CN117947032A - 一种创制豆腥味降低的大豆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种创制豆腥味降低的大豆的方法，所述方法能够降低大豆中豆腥味物质含量，具体的，本发明首次发现，同时抑制脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达可显著降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味，尤其是大豆的豆腥味。

Description

一种创制豆腥味降低的大豆的方法

本申请要求申请日为2023年2月20日的中国专利申请CN202310146847.X的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。

技术领域

本发明涉及生物技术领域领域，具体地，涉及一种创制豆腥味降低的大豆的方法，本发明创制的大豆能够减少豆腥味。

背景技术

大豆是人类油脂和蛋白质的重要来源，是世界最重要的经济作物之一。大豆及大豆蛋白因营养全面，蛋白含量高、低胆固醇等诸多优点被广泛用于加工成豆浆、植物奶、豆腐、豆脑、豆干、腐竹、香肠、熟肉等食品。然而因为大豆中豆腥味物质如己醛、2-己烯醛，1-己醇，1-辛烯-3-醇，反-2-辛烯醛，壬醛，反-2-壬烯醛等严重影响了豆制品及大豆蛋白制品的风味，严重限制了大豆及大豆蛋白粉在食品工业中的应用，例如，因为豆腥味的影响，在肉食产品中大豆蛋白粉的用量不能超过8％，烘焙食品中不能超过3％，同样因为豆腥味的影响严重限制了大豆及大豆蛋白粉在冰激凌、鱼肉制品、裱花奶油、植物蛋白饮料、婴幼儿奶粉、代餐粉、豆乳酸奶、特医食品等的应用。

近几十年人们为了应对食品工业对无豆腥味或低豆腥味大豆及大豆蛋白粉的迫切需求，从大豆原料端开发了大豆脂肪氧化酶缺失的低豆腥味大豆，已有的研究发现，大豆脂肪氧化酶Lox1/2/3全部功能缺失后，大豆中豆腥味物质如己醛、1-己醇，反-2-辛烯醛，壬醛，反-2-壬烯醛降低约40％-70％，1-辛烯-3-醇降低约20％，2-己烯醛没有显著变化，研究人员已将这种大豆脂肪氧化酶Lox1/2/3功能缺失的大豆用于生产冰激凌、调和植物奶等产品。但是，这些低豆腥味大豆中仍然保留了大量的豆腥味物质，如己醛、2-己烯醛，1-己醇，1-辛烯-3-醇，反-2-辛烯醛，壬醛，反-2-壬烯醛，导致当前市场的低豆腥味大豆的应用范围受到了严重影响，因此市场亟需无豆腥味的大豆，即豆腥味物质如己醛、1-己醇，反-2-辛烯醛，壬醛，反-2-壬烯醛降低90％以上，2-己烯醛，1-辛烯-3-醇含量更低。

我们通过CRISPR/Cas基因编辑技术获得的大豆种子中几乎不含己醛、1-己醇，反-2-辛烯醛，壬醛，反-2-壬烯醛等豆腥味物质，且2-己烯醛和1-辛烯-3-醇含量大幅降低，具有更广泛的应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味的方法。

本发明第一方面提供了一种降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味的方法，所述方法包括降低或抑制植物中脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达量和/或活性的步骤。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶基因选自Lox1基因、Lox2基因或Lox3基因中的一种或任意几种。

在优选的实施方式中，所述方法包括降低或抑制Lox1基因、Lox2基因和Lox3基因或其编码蛋白的表达量和/或活性。

在另一优选例中，所述脂肪酸去饱和酶基因选自FAD2-1A基因和/或FAD2-1B基因。

在优选的实施方式中，所述方法包括降低或抑制FAD2-1A基因和FAD2-1B基因或其编码蛋白的表达量和/或活性。

在另一优选例中，所述FAD2-1A基因的编码蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述相同或相近功能由(i)衍生的多肽；

或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％或100％)的同源性、具有相同或相近功能的多肽。

在另一优选例中，所述FAD2-1B基因的编码蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述相同或相近功能由(i)衍生的多肽；

或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％或100％)的同源性、具有相同或相近功能的多肽。

在另一优选例中，所述Lox1基因的编码蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述相同或相近功能由(i)衍生的多肽；

或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:3所示氨基酸序列有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％或100％)的同源性、具有相同或相近功能的多肽。

在另一优选例中，所述Lox2基因的编码蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:4所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述相同或相近功能由(i)衍生的多肽；

或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:4所示氨基酸序列有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％或100％)的同源性、具有相同或相近功能的多肽。

另一优选例中，所述Lox3基因的编码蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:5所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:5所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述相同或相近功能由(i)衍生的多肽；

