CN117965407B

CN117965407B - 一株屎肠球菌及其应用

Info

Publication number: CN117965407B
Application number: CN202410393979.7A
Authority: CN
Inventors: 韩冰; 梁书坤; 王金全; 孙晋涛; 顾鑫淑; 赵亚; 王秀敏; 王振龙; 陶慧; 刘杰
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2024-04-02
Filing date: 2024-04-02
Publication date: 2024-07-02
Anticipated expiration: 2044-04-02
Also published as: CN117965407A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株屎肠球菌及其应用。本发明提供屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27675。屎肠球菌F203具有较好的耐酸和耐胆盐特性，能够适应动物胃肠道环境，对常用抗生素敏感，具有较高的安全性；该菌株具有较强的胆固醇降解作用，同时能够有效缓解高脂饮食引起的血脂升高、肠道菌群失衡以及体重增长，具有降胆固醇、降脂、缓解脂肪积累和脂肪组织病变的功效，对常见致病菌具有较强的杀菌作用，可制备为益生菌制剂，具有广阔的应用前景。

Description

一株屎肠球菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株屎肠球菌及其应用。

背景技术

近年来，高脂日粮导致的宠物高胆固醇血症逐年增加，胆固醇水平升高已经成为诱发冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的重要因素，对宠物健康构成威胁。此外，肥胖已经成为近年来较为常见的宠物代谢病之一，发病率明显升高，严重危害着宠物的健康。肥胖是宠物多种代谢疾病的潜在危险因素，会导致心血管疾病和癌症的发病率及死亡率大幅度增高，也是糖尿病及胰腺炎的高风险因素。因此，有必要采取有效的措施控制宠物胆固醇升高和肥胖及其导致的代谢综合症。然而，目前用于治疗宠物高胆固醇和肥胖的药物鲜有报道。

益生菌可以通过定植于胃肠道中，改变宿主肠道菌群组成，进而影响宿主代谢和消化吸收。目前能够有效缓解宠物肥胖、高脂血症和高胆固醇血症的益生菌仍少有报道。因此，开发能够有效缓解宠物肥胖、高脂血症和高胆固醇血症的益生菌对于宠物健康具有重要意义。

发明内容

本发明提供一株屎肠球菌及其应用。

本发明从健康猫粪便中分离得到一株屎肠球菌（Enterococcus faecium），命名为屎肠球菌F203，该菌株具有较好的耐酸、耐胆盐特性，能够适应动物胃肠道环境，对抗生素敏感，具有较高的安全性；该菌株具有较强的降解胆固醇的功能，同时能够有效缓解高脂饮食引起的血脂升高、肠道菌群失衡以及体重增长，具有降解胆固醇、降脂、缓解脂肪积累和脂肪组织病变、缓解肥胖以及调节肠道菌群的功效，还能够有效抑制大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌等动物致病菌，具备开发为益生菌制剂的潜力。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203，该菌株于2023年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为屎肠球菌Enterococcus faecium，保藏编号为CGMCC No.27675。

本发明提供一种微生物制剂，所述微生物制剂包含以上所述的屎肠球菌F203。

优选地，所述微生物制剂中，屎肠球菌F203以活菌形式存在。

所述微生物制剂可以为液体制剂或固体制剂。

所述微生物制剂的活性成分包含屎肠球菌F203，除屎肠球菌F203外，所述微生物制剂还可包含微生物制剂领域允许的辅料。

优选地，所述微生物制剂中，所述屎肠球菌F203的含量为1.0×10⁷CFU/g-1.0×10¹⁰CFU/g。

在本发明的一些实施方式中，所述微生物制剂为益生菌制剂。

在本发明的一些实施方式中提供一种冻干粉剂，其包含屎肠球菌F203，还包含冻干保护剂，所述冻干保护剂包含蔗糖0.5-2份，半乳糖0.5-2份，脱脂奶粉15-25份，水70-80份（优选地，按重量百分数计，所述冻干保护剂的组成为：1%蔗糖、1%半乳糖、20%脱脂奶粉和78% ddH₂O）。

