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CN117903997B - 一种马红球菌选择性分离培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

一种马红球菌选择性分离培养基及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117903997B
CN117903997B CN202410206856.8A CN202410206856A CN117903997B CN 117903997 B CN117903997 B CN 117903997B CN 202410206856 A CN202410206856 A CN 202410206856A CN 117903997 B CN117903997 B CN 117903997B
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Abstract

本发明公开了一种马红球菌选择性分离培养基及其制备方法和应用，属于微生物技术及环境微生物学领域。培养基组成为：可溶性淀粉、丙酮酸、乙酸钠、酸水解酪蛋白、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硝酸钾、硫酸锌、硫酸锰、七水硫酸镁、柠檬酸铁铵、亚碲酸钾、琼脂、甲氧苄啶、头孢哌酮、多粘菌素B、环己酰亚胺，本发明的选择性分离培养基对马红球菌的选择性分离效果好，不仅能提高马红球菌的数量，同时还能减少平板上其他微生物的数量与种类，还包括马红球菌选择性分离培养基的应用。

Description

一种马红球菌选择性分离培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术及环境微生物学领域，具体涉及一种马红球菌选择性分离培养基及其制备方法和应用。
背景技术
马红球菌（Rhodococcus equi）是兽医学公认的细菌性病原体，是放线菌类诺卡氏菌科（Nocardiaceae）红球菌属（Rhodococcus sp.）的一种革兰氏阳性专性需氧菌，生长形态随生长条件和生长周期的变化而变化。其广泛分布于自然界，特别是土壤和草食动物粪便中，在马匹养殖环境中存在大量马红球菌菌株。受其感染的马驹会发生严重的慢性化脓性支气管肺炎，并且发病后死亡率较高，导致马匹养殖业的巨大损失。虽然罕见，但在其他哺乳动物的感染中也偶有发生，多见于人类免疫缺陷病毒感染患者等免疫功能低下人群，主要临床症状有发热、头痛、乏力等。
将马红球菌在血平板上37 ℃下培养，该菌增殖缓慢，其菌落较小且湿润、光滑，半透明并呈黏液状，能产生特征性的桔红色色素。在羊血琼脂平板上培养的马红球菌能与金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌发生协同溶血（CAMP试验阳性），在马红球菌分离株中广泛存在亚胺硫霉素与其他β-内酰胺类抗生素之间的拮抗作用。
马红球菌一般宿存于土壤和马驹肠道内，如何从土壤中准确筛选马红球菌是马场内有效监测马红球菌感染的重要手段，目前培养马红球菌并观察其菌落形态一般应用哥伦比亚血琼脂平板，然而马红球菌在该培养基上生长缓慢，菌落较小，动物养殖区域的土壤中存在大量细菌及真菌等微生物和腐殖质，国内市场上目前尚无马红球菌的选择性分离培养基，无法从存在大量其他细菌等微生物的检测样品中准确分离到马红球菌。为进一步加强实验室对该病菌的认识，减少马场的马红球菌感染，亟待研发出一款有效满足马红球菌生长、代谢、繁殖的培养基，这对及时监测马场环境中马红球菌的变化，有助于发现新的治疗药物，从而加强对马红球菌的生态学研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高马红球菌在动物养殖区域土壤中的分离率的马红球菌选择性分离培养基及其制备方法和应用，该培养基通过优化马红球菌选择性分离培养基中碳源、氮源、抗生素等营养成分，进而制备出适用于从土壤中筛选分离马红球菌的培养基，为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种马红球菌选择性分离培养基，所述马红球菌选择性分离培养基组成为：碳源、氮源、抗生素、氯化钙0.005～0.015g/L、磷酸二氢钾0.3～0.5g/L、磷酸氢二钠0.5～1.0g/L、硝酸钾0.05～0.15g/L、硫酸锌0.01～0.02g/L、硫酸锰0.01～0.03g/L、七水硫酸镁0.1～0.2g/L、柠檬酸铁铵0.03～0.07g/L、亚碲酸钾0.01～0.02g/L、琼脂16～18g/L；