或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:5所示氨基酸序列有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％或100％)的同源性、具有相同或相近功能的多肽。

在另一优选例中，所述FAD2-1A基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:1所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:6所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:6所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:6所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述FAD2-1B基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:7所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:7所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:7所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述Lox1基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:3所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:8所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:8所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:8所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述Lox2基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:4所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:9所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:9所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:9所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述Lox3基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:5所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:10所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:10所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:10所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述FAD2-1A基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述FAD2-1B基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox1基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNo.3相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox2基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.4相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox3基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.5相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、草莓。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于大豆。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、异戊醛、己酮、异戊醇、庾醇、乙酸、丙酸、二甲胺、苯、苯甲醛、富马酸、水杨酸、阿魏酸、或其组合。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

在一个实施方式中，所述降低或抑制植物中脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达量和/或活性是通过对脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因进行突变实现的；优选的，所述突变导致脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因功能完全丧失或功能部分丧失；优选，所述突变导致脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因功能完全丧失；优选的，所述突变为脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因的核苷酸序列相对于SEQ ID NO.6-10任一所示的序列缺失部分碱基；优选的，所述突变为脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因的核苷酸序列相对于SEQ ID NO.6-10任一所示的序列插入1个或多个碱基。

在另一优选例中，所述方法包括给予脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的抑制剂。

在另一优选例中，所述的降低或抑制，是指与野生型植株中脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达水平E0相比，所述植株中脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％，更佳地，0-30％。

在另一优选例中，所述降低或抑制脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达和/或活性通过选自下组的方法实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、基因编辑技术、导入基因或蛋白的抑制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的基因突变通过以下一种或多种方法获得：自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、X射线或Y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑或生物合成。

在另一优选例中，所述的突变区域包括外显子和/或内含子区。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、Crispr试剂、小分子配体、或其组合。

在另一优选例中，所述的基因编辑技术选自下组：CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术、或其组合。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)提供一植物或植物细胞；和

(ii)将脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的抑制剂导入所述植物或植物细胞，从而获得改造的植物或植物细胞。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)提供一植物或植物细胞；和

(ii)利用靶向脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因的gRNA以及相应的Cas蛋白导入所述植物或植物细胞；在优选的实施方式中，向所述植物或植物细胞中导入含有所述gRNA和Cas蛋白的表达载体。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因包括cDNA序列、CDS序列、基因组序列、或其组合。

在另一优选例中，所述降低或抑制脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达量和/或活性通过对脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因进行突变来实现。

在另一优选例中，所述降低或抑制脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达量和/或活性通过对FAD2-1A基因、FAD2-1B基因、Lox1基因、Lox2基因和Lox3基因同时进行突变来实现。

在另一优选例中，所述突变包括插入突变、缺失突变、移码突变、取代突变。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：测试植物中豆腥味物质含量的降低水平。

在另一优选例中，所述植物中的豆腥味物质的含量为0，或者，0.001-20μg/g，较佳地，0.01-5μg/g，更佳地，0.001-1μg/g，更佳地，0.001-0.5μg/g，更佳地，0.001-0.1μg/g。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。

在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。

在另一优选例中，所述植物选自大豆。

本发明第二方面提供了一种用于降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味的组合物，包括：

(a)植物中脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的抑制剂；以及，任选的，

(b)农学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶基因选自Lox1基因、Lox2基因或Lox3基因中的一种或任意几种。

在优选的实施方式中，所述抑制剂能够降低或抑制Lox1基因、Lox2基因和Lox3基因或其编码蛋白的表达量和/或活性。

在另一优选例中，所述脂肪酸去饱和酶基因选自FAD2-1A基因和/或FAD2-1B基因。

在优选的实施方式中，所述抑制剂能够降低或抑制FAD2-1A基因和FAD2-1B基因或其编码蛋白的表达量和/或活性。

在另一优选例中，所述FAD2-1A基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述FAD2-1B基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox1基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNo.3相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox2基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.4相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox3基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.5相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、草莓。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于大豆。

在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。

在另一优选例中，所述抑制剂包括农用抑制剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：基因编辑试剂、反义核酸、抗体、小分子化合物、Crispr试剂、小分子配体、或其组合。

在另一优选例中，所述反义核酸选自下组：反义RNA、反义DNA、干扰RNA、核酶、或其组合。

在另一优选例中，所述干扰RNA选自下组：siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、dsRNA、hpRNA、ihpRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物还包括其他减少植物的豆腥味的物质。

在另一优选例中，所述减少植物豆腥味包括降低植物中豆腥味物质的含量。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、异戊醛、己酮、异戊醇、庾醇、乙酸、丙酸、二甲胺、苯、苯甲醛、富马酸、水杨酸、阿魏酸、或其组合。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。