在本发明的一些实施方式中，所述冻干粉剂的制备方法包括如下步骤：

将所述屎肠球菌F203使用MRS液体培养基、于35-37℃培养20-28h后，离心沉淀菌体，后使用ddH₂O重悬菌体，洗涤菌体，得到所述屎肠球菌F203的菌泥；将所述冻干保护剂进行均质、灭菌以及冷却处理；向冷却处理后的冻干保护剂中加入屎肠球菌F203的菌泥，混合、均质后，于-80℃预冻后放入冻干机进行冻干，即得。

本发明提供所述微生物制剂的制备方法，所述方法包括培养所述屎肠球菌F203的步骤。

优选地，所述培养使用的培养基为MRS培养基，所述培养为在35-37℃条件下进行。

基于屎肠球菌F203的功能，本发明提供该菌株的以下应用：

本发明提供所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂在制备饲料、饲料添加剂或药物中的应用。

屎肠球菌F203可作为益生菌添加于动物饲料、饲料添加剂中，也可作为药物的活性成分。

优选地，所述饲料、饲料添加剂或药物具有以下功能中的一种或多种：

（1）预防、缓解或治疗肥胖；

（2）降脂；

（3）降胆固醇；

（4）缓解肝脏脂肪积累；

（5）缓解脂肪组织病变；

（6）预防、缓解或治疗代谢综合征；

（7）改善肠道菌群；

（8）抑制病原菌。

本发明提供所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂在制备用于降低胆固醇的产品中的应用。

本发明提供所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂在制备用于预防、缓解或治疗肥胖的产品，或者在制备用于抑制体重增长的产品中的应用。

优选地，所述预防、缓解或治疗肥胖表现为减少脂肪积累、减轻体重和/或抑制体重增加等。

优选地，所述肥胖为高脂饮食诱导的肥胖。

优选地，所述抑制体重增长为抑制高脂饮食导致的体重增长。

本发明提供所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂在制备降脂产品中的应用。

本发明中，所述降脂为选自降低甘油三酯、降低低密度脂蛋白胆固醇、升高高密度脂蛋白胆固醇中的一种或多种。

本发明提供所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂在制备用于预防、缓解或治疗高脂血症的产品中的应用。

本发明提供所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂在制备用于改善肠道菌群的产品中的应用。

本发明提供所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂在制备用于缓解肝脏脂肪积累、缓解脂肪组织病变或用于预防、缓解或治疗代谢综合征的产品中的应用。

本发明提供所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂在制备抑菌产品中的应用。

所述抑菌产品包括但不限于杀菌剂、抗动物病原菌的饲料或药物等。

所述菌为动物病原菌，包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。

本发明中，以上所述的应用针对的对象优选为哺乳动物，更优选为猫。

现有的猫用益生菌多是从其他动物或植物源中分离得到的，但是在临床中并未表现出良好效果，这可能是由于种属特异性导致的益生菌无法较好地在猫肠道内定殖，且益生菌表现出的生理特性可能无法很好地满足猫肠道所需。本发明提供的屎肠球菌F203是从猫肠道中特异性分离的，是特定的针对于猫的肥胖症状、高胆固醇血症的乳酸菌，应用于猫引起的猫应激反应较小，更适于作为猫用益生菌。

上述应用中，所述产品为饲料、饲料添加剂或药物。

优选地，所述产品为猫用产品。

本发明提供一种产品，所述产品包含所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂，或者，所述产品由所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂制备得到。

优选地，所述产品具有以下功能中的一种或多种：

（1）预防、缓解或治疗肥胖；

（2）降脂；

（3）降胆固醇

（4）缓解肝脏脂肪积累；

（5）缓解脂肪组织病变；

（6）预防、缓解或治疗代谢综合征；

（7）改善肠道菌群；

（8）抑制病原菌。

优选地，所述产品的活性成分包含屎肠球菌F203。

优选地，所述产品的活性成分为屎肠球菌F203。

所述产品为饲料、饲料添加剂或药物。所述产品的剂型包括但不限于胶囊、片剂、冻干粉剂、溶液、混悬液等。

优选地，所述产品为猫用产品。

本发明提供一种用于缓解猫肥胖和/或降低猫胆固醇的药物，其包含所述屎肠球菌F203或所述微生物制剂。

本发明的有益效果至少包括：

本发明提供的屎肠球菌F203具有较好的耐酸和耐胆盐特性，能够适应动物胃肠道环境，对常用抗生素敏感，具有较高的安全性；该菌株具有较强的降解胆固醇的功能，同时能够有效缓解高脂饮食引起的血脂升高、肠道菌群失衡以及体重增长，减少胆固醇吸收，降低甘油三酯含量，具有降脂、降胆固醇、缓解脂肪积累和脂肪组织病变的功效，对大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌等常见致病菌具有较强的杀菌作用，具备开发为益生菌制剂的潜力。

