CN117946959A - 一种提高芽孢萌发率的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高芽孢萌发率的方法和应用，该方法是将芽孢先经静电场预处理后再热激活处理，打破芽孢休眠状态，高效地诱导芽孢萌发形成营养细胞。本发明采用静电场对细菌芽孢进行预处理，结合热激活，两者协同作用诱导芽孢的萌发，能够显著地提高芽孢的萌发总量，再进行杀菌处理，能以更低的能耗和成本取得更好的杀菌效果。将该方法应用于食品加工领域，能够为食品的贮藏及其品质风味和营养成分的保持等提供了一种新型有效、适用度高、更具实际应用意义的芽孢杀灭方法。

Description

一种提高芽孢萌发率的方法和应用

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，具体的，涉及一种提高芽孢萌发率的方法和应用。

背景技术

芽孢主要是芽孢杆菌在缺乏营养的环境条件下形成的一种休眠体，广泛存在于自然界中，不仅对外界逆境具有极强的抗性，对各种杀菌手段也都具有很强的抗性。目前，为了避免食品受高温影响而品质劣变，“萌发-失活”策略已被开发用于温和杀死芽孢，即先打破芽孢的休眠状态，削弱其抗逆性后再将其杀灭，从而用更低的能耗和成本取得更好的杀菌效果，使食品货架期延长。因此，为延长食品货架期、保证食品安全，开发促进芽孢萌发新技术，从而进一步提高杀菌效果，将是未来控制芽孢污染的研究趋势。

为了提高芽孢的萌发率，中国发明专利CN109619182B提供一种芽孢萌发剂，所述萌发剂包括如下重量份的组分：氨基酸0.1-5份，低聚糖0.1-2.5份，无机盐0.1-1份和分散剂0.1-1份。该发明提供的芽孢萌发剂可迅速打破芽孢休眠状态，诱导芽孢萌发形成营养细胞，在发酵类主食、奶制品、罐头等易受芽孢杆菌污染且经历高温加热的食品中具有广泛的应用价值，而且该发明所述的芽孢萌发剂制备过程简单，有利于大范围推广。但这些方法不仅萌发率低，还需要额外添加萌发剂，易改变食品原有的品质和营养成分构成，不适用于多数产品。

中国发明专利CN116286783B提出了一种提高超高压深休眠芽孢萌发速率的方法，所述方法包括：对样品进行超高压处理，收集未萌发的深休眠芽孢，得到深休眠芽孢液；将所述深休眠芽孢液与十二胺进行共孵育。利用该发明的方法可以有效地促进超高压深休眠芽孢萌发，提高萌发速率，具有操作简便、用时短、效率高等优点。但该方法会破坏食品中压敏性成分，不利于食品营养成分的保持，而且超高压设备成本高，操作有风险，并不具有普遍适用性。

传统的热灭菌总是伴随着营养价值损失和感官质量降低的问题，因此更多的研究转向探索如电场、非热等离子体、超声波、高静水压等非热加工技术。电场技术具有效率高、能耗低、环保、经济可行等优点，能保持食品原有的色、香、味，对营养成分的保存和食物消毒方面具有巨大的潜力。直流、脉冲和交流是电压施加方式的主要类型，改变平板电极的类型也会影响电场特性。目前静电场常用于辅助食品的冻结，不仅对微生物的杀灭作用有限，对芽孢活性更是没有显著影响，这限制了它在食品中的应用。

因此，如何保证食品质量的同时提高芽孢的萌发率是提高芽孢杀菌效果亟待解决的问题，利用静电场开发提高芽孢萌发率新技术也极具实际应用意义和价值。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种提高芽孢萌发率的方法和应用，以克服现有技术中的不足。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案。