在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。

在另一优选例中，所述植物选自大豆。

本发明第三方面提供了一种本发明第二方面所述的组合物的用途，用于降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味。

在另一优选例中，所述的组合物的用途，用于制备降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味的试剂或试剂盒。

本发明第四方面提供了一种制备豆腥味物质含量降低或豆腥味减少的植物细胞、或植物种子、或植物组织、或植物部分、或植物的方法，包括步骤：

降低或抑制植物细胞、或植物种子、或植物组织、或植物部分、或植物中的脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达和/或活性，从而获得豆腥味物质含量降低或豆腥味减少的植物细胞、或植物种子、或植物组织、或植物部分、或植物。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶基因选自Lox1基因、Lox2基因或Lox3基因中的一种或任意几种。

在优选的实施方式中，所述方法包括降低或抑制Lox1基因、Lox2基因和Lox3基因或其编码蛋白的表达量和/或活性。

在另一优选例中，所述脂肪酸去饱和酶基因选自FAD2-1A基因和/或FAD2-1B基因。

在优选的实施方式中，所述方法包括降低或抑制FAD2-1A基因和FAD2-1B基因或其编码蛋白的表达量和/或活性。

在另一优选例中，所述FAD2-1A基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述FAD2-1B基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox1基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNo.3相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox2基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.4相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox3基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.5相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、草莓。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于大豆。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、异戊醛、己酮、异戊醇、庾醇、乙酸、丙酸、二甲胺、苯、苯甲醛、富马酸、水杨酸、阿魏酸、或其组合。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

在另一优选例中，所述降低或抑制脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达和/或活性通过选自下组的方法实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、基因编辑技术、导入基因或蛋白抑制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。

在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。

在另一优选例中，所述植物选自大豆。

本发明第五方面提供了一种制备豆腥味物质含量降低或豆腥味减少的植物的方法，包括步骤：

将本发明第四方面所述方法制备的豆腥味物质含量降低或豆腥味减少的植物细胞、或植物种子、或植物组织、或植物部分再生为植物体，从而获得豆腥味物质含量降低或豆腥味减少的植物。

在另一优选例中，所述方法还包括将利用所述豆腥味物质含量降低或豆腥味减少的植物收获植物种子的步骤。

本发明第六方面提供了一种豆腥味物质含量降低或豆腥味降低的植物细胞、或植物种子、或植物组织、或植物部分、或植物，其特征在于，所述植物细胞、或植物种子、或植物组织、或植物部分、或植物是通过将本发明第四或第五方面所述的方法制备得到。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、异戊醛、己酮、异戊醇、庾醇、乙酸、丙酸、二甲胺、苯、苯甲醛、富马酸、水杨酸、阿魏酸、或其组合。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

本发明第七方面提供了一种改良植物的方法，所述的方法包括步骤：

(a)提供一植物细胞、植物组织、植物部分，向所述植物细胞、植物组织、植物部分中导入脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的抑制剂；

(b)将步骤(a)中的植物细胞、植物组织、植物部分再生成植株。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶基因选自Lox1基因、Lox2基因或Lox3基因中的一种或任意几种。

在另一优选例中，所述脂肪酸去饱和酶基因选自FAD2-1A基因和/或FAD2-1B基因。

在另一优选例中，所述FAD2-1A基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述FAD2-1B基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox1基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNo.3相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox2基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.4相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox3基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.5相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、草莓。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于大豆。

在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞、植物组织、植物部分，从而使所述植物细胞、植物组织、植物部分中的脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达或活性降低。

在另一优选例中，所述的基因编辑技术选自下组：CRISPR基因编辑体系、易错PCR、基因重组、TALEN和ZFN。

在另一优选例中，所述方法用于降低植物中豆腥味物质含量。

在另一优选例中，所述方法用于减少植物豆腥味。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、异戊醛、己酮、异戊醇、庾醇、乙酸、丙酸、二甲胺、苯、苯甲醛、富马酸、水杨酸、阿魏酸、或其组合。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：对所述植物细胞、植物组织、植物部分或植物，测试豆腥味物质含量的降低水平。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。

在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。

在另一优选例中，所述植物选自大豆。

本发明第八方面提供了一种基因工程植物，所述的植物是用本发明第七方面所述的方法制备的。

本发明第九方面提供了一种筛选或鉴定低豆腥味植物或无豆腥味植物的方法，所述方法包括检测植物中脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因和/或其蛋白的表达量的步骤。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶基因选自Lox1基因、Lox2基因或Lox3基因中的一种或任意几种。

