CN117986312A

CN117986312A - 新的环氧多烯两性大环内酯及用于纯化纳他霉素的方法

Info

Publication number: CN117986312A
Application number: CN202410106437.7A
Authority: CN
Inventors: 亚历山大·露西雅·莱昂纳德斯·迪沙托; 彼得·菲利普·兰克豪斯特; 维勒布鲁尔德斯·伯纳德斯·范谢平根
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2024-05-07
Also published as: PL3837269T3; ES2940488T3; WO2020035553A1; EP3837269A1; EP3837269B1; CN112585150A; US11591360B2; US20210188892A1; US12202853B2; EP4163286A1; CN112585150B; US20230151045A1

Abstract

本发明涉及新的环氧多烯两性大环内酯及用于纯化纳他霉素的方法。本发明涉及用于纯化纳他霉素的方法、环氧多烯两性大环内酯、包含所述多烯两性大环内酯的组合物以及用于制备所述多烯两性大环内酯的方法。

Description

新的环氧多烯两性大环内酯及用于纯化纳他霉素的方法

本申请是申请人帝斯曼知识产权资产管理有限公司于2019年8月15日提交的申请号为201980053718.8(PCT/EP2019/071900)、题为“新的环氧多烯两性大环内酯及用于纯化纳他霉素的方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于纯化纳他霉素的方法、环氧多烯两性大环内酯、包含所述多烯两性大环内酯的组合物以及制备所述多烯两性大环内酯的方法。

背景技术

纳他霉素(结构式(I)，游霉素，C₃₃H₄₇NO₁₃，CAS号7681-93-8，(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14E,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-氨基-3,6-二脱氧-β-D-吡喃甘露糖基)氧基]-1,3,26-三羟基-12-甲基-10-氧代-6,11,28-三氧杂三环[22.3.1.0^5,7]二十八碳-8,14,16,18,20-五烯-25-羧酸(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14E,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-amino-3,6-dideoxy-β-D-mannopyranosyl)oxy]-1,3,26-trihydroxy-12-methyl-10-oxo-6,11,28-trioxatricyclo[22.3.1.0^5,7]octacosa-8,14,16,18,20-pentaene-25-carboxylicacid))是一种全反式环氧多烯两性大环内酯类抗真菌药，用于治疗眼睛周围的真菌感染。这包括眼睑、结膜和角膜的感染。纳他霉素还在食品工业中用作奶酪等乳制品的防腐剂，还用作香肠等肉制品和水果的防腐剂。

由于多种原因，例如原子效率的优化、废物的最小化以及避免污染物的有害副作用，获得高纯度天然产生的分子至关重要。特别是对于制药应用，纯度要求很高，纳他霉素也不例外。

纳他霉素是通过细菌纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)发酵产生的，在发酵之后通常以板状晶体的形式获得产物。与纳他霉素相关的问题之一涉及其在水性环境中的低溶解度以及由此产生的事实，即水性制剂为悬浮液形式。纳他霉素晶体以其原始形式迅速沉淀，这使纳他霉素悬浮液不易使用，并且难以均匀分配。WO 2006/045831描述了通过在低pH或高pH下溶解，然后将pH重新设定为中性以产生小的针状晶体，来在水性环境中重结晶。后面的重结晶过程非常适合于工业规模的应用，并通过晶体形态解决了不希望的纳他霉素悬浮液快速沉降的问题。

进一步地或替代地，关于纯度的改进在理论上可以通过色谱技术来实现。不幸的是，如上所述，(制备)色谱纯化中的主要问题是纳他霉素在水性环境中的低溶解度。因此，不能达到足够高的浓度，结果是不可能设计出得到进一步纯化的纳他霉素的有效方法。尽管在科学文献中已报道了色谱方法，但所有方法均旨在检测和定量各种样品中的纳他霉素，并且这些方法都不具有制备属性。因此，这些方法从未公开过将较大浓度的纳他霉素应用于色谱材料，也没有任何暗示表明如何才能实现将较大浓度的纳他霉素应用于色谱材料。实际上，以上文献公开了纳他霉素的浓度范围为0.02至1mg/L，这甚至远低于那他霉素在中性pH值下在水中的溶解度(约40mg/L)。有可能获得更高浓度溶解的纳他霉素，但是这需要添加大量的有机溶剂，例如在WO 2004/105491、WO 95/07998中以及在H.Brik的‘Analytical Profiles of Drug Substances’(1981)10,513-561中所述。