低压静电场由静电场发生器和放电板组成，经变压器升压产生直流电压，采用空间放电方式，在一定范围内形成负离子环境，会对微生物产生生物电效应。本发明人将静电场技术应用于芽孢萌发中发现，静电场对抗性高的芽孢具有刺激作用，采用静电场处理芽孢后再热激活能够促进芽孢的萌发。而且利用静电场处理芽孢在实际操作中芽孢悬液不需要与放电板直接接触，使得静电场诱导芽孢萌发的方法更为简便和绿色。

本发明的一个方面提供了一种提高芽孢萌发率的方法，包括采用静电场对细菌芽孢进行预处理，然后再进行热激活，最后经萌发处理即可实现芽孢的高萌发率。

具体地，本发明提供的提高芽孢萌发率的方法包括以下步骤：

S1.静电场预处理：采用静电场对所述细菌芽孢悬液进行预处理，得到预处理芽孢悬液；

S2.芽孢热激活：对S1得到的所述预处理芽孢悬液进行热激活，得到激活芽孢悬液；

S3.萌发：将S2得到的所述激活芽孢悬液在25～55℃下萌发20～60min，得到萌发芽孢悬液。

优选地，所述预处理包括将细菌芽孢悬液放置在距离板状电极10～50cm处，在5～85℃下用静电场预处理20～60min。

优选地，所述静电场，其功率为2000～2500V/cm²。在一些具体的实施方式中，板状电极的大小为(20～50)×(10～25)cm²。

优选地，所述细菌包括芽孢芽孢杆菌(Bacillus)的细菌。

作为优选的实施方式，所述细菌包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)中的任一种或多种的组合。

优选地，所述热激活的条件包括将细菌芽孢悬液在70～85℃热处理10～30min。

优选地，步骤S1中所述细菌芽孢悬液的制备方法包括以下步骤：

(1)提供芽孢粗液；将活化的细菌接种至培养基中进行培养后，洗涤并收集得到所述芽孢粗液；

(2)提供芽孢泥；将步骤(1)得到的所述芽孢粗液离心洗涤，得到所述芽孢泥；

(3)制备所述芽孢悬液；将步骤(2)得到的所述芽孢泥重悬后即得到所述细菌芽孢悬液。

更优选地，步骤(1)中，将活化的所述细菌接至8～12mL含0.3～1.5μmol/L Mn²⁺的营养琼脂培养基中，35～38℃条件下培养6～8d，用2～8mL无菌去离子水振荡、洗涤并收集，得到所述芽孢粗液。

更优选地，步骤(2)中，所述芽孢粗液用10～30mL无菌去离子水在8000r/min下离心洗涤15min，重复3～6次，得到所述芽孢泥。

更优选地，步骤(3)中，将所述芽孢泥重悬在30～60mL无菌去离子水，得到所述细菌芽孢悬液。

本发明提供的一种提高芽孢萌发率的方法，将芽孢置于静电场中，负离子环境对芽孢施加高电荷，产生生物电效应，导致pH值的变化、电解引起的过量离子进入细胞内，改变膜内外电动势和产生自由基氧化剂，进而能够影响生物体内的代谢作用和膜电位等，使芽孢对外界环境变化的感知更加敏感。静电场产生的带电粒子流还增强了细胞内膜渗透性，打开了蛋白质通道，使Na⁺、K⁺以及2，6-吡啶二羧酸钙等这些离子更快释放并在膜外积累，刺激未萌发芽孢萌发。经过静电场处理后，更加敏感的芽孢在进一步受到热刺激后更容易打破芽孢休眠状态，萌发形成营养细胞。在静电场处理和热激活的协同作用下，能够进一步地提高芽孢的萌发率，再经过灭菌处理，能够对显著地提高芽孢杀菌效果。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种提高芽孢萌发率的方法。该方法利用静电场对细菌芽孢进行预处理，再结合热激活处理，两者协同作用诱导芽孢的萌发，显著地提高了芽孢的萌发总量。后续再将已萌发的芽孢杀灭，能够以更低的能耗和成本取得更好的杀菌效果。将本发明提供的方法应用于食品加工领域，能够为食品的贮藏及其品质风味和营养成分的保持等提供了一种新型有效、适用度高、具实际应用意义的芽孢杀灭方法。