所述碳源组成为：可溶性淀粉1～5g/L、丙酮酸1～5g/L、乙酸钠1～5g/L；
所述氮源组成为：酸水解酪蛋白10～25g/L、牛肉浸粉1～10g/L、酵母浸粉1～5g/L；
所述抗生素组成为：甲氧苄啶1～10mg/L、头孢哌酮1～10mg/L、多粘菌素B 1～10mg/L、环己酰亚胺50～200mg/L。
一种马红球菌选择性分离培养基的制备方法，其特征在于，称取1～5g可溶性淀粉、1～5g丙酮酸、1～5g乙酸钠、10～25g酸水解酪蛋白、1～10g牛肉浸粉、1～5g酵母浸粉、0.005～0.015g氯化钙、0.3～0.5g磷酸二氢钾、0.5～1.0g磷酸氢二钠、0.05～0.15g硝酸钾、0.01～0.02g硫酸锌、0.01～0.03g硫酸锰、0.1～0.2g七水硫酸镁、0.03～0.07g柠檬酸铁铵、0.01～0.02g亚碲酸钾、16～18g琼脂，溶解于去离子水中，定容至1000 mL，并以碳酸钠和柠檬酸调整PH至7.5～7.6，121 ℃高压灭菌15分钟，冷却至50 ℃，加入1～10mg甲氧苄啶、1～10mg头孢哌酮、1～10mg多粘菌素B和50～200mg环己酰亚胺并混匀，无菌灌装至90mm无菌培养皿中，制得所述马红球菌选择性分离培养基。
所述马红球菌选择性分离培养基应用于马红球菌在动物养殖区域土壤中的分离，即微生物为马红球菌（Rhodococcus equi）。
培养温度为30 ℃。
培养时间为48～72 h。
马红球菌选择性分离培养基的应用方法为：
（1）将采集的土样放置于无菌平皿中自然干燥，用无菌研杵研磨成粉末状；
（2）称取1g土壤样品，添加到10 mL 2%草酸中，在180 r·min-1的摇床中振荡20min，自然沉淀5 min；
（3）倾倒上清液，以3000 rpm离心5 min；
（4）将沉积物悬浮在5 mL 1%无菌蛋白胨水中，吸取1 mL土壤悬液至9 mL无菌水中，进行10倍梯度稀释至浓度为1g·L-1；
（5）取200μL涂布于分离培养基平皿上，置于30 ℃恒温培养箱中培养。
本发明提供的马红球菌选择性分离培养基用于非疾病诊断目的的马红球菌的富集培养和分离筛选。
本发明的有益效果是：
（1）本发明所提供的培养基采用的原材料廉价易得，经济成本较低，而且经过多次试验，优化了培养基的营养成分，适量添加了马红球菌正常生长所需的微量元素，不仅满足马红球菌的营养需求，使得马红球菌菌落形态更具特征，而且可以增加菌种分离过程中特定菌株的生长速度，缩短分离时间，提高分离效率，可实现马红球菌的富集培养，从而满足马场环境中的马红球菌生长、代谢和繁殖，有助于提高对养殖环境中马红球菌的检测和监测能力，有益于养马场等动物养殖区域的马红球菌感染问题防控；
（2）利用土壤中不同微生物对不同药剂药敏程度的差异，向培养基中添加对马红球菌抑制作用较弱，而对肠杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、沙门菌属等多种细菌和青霉、曲霉等某些真菌抑制作用较强的抗生素，从而使马红球菌生长而环境中的杂菌生长缓慢或不生长，能有效提高从土壤中分离马红球菌的成功率，大大节约操作时间；
（3）本发明所述的马红球菌选择性分离培养基配制时，除抗生素以外的组分混合后加热灭菌冷却后再加入甲氧苄啶等抗生素，不会破坏抗生素的基本结构和性质，从而使得培养基能够较好的抑制其它杂菌；
（4）本发明的培养基配制过程操作简便，制作所需时间短，无需复杂的配套设备，能降低实际生产过程中的人力物力，实践操作可行性强，使用便捷性较高；