本发明提供的屎肠球菌F203是从猫肠道中特异性分离的，是特定的针对于猫的肥胖症状和高胆固醇血症的乳酸菌，应用于猫引起的猫应激反应较小，可用于猫粮等动物饲料中益生菌的添加或猫等动物用饲料添加剂的制备，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的镜检图。

图2为本发明实施例4中屎肠球菌CGMCC No.27675菌株引发的小鼠肝脏甘油三酯含量变化图。

图3为本发明实施例4中屎肠球菌CGMCC No.27675菌株引发的小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量变化图。

图4为本发明实施例4中屎肠球菌CGMCC No.27675菌株引发的小鼠体重的变化图。

图5为本发明实施例4中屎肠球菌CGMCC No.27675菌株引发的小鼠肝脏指数的变化图。

图6为本发明实施例4中屎肠球菌CGMCC No.27675菌株引发的小鼠脂肪组织病变病理切片图，其中，切片为HE染色，放大100倍观察。

图7为本发明实施例4中小鼠粪便微生物PCoA图。

图2-图7中，F203代表F203组，CON代表空白对照组，M代表高脂饮食模型组。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

针对现有用于调节猫肥胖的乳酸菌及猫用益生菌产品存在的诸多问题，本发明提供能够有效缓解高脂饮食诱导肥胖、具有降脂、降胆固醇功效的猫源性屎肠球菌CGMCCNo.27675菌株，并将屎肠球菌CGMCC No.27675制备为冻干益生菌制剂，用于开发缓解猫肥胖、降低胆固醇的药物、饲料或饲料添加剂。该菌株冻干后仍具有高活力，且对猫临床常见致病菌具有较强的抑制效果，可耐受胃酸环境和高胆盐浓度，适应胃肠道环境，能够有效增加肥胖动物体内胆固醇代谢，降低甘油三酯含量，缓解脂肪积累和脂肪组织病变，可用于临床以减少猫肥胖、高胆固醇血症的发生。

本发明的技术方案具体如下：

本发明从健康猫粪便中分离获得一株新的益生菌菌株F203，通过微生物学性状分析以及16S rRNA基因序列（SEQ ID NO.1）对比分析，鉴定该菌株为屎肠球菌（Enterococcus faecium）。

通过胆固醇降解试验发现，屎肠球菌CGMCC No.27675的24h胆固醇降解率可达66.8%，表明屎肠球菌CGMCC No.27675具有明显的降解胆固醇的作用，能够用于降胆固醇类产品的开发。

通过耐酸实验发现，屎肠球菌CGMCC No.27675在pH为4的环境中生长良好（4h存活率为91.56%），在pH为3的酸性环境中4h后的活菌计数存活率为86.21%，在pH为2的酸性环境中4h后的活菌计数存活率为70.17%，表明屎肠球菌CGMCC No.27675可以很好地耐受胃内酸性环境，能到达肠道发挥生物学作用。

通过耐胆盐实验发现，屎肠球菌CGMCC No.27675在胆盐浓度为0.15%的环境中生长良好，存活率达到80.60%，在胆盐浓度为0.3%的环境中存活率为68.24%，在胆盐浓度为0.6%的环境中存活率为60.23%，表明该菌株可以很好地耐受胆盐，能够在肠道发挥生物学作用。

通过抑菌实验发现，屎肠球菌CGMCC No.27675对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

通过耐药性实验发现，临床常用的红霉素、米诺环素、头孢曲松、哌拉西林等9种抗生素均可对屎肠球菌CGMCC No.27675的生长产生有效抑制，表明屎肠球菌CGMCC No.27675无耐药性，可安全地应用于临床。

