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CN117925814B - Usp-7在制备用于糖尿病性心脏病诊断或风险评估的产品中的应用 - Google Patents

Usp-7在制备用于糖尿病性心脏病诊断或风险评估的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子诊断领域，具体涉及USP‑7在制备用于糖尿病性心脏病诊断或风险评估的产品中的应用。本发明首次发现了USP‑7表达量上调和糖尿病性心肌病之间的相关性，并进一步明确了USP‑7去泛素化调节PGC1β，介导心肌细胞线粒体动力学失衡以及能量代谢障碍，促进糖尿病性心肌病的发生，为临床诊断糖尿病性心肌病提供了标志物。本发明还为USP‑7抑制剂在预防和/或治疗糖尿病性心肌病的应用提供了理论依据，在临床治疗上具有重要意义。

Description

USP-7在制备用于糖尿病性心脏病诊断或风险评估的产品中 的应用
技术领域
本发明属于分子诊断领域，具体涉及USP-7在制备用于糖尿病性心脏病诊断或风险评估的产品中的应用。
背景技术
糖尿病性心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的主要心血管并发症。现有研究表明，心肌细胞线粒体失稳态以及心肌能量代谢障碍是DCM发生发展的关键致病因素。现有研究证实，DCM患者心肌细胞内脂滴聚集、线粒体形态完整性受损以及动力学失衡(表现为线粒体分裂增加、融合减少)、心肌能量代谢障碍，从而导致心肌肥厚以及纤维化等典型病理特征。DCM进展缓慢，往往当心脏表现出某种程度的功能障碍时才能得到诊断，是糖尿病患者死亡的重要原因之一。因此，及时诊断出DCM于临床诊疗意义重大。近年来许多研究聚集于血清生物标志物，为DCM的早期诊断提供了依据。
中国专利申请202310432328.X公开了miR-194-3p在制备治疗糖尿病心肌病的药物中的应用，miR-194-3p过表达可以明显改善糖尿病小鼠的左室舒张功能和小鼠心肌纤维化，显著降低纤维化面积，逆转糖尿病心肌纤维化。
中国专利申请202180054733.1公开了识别具有增加的可能性进展到因糖尿病导致的终末器官损伤的对象的方法，其包含：比较来自所述对象的生物样本中lncRNA的量与参考值，以及如果样本中所述lncRNA的量相对于所述参考值增加，则识别所述对象具有增加的可能性进展到因糖尿病导致的终末器官损伤。
目前本领域需要更多的用于DCM诊断或风险评估的生物标志物。
发明内容
USP-7，又称疱疹病毒相关蛋白酶(herpes virus-associated ubiquitin-specific protease，HAUSP)，是去泛素酶最大亚家族-泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases，USPs)家族的一员。USP-7是一个128kDa的蛋白质，位于染色体16p13.2上。其蛋白主要由N端肿瘤坏死因子(N-terminal tumor necrosis factorreceptor-associated factor，TRAF)样结构域(残基53-206)、催化核心结构域(残基208-560)、C端HAUSP泛素样结构域(残基564-1084)三部分组成。催化核心结构域负责识别并结合泛素，行使催化蛋白质底物去泛素化的功能，是USP-7功能执行的核心结构域。
目前尚未有研究公开USP-7在糖尿病性心脏病诊断或风险评估中的应用。
为了实现上述技术目的，本发明提出了以下技术方案：
在一个方面，本发明提供了USP-7在制备用于糖尿病性心脏病诊断或风险评估的产品中的应用。
在一些实施方式中，所述糖尿病性心脏病包括，但不限于冠心病(coronaryartery disease，CAD)、糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DC)或心脏自主神经病变(cardiac autonomic neuropathy，CAN)。
在一些优选的实施方式，所述糖尿病性心脏病为糖尿病性心肌病。
