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CN117903265B - 一种大环肽类化合物acalitide及其制备方法和应用 - Google Patents

一种大环肽类化合物acalitide及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大环肽类化合物acalitide及其制备方法和应用。本发明所述的一种大环肽类化合物acalitide的化学结构式如式(I)所示：生物学活性数据结果表明，本发明的大环肽类化合物acalitide(Aca)能够修复多巴胺神经元的损伤其效果显著，可进一步开发作为治疗帕金森等神经损伤类疾病的先导药物。

Description

一种大环肽类化合物acalitide及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种大环肽类化合物acalitide及其制备方法和应用。
背景技术
帕金森病是仅次于阿尔茨海默病的第二常见的神经退行性疾病，影响着数百万人的健康。主要是由于黑质致密区多巴胺能神经元丢失导致纹状体中多巴胺含量降低，造成乙酰胆碱系统功能相对亢进，而引起的一种神经系统变性病。帕金森病常以静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势步态异常等运动症状为主要临床表现，同时可伴有抑郁、焦虑、睡眠障碍、自主神经功能障碍以及感觉障碍等非运动症状的表现。关于帕金森病的治疗方法主要是药物治疗、手术治疗、运动治疗、心理疏导及照料护理等。遗憾的是，目前所应用的药物治疗手段，只能改善症状，不能阻止病情发展，更无法治愈。因此，开发具有显著治疗帕金森疾病药物显得尤为重要。
天然产物一直被公认为是新药发现的重要源泉，其主要归因于天然产物是自然界生物体在进化过程中为了适应环境、竞争拮抗、沟通交流、抵御外侵、传递信号等而产生的代谢产物；它具有化学结构复杂特性，难以或者不可能用人工合成的方式去获得作为药物候选；此外，大多数天然产物还具有天然生成的手性，比起没有手性的大部分合成化合物更具有成药性；另外，天然产物本来就是生物体“设计”出来与生物大分子/药物靶标(酶、蛋白质等)作用的，它们具有天然的亲和作用力，以及参与生物体内各种生理过程的“天然”可行性。因此，从天然产物中寻找开发新药先导化合物是可靠有效的途径。
目前，还缺乏从昆虫内生真菌中分离出一种大环肽类化合物acalitide及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的问题，而提出的一种大环肽类化合物acalitide及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种大环肽类化合物acalitide，所述的大环肽类化合物acalitide的化学结构式如式(I)所示：
本发明的大环肽类化合物acalitide的制备方法，包括如下步骤：
(1)将内生真菌Acaulium sp.H-JQSF菌株，采用PDA平板发酵培养；
(2)将步骤(1)所得培养基切成小块，放入大米培养基中，30℃静置培养28-35天；
(3)将步骤(2)所得培养基采用乙酸乙酯萃取，浓缩得到浸粗膏；
(3)对浸粗膏进行正向硅胶柱层析，先采用石油醚和乙酸乙酯进行洗脱，再用二氯甲烷和甲醇洗脱，获得洗脱组分；
(4)再将步骤(3)所得洗脱组分，分别经反向硅胶、凝胶柱层析和HPLC分离纯化，制得大环肽类化合物acalitide。
进一步地，在步骤(1)中，所述的Acaulium sp.H-JQSF菌株，该菌株为Acauliumalbum(Costantin)Seifert&Woudenb H-JQSF菌株；保藏名称为Acaulium sp.H-JQSF菌株Acaulium sp.；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年04月09日；保藏编号：CCTCC No：M2021342 H-JQSF。
进一步地，在步骤(1)中，PDA平板发酵培养的培养条件为26～30℃培养7天。
更进一步地，在步骤(4)中，HPLC色谱条件为：使用反相色谱柱，流动相A为水，流动相B为甲醇，等度洗脱程序为：流动相A的质量百分比为13％，流动相B的质量百分比为87％，时间为18min。
进一步地，在步骤(4)中，HPLC分离纯化过程如下：semi-HPLC半制备反相高效液相色谱：ODS-2Hypersil colum，5μm，250mm×10mm，流动相为：甲醇与水的体积比为87：13，以2mL/min流速梯度洗脱18min；泵的型号可以为Hitachi pump L-7100，紫外灯的型号可以为UV detector L-7400。
本发明的大环肽类化合物acalitide在制备帕金森神经损伤类疾病的药物中的应用。
本发明的大环肽类化合物acalitide在制备帕金森神经损伤类疾病的先导药物中的应用。