本发明的屎肠球菌CGMCC No.27675可以制备为益生菌制剂，该益生菌制剂含有屎肠球菌CGMCC No.27675的活菌形式。本发明的益生菌制剂可以为胶囊、溶液或袋装粉剂。益生菌制剂的单剂量可含有1.0×10⁷CFU/g-1.0×10¹⁰CFU/g的屎肠球菌CGMCC No.27675。

优选地，所述益生菌制剂为口服制剂。

本发明的屎肠球菌CGMCC No.27675还可以制备为饲料或饲料添加剂。

本发明提供了屎肠球菌CGMCC No.27675的冻干益生菌制剂，其包含屎肠球菌CGMCC No.2767和冻干保护剂，所述冻干保护剂按重量百分数计的组成如下：1%蔗糖、1%半乳糖、20%脱脂奶粉和78% ddH₂O。

具体地，所述冻干益生菌制剂由屎肠球菌CGMCC No.27675的菌泥与所述冻干保护剂按照1:8的重量比例混合制备得到。

具体地，所述冻干益生菌制剂中，屎肠球菌CGMCC No.27675的含量为1.0×10⁹CFU/g，基于冻干益生菌制剂的总重量，屎肠球菌CGMCC No.27675的总重量为11.11%。

本发明进一步通过小鼠高脂饮食模型验证屎肠球菌CGMCC No.27675的冻干益生菌制剂对于高脂饮食引发的肥胖、高胆固醇、高血脂具有良好的缓解作用。

具体地，在小鼠高脂饮食模型中，屎肠球菌CGMCC No.27675的冻干益生菌制剂可以缓解体重增长，降低肝脏脂肪病变，减少脂质积累；可降低小鼠高脂饮食模型中血清LDL-C的含量，与饲喂PBS的小鼠高脂饮食模型的LDL-C含量存在差异；可降低小鼠高脂饮食模型肝脏中甘油三酯含量，与饲喂PBS的小鼠高脂饮食模型的甘油三酯含量存在显著差异。

由本发明的屎肠球菌CGMCC No.27675制备的益生菌制剂、饲料、饲料添加剂、药物可用于防治高脂饮食导致的肥胖、高胆固醇、高血脂的发生，用于预防、缓解和治疗猫肥胖。

实施例1 屎肠球菌F203的筛选分离与鉴定

1、菌株F203的筛选与分离

收集85只健康猫粪便样本，接种至MRS液体培养基，37℃静置培养24h后，使用PBS稀释至10⁶分别涂布于MRS培养基上，将涂布后的平板37℃静置培养24h，挑选水解圈明显的菌落接种于MRS液体培养基进行扩增，之后在MRS固体培养基上划线分离纯化，37℃静置培养24h。经筛选获得F203菌株。

2、菌株鉴定

将分离纯化出的单菌落进行革兰氏染色、镜检，确定为单菌后使用甘油于-80℃冻存。利用细菌基因组提取试剂盒提取乳酸菌基因组DNA，采用16S rRNA通用引物27F、1492R扩增目的片段，将纯化回收的PCR产物送生工生物工程有限公司进行序列测定。测序结果在NCBI网站进行BLAST同源性比对。选取同源性最高的乳酸杆菌模式菌株核酸序列进行同源性分析，以邻接法（Neighbor-joining, NJ）构建系统进化树。结合生物学特征以及16SrRNA基因序列（SEQ ID NO.1）比对，确认F203菌株为屎肠球菌，镜检照片如图1所示。

屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203已于2023年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为屎肠球菌Enterococcus faecium，保藏编号为CGMCC No.27675。

实施例2 屎肠球菌CGMCC No.27675的特性检测

胆固醇降解能力检测

将活化的浓度为10⁸CFU/mL的屎肠球菌F203菌液分别按1%和2%添加量添加至含胆固醇（1%）的MRS液体培养基（100mL）中，在37℃下培养24h后，取0.2 mL菌液到10 mL离心管中。向离心管中加入4.8 mL无水乙醇，静置15 min，以6659×g离心10 min。吸取2 mL上清液至试管中，然后加入2 mL铁矾显色剂溶液，用移液管缓慢吹匀，冷却至室温后，在15-90 min内用酶标仪测定其OD_560nm，用2 mL无水乙醇加入2 mL铁矾溶液作为空白进行零点调整，并以不含菌液的添加胆固醇的MRS培养基作为对照组。使用胆固醇浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL的无菌胆固醇标准溶液，用OD_560nm值和标准浓度绘制标准曲线。根据标准曲线计算屎肠球菌F203的胆固醇降解率。