在一些实施方式中，所述产品包括，但不限于检测试剂、试剂盒或检测系统。
在一些实施方式中，所述检测试剂为针对所述USP-7具有特异性的物质。
在一些实施方式中，所述检测试剂选自以下至少一种或其组合：
特异性结合USP-7蛋白的抗体或其抗原结合片段，优选单克隆抗体；特异性识别USP-7基因或其转录本的探针、基因芯片、引物等；
针对USP-7的化学分析设备，例如质谱、液质联用、测序仪；和/或
用于在基因水平和/或蛋白质水平上检测所述USP-7的物质，如用于选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：免疫组织化学法，如免疫荧光分析、化学发光法、反向酶联免疫吸附、免疫胶体金法；Western印迹法；Northern印迹法；PCR或生物芯片法。
在一些实施方式中，所述试剂盒或检测系统包含所述诊断试剂。
在另一个方面，本发明提供了一种用于糖尿病性心脏病诊断或风险评估的产品，所述产品包括：
用于糖尿病性心脏病诊断或风险评估的检测试剂；
可选地，用于糖尿病性心脏病诊断或风险评估的其他检测试剂。
在一些实施方式中，所述糖尿病性心脏病包括，但不限于冠心病、糖尿病性心肌病或心脏自主神经病变，优选糖尿病性心肌病。
在一些实施方式中，所述检测试剂选自以下至少一种或其组合：
特异性结合USP-7蛋白的抗体或其抗原结合片段，优选单克隆抗体；特异性识别USP-7基因或其转录本的探针、基因芯片、引物等；
针对USP-7的化学分析设备，例如质谱、液质联用、测序仪；和/或
用于在基因水平和/或蛋白质水平上检测所述USP-7的物质，如用于选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：免疫组织化学法，如免疫荧光分析、化学发光法、反向酶联免疫吸附、免疫胶体金法；Western印迹法；Northern印迹法；PCR或生物芯片法。
在一些实施方式中，所述其他检测试剂包括：
针对现有的糖尿病性心脏病诊断或风险评估的标志物的检测试剂，例如针对脂联素、胰岛素样生长因子结合蛋白-7、循环激活素A、白介素-1β等的检测试剂。
在又一个方面，本发明提供了一种用于糖尿病性心脏病诊断或风险评估的检测系统，所述检测系统包括检测装置、计算装置和输出装置。
在一些实施方式中，所述检测装置包括进样器和检测器，所述进样器用于采集来自受试者的样品，所述检测器用于检测USP7蛋白、USP7基因或其转录本的表达水平。
在一些实施方式中，所述计算装置包括存储器和处理器，所述述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：
若所述样品中USP7蛋白、USP7基因或其转录本的表达水平相对于正常对照值提高，则判定受试者罹患糖尿病性心脏病或存在罹患糖尿病性心脏病的风险。
在一些实施方式中，所述计算装置包括电脑主机、中央处理器和网络服务器中的至少一种。
在一些实施方式中，所述输出装置用于输出所述检测装置的检测结果和/或所述计算装置的判别结果。
在一些实施方式中，所述输出装置包括显示器、打印机和音频输出装置中的至少一种。
在一些实施方式中，所述糖尿病性心脏病包括，但不限于冠心病、糖尿病性心肌病或心脏自主神经病变，优选糖尿病性心肌病。
在又一个方面，本发明提供了一种筛选预防和/或治疗糖尿病性心脏病的药物的方法，所述方法包括：
检测药物对受试者样本中的USP-7的影响；
若施用所述药物后，受试者样本中的USP-7蛋白、USP-7基因或其转录本的水平降低，则所述药物对糖尿病性心脏病具有预防和/或治疗效果。
在一些实施方式中，所述糖尿病性心脏病包括，但不限于冠心病、糖尿病性心肌病或心脏自主神经病变，优选糖尿病性心肌病。
在又一个方面，本发明提供了USP-7抑制剂在制备预防和/或治疗糖尿病性心脏病的药物中的应用。
在一些实施方式中，所述糖尿病性心脏病包括，但不限于冠心病、糖尿病性心肌病或心脏自主神经病变。
在一些实施方式中，所述USP-7抑制剂包括，但不限于P22077，USP7-IN-1，GNE-6776，FT-671，FT-827，GNE-3086或P5091。
在一些优选的实施方式中，所述USP-7抑制剂为P5091。
