离，称重。如图9所示，自由RNaseA由于很难进入肿瘤细胞，因此肿瘤抑制效果非常差。实施例7所制备的嵌段共聚物可以通过细胞膜成孔的方式介导RNase A进入肿瘤细胞，在体内具有显著的肿瘤抑制效果。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物，其特征在于，所述嵌段共聚物由阳离子亲水段和螺旋疏水段构成；
其中，所述阳离子亲水段是具有无规卷曲结构的阳离子聚合物；
所述螺旋疏水段为能形成稳定α-螺旋结构的聚氨基酸及其衍生物；
所述聚氨基酸及其衍生物的聚合度为15~100；
所述嵌段共聚物为线形嵌段共聚物、环形嵌段共聚物、梳形嵌段共聚物、支化嵌段共聚物中的一种，所述阳离子亲水段的嵌段数m1≥1；和/或，所述螺旋疏水段的嵌段数m2≥1；
所述嵌段共聚物为线形嵌段共聚物，所述嵌段数m1≤2、和/或m2≤2时，所述阳离子亲水段为含有仲胺、叔胺、季胺、胍盐的聚合物中的至少一种；
所述嵌段共聚物为线形嵌段共聚物，所述嵌段数m1＞2、且m2＞2时，所述阳离子亲水段为含有伯胺、仲胺、叔胺、季胺、胍盐的聚合物中的至少一种；
所述嵌段共聚物为环形嵌段共聚物、梳形嵌段共聚物、支化嵌段共聚物时，所述阳离子亲水段为含有伯胺、仲胺、叔胺、季胺、胍盐的聚合物中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的嵌段共聚物，其特征在于，所述嵌段共聚物为线形嵌段共聚物，所述嵌段数m1≤2、和/或m2≤2，且m1与m2之和为2~3时，所述螺旋疏水段为聚苯丙氨酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的嵌段共聚物，其特征在于，所述嵌段共聚物为线形嵌段共聚物，所述嵌段数m1≥2、且m2≥2时，所述螺旋疏水段为聚丙氨酸、聚亮氨酸、聚苯丙氨酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的嵌段共聚物，其特征在于，所述嵌段共聚物为环形嵌段共聚物、梳形嵌段共聚物、支化嵌段共聚物时，所述螺旋疏水段为聚丙氨酸、聚亮氨酸、聚苯丙氨酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的嵌段共聚物，其特征在于，所述阳离子亲水段为含有仲胺、叔胺、季胺的聚合物中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的嵌段共聚物，其特征在于，所述螺旋疏水段为聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的至少一种。
7.根据权利要求3-4任一所述的嵌段共聚物，其特征在于，所述阳离子亲水段为含有仲胺、叔胺、季胺、胍盐的聚合物中的至少一种，所述螺旋疏水段为聚丙氨酸、聚亮氨酸、聚苯丙氨酸、聚赖氨酸衍生物、聚天冬氨酸衍生物、聚谷氨酸衍生物、聚半胱氨酸衍生物中的至少一种。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括：
以阳离子化合物单体为原料，通过聚合反应制备得到阳离子聚合物；其中，阳离子聚合物的分子量Mn为1000~25000；
以阳离子聚合物为原料，通过引发氨基酸及其衍生物的小分子开环聚合制备得到嵌段共聚物；
和/或，与螺旋疏水段偶联、接枝反应，制备得到嵌段共聚物；其中，聚氨基酸及其衍生物的聚合度n为15~100。
9.一种权利要求8所述的具有细胞膜成孔性能的嵌段共聚物用于自组装体、生物传感和药物载体中的应用。
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