屎肠球菌CGMCC No.27675的胆固醇降解率检测结果如表1所示，在添加量为1%时，屎肠球菌CGMCC No.27675处理24h可降解44.59%的胆固醇，在添加量为2%时，屎肠球菌CGMCC No.27675处理24h可降解66.8%的胆固醇，表明屎肠球菌CGMCC No.27675具有明显的降解胆固醇的作用，能够用于降胆固醇类产品的开发。

表1 屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的降解胆固醇能力

2、耐酸特性检测

将MRS液体培养基调节至pH分别为2、3、4，在上述培养基中按照0.01%的接种量接种屎肠球菌CGMCC No.27675，在培养4h后，接种固体培养基并于37℃培养24h后，使用平板计数法计算活菌数，测定屎肠球菌CGMCC No. 27675的耐酸能力。

屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的耐酸能力如表2所示，屎肠球菌CGMCC No.27675在pH为4的酸性环境中生长良好（4h存活率为91.56%），在pH为3的酸性环境中4h后的活菌计数存活率为86.21%，在pH为2的酸性环境中4h后的活菌计数存活率为70.17%，表明屎肠球菌CGMCC No.27675可以很好地耐受胃内酸性环境，能够到达肠道发挥生物学作用。

表2 屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的耐酸能力

3、耐胆盐特性检测

在MRS液体培养基中分别加入0.1%、0.3%、0.6%的牛胆盐，在上述培养基中按照0.01%的接种量接种屎肠球菌CGMCC No.27675，在培养4h后，接种固体培养基并于37℃培养24h后，使用平板计数法计算活菌数，测定屎肠球菌CGMCC No.27675的耐胆盐能力。

屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的耐胆盐能力如表3所示，屎肠球菌CGMCCNo.27675在胆盐浓度为0.15%的环境中生长良好，存活率达80.60%，在胆盐浓度为0.3%的环境中存活率为68.24%，在胆盐浓度为0.6%的环境中存活率为60.23%，表明该菌株可以很好地耐受胆盐，能够在肠道发挥生物学作用。

表3 屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的耐胆盐能力

4、抑菌特性检测

将处于对数生长期的屎肠球菌CGMCC No.27675用生理盐水稀释至浓度为10⁸CFU/mL的菌液，利用琼脂扩散的牛津杯法检测该菌株对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella enteritidis）、大肠杆菌（Escherichia coli）的抑菌效果，肉汤培养基灭菌后冷却至50 ℃，按照10mL菌液（10⁸CFU/mL）每1 mL培养基的比例，混匀后倒入培养基。分别向牛津杯中加入200 mL单株待测菌液，于37 ℃正置恒温培养24 h，以抑菌圈半径大小为指标，分为不抑制（0 cm）、抑制（大于0且小于等于2.0 cm）、明显抑制（＞2.0 cm）三种，分别检测屎肠球菌CGMCC No.27675对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌的抑菌效果。

屎肠球菌CGMCC No.27675的抑菌结果如表4所示，屎肠球菌CGMCC No.27675菌株对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌产生抑制作用。

表4 屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的抑菌实验结果

5、抗生素敏感性检测

采用纸片扩散试验法（K-B法），根据抑菌环大小，判断屎肠球菌CGMCC No.27675对速诺、头孢噻呋、头孢喹肟、多西环素等猫临床常用抗菌药物是否敏感。无菌条件下，用已灭菌的接种环挑取单菌落，接种于MRS培养基中37 ℃培养24h。每个平板涂布菌液100 μL，滴于MRS固体培养基表面，均匀涂布后，用灭菌的镊子以无菌操作方式取出含药纸片贴于培养基表面，静置一段时间后放于37℃恒温箱中培养24 h，观察抑菌结果并用游标卡尺量取各药片组的抑菌圈半径大小，运用EXCEL软件计算其平均值，同时根据《抗微生物药物敏感性实验规范》，判断药敏效果，并将结果分为耐药、中介（耐药中介敏感）、敏感三种，检测屎肠球菌CGMCC No.27675的抗生素敏感特性。

屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的抗生素敏感性结果如表5所示，猫临床常用的红霉素、米诺环素、头孢曲松、哌拉西林等9种抗生素均可对屎肠球菌CGMCC No.27675的生长产生有效抑制，表明屎肠球菌CGMCC No.27675菌株对临床常见的猫用抗生素敏感，可安全应用于临床。

表5 屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的抗生素敏感性检测结果

实施例3 屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的冻干益生菌制剂的制备

将屎肠球菌CGMCC No.27675制备为冻干粉剂，该冻干粉剂为屎肠球菌CGMCCNo.27675以及冻干保护剂的组合物，冻干保护剂按重量百分比组成如下：1%蔗糖、1%半乳糖、20%脱脂奶粉、78% ddH₂O。

冻干粉剂的制备方法具体如下：

将活化后的屎肠球菌CGMCC No.27675使用MRS液体培养基于37℃、湿度65-70%，pH＜7条件下静置培养24h后，以6000rpm，25℃，10min进行离心，沉淀菌体，后使用ddH₂O重悬菌体，再次以6000rpm，25℃，10min进行离心洗涤菌体，最终得到屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的菌泥。将冻干保护剂（组成为：1%蔗糖、1%半乳糖、20%脱脂奶粉、78% ddH₂O）进行均质、灭菌以及冷却处理，其中，灭菌是在100℃的条件下进行20min，冷却处理后的温度为25℃。向冷却处理后的冻干保护剂中按照菌泥：冻干保护剂=1:8的重量比加入洗涤后的屎肠球菌CGMCC No.27675菌株的菌泥，混合、均质后，放置于-80℃预冻12h后，放入冻干机在0Pa、-80℃条件下进行冻干，即得屎肠球菌CGMCC No.27675的冻干益生菌制剂。在冻干结束后采用涂布平板计数法计算冻干菌粉活菌数。

屎肠球菌CGMCC No.27675菌株冻干后菌粉活菌数量为1.0×10⁷CFU/g-1.0×10¹⁰CFU/g，4℃保存。结果显示，冻干后屎肠球菌CGMCC No.27675的活菌数量并未明显下降，表明该菌株具有较好的冻干稳定性。

实施例4 小鼠高脂饮食模型评价屎肠球菌CGMCC No.27675缓解肥胖和降脂功效

本实施例采用高脂饮食动物模型评价屎肠球菌CGMCC No.27675的缓解肥胖和降脂功效，具体方法和结果如下：

1、试验饲喂及分组情况

选取9只健康的4周龄Babl/c雄性鼠，随机分为F203组、模型组和空白对照组，每组3只，每笼3只。使用普通繁殖料适应饲喂3天后，F203组及模型组饲喂HFD（高脂肪饮食）饲料，空白对照组饲喂普通小鼠繁殖料，同时对F203组灌服屎肠球菌CGMCC No.27675的冻干益生菌制剂（制备方法参考实施例3），连续灌服28d，灌服剂量为0.1mL（1×10⁹CFU/只/天）。模型组及空白对照组灌服0.1mL PBS。在温度22±2℃、湿度30-70%条件下饲养，小鼠自由饮食和饮水。试验结束时对小鼠进行眼球采血后脱颈处死，剖检脏器，记录观察小鼠体重变化、肝脏甘油三酯含量以及血清脂质代谢相关蛋白表达量，评价屎肠球菌CGMCC No.27675缓解肥胖和降脂的能力。

2、甘油三酯及脂质代谢相关蛋白测定

试验结束时，对小鼠进行眼球摘除取血，血液采样后室温静置10min，4000rpm离心1min，分离血清。对小鼠剖检后取出小鼠肝脏，称取0.1g加入9mL无水乙醇，进行匀浆处理后取上清进行检测。使用试剂盒测定小鼠肝脏甘油三酯（TG）及小鼠血清中LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）含量。

结果如图2、图3所示，饲喂屎肠球菌CGMCC No.27675冻干益生菌制剂28天后的小鼠肝脏中甘油三酯含量降低（P<0.05），血清中LDL-C含量低于模型组（P>0.05）。