（5）本发明的培养基应用于从土壤样品中分离马红球菌时，将待检样品初步用2 %浓度的草酸处理，通过影响土壤的酸碱平衡，能够初步消除土壤中的杂菌、金属离子及腐殖质，而马红球菌对草酸环境有较强耐受力，从而提高了马红球菌在样品中的生物量。
附图说明
图1为实施例1-4中选择性分离培养基对马红球菌的回收率对比图；
图2为实施例1-4中马红球菌在选择性培养基中的生长曲线对比图；
图3为实施例1-4的选择性培养基对非马红球菌的生长抑制能力对比图；
图4为实施例1-4中应用选择性培养基从土壤中筛选马红球菌效果对比图。
具体实施方式
以下将描述三个实施例来更清晰的显示本发明的技术方案和优势。通过调整本发明的培养基的营养组成，使用计数回收、生长曲线试验等方法，从培养基的促生长能力、对非马红球菌的抑制能力几方面评估其选择性分离效果。
以下实施例中的土壤样品均来自于当地同一马匹养殖场，在养殖场内马匹生存的区域采集表层土样，土壤样品采集后用冰袋和冰盒保存，并立即带回实验室进行处理。
以下实施例所使用的标准菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，所使用的仪器和试剂均为市售常规产品。
表 1 实验用参考菌株
菌名 菌号
马红球菌 CGMCC1.6322
嗜粪红球菌 CGMCC4.1813
马链球菌 CGMCC1.10838
粪肠球菌 CGMCC1.125
金黄色葡萄球菌 CGMCC1.4519
铜绿假单胞菌 CGMCC1.1785
枯草芽孢杆菌 CGMCC1.439
白色链霉菌 CGMCC4.7658
土曲霉 CGMCC3.3934
产黄青霉 CGMCC3.15539
异丝腐霉 CGMCC3.17815
1.培养基配方：
每升培养基所含：碳源、氮源、抗生素、氯化钙0.005～0.015g、磷酸二氢钾0.3～0.5g、磷酸氢二钠0.5～1.0g、硝酸钾0.05～0.15g、硫酸锌0.01～0.02g、硫酸锰0.01～0.03g、七水硫酸镁0.1～0.2g、柠檬酸铁铵0.03～0.07g、亚碲酸钾0.01～0.02g、琼脂16～18g；
其中碳源组成为：可溶性淀粉1～5g/L、丙酮酸1～5g/L、乙酸钠1～5g/L；可溶性淀粉、丙酮酸和乙酸钠提供马红球菌生长所需的碳源；
氮源组成为：酸水解酪蛋白10～25g/L、牛肉浸粉1～10g/L、酵母浸粉1～5g/L；酸水解酪蛋白、牛肉浸粉和酵母浸粉为马红球菌的生长提供氮源、维生素和氨基酸；
抗生素组成为：甲氧苄啶1～10mg/L、头孢哌酮1～10mg/L、多粘菌素B 1～10mg/L、环己酰亚胺50～200mg/L。甲氧苄啶能干扰细菌的叶酸代谢，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性细菌都有抑制作用，头孢哌酮属一种广谱抗生素，对常见的如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、β-溶血性链球菌及大肠杆菌等均有较好的抗菌活性，多粘菌素B对绿脓杆菌、克雷伯氏杆菌等革兰阴性杆菌有抑制作用，环己酰亚胺则对真菌有显著的抑制作用。
2.配制培养基
本发明固体培养基的制备：称取1～5g可溶性淀粉、1～5g丙酮酸、1～5g乙酸钠、10～25g酸水解酪蛋白、1～10g牛肉浸粉、1～5g酵母浸粉、0.005～0.015g氯化钙、0.3～0.5g磷酸二氢钾、0.5～1.0g磷酸氢二钠、0.05～0.15g硝酸钾、0.01～0.02g硫酸锌、0.01～0.03g硫酸锰、0.1～0.2g七水硫酸镁、0.03～0.07g柠檬酸铁铵、0.01～0.02g亚碲酸钾、16～18g琼脂，溶解于去离子水中，定容至1000 mL，并以碳酸钠和柠檬酸调整PH至7.5～7.6，121 ℃、105 kPa灭菌15分钟，冷却至50 ℃，加入1～10mg甲氧苄啶、1～10mg头孢哌酮、1～10mg多粘菌素B和50～200mg环己酰亚胺并混匀，无菌灌装至90 mm无菌培养皿中，制得固体马红球菌选择性分离培养基。