同样的问题也阻止了存在于纳他霉素样品中的化合物的分离、制备、鉴定和分析，这些化合物的含量极低，但迄今仍未检测到，或者根据纳他霉素的来源或生产过程，甚至可能不存在。获得此类化合物将是进行进一步分析的理想工具，不仅有助于了解和优化纳他霉素产品，而且在适用时还有助于其生产工艺。

发明内容

本发明通过提供与羧酸的金属盐结合的纳他霉素的液体溶液用于色谱纯化工艺中，来寻求克服上述问题。此外，本发明涉及分离和鉴定纳他霉素中可能存在的迄今未知的痕量化合物。

在第一方面，本发明提供了一种用于纯化纳他霉素的方法，包括将包含粗制纳他霉素、羧酸的金属盐和水的组合物混合，并将所得混合物进行色谱法，由此收集级分并将包含纳他霉素的所选级分合并，其中所述粗制纳他霉素的量为所述组合物的总重量的1g/kg至100g/kg，并且其中所述羧酸的金属盐的浓度为0.1mol/L至5mol/L。

在一些实施方式中，所述混合在30℃至130℃的温度下进行，其中所述温度保持10至200分钟。

在一些实施方式中，所述金属是碱金属或碱土金属。

在一些实施方式中，所述羧酸是乙酸、苯甲酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、丙酸、山梨酸或其混合物。

在一些实施方式中，所述羧酸是山梨酸。

在第二方面，本发明提供了式(II)的(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14Z,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-氨基-3,6-双脱氧-β-D-吡喃甘露糖基)氧基]-1,3,26-三羟基-12-甲基-10-氧代-6,11,28-三氧三环-[22.3.1.0^5,7]二十八碳-8,14,16,18,20-五烯-25-羧酸或其盐。

本发明还提供了一种包含纳他霉素、水和第二方面的化合物的组合物，其中，相对于纳他霉素的量，水的量为0.001-10％(w/w)，并且其中第二方面的所述化合物的量为0.001-0.1％(w/w)。

在一些实施方式中，所述组合物进一步包含式(III)的(1R,3S,5E,7R,11R,13E,15E,17E,19E,21R,23S,24R,25S)-21-[(3-氨基-3,6-二脱氧)-β-D-吡喃甘露糖基]氧基]-1,3,7,25-四羟基-11-甲基-9-氧代-10,27-二氧杂二环-[21.3.1]二十七碳-5,13,15,17,19-五烯-24-羧酸或其盐，其中，相对于纳他霉素的量，所述式(III)的化合物的量为0.001-0.1％(w/w)。

在第三方面，本发明提供了用于制备第二方面的化合物的方法，该方法包括使重结晶的纳他霉素的母液或纳他霉素进行色谱法，由此收集级分并将包含所述化合物的所选级分合并。或者，在第三方面，本发明提供了用于制备第二方面的化合物的方法，其包括使纳他霉素或重结晶的纳他霉素的母液经历根据第一方面中所记载的色谱法，由此收集级分，并将包含第二方面的所述化合物的所选级分合并。

在一些实施方式中，所述合并的所选级分被浓缩。

在一些实施方式中，所述浓缩是冻干。

在一些实施方式中，所述色谱法以每批1g-10kg的纳他霉素进行。

在第四方面，本发明提供第二方面的化合物或组合物在分析含有纳他霉素的样品中的用途。

具体实施方式

在本说明书和所附权利要求书中，词语“包含(comprise)”、“包括(include)”和“具有(having)”以及诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的变体应进行包括性的解释。在上下文允许的情况下，这些词意在传达这样的含义：可能包含其他未明确叙述的要素或整数。