本发明首次发现了USP-7表达量上调和糖尿病性心肌病之间的相关性，并进一步明确了USP-7去泛素化调节PGC1β-PPARα，介导心肌细胞线粒体动力学失衡以及能量代谢障碍，促进糖尿病性心肌病的发生，为临床诊断糖尿病性心肌病提供了标志物。本发明还提供了USP-7抑制剂在预防和/或治疗糖尿病性心肌病提供了理论依据，在临床治疗上具有重要意义。
附图说明
图1示出了不同处理组小鼠心脏组织USP7的mRNA表达变化。
图2示出了不同处理组(对照组和模型组)心脏组织的免疫印迹检测结果，*P<0.05，**P<0.01vs control，n＝3。
图3示出了不同处理组(对照组和PA组)、心肌细胞的免疫印迹检测结果，*P<0.05，**P<0.01vs control，n＝3。
图4为不同处理组超声心动图以及峰E/A峰的代表性图像。
图5示出了不同处理组射血分数(Ejection fraction％，EF％)的变化情况，每组n＝8，数值为平均值±SEM，*P<0.05vs.CTRL，**P<0.01vs.DCM。
图6示出了不同处理组分数缩短率(Fractional shortening％，FS％)的变化情况，每组n＝8，数值为平均值±SEM，*P<0.05vs.CTRL，**P<0.01vs.DCM。
图7示出了不同处理组峰E-峰A(E/A)的变化情况，每组n＝8，数值为平均值±SEM，*P<0.05vs.CTRL，**P<0.01vs.DCM。
图8示出了不同处理组左室收缩末期内径(LVIDd)的变化情况，每组n＝8，数值为平均值±SEM，*P<0.05vs.CTRL**P<0.01vs.DCM。
图9示出了不同处理组左室舒张末期内径(LVIDs)的变化情况，每组n＝8，数值为平均值±SEM，*P<0.05vs.CTRL，**P<0.01vs.DCM。
图10示出了不同处理组小鼠心脏切片WGA、H&E及Masson染色图。比例尺：50μm。
图11示出了不同处理组心脏组织中凋亡相关蛋白(Bcl2、Bax、Cleaved-caspase3)免疫印迹检测结果的代表性图像。
图12-图14示出了不同处理组心脏组织中肥大因子(ANP、BNP、β-HMC)mRNA水平，每组n＝5，数值为平均值±SEM，*P<0.05vs.CTRL**P<0.01vs.DCM。
图15示出了不同处理组心脏组织中PPARα与PGC1β蛋白免疫印迹检测结果的代表性图像。
图16示出了不同处理组心脏组织中Mfn2与Drp1蛋白免疫免疫印迹检测结果的代表性图像。
图17示出了USP7与PGC1β分子对接情况。
图18和图19示出了不同处理组心脏组织中USP7与PGC1β蛋白免疫共沉淀检测结果的代表性图像。
具体实施方式
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物，例如《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室科学出版社)、Ausubel，F.M等人，CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley-lnterscience的出版中也进行了描述。
实施例1USP-7在DCM小鼠心脏组织及糖脂毒性细胞模型中表达升高
首先利用野生型C56BL/6小鼠(购自中国珠海百事通生物科技有限公司)，使用高脂饮食结合小剂量腹腔注射STZ的方式，构建糖尿病小鼠模型，空腹血糖>11.1mmol/L，视为糖尿病构建成功，继续饲养12周。
采用免疫印迹技术及PCR技术验证了DM-12w小鼠左心室USP-7蛋白及mRNA异常升高(图1-2)。
在细胞水平，使用30mM HG培养基或400μM棕榈酸(PA)处理H9C2大鼠心肌细胞系，孵育24h，模拟糖尿病状态下糖脂毒性，免疫印迹WB检测USP-7的表达情况。结果表明，PA组心肌细胞内USP-7的蛋白水平显著升高(图3)。
综合以上结果，USP-7在DCM小鼠心脏组织及糖脂毒性细胞模型中表达升高，可能参与DCM的发生发展。
实施例2USP-7抑制剂P5091可改善糖脂代谢异常诱发的心肌病变
糖尿病小鼠模型构建同实施例1。