在另一优选例中，所述脂肪酸去饱和酶基因选自FAD2-1A基因和/或FAD2-1B基因。

在另一优选例中，所述FAD2-1A基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述FAD2-1B基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox1基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNo.3相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox2基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.4相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述Lox3基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.5相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。

在另一优选例中，所述的脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、草莓。

在另一优选例中，所述脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因来源于大豆。

在另一优选例中，所述低豆腥味或无豆腥味是指豆腥味物质含量低。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、异戊醛、己酮、异戊醇、庾醇、乙酸、丙酸、二甲胺、苯、苯甲醛、富马酸、水杨酸、阿魏酸、或其组合。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。

在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。

在另一优选例中，所述植物选自大豆。

在另一优选例中，所述检测植物的检测部位包括植物的愈伤组织、果实、种子、花、茎、叶、穗、根。

本发明第十方面提供了一种制备低豆腥味或无豆腥味大豆种子的方法，所述方法包括利用上述方法制备得到的植株制备低豆腥味或无豆腥味大豆种子的步骤。

本发明第十一方面还提供了一种低豆腥味或无豆腥味大豆种子，所述低豆腥味或无豆腥味大豆种子是采用上述制备低豆腥味或无豆腥味大豆种子的方法制备得到的。

在另一优选例中，所述的低豆腥味或无豆腥味大豆，是指与野生型大豆种子相比，编辑之后的大豆种子的豆腥味物质含量降低至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、异戊醛、己酮、异戊醇、庾醇、乙酸、丙酸、二甲胺、苯、苯甲醛、富马酸、水杨酸、阿魏酸、或其组合。

在另一优选例中，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

本发明第十二方面还提供了一种制备大豆植物的方法，所述方法包括利用上述低豆腥味或无豆腥味大豆种子或低豆腥味或无豆腥味大豆植株与其他的大豆进行杂交从而制备大豆植物的步骤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人通过对大量的植物性状位点的研究和筛选，首次意外地发现，当同时抑制脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达时，可显著降低植物中豆腥味物质含量。本发明人在此基础上完成了本发明。

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

如本文所用，所述“豆腥味”含义包括豆腥味、异味、腥味、刺激性气味、难闻气味等气味。豆腥味物质包括但不限于己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、异戊醛、己酮、异戊醇、庾醇、乙酸、丙酸、二甲胺、苯、苯甲醛、富马酸、水杨酸、阿魏酸。

如本文所用，所述“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

如本文所用，所述“Cripsr制剂”是指可以实现基因编辑效果的各有效成分的组合，包括gRNA(向导RNA)或其编码序列和Cas蛋白或其编码序列，还可以进一步包括载体，以及有利于同源重组或基因表达的元件。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。比对方法为本领域技术人员已知的常规方法，比如BLAST运算法则。

术语“基因工程”是指通过人工干预的方式对控制生物遗传信息的核苷酸进行改造和利用，从而获得新的遗传特性、或新品种、或新产品的技术，包括本领域所公开的所有基因改造技术，如基因诱变、转基因或基因编辑等方法。基因诱变的方法包括但不限于物理诱变(比如紫外线诱变)、化学诱变(比如吖啶类染料)、生物诱变(如病毒、噬菌体诱变)等。

本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.1-5任一序列进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapid similaritysearches ofnucleic acid and protein data banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10；缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与SEQID No.1-5任一序列进行比来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。

本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，半胱氨酸(Cys，C)，脯氨酸(Pro，P)，异亮氨酸(Ile，I)，组氨酸(His，H)，精氨酸(Arg，R)。

术语“调控元件”又称“调节元件”，如本文中所使用的，旨在包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段((Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。

术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。

术语“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。

术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。

术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链DNA的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。

本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pBR322(ATCC37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174pBluescript IIKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。

本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。

术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

术语“植物细胞”应理解为来自或者发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearingtree)、以及灌木和其他苗木。

术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)，其来自微生物的免疫系统。其中基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b、Cas12i、Cas12j等)。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。

如本文所用，术语“基因编辑酶”指适用于CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶技术Transcription Activator-like(TAL)efiector nucleases)、ZFN(锌指核酸技术，Zinc finger nuclease)等编辑工具的核酸酶。优选地，所述基因编辑酶为CRISPR酶，又名Cas蛋白，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。所述的Cas蛋白是指蛋白家族，可以根据其来源不同而具有不同的结构，如来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9、来源于葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的SaCas9；还可以根据结构特征(如结构域)进行下位分类，如Cas12家族包括Cas12a(又名Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12i等。所述的Cas蛋白可以具有双链或单链或无切割活性。本发明所述的Cas蛋白可以是野生型或其突变体，所述的突变体的突变类型包括氨基酸的替换、取代或缺失，所述的突变体可以改变也可以不改变Cas蛋白的酶切活性。本领域技术人员所知，现有技术中已报到的多种具有核酸切割活性的Cas蛋白，该公知蛋白或其改造后的变体均可以实现本发明的功能，本文通过引用方式将其纳入保护范围。如本文中所使用的，术语“指导RNA(guide RNA)”、“成熟crRNA”、“指导序列”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，指导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat)和引导序列，或者基本上由或由同向重复序列和引导序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。