在本文中使用时，“一”、“一种”和不使用数量词的情形表示“一个或多于一个”或“一种或多于一种”(即一个/种或至少一个/种)的所述语法对象。

在本发明的上下文中，术语“溶液”是指其中一种组分(或组分的混合物)溶解在另一种组分(或组分的混合物)中的组合物。当一种组分(或组分的混合物)没有(完全)溶解，即部分溶解在另一种组分(或组分的混合物)中时，该组合物称为“悬浮液”。例如，将其中那他霉素完全溶解的包含999.98g水和0.02g那他霉素(即20ppm)的组合物称为那他霉素在水中的(20ppm)溶液，而将其中那他霉素部分溶解的包含999.8g水和0.2g那他霉素(即200ppm)的组合物称为那他霉素在水中的(200ppm)悬浮液。在本发明的上下文中，溶液被定义为液体混合物，其在3000rpm下离心至少10分钟后产生团粒和上清液，除去上清液并干燥后的团粒物不超过离心前起始溶液重量的0.001％。

在第一方面，本发明提供了一种用于纯化纳他霉素的方法，该方法包括将包含粗制纳他霉素、羧酸的金属盐和水的组合物混合，并将所得混合物进行色谱法，由此收集级分并将包含纳他霉素的所选级分合并，其中所述粗制纳他霉素的量为所述组合物的总重量的1g/kg至100g/kg，并且其中所述羧酸的金属盐的浓度为0.1mol/L至5mol/L。

在本发明的上下文中，通过色谱法纯化纳他霉素不是简单的。尽管可以设想或已知各种色谱方法，但是这些方法是为分析目的而开发的，并且涉及以非常低的浓度应用样品。后者对于纳他霉素在中性pH下在水性体系中的低溶解度来说非常重要。对于纳他霉素的制备级色谱纯化来说，这些方法不适合，因为那他霉素的最大量太低而无法分离出定量的量。没有已知的方法可以在水性体系中(即在不包含会对色谱分离或甚至色谱材料本身产生不利影响的组分(例如有机溶剂、强酸或强碱)的体系中)在合适的pH值下以高浓度溶解纳他霉素。尽管纳他霉素与高浓度的羧酸的金属盐的结合是已知的，但均是出于不同的目的和/或不是以水溶液的形式。例如，CN 105342987公开了一种用于治疗口腔溃疡的包含各种组分(包括纳他霉素和山梨酸钾)的凝胶。在EP 2749166、US 5,738,888、WO 2009/010547和P.Onsberg等人的(Sabouradia(1978)16，39-46)中也描述了使用相同的组合或羧酸的其他金属盐控制真菌的生长，后者与多达60％的二甲基亚砜组合。

通过施加相对较高浓度的羧酸的金属盐，例如0.1mol/L至10mol/L或0.5mol/L至5mol/L或1mol/L至2.5mol/L，纳他霉素以高浓度溶解，例如1g/L至100g/L，或2g/L至75g/L或5g/L至60g/L。在20±2℃下测得的本发明溶液的pH值为6.0至11，通常为6.5至10，或为7.0至9.5。在这样的pH值下，纳他霉素在水中的溶解度通常低得多，例如，在中性pH值下，其约为0.04g/L(40ppm)。

在一个实施方式中，作为羧酸的金属盐的一部分的金属是碱金属或碱土金属，其实例为钙、锂、镁、钾或钠。实际上，当金属是钾或钠时，可获得良好的结果。

在另一个实施方式中，羧酸包含1至7个碳原子。实例是乙酸、苯甲酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、丙酸、山梨酸以及它们的混合物。良好的实例是具有3个碳原子的羧酸，例如乳酸和丙酸，以及具有6个碳原子的羧酸，例如柠檬酸和山梨酸。羧酸可以是具有一个或多个双键的不饱和的羧酸。所述双键可以是顺式或反式取向的。一个很好的例子是具有两个反式取向双键的羧酸，例如山梨酸。羧酸可包含羟基，例如柠檬酸和乳酸。羧酸可以具有单个羧基官能团，但是也可以具有两个、三个或更多个羧基官能团。