为了验证USP-7是否参与调控DCM小鼠心脏功能，采用其小分子化学抑制剂P5091对糖尿病小鼠-心脏功能进行干预，同时采用二甲双胍作为阳性对照药，采用隔天腹腔注射方式，用药12周后，检测小鼠心脏功能。超声心动图显示，P5091及二甲双胍可有效改善糖尿病小鼠左室EF％，FS％，E/A峰值，左室收缩及舒张末期内径(图4-图9)。心脏切片病理染色显示，P5091可抑制DCM小鼠心肌细胞横截面积、改善DCM心肌损伤及胶原生成(图10)。
实施例3USP-7介导DCM心肌细胞凋亡
糖尿病小鼠模型构建同实施例1。
为了验证USP-7是否参与调控DCM小鼠心肌细胞凋亡，采用其小分子化学抑制剂P5091对糖尿病小鼠-心脏功能进行干预，同时采用二甲双胍作为阳性对照药，采用隔天腹腔注射方式，用药12周后，检测小鼠心脏凋亡相关蛋白表达。蛋白免疫印迹检测结果显示，P5091及二甲双胍可有效逆转糖尿病小鼠心脏中Bcl2、Bax、Cleaved-caspase3的蛋白表达水平(图11)。qRT-PCR结果显示，P5091可改善糖尿病小鼠心脏心肌肥大(图12-图14)。
实施例4USP-7调控PCG1β-PPARα的蛋白表达
过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPARα)是一种配体激活的转录因子，属于核受体家族。PPAR-α调控脂肪酸β-氧化相关基因的表达，是能量稳态的主要调节因子。PPAR-α通过PGC1β激活能增加细胞脂肪酸的摄取、酯化和运输，并调节脂蛋白代谢基因，同时通过控制脂肪酸运输、脂肪酸氧化和生酮来调控心脏中心肌细胞的能量代谢。研究表明，心脏特异性过表达PPARα的糖尿病小鼠模型中，心肌细胞PPARα通过介导脂肪酸摄取和FAO相关蛋白的基因的表达，导致脂肪酸摄取和FAO之间的平衡失调，引起线粒体毒性脂质积累、ROS过度生成、线粒体解偶联和线粒体裂变，导致左心室功能障碍和脂毒性心肌病的发生。
前期研究中，发明人发现USP-7特异性抑制剂P5091可抑制糖尿病小鼠心肌细胞内PPARα、PGC1β的蛋白表达，并可抑制心肌线粒体分裂蛋白Drp1，促进线粒体融合蛋白Mfn-2的表达(图15和图16)。发明人进一步采用RCSB PDB数据库及pymol软件对人源性USP-7与人源性PGC1β进行模拟分子对接，发现USP-7蛋白通与PGC1β蛋白有5个氨基酸位点形成氢键，且结合位点位于USP-7执行去泛素化功能的催化核心结构域内(图17)。同时CO-IP结果表明，USP-7通过调控PGC1β蛋白的去泛素化过程，介导心肌细胞的能量代谢障碍(图18和图19)。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.USP-7在制备用于糖尿病性心肌病诊断或风险评估的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测试剂、试剂盒或检测系统。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为针对USP-7具有特异性的物质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述针对USP-7具有特异性的物质选自特异性结合USP-7蛋白的抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异性结合USP-7蛋白的抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述针对USP-7具有特异性的物质选自特异性识别USP-7基因或其转录本的探针、基因芯片或引物。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述针对USP-7具有特异性的物质选自用于在基因水平和/或蛋白质水平上检测所述USP-7的物质。
8.USP-7抑制剂在制备预防和/或治疗糖尿病性心肌病的药物中的应用，其特征在于，所述的USP-7抑制剂为P5091。
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