进一步地，所述的大环肽类化合物acalitide能够修复多巴胺神经元的损伤。
有益效果：本发明首次从卷球鼠妇来源的内生真菌Acaulium sp.H-JQSF菌株的大米发酵产物中，发现了一种大环肽类化合物acalitide，其线虫动物模型活性数据表明，acalitide能够修复由MPP+引起的多巴胺神经元损伤且效果显著，可进一步作为用于治疗帕金森等神经损伤疾病类的先导药物。
附图说明
图1为本发明化合物acalitide的核磁氢谱数据图；
图2为本发明化合物acalitide的核磁碳谱数据图；
图3为本发明化合物acalitide的核磁DEPT135谱数据图；
图4为本发明化合物acalitide的核磁1H-1HCOSY谱数据图；
图5为本发明化合物acalitide的核磁HSQC谱数据图；
图6为本发明化合物acalitide的核磁HMBC谱数据图；
图7为本发明化合物acalitide的核磁NOESY谱数据图；
图8为本发明化合物acalitide的质谱数据图；
图9为本发明化合物acalitide的晶体结构数据图；
图10为本发明化合物acalitide在线虫动物模型活性实验结果图，大环肽acalitide具有显著的修复多巴胺神经元损伤活性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
本发明的一种大环肽类化合物acalitide，所述的一种大环肽类化合物acalitide的化学结构式如式(I)所示：
本发明所述的大环肽类化合物acalitide的制备方法，包括如下步骤：
(1)将内生真菌Acaulium sp.H-JQSF菌株，采用PDA平板发酵培养；PDA平板发酵培养的培养条件为30℃培养7天。
(2)将步骤(1)所得培养基切成小块，放入大米培养基中，30℃静置培养30天；
(3)将步骤(2)所得培养基采用乙酸乙酯萃取，浓缩得到浸粗膏；
(3)对浸粗膏进行正向硅胶柱层析，先采用石油醚和乙酸乙酯进行洗脱，再用二氯甲烷和甲醇洗脱，获得洗脱组分；
(4)再将步骤(3)所得洗脱组分，分别经反向硅胶、凝胶柱层析和HPLC分离纯化，制得一种大环肽类化合物acalitide。HPLC色谱条件为：使用反相色谱柱，流动相A：水，流动相B：甲醇，等度洗脱程序为：流动相A的质量百分比为13％，流动相B的质量百分比为87％，时间为18min。HPLC分离纯化过程如下：semi-HPLC半制备反相高效液相色谱：ODS-2 Hypersilcolum，5μm，250mm×10mm，流动相为：甲醇与水体积比为87：13，以2mL/min流速梯度洗脱18min；泵的型号可以为Hitachi pump L-7100，紫外灯的型号可以为UV detector L-7400。
本发明所述的Acaulium sp.H-JQSF菌株，该菌株为Acaulium album(Costantin)Seifert&Woudenb H-JQSF菌株；保藏名称为Acaulium sp.H-JQSF菌株Acaulium sp.；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年04月09日；保藏编号：CCTCC No：M2021342 H-JQSF。
本发明所述的大环肽类化合物acalitide在制备帕金森神经损伤类疾病的药物中的应用。
本发明所述的大环肽类化合物acalitide在制备帕金森神经损伤类疾病的先导药物中的应用。
本发明所述的大环肽类化合物acalitide能够修复多巴胺神经元的损伤。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：本发明所述的大环肽类化合物acalitide的制备方法，包括如下步骤：
在步骤(1)中，将内生真菌Acaulium sp.H-JQSF菌株，采用PDA平板发酵培养；PDA平板发酵培养的培养条件为30℃培养7天。
在步骤(2)中，将步骤(1)所得培养基切成小块，放入大米培养基中，30℃静置培养28天。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：本发明所述的大环肽类化合物acalitide的制备方法，包括如下步骤：
在步骤(1)中，将内生真菌Acaulium sp.H-JQSF菌株，采用PDA平板发酵培养；PDA平板发酵培养的培养条件为30℃培养7天。
在步骤(2)中，将步骤(1)所得培养基切成小块，放入大米培养基中，30℃静置培养35天。
试验例1
Acaulium sp.H-JQSF菌株的活化。
将内生真菌Acaulium sp.H-JQSF菌株的冻存干粉涂布于PDA平板培养基(土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1L，pH7.2～7.6)中，置于30℃恒温箱中培养，得到该真菌。在PDA平板上，培养初期基内菌丝为白色，易产生单个菌落，一周后开始产生大量白色菌丝体。经过形态学和ITS序列鉴定该菌为无茎真菌属Acaulium album(Costantin)Seifert&Woudenb。该菌名为Acaulium sp.H-JQSF。