在一个实施方式中，上述混合在一定时间的升高温度下进行。已经发现，不仅纳他霉素的溶解发生得更快，而且纳他霉素的最终浓度也很高，并且通常所得溶液显示出改善的稳定性。因此，可以将温度暂时升高到30℃至130℃，或60℃至120℃，或70℃至110℃，持续2至200分钟，或3至100分钟，或4至60分钟。

显著地，纳他霉素在上文获得的溶液中的稳定性高，并且即使在长时间之后，纳他霉素的浓度也保持在高值。当羧酸是山梨酸时，这种效果最为明显。同样，当金属为诸如钾的碱金属时，这种效果最为明显。因此，本发明的解决方案出乎意料地不需要现有技术中描述的保证化学稳定性的其他辅助材料，例如像EDTA这样的螯合剂或抗氧化剂。

因此，将纳他霉素与羧酸的金属盐混合产生高浓度的溶液，其可有利地应用于制备色谱中，该方法在本领域中尚未得到证实或教导。

在另一个实施方式中，可以将二醇加入包含纳他霉素、羧酸的金属盐和水的组合物中。可以在其他组分混合之前、期间或之后加入二醇。二醇的沸点优选在125℃至300℃之间或在150℃至250℃之间，并且二醇的量为组合物总重量的50g/kg至950g/kg。观察到，向本发明的溶液中添加二醇导致纳他霉素的稳定性进一步提高和/或溶解度进一步提高。合适的二醇是二丙二醇、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇或它们的混合物。

羧酸的金属盐与纳他霉素的比例为0.1(w/w)至50(w/w)，或0.2(w/w)至45(w/w)，或0.5(w/w)至25(w/w)，或1(w/w)至10(w/w)。或者，以摩尔计，羧酸的金属盐与纳他霉素的比例为0.5(摩尔/摩尔)至250(摩尔/摩尔)，或1(摩尔/摩尔)至100(摩尔/摩尔)，或2.5(摩尔/摩尔)至50(摩尔/摩尔)，或5(摩尔/摩尔)至45(摩尔/摩尔)。

本发明的一个实施方式是使用经过色谱法的高度浓缩的纳他霉素溶液的用途。因此，本发明的色谱方法有利地以前所未有的大规模来进行。例如，当分批进行本发明的色谱方法时，施加到色谱材料上的纳他霉素的量可以是每批1g至10kg，或每批5g至5kg，或每批25g至1kg。在一个实例中，发现可以通过将纳他霉素物料溶解在高摩尔的山梨酸钾中来实现高输入浓度。

术语“制备色谱”涉及分离溶解在流动相中的化合物的混合物的方法，其具有足够的规模以分离所需量的所需化合物。这样的方法是本领域已知的。制备色谱的合适方法是例如吸附色谱法，如柱色谱。特别优选的分离方法是已知为HPLC(高效液相色谱)、SFC(超临界流体色谱)的那些，二者以间歇模式和连续模式，例如SMB(模拟移动床色谱)。

如本领域技术人员所公知的，术语“固定相”涉及其上固定有相互作用剂的合适的惰性载体材料。术语“反相”涉及其中烷基链键合到惰性载体材料上的固定相。合适的惰性载体材料优选是大孔的，例如硅胶、交联的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺或氧化锆。硅胶是特别优选的。“反相”固定相的示例是Symmetry C18和Atlantis C18。

术语“流动相”涉及要分离的化合物的混合物溶解于其中的溶剂或溶剂混合物。在根据本发明的制备色谱方法中使用的合适的溶剂是已知在分析色谱中使用的溶剂。通常在“反相”液相色谱中，使用极性、极性质子或非质子溶剂、或其混合物。合适的极性溶剂是例如水与甲醇或乙腈的组合。在超临界色谱中，二氧化碳和极性质子溶剂(例如甲醇)的混合物是优选的。