本发明液体培养基的制备：称取1～5g可溶性淀粉、1～5g丙酮酸、1～5g乙酸钠、10～25g酸水解酪蛋白、1～10g牛肉浸粉、1～5g酵母浸粉、0.005～0.015g氯化钙、0.3～0.5g磷酸二氢钾、0.5～1.0g磷酸氢二钠、0.05～0.15g硝酸钾、0.01～0.02g硫酸锌、0.01～0.03g硫酸锰、0.1～0.2g七水硫酸镁、0.03～0.07g柠檬酸铁铵、0.01～0.02g亚碲酸钾，溶解于去离子水中，定容至1000 mL，并以碳酸钠和柠檬酸调整PH至7.5～7.6，121 ℃、105kPa灭菌15分钟，冷却至50 ℃，加入1～10mg甲氧苄啶、1～10mg头孢哌酮、1～10mg多粘菌素B和50～200mg环己酰亚胺并混匀，制得液体马红球菌选择性分离培养基。
3.接种并培养
（1）标准菌株回收率实验：将活化后的马红球菌菌株用无菌NaCl溶液逐级稀释至不大于100 cfu·mL-1，涂布至TSA和所述马红球菌选择性分离培养基，在两种培养基上分别涂布3个平皿，30 ℃培养48～72 h，观察菌种生长情况，并点计数菌落，计算回收率；
回收率=（选择性分离培养基菌落数/TSA菌落数）×100%
（2）将活化后的马红球菌菌株用0.9 %无菌NaCl溶液逐级稀释至约105 cfu·mL-1，将20μL菌液与180μL 选择性液体培养基混合，置于生长曲线仪中，30 ℃培养至72 h，读取培养孔OD 600值，绘制生长曲线；
（3）选择性培养基的抑制能力：以土壤中常见的微生物嗜粪红球菌、马链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、土霉菌、产黄青霉和异丝腐霉作为检测培养基抑制其他微生物生长能力的试验菌株，将活化后的所述菌株各约104 cfu接种于选择性分离培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中培养72 h，观察是否有菌落出现；
（4）马红球菌选择性分离培养基实际应用方法：将采集的土样放置于无菌平皿中自然干燥，用无菌研杵研磨成粉末状，称取1g土壤样品，添加到10 mL 2%草酸中，在180 r·min-1的摇床中振荡20 min，自然沉淀5 min，倾倒上清液，以3000 rpm离心5 min，将沉积物悬浮在5 mL 1%无菌蛋白胨水中，吸取1 mL土壤悬液至9 mL无菌水中，进行10倍梯度稀释至浓度为1 g·L-1，取200μL涂布于分离培养基平皿上，置于30 ℃恒温培养箱中培养。
本发明所述马红球菌选择性分离培养基在实际应用时，将采集的土样用无菌研杵研磨，可以使土壤样品与草酸充分接触，在后续的振荡过程中草酸通过影响土壤的酸碱平衡，能够初步消除土壤中的杂菌、金属离子及腐殖质，而马红球菌对草酸环境有较强耐受力，能够提高马红球菌在样品中的生物量，土壤悬液经离心并稀释至一定浓度后，马红球菌的浓度比较适中，涂布在选择性分离培养基上的生长数量计数方便，菌落易观察。
马红球菌选择性分离培养基可以制作固体，也可以制作液体，以下实施例中均按照固体的制作方式进行描述。
实施例1
本实施例提供一种马红球菌选择性分离培养基。
1.培养基配方如下：
每升培养基所含：可溶性淀粉1.5g、丙酮酸2g、乙酸钠1.85g、酸水解酪蛋白17.5g、牛肉浸粉6g、酵母浸粉4g、氯化钙0.01g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钠0.73g、硝酸钾0.1g、硫酸锌0.016g、硫酸锰0.022g、七水硫酸镁0.12g、柠檬酸铁铵0.054g、亚碲酸钾0.015g、琼脂17g；添加剂为甲氧苄啶5.8mg、头孢哌酮6.75mg、多粘菌素B 6.45mg、环己酰亚胺90mg。
2.配制培养基
称取可溶性淀粉1.5g、丙酮酸2g、乙酸钠1.85g、酸水解酪蛋白17.5g、牛肉浸粉6g、酵母浸粉4g、氯化钙0.01g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钠0.73g、硝酸钾0.1g、硫酸锌0.016g、硫酸锰0.022g、七水硫酸镁0.12g、柠檬酸铁铵0.054g、亚碲酸钾0.015g、琼脂17g，溶解于去离子水中，定容至1000 mL，并以碳酸钠和柠檬酸调整PH至7.5～7.6，121 ℃、105kPa灭菌15分钟，冷却至50 ℃，加入甲氧苄啶5.8mg、头孢哌酮6.75mg、多粘菌素B 6.45mg、环己酰亚胺90mg并混匀，无菌灌装至90 mm无菌培养皿中，制得马红球菌选择性分离培养基。