在某些情况下，引导序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。在一个实施方式中，当最佳比对时，引导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

FAD2基因

FAD2基因是脂肪酸去饱和酶基因，是控制油酸向亚油酸转化的关键基因。在大豆中存在多个FAD2同源基因，如FAD2-1A(Glyma10g42470)、FAD2-1B(Glyma20g24530)等。大豆FAD2-1A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示，编码的蛋白序列如SEQ ID NO.:1所示；大豆FAD2-1B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示，编码的蛋白序列如SEQ ID NO.:2所示。

Lox基因

Lox基因是脂肪氧化酶基因，可催化不饱和脂肪酸的加氧反应,形成过氧化氢衍生物等挥发性物质,能直接与食品中的蛋白质和氨基酸结合,产生豆腥味和苦涩味,降低食品的风味和营养价值。在大豆中存在多个Lox同源基因，如GmLox1(Glyma.13g347600)、GmLox2(Glyma.13g347500)和GmLox3(Glyma.15g026300)等。大豆Lox1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.:8所示，编码的蛋白序列如SEQ ID NO.:3所示；大豆Lox2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.:9所示，编码的蛋白序列如SEQ ID NO.:4所示；大豆Lox3基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.:10所示，编码的蛋白序列如SEQ ID NO.:5所示。

本发明还包括与本发明的优选基因序列(SEQ ID NO.:6或7或8或9或10)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％，或100％)同源性的核酸。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

在本发明中，SEQ ID NO.:6-10中任一核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQ ID NO.:6-10任一序列的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQ IDNO.:6-10任一序列的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO.:1-5任一序列的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO.:6-10中任一核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.:6-10任一所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于大豆，但是来源于其它类似的植物的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO.:6-10任一序列所示)具有一定同源性(如具有70％以上，如70％,75％,80％,85％,90％,95％甚至98％，99％，或100％序列相同性)的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:6-10任一序列的编码区序列相同或者是简并的变异体。

编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的FAD2-1A基因、FAD2-1B基因、Lox1基因、Lox2基因、或Lox3基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

FAD2基因编码的多肽

如本文所用，术语“脂肪酸去饱和酶”、“FAD2基因编码的多肽”、“FAD2-1A基因或FAD2-1B的编码蛋白”可以互换使用，都是指来源于植物(如大豆)的脂肪酸去饱和酶的多肽及其变体。在一优选实施方式中，本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1或2所示。

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:1或2所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％或100％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

所述“相同或相似功能”主要是指具有脂肪酸去饱和酶活性。

本发明还包括具有脂肪酸去饱和酶活性的脂肪酸去饱和酶蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然脂肪酸去饱和酶蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

Lox基因编码的多肽

如本文所用，术语“脂肪氧化酶”、“Lox基因编码的多肽”、“Lox1基因或Lox2基因或Lox3基因的编码蛋白”可以互换使用，都是指来源于植物(如大豆)的脂肪氧化酶的多肽及其变体。在一优选实施方式中，本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3-5任一序列所示。

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:3-5任一所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％或100％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

所述“相同或相似功能”主要是指具有脂肪氧化酶活性。

本发明还包括具有脂肪氧化酶活性的脂肪氧化酶蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然脂肪氧化酶蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.:1-5任一所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO.:1-5任一所示的序列的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

农用抑制剂

可将本发明的活性物质(如脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的抑制剂)以常规的方法制备成农用制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、用活性物质浸渍的天然的和合成的材料、在多聚物中的微胶囊、用于种子的包衣剂。

这些制剂可用已知的方法生产，例如，将活性物质与扩充剂混合，这些扩充剂就是液体的或液化气的或固体的稀释剂或载体，并可任意选用表面活性剂即乳化剂和/或分散剂和/或泡沫形成剂。例如在用水作扩充剂时，有机溶剂也可用作助剂。

用液体溶剂作稀释剂或载体时，基本上是合适的，如：芳香烃类，例如二甲苯，甲苯或烷基萘；氯化的芳香或氯化的脂肪烃类，例如氯苯，氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烃类，例如环己烷或石蜡，例如矿物油馏分；醇类，例如乙醇或乙二醇以及它们的醚和脂类；酮类，例如丙酮，甲乙酮，甲基异丁基酮或环已酮；或不常用的极性溶剂，例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，以及水。