在一个实施方式中，在制备色谱中使用的柱是装有用于结合目标分子的色谱介质的垂直圆柱形管，然后用缓冲液缓慢洗脱它们并收集洗脱液的各个级分。然后将含有最纯形式的目标分子的级分合并以获得所需的纯化度。然而，技术人员知道可用的替代性配置。

在第二方面，本发明提供了式(II)的(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14Z,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-氨基-3,6-双脱氧-β-D-吡喃甘露糖基)氧基]-1,3,26-三羟基-12-甲基-10-氧代-6,11,28-三氧三环-[22.3.1.0^5,7]二十八碳-8,14,16,18,20-五烯-25-羧酸((1R,3S,5R,7R,8E,12R,14Z,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-amino-3,6-dideoxy-β-d-mannopyranosyl)oxy]-1,3,26-trihydroxy-12-methyl-10-oxo-6,11,28-trioxatricyclo[22.3.1.0^5,7]octacosa-8,14,16,18,20-pentaene-25-carboxylic acid)或其盐。

已经发现，通过进行本发明的第一方面的方法，可以分离出迄今未知的式(II)的化合物，随后进行分析和鉴定。

在一个实施方式中，本发明提供了包含纳他霉素和式(II)的化合物的组合物，其中相对于纳他霉素的量，所述式(II)的化合物的量为0.001-0.1％(w/w)。优选地，在本发明的第一方面的用于纯化纳他霉素的方法之后分离组合物，例如通过冻干、喷雾干燥或去除大量水团(water masses)的其他手段来分离组合物。因此，第二方面的组合物包含0.001-10％(w/w)的水，或0.002-5％(w/w)的水，或0.005-3％(w/w)的水。换句话说，第二方面的组合物是通过用于纯化纳他霉素的方法能够获得的组合物，该方法包括将包含粗制纳他霉素、羧酸的金属盐和水的组合物混合，并将所得混合物进行色谱法，由此收集级分并将包含纳他霉素的所选级分合并，其中所述粗制纳他霉素的量为所述组合物的总重量的1g/kg至100g/kg，并且其中所述羧酸的金属盐的浓度为0.1mol/L至5mol/L。该组合物可以进一步提供另一种新颖的组分，即式(III)的(1R,3S,5E,7R,11R,13E,15E,17E,19E,21R,23S,24R,25S)-21-[(3-氨基-3,6-二脱氧)-β-D-吡喃甘露糖基]氧基]-1,3,7,25-四羟基-11-甲基-9-氧代-10,27-二氧杂二环-[21.3.1]二十七碳-5,13,15,17,19-五烯-24-羧酸((1R,3S,5E,7R,11R,13E,15E,17E,19E,21R,23S,24R,25S)-21-[(3-amino-3,6-dideoxy-β-d-mannopyranosyl)oxy]-1,3,7,25-tetrahydroxy-11-methyl-9-oxo-10,27-dioxabicyclo[21.3.1]heptacosa-5,13,15,17,19-pentaene-24-carboxylic acid)，C₃₃H₄₉NO₁₃，或其盐。相对于纳他霉素的量，式(III)的化合物的量为0.001-0.1％(w/w)。

在第三方面，本发明提供了用于制备第二方面的化合物的方法，该方法包括使重结晶的纳他霉素的母液或纳他霉素进行色谱法，由此收集级分并将包含所述化合物的所选级分合并。合并的级分可以被浓缩以分离相应的化合物。可以使用对技术人员来说可用的工具来实现浓缩，例如蒸发、冻干，也可以结晶或沉淀然后过滤。

本发明的一个实施方式是经过色谱法的高度浓缩的纳他霉素溶液的用途。因此，本发明的色谱方法有利地以前所未有的大规模来进行。例如，当分批进行本发明的色谱方法时，施加到色谱材料上的纳他霉素的量可以是每批1g至10kg，或每批5g至5kg，或每批25g至1kg。