3.接种并培养
（1）将活化后的马红球菌菌株用无菌NaCl溶液逐级稀释至不大于100 cfu·mL-1，涂布至TSA和分离培养基上，在两种培养基上分别涂布3个平皿，30 ℃培养48～72 h，观察菌种生长情况，并点计数菌落，取平均值计算回收率；
回收率=（选择性分离培养基菌落数/TSA菌落数）×100%
（2）将活化后的马红球菌菌株用0.9 %无菌NaCl溶液逐级稀释至约105 cfu·mL-1，将20μL菌液与180μL 选择性液体培养基混合，置于生长曲线仪中，30 ℃培养至72 h，读取培养孔OD 600值，绘制生长曲线；
（3）以嗜粪红球菌、马链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、土霉菌、产黄青霉和异丝腐霉作为检测培养基抑制其他微生物生长能力的试验菌株，将活化后的所述菌株各约104 cfu接种于选择性分离培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中培养72 h，观察是否有菌落出现；
（4）马红球菌选择性分离培养基实际应用方法：将采集的土样放置于无菌平皿中自然干燥，用无菌研杵研磨成粉末状，称取1g土壤样品，添加到10 mL 2%草酸中，在180 r·min-1的摇床中振荡20 min，自然沉淀5 min，倾倒上清液，以3000 rpm离心5 min，将沉积物悬浮在5 mL 1%无菌蛋白胨水中，吸取1 mL土壤悬液至9 mL无菌水中，进行10倍梯度稀释至浓度为1 g·L-1，取200μL涂布于分离培养基平皿上，置于30 ℃恒温培养箱中培养。
实施例2
本实施例提供一种马红球菌选择性分离培养基。
1.培养基配方如下：
每升培养基所含：可溶性淀粉4.5g、丙酮酸4.46g、乙酸钠4.85g、酸水解酪蛋白24g、牛肉浸粉9.2g、酵母浸粉4.9g、氯化钙0.015g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钠0.95g、硝酸钾0.148g、硫酸锌0.019g、硫酸锰0.028g、七水硫酸镁0.195g、柠檬酸铁铵0.06g、亚碲酸钾0.018g、琼脂17g；添加剂为甲氧苄啶10mg、头孢哌酮9.25mg、多粘菌素B 9.5mg、环己酰亚胺190mg。
2.配制培养基
称取可溶性淀粉4.5g、丙酮酸4.46g、乙酸钠4.85g、酸水解酪蛋白24g、牛肉浸粉9.2g、酵母浸粉4.9g、氯化钙0.015g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钠0.95g、硝酸钾0.148g、硫酸锌0.019g、硫酸锰0.028g、七水硫酸镁0.195g、柠檬酸铁铵0.06g、亚碲酸钾0.018g、琼脂17g，溶解于去离子水中，定容至1000 mL，并以碳酸钠和柠檬酸调整PH至7.5～7.6，121℃、105 kPa灭菌15分钟，冷却至50 ℃，加入甲氧苄啶10mg、头孢哌酮9.25mg、多粘菌素B9.5mg、环己酰亚胺190mg并混匀，无菌灌装至90 mm无菌培养皿中，制得马红球菌选择性分离培养基。
3.接种并培养
（1）将活化后的马红球菌菌株用无菌NaCl溶液逐级稀释至不大于100 cfu·mL-1，涂布至TSA和分离培养基上，在两种培养基上分别涂布3个平皿，30 ℃培养48～72 h，观察菌种生长情况，并点计数菌落，取平均值计算回收率；
回收率=（选择性分离培养基菌落数/TSA菌落数）×100%
（2）将活化后的马红球菌菌株用0.9 %无菌NaCl溶液逐级稀释至约105 cfu·mL-1，将20μL菌液与180μL 选择性液体培养基混合，置于生长曲线仪中，30 ℃培养至72 h，读取培养孔OD 600值，绘制生长曲线；