就液化气的稀释剂或载体说，指的是在常温常压下将成为气体的液体，例如气溶胶推进剂，如卤化的烃类以及丁烷，丙烷，氮气和二氧化碳。

固体载体可用研磨的天然矿物质，例如高岭土，粘土，滑石，石英，活性白土，蒙脱土，或硅藻土，和研磨合成的矿物质，例如高度分散的硅酸，氧化铝和硅酸盐。供颗粒用的固体载体是碾碎的和分级的天然锆石，例如方解石，大理石，浮石，海泡石和白云石，以及无机和有机粗粉合成的颗粒，和有机材料例如锯木屑，椰子壳，玉米棒子和烟草梗的颗粒等。

非离子的和阴离子的乳化列可用作乳化剂和/或泡沫形成剂。例如聚氧乙烯-脂肪酸酯类，聚氧乙烯-脂肪醇醚类，例如烷芳基聚乙二醇醚类，烷基磺酸酯类，烷基硫酸酯类，芳基磺酸酯类以及白蛋白水解产物。分散剂包括，例如木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。

在制剂中可以用粘合剂，例如羧甲基纤维素和以粉末，颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物，例如阿拉伯胶，聚乙烯基醇和聚乙烯醋酸酯。

可以用着色剂例如无机染料，如氧化铁，氧化钻和普鲁士蓝；有机染料，如有机染料，如偶氮染料或金属钛菁染料；和用痕量营养剂，如铁，猛，硼，铜，钴，铝和锌的盐等。

在本发明中，所述“农用制剂”通常是农用植物生长调节剂，其含有脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的抑制剂作为改良植物性状(如，减少植物豆腥味)的活性成分；以及农业上可接受的载体。

如本文所用，所述“农业上可接受的载体”是用于将本发明的活性物质传送给植物的农药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的农业上可接受的载体选自下组：水、缓冲液、DMSO、表面活性剂如Tween-20、或其组合。任何本领域技术人员已知的农业上可接受的载体均可用于本发明中。

本发明的农用抑制剂可包括农用组合物。

本发明的农用制剂可与其他减少植物豆腥味的物质联用。所述其他减少豆腥味的物质可以是本领域技术人员已知的植物生长调节剂。

本发明所述的农用制剂的剂型可以是多种多样的，只要能够使活性成分有效地到达植物体内的剂型都是可以的，从易于制备和施用的立场看，优选的农用制剂是一种喷雾剂或溶液制剂。

本发明所述的农用制剂通常含有占所述农用制剂总重量的0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的本发明的活性成分。商品制剂或使用剂型中的本发明的活性成分的浓度可在广阔的范围内变动。商品制剂或使用剂型中的本发明的活性成分的浓度可从0.0000001-100％(g/v)，最好在0.0001与50％(g/v)之间。

本发明涉及的序列如下：

序列号(SEQ ID No.)	序列描述
		1	GmFAD2-1A氨基酸序列
2	GmFAD2-1B氨基酸序列
		3	GmLox1氨基酸序列
4	GmLox2氨基酸序列
		5	GmLox3氨基酸序列
6	GmFAD2-1A核苷酸序列
		7	GmFAD2-1B核苷酸序列
8	GmLox1核苷酸序列
		9	GmLox2核苷酸序列
10	GmLox3核苷酸序列

本发明的主要优点：

本发明首次发现，通过抑制脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达或活性，可显著降低豆腥味物质的含量或减少豆腥味，特别是己醛、2-己烯醛、1-己醇和1-辛烯-3-醇含量显著降低，从而可以制备无豆腥味大豆。

附图说明

图1.实验组(fad2-1a/b,lox1/2/3五突)大豆(图1中的新型无腥味大豆)、对照组(lox1/2/3三突)大豆(图1中的传统无腥味大豆)和野生型大豆种子(WT)豆腥味物质含量对照图。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、制备大豆基因编辑株系

1、基因编辑载体构建

通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站获得GmFAD2-1A(Glyma10g42470)、GmFAD2-1B(Glyma20g24530)、GmLox1(Glyma.13g347600)、GmLox2(Glyma.13g347500)和GmLox3(Glyma.15g026300)基因的基因组序列及氨基酸序列，分别针对这五个基因的编码区进行靶点设计。本实施方式中采用基于CRISPR的基因编辑技术在大豆(徐豆18)中进行基因编辑进行基因编辑，所利用的Cas蛋白为改良的Cas12i蛋白(专利CN114672473B中记载的Cas突变蛋白S7R)。