本发明的一个实施方式是使重结晶的纳他霉素的母液进行制备色谱法。这样的母液可以例如在纳他霉素重新结晶后获得，如WO 2006/045831中所述。这可以是纳他霉素在高pH下溶解，然后在中性pH下结晶，或者纳他霉素在低pH下溶解，然后在中性pH下结晶。在制备色谱中使用重结晶的纳他霉素的母液的优点在于，与纳他霉素相比，母液中的杂质通常比原始晶体的杂质相对较高，并且肯定比所得晶体的杂质高。因此，使用重结晶的纳他霉素的母液将导致色谱法后产率更高的所需化合物和/或纯度更高和/或步骤更少。

在第四方面，本发明提供第二方面的化合物或组合物在分析含有纳他霉素的样品中的用途。当已知尽可能多的或可能的副产物或污染物等时，可以最佳地设计和优化纳他霉素的生产工艺。但重要的是，对技术人员来说不仅已知而且可用，这使他能够始终如一地重复分析程序并获得可靠的结果。本发明的化合物和组合物是对技术人员的工具箱的补充，使他能够进一步改进和优化分析程序，因此不仅将工艺理解提高到更高水平，而且将产品质量提高到更高水平。这些是现代产品开发中不变的需求。

在一个实施方式中，第二方面的化合物或组合物可以在分析方法(诸如高效液相色谱、质谱分析、薄层色谱或NMR)中用作标准品和/或参考物。可以使用更大数量的产品，以确保参考物和标准品的恒定的可用性和质量。因此，式(II)的化合物，还有式(III)的化合物，在工业上可用于各种目的，目的有范围从进一步优化纳他霉素的生产到其本身潜在的抗真菌活性。该抗真菌活性可以用于各种食品应用中。

参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

通用信息

HPLC结合高分辨率质谱仪(LC-MS)

液相色谱柱：Waters,Symmetry C18

流动相：溶剂A：50mM醋酸铵缓冲液pH 5.8

溶剂B：乙腈

进样体积：10μL

柱温： 25℃

流速： 1mL/min

MS仪器： LTQ Orbitrap

LC/MS：全扫描ESI正(possitive)模式

用于分级的HPLC-UV条件

色谱柱：Dr.Maische,NovoGROM Spherical C18,250x 4.6mm,15μm

流动相：溶剂A：50mM醋酸铵缓冲液pH 5.8

溶剂B：乙腈

注射体积: 100μL

柱温: 25℃

流速: 1.0mL/min.

样品温度: 15℃

运行时间(min.):30分钟

Dionex Ultimate DAD-3000(UV单波长)

波长 305nm

带宽 1nm

数据收集速率5Hz

Dionex Ultimate DAD-3000(UV 3D)

使用上述条件，通过高分辨率质谱法验证了化合物(I)、(II)和(III)的分离。开始收集20级份的化合物(II)、(III)和纳他霉素(I)。将收集的级分冻干以分离各个化合物，并进一步分析来结构解析。

为了参考，在Bruker Ascend 600谱仪上记录了纳他霉素(I)的NMR谱。甲醇用作化学位移参考(δ＝3.31ppm，49.2ppm)。从¹H-¹³C相关(HSQC)谱中提取了¹H和¹³C化学位移。

实施例1

(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14Z,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-氨基-3,6-双脱氧-β-D-吡喃甘露糖基)氧基]-1,3,26-三羟基-12-甲基-10-氧代-6,11,28-三氧三环-[22.3.1.0^5,7]二十八碳-8,14,16,18,20-五烯-25-羧酸(II)的制备