(2)本发明的技术方案提供的一种提高芽孢萌发率的方法，具有操作简单，成本低廉，绿色环保的优点，尤其是无需再添加萌发剂，增强了其应用于食品杀菌领域中的安全性，能够大大减少操作步骤，适宜于大规模的推广应用。

附图说明

图1示出了实施例1-2和对比例1-2制备的萌发芽孢悬液的芽孢萌发率。

图2示出了实施例1-2和对比例1-2制备的萌发芽孢悬液的折光性。

图3示出了实施例1-2和对比例1-2制备的萌发芽孢悬液的2，6-吡啶二羧酸(DPA)荧光值。

具体实施方式

以下结合若干实施例对本发明的技术方案进行更为详细的解释说明。

如下实施例及对比例中使用的部分原料的来源及制备方法如下：

(1)枯草芽孢杆菌，保藏号CICC 24225，中国微生物菌种保藏中心。

(2)PCA培养基：PCA培养基购于广东环凯微生物科技有限公司，用于枯草芽孢杆菌的计数。

(3)LB培养基：LB培养基购于青岛海博生物技术有限公司，用于枯草芽孢杆菌的活化和传代培养。

(4)含0.91μmol/L Mn²⁺的营养琼脂培养基：将0.91μmol Mn²⁺加入到1L的营养琼脂培养基中，经121℃杀菌15min后冷却，制成斜面后使用。营养琼脂培养基购于广东环凯微生物科技有限公司；Mn²⁺来源于MnCl₂·4H₂O，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；该培养基用于芽孢的制备。

(5)枯草芽孢杆菌的活化：无菌条件下用接种环挑取枯草芽孢杆菌，接入10～15mLLB培养基中，涡旋振荡，37℃培养16～18h后得到活化枯草芽孢杆菌。

实施例1

本实施了提供了一种芽孢悬液的制备方法，步骤如下：

X1、将活化的枯草芽孢杆菌接至10mL含0.91μmol/L Mn²⁺的营养琼脂培养基中，37℃下培养7d，用3mL无菌去离子水振荡、洗涤并收集，得到芽孢粗液；

X2、将步骤X1得到的芽孢粗液用20mL无菌去离子水在8000r/min下离心洗涤15min5次，得到芽孢泥；

X3、将步骤X2得到的芽孢泥重悬在50mL无菌去离子水，调节芽孢悬液OD₆₀₀为1.0，得到芽孢悬液。

实施例2

本实施例提供了一种提高芽孢萌发率的方法，具体步骤如下：

(1)静电场预处理：在37℃下，将枯草芽孢杆菌芽孢悬液放置在距离板状电极30cm处，使用功率为2500V/cm²的静电场处理30min，所述板状电极大小为43×25cm²，得到预处理芽孢悬液；

(2)热激活：将步骤(1)得到的预处理芽孢悬液在75℃热处理30min，得到激活芽孢悬液；

(3)萌发：将步骤(2)得到的激活芽孢悬液在37℃下萌发30min，得到萌发芽孢悬液。

实施例3

本实施例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例2基本相同，区别在于，在步骤(1)中，是将实施例1得到的芽孢悬液放置在距离板状电极50cm处，使用功率为2000V/cm²的静电场处理50min，得到预处理芽孢悬液。

实施例4

本实施例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例2基本相同，区别在于，在步骤(2)中，是将实施例1得到的芽孢悬液在70℃热处理30min，得到激活芽孢悬液。

实施例5

本实施例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例2基本相同，区别在于，在步骤(2)中，是将实施例1得到的芽孢悬液在85℃热处理10min，得到激活芽孢悬液。