根据大豆中GmFAD2-1A、GmFAD2-1B、GmLox1、GmLox2和GmLox3基因的编码序列设计针对Cas12i的gRNA，设计的gRNA序列如下：

gRNA	gRNA的引导序列(5’至3’)	PAM	所靶向的靶基因
				gRNA 1	cctcattgcatggccaatctat	ttc	GmFAD2-1A/B
gRNA 2	tagaaggttgcttcctgagaaag	ttc	GmLox1
				gRNA 3	ctcatcaacaccactgtcccttt	ttc	GmLox2
gRNA 4	ttgcgcatcaacaccactgtccc	ttc	GmLox3

上述gRNA的同向重复序列为agagaaugugugcauagucacac(5’至3’)。上述gRNA1-gRNA4从5’至3’依次包括上述同向重复序列以及各自的引导序列。

根据靶点设计退火引物，退火引物的序列如下：

引物退火后，通过Golden Gate法连接基因编辑骨架载体，得到基因编辑载体，所述基因编辑载体上包含Cas12i蛋白以及上述gRNA。

实验组的载体靶向大豆GmFAD2-1A、GmFAD2-1B、GmLox1、GmLox2和GmLox3基因，起到GmFAD2-1A、GmFAD2-1B、GmLox1、GmLox2和GmLox3五个基因同时缺失的作用；另外，设置三突对照组，其载体靶向大豆GmLox1、GmLox2和GmLox3基因，起到GmLox1、GmLox2和GmLox3三个基因同时缺失的作用。

2、重组菌获得

1)转化大肠杆菌

将步骤1中的基因编辑载体转化大肠杆菌，对转化的大肠杆菌进行菌液PCR，选择PCR条带大小正确的扩增产物测序，测序结果正确的大肠杆菌即含有基因编辑载体的重组大肠杆菌。

2)转化农杆菌

将步骤1)含有基因编辑载体的重组大肠杆菌进行培养后提质粒DNA，加入到农杆菌感受态细胞中，冰浴5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰上放置5min；

取出离心管，加入700μl培养液(无抗生素)，28℃振荡培养2～4h；

取出菌液与含相应抗生素的培养基平板上涂板，在培养箱中倒置培养，2天左右菌落可见，对菌落按步骤1)中的方法进行PCR，并对扩增产物进行测序，测序结果正确的农杆菌即含有基因编辑载体的重组农杆菌。

3、植物遗传转化

1)大豆种子灭菌：

将挑选好的大豆种子放在干燥器中的培养皿里，向干燥器中装有150ml次氯酸钠的烧杯中贴壁缓慢加入10ml浓盐酸，迅速关闭干燥器的盖子。用次氯酸钠和浓盐酸产生的氯气灭菌16h。

2)种子发芽：

将步骤1)已灭菌种子种化向下插进MS培养基，插入培养基的深度占种子宽度的1/3～1/2，于25℃暗培养或光下培养过夜。

3)农杆菌菌液制备：

取储藏在-80℃冰箱中的菌液，在含有抗生素的YEP平板上划菌(步骤2的2)中含有基因编辑载体的重组农杆菌)，28℃培养2天，挑取菌落接种于50ml离心管中的5ml YEP液体培养基中，28℃振荡过夜；取300μl菌液，加到250ml YEP液体培养基中，过夜培养至OD600＝0.6左右，4000rpm离心10min，用侵染液重新稀释至OD600＝0.6左右备用。

4)子叶节划伤、侵染和共培养：

步骤2)的种子发芽1天后，在下胚轴靠近子叶节3～5mm处，横切一刀，然后沿着两片子叶中间纵切，不要伤到子叶，将下胚轴纵向切开，去掉顶芽，在子叶节部位分别纵向轻划1～5刀，迅速放入步骤3)中事先制备的农杆菌侵染液中，侵染1～4小时左右，取出放到铺有滤纸的共培养培养基上，于22℃共培养3～5天。

5)恢复培养：

将共培养之后的外植体插到恢复培养基中，培养皿用3M的透气胶带封口后放置在光下，25℃左右恢复培养5～7天。

6)筛选培养：

将恢复之后的外植体伤口处插入筛选培养基，25℃左右光下筛选，每10天继代一次，继代3～5次。

7)芽伸长培养：

将筛选后的外植体，切掉子叶，带丛生芽的部分移到芽伸长培养基，每10天继代一次，光照和温度同筛选培养。

8)生根和移苗：

当芽伸长培养基中的植株伸长到3cm上(或有两个三出复叶)后，沿基部切下插入灭菌的营养土中，浇生根培养液生根。当根长出后，移到事先浇透水的土壤中，覆盖塑料薄膜，一周后剪开塑料薄膜炼苗，两周后如果有新叶长出，完全去掉塑料薄膜，得到E0代转化苗。