试验例2
Acaulium sp.H-JQSF菌株大米培养基发酵
将菌株Acaulium sp.H-JQSF转接至平板PDA培养基上，在30℃恒温箱中进行培养7天。待菌丝体铺满平板后，将其切成小方块，转入大米培养基中，30℃静置培养30天。
试验例3
acalitide的提取与分离
将试验例2中所得的大米培养基加入乙酸乙酯萃取，浓缩得到浸膏F1。对浸膏F1进行正向硅胶柱层析，先用石油醚和乙酸乙酯进行洗脱，再用二氯甲烷和甲醇洗脱，得到10个组分；再将第十出峰组分，分别经反向硅胶、凝胶柱层析和semi-HPLC(色谱柱：AllsphereODS-2.5mm column)，甲醇-水体系，以2mL/min流速，甲醇-水体积比＝87:13等度洗脱18min，制得本发明所述acalitide(16.0mg)。泵的型号可以为Hitachi pump L-7100，紫外灯的型号可以为UV detector L-7400。
试验例4
acalitide的结构鉴定。Acalitide的1H，13C NMR和二维谱图的数据归属如表1所示：
表1
试验例5
线虫模型动物活性试验
实验材料：BZ555[Pdat-1::GFP]线虫，1-甲基4-苯基吡啶离子(MPP+)，LB培养基
实验方法：
1)线虫培养和MPP+模型建立
将E.coli OP50菌株挑至100mL LB培养基中，37℃培养至OD(λ)600＝0.4，后将菌液(100μL)涂布在NGM平板上，在室温下过夜后备用。挑取处于产卵期的BZ555[Pdat-1::GFP]线虫若干条放入平板中，培养2天后再使用次氯酸钠和氢氧化钾对线虫进行同步化处理。将L1期的幼虫按每孔30～60条加入到96孔培养板，每孔液体总体积为50μL。实验分组为空白对照组、单独MPP+(浓度为1mM)组、MPP+加阳性药物amantadine(浓度为2μM)组，MPP+加化合物acalitide(浓度为2μM)组共计4组。培养48h测线虫的存活数。
2)活性测定
采用3mmol/L左旋咪唑麻醉的存活线虫放在2％琼脂糖凝胶玻片上，用荧光显微镜观察，计算线虫头部的6条标记绿色荧光的多巴胺能神经元的数量。
实验结果下图9所示：线虫模型动物体内活性实验表明，大环肽acalitide具有显著的修复多巴胺神经元损伤活性，可进一步作为开发治疗帕金森疾病等神经损伤疾病的先导药物。
本发明所述acalitide的结构是基于质谱、核磁共振谱确定的。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种大环肽类化合物acalitide，其特征在于：所述的大环肽类化合物acalitide的化学结构式如式(I)所示：
2.权利要求1所述的大环肽类化合物acalitide的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将保藏编号为CCTCC No:M2021342的内生真菌Acaulium sp.H-JQSF菌株，采用PDA平板发酵培养；
(2)将步骤(1)所得培养基切成小块，放入大米培养基中，30℃静置培养28-35天；
(3)将步骤(2)所得培养基采用乙酸乙酯萃取，浓缩得到浸粗膏；
(3)对浸粗膏进行正向硅胶柱层析，先采用石油醚和乙酸乙酯进行洗脱，再用二氯甲烷和甲醇洗脱，获得洗脱组分；
(4)再将步骤(3)中所得洗脱组分，分别经反向硅胶、凝胶柱层析和HPLC分离纯化，制得大环肽类化合物acalitide。
3.根据权利要求2所述的大环肽类化合物acalitide的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，PDA平板发酵培养的培养条件为26～30℃培养7天。
4.根据权利要求2所述的大环肽类化合物acalitide的制备方法，其特征在于：在步骤(4)中，HPLC色谱条件为：使用反相色谱柱，流动相A为水，流动相B为甲醇，等度洗脱程序为：流动相A的质量百分比为13％，流动相B的质量百分比为87％，时间为18min。
5.根据权利要求2所述的大环肽类化合物acalitide的制备方法，其特征在于：在步骤(4)中，HPLC分离纯化过程如下：semi-HPLC半制备反相高效液相色谱：ODS-2Hypersilcolum，5μm，250mm×10mm，流动相为：甲醇与水的体积比为87：13，以2mL/min流速梯度洗脱18min；泵的型号为Hitachi pump L-7100，紫外灯的型号为UV detector L-7400。
6.权利要求1所述的大环肽类化合物acalitide在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
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