3、体重变化

在0、28天时称取小鼠重量，记录小鼠在0、28天时的体重，记录差异变化：

体重变化如图4所示，饲喂屎肠球菌CGMCC No.27675冻干益生菌制剂的小鼠在28天时体重明显低于仅饲喂高脂饲料的小鼠（P<0.05），表明屎肠球菌CGMCC No.27675能够有效缓解高脂饮食引起的体重增长。

4、肝脏的脏器指数

小鼠剖检后取出肝脏，无菌生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称重后计算肝脏脏器指数，记录差异变化：

脏器指数=（脏器重量/体重）×100。

肝脏的脏器指数结果如图5所示，饲喂屎肠球菌CGMCC No.27675冻干益生菌制剂的小鼠的肝脏脏器指数显著小于仅饲喂高脂饲料的小鼠（P<0.05），表明屎肠球菌CGMCCNo.27675能够有效减少肝脏脂肪堆积。

5、脂肪病变情况

小鼠剖检后取出小鼠腹部脂肪，使用脂肪5-10倍体积的4%组织固定液固定脂肪组织，制作病理切片观察组织变化情况。

结果如图6所示，饲喂屎肠球菌CGMCC No.27675冻干益生菌制剂的小鼠腹腔脂肪细胞增生肥大情况较仅喂食高脂饲料的小鼠少，仅见少量炎性细胞，无脂肪细胞坏死灶。可见屎肠球菌CGMCC No.27675对体内脂肪异常堆积具有明显的减轻作用。

6、粪便微生物变化情况

试验结束时，取小鼠新鲜粪便经液氮速冻后冻存于-80℃，之后使用E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA Kit (Omega, M5635-02,USA)从12个粪便样品（F203组、空白对照组、模型组各取4个样品）中提取DNA，并使用Quibit dsDNA HS（Thermo，美国）测试DNA样品的浓度。之后进行PCR扩增，正向引物序列为CCTACGGGNGGCWGCAG（SEQ ID NO.2），反向引物序列为GACTACHVGGGTATCTAATCC（SEQ ID NO.3）。PCR扩增两次，PCR反应条件为：94℃，3分钟，94℃，30秒，45℃，20秒，65℃，30秒，5个循环；再在94°C±20秒、55°C±20秒、72°C±30秒下进行20次循环；72°C，5分钟。使用电泳检测PCR产物。提取的DNA样品在生工生物技术（上海）有限公司进行16S rRNA测序。

PCoA分析结果如图7所示，饲喂屎肠球菌CGMCC No.27675冻干益生菌制剂的小鼠粪便菌群与模型组存在明显差异，说明屎肠球菌CGMCC No.27675对肠道微生物菌群具有明显调节作用，可通过改变高脂饮食下小鼠肠道微生物组成从肠道改变脂质代谢。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27675。

2.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包含权利要求1所述的屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203。

3.权利要求1所述的屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203或权利要求2所述的微生物制剂在制备饲料、饲料添加剂或药物中的应用。

4.权利要求1所述的屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203或权利要求2所述的微生物制剂在制备用于降低胆固醇的产品中的应用；

所述产品为饲料、饲料添加剂或药物。

5.权利要求1所述的屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203或权利要求2所述的微生物制剂在制备用于治疗肥胖的产品，或者在制备用于抑制体重增长的产品中的应用；

所述产品为饲料、饲料添加剂或药物。

6.权利要求1所述的屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203或权利要求2所述的微生物制剂在制备降脂产品中的应用；

所述产品为饲料、饲料添加剂或药物。

7.权利要求1所述的屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203或权利要求2所述的微生物制剂在制备用于治疗高脂血症的产品中的应用；

所述产品为饲料、饲料添加剂或药物。

8.权利要求1所述的屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203或权利要求2所述的微生物制剂在制备用于改善肠道菌群的产品中的应用；

所述产品为饲料、饲料添加剂或药物。

9.权利要求1所述的屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203或权利要求2所述的微生物制剂在制备抑菌产品中的应用；

所述菌为大肠杆菌、沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌；

所述产品为饲料、饲料添加剂或药物。

10.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1所述的屎肠球菌（Enterococcus faecium）F203或权利要求2所述的微生物制剂；

所述产品为饲料、饲料添加剂或药物。