实施例6

本实施例提供一种芽孢的制备方法与实施例1基本相同，区别在于，在步骤X1中，使用的菌株为腊样芽孢杆菌。

实施例7

本实施例提供的一种促进芽孢萌发的方法与实施例2基本相同，区别在于，在步骤S1中，使用是实施例6制备得到的芽孢悬液。

对比例1

本对比例提供一种芽孢萌发的方法，具体步骤包括：

(1)热激活：将实施例1得到的芽孢悬液在75℃热处理30min，得到激活芽孢悬液；

(2)芽孢萌发：将步骤(1)得到的激活芽孢悬液在37℃下萌发60min，得到萌发芽孢悬液。

对比例2

本对比例提供一种芽孢萌发的方法，步骤如下：

(1)静电场预处理：在37℃下，将枯草芽孢杆菌芽孢悬液放置在距离板状电极30cm处，使用2500V/cm²功率处理60min，所述板状电极大小为43×25cm²，得到预处理芽孢悬液；

(2)萌发：将步骤(1)得到的激活芽孢悬液在37℃下萌发30min，得到萌发芽孢悬液。

测试例

将实施例和对比例的芽孢萌发量、折光性以及荧光强度进行测试，测试方法分别包括：

芽孢萌发量的测定：分别取1mL实施例1-2和对比例1-2制备的样品，置于9mL0.9％NaCl溶液中梯度稀释，选取合适的梯度涂布至PCA培养基上，在37℃下培养12h后计数以测定芽孢萌发量。芽孢总数约为1.75×10⁶CFU/mL。芽孢萌发率为芽孢萌发数和芽孢总数的比值，结果如图1所示。

折光性的测定：取实施例1-2和对比例1-2制备的样品100μL，分别用紫外分光光度计在波长600nm处测定折光性，结果如图2所示。

2，6-吡啶二羧酸(DPA)的测定：将实施例1-2和对比例1-2制备的样品分别与1.5mL50μmol/L pH5.6的TbCl₃溶液混合，冰浴10min，用荧光分光光度计测定荧光强度，激发波长为270nm，发射波长545nm，结果如图3所示。

数据统计分析：所有的实验重复三次，结果表示为平均值±标准差。实验数据统计采用Statistix8.1软件包中的Linear Models程序，差异显著性(P＜0.05)分析使用TukeyHSD程序进行。需要说明的是，图1-图3中小写字母(a、b、c、d)分别表示不同处理组之间差异显著(P＜0.05)。

结果分析：

如图1所示，实施例1中得到的芽孢悬液中芽孢萌发率仅为19.62％，而对比例1和对比例2的芽孢悬液中萌发的芽孢率分别可达28.38％和24.38％，说明热激活和静电场都能在一定程度上诱导芽孢萌发，但是效果有限。进一步地，采用实施例1制备得到的细菌芽孢悬液再经过静电场预处理-热激活-萌发处理，得到的细菌芽孢的萌发率可达91.43％，显著高于实施例1和对比例1-2(P＜0.05)。这说明热激活处理和静电场处理仅能诱导小部分芽孢萌发，而静电场预处理后再热激活处理能够使大部分芽孢萌发。

芽孢萌发后，OD₆₀₀值呈下降趋势。如图2所示，与实施例1相比，对比例1和对比例2处理的芽孢悬液折光性显著下降(P＜0.05)，而经过静电场处理再热激活处理的实施例2能进一步使芽孢悬液的折光性降低，说明静电场与热处理联用能让更多的芽孢萌发，使其生理状态改变，降低了折光性，从而说明静电场处理与热激活处理对芽孢的萌发具有协同作用。

实施例2和实施例3-5及实施例7分别不同条件的热激活方法和菌株，诱导芽孢萌发后，得到的芽孢悬液的萌发率及折光性结果均相似，这里不再赘述。

进一步地，本发明在上述优选的实施例中分别以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)为例进行了说明，可以推及，本发明采用其他为芽孢杆菌属(Bacillus)细菌也能够实现相同或相似的结果。