（3）以嗜粪红球菌、马链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、土霉菌、产黄青霉和异丝腐霉作为检测培养基抑制其他微生物生长能力的试验菌株，将活化后的所述菌株各约104 cfu接种于选择性分离培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中培养72 h，观察是否有菌落出现；
（4）马红球菌选择性分离培养基实际应用方法：将采集的土样放置于无菌平皿中自然干燥，用无菌研杵研磨成粉末状，称取1g土壤样品，添加到10 mL 2%草酸中，在180 r·min-1的摇床中振荡20 min，自然沉淀5 min，倾倒上清液，以3000 rpm离心5 min，将沉积物悬浮在5 mL 1%无菌蛋白胨水中，吸取1 mL土壤悬液至9 mL无菌水中，进行10倍梯度稀释至浓度为1 g·L-1，取200μL涂布于分离培养基平皿上，置于30 ℃恒温培养箱中培养。
实施例3
本实施例提供一种马红球菌选择性分离培养基。
1.培养基配方如下：
每升培养基所含：可溶性淀粉3g、丙酮酸4g、乙酸钠3.15g、酸水解酪蛋白11.5g、牛肉浸粉9g、酵母浸粉2.5g、氯化钙0.01g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钠0.65g、硝酸钾0.1g、硫酸锌0.015g、硫酸锰0.02g、七水硫酸镁0.14g、柠檬酸铁铵0.05g、亚碲酸钾0.014g、琼脂17g；添加剂为甲氧苄啶2.15mg、头孢哌酮9.45mg、多粘菌素B 8.75mg、环己酰亚胺60 mg。
2.配制培养基
称取可溶性淀粉3g、丙酮酸4g、乙酸钠3.15g、酸水解酪蛋白11.5g、牛肉浸粉9g、酵母浸粉2.5g、氯化钙0.01g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钠0.65g、硝酸钾0.1g、硫酸锌0.015g、硫酸锰0.02g、七水硫酸镁0.14g、柠檬酸铁铵0.05g、亚碲酸钾0.014g、琼脂17g，溶解于去离子水中，定容至1000 mL，并以碳酸钠和柠檬酸调整PH至7.5～7.6，121 ℃、105kPa灭菌15分钟，冷却至50 ℃，加入甲氧苄啶2.15mg、头孢哌酮9.45mg、多粘菌素B 8.75mg、环己酰亚胺60mg并混匀，无菌灌装至90 mm无菌培养皿中，制得马红球菌选择性分离培养基。
3.接种并培养
（1）将活化后的马红球菌菌株用无菌NaCl溶液逐级稀释至不大于100 cfu·mL-1，涂布至TSA和分离培养基上，在两种培养基上分别涂布3个平皿，30 ℃培养48～72 h，观察菌种生长情况，并点计数菌落，取平均值计算回收率；
回收率=（选择性分离培养基菌落数/TSA菌落数）×100%
（2）将活化后的马红球菌菌株用0.9 %无菌NaCl溶液逐级稀释至约105cfu·mL-1，将20μL菌液与180μL 选择性液体培养基混合，置于生长曲线仪中，30 ℃培养至72 h，读取培养孔OD 600值，绘制生长曲线；
（3）以嗜粪红球菌、马链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、土霉菌、产黄青霉和异丝腐霉作为检测培养基抑制其他微生物生长能力的试验菌株，将活化后的所述菌株各约104 cfu接种于选择性分离培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中培养72 h，观察是否有菌落出现；
（4）马红球菌选择性分离培养基实际应用方法：将采集的土样放置于无菌平皿中自然干燥，用无菌研杵研磨成粉末状，称取1g土壤样品，添加到10 mL 2%草酸中，在180 r·min-1的摇床中振荡20 min，自然沉淀5 min，倾倒上清液，以3000 rpm离心5 min，将沉积物悬浮在5 mL 1%无菌蛋白胨水中，吸取1 mL土壤悬液至9 mL无菌水中，进行10倍梯度稀释至浓度为1 g·L-1，取200μL涂布于分离培养基平皿上，置于30 ℃恒温培养箱中培养。