纳他霉素是通过按照受控的发酵过程进行纳塔尔链霉菌细菌的培养而产生的，例如在WO 97/29207中或其中的参考文献中所述。将得到的肉汤样品与山梨酸钾水溶液(3M)混合，搅拌混合物直至所有纳他霉素都溶解。山梨酸钾水溶液的量使得纳他霉素的最终浓度为10g/L(w/w，1％)。或者，采用类似的其他方法，通过将温度升高至40±10℃持续30±20分钟，然后冷却至20±2℃，来促进纳他霉素的实验溶解。将所得溶液进行在上文的“通用信息”(用于分馏的HPLC-UV条件)下所描述的半制备性高效液相色谱(用于分馏的HPLC-UV条件)，以分离出大量化合物(II)。另外，分离出包含式(III)的第二化合物的级分。获得的样品如下表所示。样品的含量用LC-UV测定。

通过质谱(MS)和核磁共振(NMR)解析化学结构。

实施例2

(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14Z,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-氨基-3,6-双脱氧-β-D-吡喃甘露糖基)氧基]-1,3,26-三羟基-12-甲基-10-氧代-6,11,28-三氧三环-[22.3.1.0^5,7]二十八碳-8,14,16,18,20-五烯-25-羧酸(II)的结构解析

将来自实施例1中获得的包含化合物(II)的级分的所有材料吸附在Sep-Pak柱上。该柱用D₂O(1mL)冲洗。接下来，用氮气吹扫该柱。用CD₃CN(1mL)反向洗脱该柱。化合物(II)未从柱上洗脱，随后用CDCl₃/CD₃OD 1/1洗脱。将溶液转移到NMR管中，并通过氮气流的方式进一步浓缩，直到获得0.65mL的体积。加入一滴D₂O以改善NMR谱中的线宽。

NMR谱记录在Bruker DRX 600谱仪上，其在600MHz的¹H频率下运行。使用配有梯度线圈的反向探头。除¹H NMR谱外，还记录了COSY、TOCSY和HSQC谱。对于化学位移预测，使用ACD软件版本4.04。

表：与ACD软件版本4.04预测的位移相比，(II)和纳他霉素(I)中特征碳和质子的化学位移。

2D NMR谱与纳他霉素(I)的比较表明，化合物(II)与纳他霉素(I)的区别仅在于双键C14-C15的构型，在化合物(II)中为顺式，在纳他霉素(I)中为反式。H14的耦合常数的模式与C14-C15上的顺式-双键一致。当比较纳他霉素(I)和化合物(II)的谱时，看上去大多数信号具有几乎相同的化学位移，除了C/H 12、13和14的那些之外。此外，H14的耦合模式与纳他霉素(I)中观察到的模式非常不同。H14轻微失真的四重峰是由±9Hz(顺式耦合的典型值)的三个耦合常数引起的，而反式耦合的幅度通常为12-18Hz。此外，与反式双键相比，C13的¹³C化学位移向高场位移了6ppm，这是与顺式双键相邻的CH₂典型的预期高场位移(ACD预测)。上表列出了相关质子和碳的化学位移。从结果得出这样的结论，化合物(II)是纳他霉素(I)的异构体，其在C14和C15之间具有顺式双键。

实施例3

(1R,3S,5E,7R,11R,13E,15E,17E,19E,21R,23S,24R,25S)-21-[(3-氨基-3,6-二脱氧)-β-D-吡喃甘露糖基]氧基]-1,3,7,25-四羟基-11-甲基-9-氧代-10,27-二氧杂二环-[21.3.1]二十七碳-5,13,15,17,19-五烯-24-羧酸(III)的结构解析

将来自实施例1中获得的包含化合物(III)的级分的所有材料溶解在CD₃OD(0.6mL)中。样品中可能含有大量甘油，甘油是在冷冻干燥过程中作为污染物引入的。游离脂肪酸的信号也是主要的。NMR谱记录在配备有TCI低温探头的质子频率为700MHz并在抑制水信号的情况下用300K的探头温度进行测量的Bruker Ascend 700谱仪上。在30分钟内通过256次扫描获得1D(一维)¹H谱，在3小时内F1中记录8次扫描并以800增量的COSY谱，每次3小时通过8次扫描、40和100毫秒的混合时间在F1维度上的800增量，来记录TOCSY谱。在55小时内通过288次扫描和F1维度的512增量记录¹H–¹³C相关(HSQC)谱。