4、大豆转化株检测及表型观察

在E0代转化苗中通过PCR和测序检测并筛选编辑苗，在气候室种植。

5、结果

检测大豆编辑植株的情况，结果显示，实验组(五突)大豆GmFAD2-1A、GmFAD2-1B、GmLox1、GmLox2和GmLox3基因序列部分缺失或者氨基酸插入，基因功能均完全丧失；三突对照组的GmLox1、GmLox2和GmLox3基因功能均完全丧失，GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因功能正常没有检测到编辑事件。

对上述大豆编辑植株的表型鉴定：

取野生型大豆种子和E1代上述编辑植株(实验组、三突对照组)的大豆种子粉碎后检测豆腥味物质(己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛)含量；上述豆腥味物质含量的检测可以采用本领域常规的技术进行检测。

结果如图1所示。与野生型大豆种子(图1中的WT)相比，三突对照组(图1中的传统无腥味大豆)大豆种子的豆腥味物质含量显著下降(除己醛和2-己烯醛外)，实验组(五突)大豆种子(图1中的新型无腥味大豆)的豆腥味物质含量也显著下降；与三突对照组大豆种子相比，实验组(五突)大豆种子的豆腥味物质含量均显著下降，特别是己醛、2-己烯醛、1-己醇和1-辛烯-3-醇，其中，己醛含量降低98％以上，1-己醇含量降低96％以上，2-己烯醛和1-辛烯-3-醇分别降低80％和50％左右。尽管三突对照组大豆种子的豆腥味物质较低，但是实验组(五突)大豆种子几乎不含豆腥味物质(检测的多种豆腥味物质含量大部分低于0.09μg/g，有些豆腥味物质甚至完全消失)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味的方法，其特征在于，所述方法包括降低或抑制植物中脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达量和/或活性的步骤；

所述脂肪氧化酶基因选自Lox1基因、Lox2基因或Lox3基因中的一种或任意几种；

所述脂肪酸去饱和酶基因选自FAD2-1A基因和/或FAD2-1B基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述降低或抑制植物中脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达量和/或活性通过选自下组的方法实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、基因编辑技术、导入基因或蛋白的抑制剂、或其组合。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述植物为大豆。

5.一种用于降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味的组合物，其特征在于，包括：

(a)植物中脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的抑制剂；以及，任选的，

(b)农学上可接受的载体；

所述脂肪氧化酶基因选自Lox1基因、Lox2基因或Lox3基因中的一种或任意几种；

所述脂肪酸去饱和酶基因选自FAD2-1A基因和/或FAD2-1B基因；

优选的，所述抑制剂选自下组：基因编辑试剂、反义核酸、抗体、小分子化合物、Crispr试剂、小分子配体、或其组合；

优选的，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

6.权利要求5所述的组合物的用途，其特征在于，用于降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味；或者用于制备降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味的试剂或试剂盒。

7.一种制备豆腥味物质含量降低或豆腥味减少的植物细胞、或植物种子、或植物组织、或植物部分、或植物的方法，其特征在于，包括步骤：

降低或抑制植物细胞、或植物种子、或植物组织、或植物部分、或植物中脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达量和/或活性；

所述脂肪氧化酶基因选自Lox1基因、Lox2基因或Lox3基因中的一种或任意几种；

所述脂肪酸去饱和酶基因选自FAD2-1A基因和/或FAD2-1B基因；

优选的，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

8.一种制备豆腥味物质含量降低或豆腥味减少的植物的方法，其特征在于，包括步骤：

将权利要求7所述方法制备的植物细胞、或植物种子、或植物组织、或植物部分再生为植物体，从而获得所述豆腥味物质含量降低或豆腥味减少的植物；

进一步的，所述方法还包括将利用所述豆腥味物质含量降低或豆腥味减少的植物收获植物种子的步骤。

9.一种改良植物的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)提供一植物细胞、植物组织、植物部分，向所述植物细胞、植物组织、植物部分中导入脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的抑制剂；或者，降低或抑制植物细胞、植物组织、植物部分中的脂肪氧化酶和脂肪酸去饱和酶基因或其编码蛋白的表达和/或活性；

(b)将步骤(a)中的植物细胞、植物组织、植物部分再生成植株；

所述脂肪氧化酶基因选自Lox1基因、Lox2基因或Lox3基因中的一种或任意几种；

所述脂肪酸去饱和酶基因选自FAD2-1A基因和/或FAD2-1B基因；

优选的，所述改良植物为降低植物中豆腥味物质含量或减少植物豆腥味；

优选的，所述豆腥味物质选自下组：己醛、2-己烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、反-2-壬烯醛、或其组合。

10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，所述植物为大豆。