实施例4
本实施例提供一种马红球菌选择性分离培养基。
1.培养基配方如下：
每升培养基所含：可溶性淀粉1.25g、丙酮酸1.2g、乙酸钠1.1g、酸水解酪蛋白11.8g、牛肉浸粉1.75g、酵母浸粉1.5g、氯化钙0.006g、磷酸二氢钾0.32g、磷酸氢二钠0.55g、硝酸钾0.06g、硫酸锌0.011g、硫酸锰0.012g、七水硫酸镁0.114g、柠檬酸铁铵0.035g、亚碲酸钾0.012g、琼脂17g；添加剂为甲氧苄啶1.5mg、头孢哌酮1.8mg、多粘菌素B2mg、环己酰亚胺70mg。
2.配制培养基
称取可溶性淀粉1.25g、丙酮酸1.2g、乙酸钠1.1g、酸水解酪蛋白11.8g、牛肉浸粉1.75g、酵母浸粉1.5g、氯化钙0.006g、磷酸二氢钾0.32g、磷酸氢二钠0.55g、硝酸钾0.06g、硫酸锌0.011g、硫酸锰0.012g、七水硫酸镁0.114g、柠檬酸铁铵0.035g、亚碲酸钾0.012g、琼脂17g，溶解于去离子水中，定容至1000 mL，并以碳酸钠和柠檬酸调整PH至7.5～7.6，121℃、105 kPa灭菌15分钟，冷却至50 ℃，加入甲氧苄啶1.5mg、头孢哌酮1.8mg、多粘菌素B2mg、环己酰亚胺70mg并混匀，无菌灌装至90 mm无菌培养皿中，制得马红球菌选择性分离培养基。
3.接种并培养
（1）将活化后的马红球菌菌株用无菌NaCl溶液逐级稀释至不大于100 cfu·mL-1，涂布至TSA和分离培养基上，在两种培养基上分别涂布3个平皿，30 ℃培养48～72 h，观察菌种生长情况，并点计数菌落，取平均值计算回收率；
回收率=（选择性分离培养基菌落数/TSA菌落数）×100%
（2）将活化后的马红球菌菌株用0.9 %无菌NaCl溶液逐级稀释至约105cfu·mL-1，将20μL菌液与180μL 选择性液体培养基混合，置于生长曲线仪中，30 ℃培养至72 h，读取培养孔OD 600值，绘制生长曲线；
（3）以嗜粪红球菌、马链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、土霉菌、产黄青霉和异丝腐霉作为检测培养基抑制其他微生物生长能力的试验菌株，将活化后的所述菌株各约104 cfu接种于选择性分离培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中培养72 h，观察是否有菌落出现；
（4）马红球菌选择性分离培养基实际应用方法：将采集的土样放置于无菌平皿中自然干燥，用无菌研杵研磨成粉末状，称取1g土壤样品，添加到10 mL 2%草酸中，在180 r·min-1的摇床中振荡20 min，自然沉淀5 min，倾倒上清液，以3000 rpm离心5 min，将沉积物悬浮在5 mL 1%无菌蛋白胨水中，吸取1 mL土壤悬液至9 mL无菌水中，进行10倍梯度稀释至浓度为1 g·L-1，取200μL涂布于分离培养基平皿上，置于30 ℃恒温培养箱中培养。
如图1所示，实施例1-4的选择性分离培养基的回收率平均值分别为91%、66%、81%、62%，上述结果表明，实施例1-4的选择性分离培养基对马红球菌的回收率均高于50%，但相较于实施例2-4，实施例1中的培养基回收率优势显著。马红球菌在实施例1-4的培养基中均生长良好，实施例1中的液体培养基的生长曲线的斜率均略大于实施例2-4，提示马红球菌在实施例1中的液体培养基生长速率更快，在更短的时期内达到稳定期。作为检测培养基抑制能力的试验菌株嗜粪红球菌、马链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、土霉菌、产黄青霉和异丝腐霉在选择性培养基上均未生长，表明实施例1-4的选择性培养基均能在一定程度上达到抑制能力要求。当从高度污染的来源中分离马红球菌时，选择性介质的使用是非常重要的，如图4所示，在实施例1-4的选择性培养基上，实施例1的培养基能够很好的抑制污染菌群，并且马红球菌在该培养基上的菌落形态更具特征性（有光泽、光滑、湿润），马红球菌有更大数量的生长，而实施例3的培养基上只观察到马红球菌较弱的生长。实施例2和实施例4的培养基比实施例3的培养基有更少数量的马红球菌生长，并且马红球菌在该实施例的培养基上的回收率较低。