从¹H NMR谱可以清楚地看出纳他霉素的H9信号缺失。通过将质子碳相关谱(HSQC)和质子-质子相关谱(COSY)与纳他霉素的那些谱进行比较，可以鉴定该级分中的化合物。重叠纳他霉素的HSQC谱图和该级分的HSQC谱图表明，除式(II)化合物的5、6、7、8和11号原子处的信号外，大多数信号具有(接近)相同的化学位移(请注意(III)中的原子5、6、7、8和11分别是(I)中的5、7、8、9和12)。借助于COSY谱和LC/MS给出的分子式(纳他霉素+2H)，对上述信号进行归属，并得出这样的结论，杂质具有如式(III)中给出的结构。

在6.06ppm处的H9的纳他霉素(I)特征性双峰消失了，取而代之的是在2.28和2.50ppm处以两个相互耦合的信号出现(III)中的H8。这些化学位移强烈表明是CH₂基团。此外，纳他霉素(I)中H8的特征性双峰消失了，并且在4.29ppm处认定为(III)中H7的质子信号，这强烈表明是CH(OH)基团。最后，与环氧化物片段一致，在3.14和2.82ppm处分别发现(I)中的H7和H5。在分析中，在5.48ppm处均发现标记的H6和H5的这些质子信号。下表给出了与纳他霉素的化学位移明显不同的质子和碳的化学位移。这些¹H和¹³C化学位移是从¹H-¹³C相关(HSQC)谱中提取的。没有给出¹H信号的多重性，因为所有质子信号都与其他信号部分地重叠。

表：与通过ACD软件版本4.04预测的位移相比，(III)中特征碳和质子的化学位移。

Claims

1.一种用于纯化纳他霉素的方法，包括将包含粗制纳他霉素、羧酸的金属盐和水的组合物混合，并将所得混合物进行色谱法，由此收集级分并将包含纳他霉素的所选级分合并，其中所述粗制纳他霉素的量为所述组合物的总重量的1g/kg至100g/kg，并且其中所述羧酸的金属盐的浓度为0.1mol/L至5mol/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合在30℃至130℃的温度下进行，其中所述温度保持10至200分钟。

3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述金属是碱金属或碱土金属。

4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述羧酸是乙酸、苯甲酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、丙酸、山梨酸或其混合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述羧酸是山梨酸。

6.式(II)的(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14Z,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-氨基-3,6-双脱氧-β-D-吡喃甘露糖基)氧基]-1,3,26-三羟基-12-甲基-10-氧代-6,11,28-三氧三环-[22.3.1.0^5,7]二十八碳-8,14,16,18,20-五烯-25-羧酸或其盐。

7.一种包含纳他霉素、水和根据权利要求6的化合物的组合物，其中，相对于纳他霉素的量，水的量为0.001-10％(w/w)，并且其中根据权利要求6的所述化合物的量为0.001-0.1％(w/w)。

8.根据权利要求7所述的组合物，进一步包含式(III)的(1R,3S,5E,7R,11R,13E,15E,17E,19E,21R,23S,24R,25S)-21-[(3-氨基-3,6-二脱氧)-β-D-吡喃甘露糖基]氧基]-1,3,7,25-四羟基-11-甲基-9-氧代-10,27-二氧杂二环-[21.3.1]二十七碳-5,13,15,17,19-五烯-24-羧酸或其盐，其中，相对于纳他霉素的量，所述式(III)的化合物的量为0.001-0.1％(w/w)。

9.一种制备根据权利要求6的化合物的方法，其包括使纳他霉素或重结晶的纳他霉素的母液经历根据权利要求1的色谱法，由此收集级分，并将包含根据权利要求6的所述化合物的所选级分合并。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述合并的所选级分被浓缩。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述浓缩是冻干。

12.根据权利要求9-11中任一项的方法，其中所述色谱法以每批1g-10kg的纳他霉素进行。

13.根据权利要求6的化合物在分析含有纳他霉素的样品中的用途。