芽孢的萌发伴随着DPA的释放。DPA的荧光值越高说明DPA释放的越多。如图3所示，与实施例1相比，实施例2和对比例1-2的芽孢悬液释放的DPA均显著增加(P＜0.05)，施加静电场处理再热激活处理的实施例2芽孢悬液释放的DPA更是显著高于对比例1-2(P＜0.05)。这可能是由于静电场后，负离子环境对芽孢施加高电荷，产生生物电效应，导致pH值的变化、电解引起的过量离子进入细胞内，改变膜内外电动势和产生自由基氧化剂，进而能够影响生物体内的代谢作用和膜电位等，使芽孢对外界环境变化的感知更加敏感。静电场产生的带电粒子流还增强了细胞内膜渗透性，打开了蛋白质通道，使Na+、K+以及Ca-DPA等这些离子更快释放并在膜外积累，刺激未萌发芽孢萌发。经过静电场处理后，更加敏感的芽孢在进一步受到热刺激后更容易打破芽孢休眠状态，萌发形成营养细胞，释放更多的DPA，降低其折光性，提高产芽孢细菌的萌发量，这有利于后续食品中芽孢的杀灭，为食品的贮藏期及其品质风味和营养成分的保持提供了一种新型的、极具实际应用意义的芽孢控制方法。

应说明的是，以上所述仅为本申请的优选实照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对施例而已，并不用于限制本申请，尽管参于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高芽孢萌发率的方法，包括采用静电场对细菌芽孢进行预处理，然后再进行热激活，最后经萌发处理实现所述细菌芽孢的高萌发率。

2.根据权利要求1所述的提高芽孢萌发率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.静电场预处理：采用静电场对所述细菌芽孢悬液进行预处理，得到预处理芽孢悬液；

S2.芽孢热激活：对S1得到的所述预处理芽孢悬液进行热激活，得到激活芽孢悬液；

S3.萌发：将S2得到的所述激活芽孢悬液萌发处理，得到萌发芽孢悬液。

3.根据权利要求1或2所述的提高芽孢萌发率的方法，其特征在于，所述预处理包括将细菌芽孢悬液放置在距离板状电极10～50cm处，在5～85℃下用静电场预处理20～60min。

4.根据权利要求3所述的提高芽孢萌发率的方法，其特征在于，所述静电场的功率为2000～2500V/cm²。

5.根据权利要求1或2所述的提高芽孢萌发率的方法，其特征在于，所述细菌为芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。

6.根据权利要求1或2所述的提高芽孢萌发率的方法，其特征在于，所述热激活的方法包括将所述细菌芽孢悬液在70～85℃热处理10～30min。

7.根据权利要求1或2所述的提高芽孢萌发率的方法，其特征在于，所述萌发处理包括将所述激活芽孢悬液在25～55℃下作用20～60min，得到所述萌发芽孢悬液。

8.根据权利要求2所述的提高芽孢萌发率的方法，其特征在于，步骤S1中所述细菌芽孢悬液的制备方法包括以下步骤：

(1)提供芽孢粗液；将活化的细菌接种至培养基中进行培养后，洗涤并收集得到所述芽孢粗液；

(2)提供芽孢泥；将步骤(1)得到的所述芽孢粗液离心洗涤，得到所述芽孢泥；

(3)制备所述芽孢悬液；将步骤(2)得到的所述芽孢泥重悬后即得到所述细菌芽孢悬液。

9.根据权利要求8所述的提高芽孢萌发率的方法，其特征在于，

步骤(1)中，将所述的活化细菌接至8～12mL含0.3～1.5μmol/L Mn²⁺的营养琼脂培养基中，35～38℃条件下培养6～8d，用2～8mL无菌去离子水振荡、洗涤并收集，得到所述芽孢粗液；

步骤(2)中，所述芽孢粗液用10～30mL无菌去离子水在8000r/min下离心洗涤15min，重复3～6次，得到所述芽孢泥；

步骤(3)中，将所述芽孢泥重悬在30～60mL无菌去离子水，得到所述细菌芽孢悬液。

10.如权利要求1-9任一项所述的提高细菌芽孢萌发率的方法在食品杀菌领域中的应用。