综上所述，本发明根据马红球菌的生长需求与特性对其培养基配方调整优化，形成马红球菌选择性分离培养基，通过马红球菌在选择性培养基上的回收、生长曲线及生长菌落表型特征，以及非马红球菌在选择性培养基上的生长情况，对给出的实施例1-4中的选择性培养基进行比较，实施例1的选择性培养基具备更佳的促马红球菌生长能力，且能达到相应的抑制能力，所以实施例1为本发明的最佳实施例。本发明的马红球菌选择性分离培养基能有效检测马场养殖环境中马红球菌的存在情况，可以应用于马红球菌富集培养、分离筛选、数量检测等，对于马场等动物养殖区域的马红球菌感染问题防控具有重要价值。
最后应当说明的是，以上实施例仅是本发明的部分实施例，而并非对本发明保护范围的限制，本领域普通技术人员在不脱离本发明原理的前提下所作出的若干改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种马红球菌选择性分离培养基，其特征在于，所述马红球菌选择性分离培养基组成为：碳源、氮源、抗生素、氯化钙0.005～0.015g/L、磷酸二氢钾0.3～0.5g/L、磷酸氢二钠0.5～1.0g/L、硝酸钾0.05～0.15g/L、硫酸锌0.01～0.02g/L、硫酸锰0.01～0.03g/L、七水硫酸镁0.1～0.2g/L、柠檬酸铁铵0.03～0.07g/L、亚碲酸钾0.01～0.02g/L、琼脂16～18g/L；
所述碳源组成为：可溶性淀粉1～5g/L、丙酮酸1～5g/L、乙酸钠1～5g/L；
所述氮源组成为：酸水解酪蛋白10～25g/L、牛肉浸粉1～10g/L、酵母浸粉1～5g/L；
所述抗生素组成为：甲氧苄啶1～10mg/L、头孢哌酮1～10mg/L、多粘菌素B 1～10mg/L、环己酰亚胺50～200mg/L。
2.一种配制如权利要求1所述的马红球菌选择性分离培养基的方法，其特征在于，称取1～5g可溶性淀粉、1～5g丙酮酸、1～5g乙酸钠、10～25g酸水解酪蛋白、1～10g牛肉浸粉、1～5g酵母浸粉、氯化钙0.005～0.015g/L、磷酸二氢钾0.3～0.5g/L、磷酸氢二钠0.5～1.0g/L、硝酸钾0.05～0.15g/L、硫酸锌0.01～0.02g/L、硫酸锰0.01～0.03g/L、七水硫酸镁0.1～0.2g/L、柠檬酸铁铵0.03～0.07g/L、亚碲酸钾0.01～0.02g/L、琼脂16～18g/L，溶解于去离子水中，定容至1000 mL，并以碳酸钠调整PH至7.5～7.6，121 ℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃，加入1～10mg甲氧苄啶、1～10mg头孢哌酮、1～10mg多粘菌素B和50～200mg环己酰亚胺并混匀，无菌灌装至90 mm无菌培养皿中，制得所述马红球菌选择性分离培养基。
3.根据权利要求1所述的马红球菌选择性分离培养基的应用，其特征在于，所述马红球菌选择性分离培养基应用于马红球菌在动物养殖区域土壤中的分离。
4.根据权利要求3所述的马红球菌选择性分离培养基的应用，其特征在于，所述分离培养基培养马红球菌的培养温度为30 ℃。
5.根据权利要求3所述的马红球菌选择性分离培养基的应用，其特征在于，所述分离培养基培养马红球菌的培养时间为48～72 h。
6.一种应用如权利要求1所述的马红球菌选择性分离培养基的方法，其特征在于，
（1）将采集的土样放置于无菌平皿中自然干燥，用无菌研杵研磨成粉末状；
（2）称取1g土壤样品，添加到10 mL 2%草酸中，在180 r·min-1的摇床中振荡20 min，自然沉淀5 min；
（3）倾倒上清液，以3000 rpm离心5 min；
（4） 将沉积物悬浮在5 mL 1%无菌蛋白胨水中，吸取1 mL土壤悬液至9 mL无菌水中，进行10倍梯度稀释至浓度为1g·L-1；
（5）取200μL涂布于分离培养基平皿上，置于30 ℃恒温培养箱中培养。
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