CN117903157A

CN117903157A - 一种极性-粘度敏感型脂滴可视化的新型小分子荧光探针、制备方法及其应用

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Publication number: CN117903157A
Application number: CN202311631937.4A
Authority: CN
Inventors: 张海涛; 晁明震; 胡庆飞
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Wujiang Hanta Textile Finishing Co ltd
Priority date: 2023-12-01
Filing date: 2023-12-01
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2043-12-01
Also published as: CN117903157B

Abstract

本发明提供一种极性‑粘度敏感型脂滴可视化的新型小分子荧光探针、制备方法及其应用，所述荧光探针为7‑(4‑(二甲基氨基)苯基)‑2,3‑二氢噻吩并[3,4‑b][1,4]二恶烷‑5‑甲醛；本发明开发了一种新型π桥结构的极性、粘度敏感的荧光探针，选择性好，抗干扰能力强，各种干扰溶剂对探针的影响很小；本发明探针具有较大斯托克斯位移，背景干扰低，灵敏度高，能更好应用于生物成像；本发明实现了对脂滴可视化。

Description

一种极性-粘度敏感型脂滴可视化的新型小分子荧光探针、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于极性-粘度敏感型脂滴双色可视化的荧光探针，以及光谱测试、细胞成像；属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

在生物系统中，极性、粘度、氧化还原状态和内部环境温度对于维持生物分子的正常物理化学性质具有重要意义。作为两个极其重要的微环境相关参数，极性和粘度在细胞内的各种生理过程中发挥着至关重要的作用。每个细胞器都处于其正常生理活动的最佳微环境中，这使得每个细胞器的极性和粘度不同。由于与胞质溶胶相比，脂滴提供了更多的疏水性和粘性环境，因此对极性或粘度敏感的荧光探针可以作为靶向脂滴的潜在工具，用于成像或功能研究。脂滴的代谢异常通常与癌症、糖尿病、肥胖、病毒增殖和其他疾病密切相关。因此，研究细胞中的脂滴是非常必要的。

荧光成像具有非侵入性、高灵敏度、高选择性、实时观察、高分辨率成像、多通道成像等特点，使其在生命科学研究中具有广泛的应用前景。最近已经报道过许多对脂滴单独成像的荧光探针，但同时针对极性、粘度对LDs进行成像的探针却鲜有报道。

CN114213388B公开了基于噻吩化合物的荧光探针在检测极性值和粘度值中的用途，但该荧光探针对于极性和粘度的响应不够灵敏，并且未对HeLa细胞中的脂滴进行精确定位。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明利用3,4-乙烯二氧噻吩作为新型π桥，合成出一种分子推拉型（D-π-A）能够可视化脂滴的极性和粘度敏感荧光探针，实现以下发明目的：

提供一种脂滴可视化荧光探针，对极性和粘度的灵敏度高，对HeLa细胞中的脂滴进行精确定位。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种极性-粘度敏感型脂滴可视化的新型小分子荧光探针，所述荧光探针的化学结构式如下：

。

所述荧光探针的制备方法为将2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛、4-(二甲氨基)苯基硼酸频哪醇酯、{ [1,1'-双 (二苯基膦)二茂铁]二氯化钯 (II)}和乙酸钾溶于1, 4-二氧六环溶液中，在N₂气氛中， 78-82℃下反应11.5-12.5h，将得到的粗产物经抽滤、萃取、干燥、提纯得到探针7-(4-(二甲基氨基)苯基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶烷-5-甲醛。

所述抽滤、萃取、干燥、提纯的方法为将粗产物抽滤去除乙酸钾，利用二氯甲烷和水进行萃取，得到的有机相干燥后，采取色谱法提纯。

所述2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛和4-(二甲氨基)苯基硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:0.9-1.1；所述2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛和{ [1,1'-双 (二苯基膦)二茂铁]二氯化钯 (II)}的摩尔比为10:0.9-1.1；所述2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛和乙酸钾的摩尔比为1:1.2-1.3；所述乙酸钾和1, 4-二氧六环的质量体积比为1g:31-33mL。

所述2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛的制备方法为将2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛悬浮于乙腈中，冷却至-0.8～0.2℃，加入N-溴代琥珀酰亚胺，在室温条件下反应58-62h，得到橙色透明溶液混合物，经萃取、干燥、纯化得到。

所述萃取、干燥、纯化的方法为将混合物加入乙酸乙酯，先用碳酸钠水溶液萃取2次，再用水萃取2次，干燥后，采取色谱法纯化。

所述2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛与N-溴代琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.05-1.15；所述2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛与乙腈的质量体积比为1g:24-26mL。

所述的荧光探针在制备生物成像试剂中的应用，所述应用包括荧光光谱检测、荧光细胞成像。

探针EDOT-LDs的合成路线如下：

。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

本发明开发了一种新型π桥结构的极性、粘度敏感的荧光探针，选择性好，抗干扰能力强，各种干扰溶剂对探针的影响很小；

本发明探针具有较大斯托克斯位移，背景干扰低，对于进行和粘度的灵敏度较高，能更好应用于生物成像；

本发明实现了对脂滴可视化，基于其在脂滴中呈现黄色，该探针可用于生物体系中对脂滴变化的监测。

附图说明

图1为实施例1制备的探针EDOT-LDs的¹H NMR图谱；

图2为探针EDOT-LDs在不同溶剂中的紫外吸收和荧光光谱；

其中图2（a）为紫外吸收光谱，图2（b）为荧光光谱；

图3为探针EDOT-LDs随极性变化的荧光光谱和荧光强度的折线图；

其中图3（a）为探针EDOT-LDs随极性变化的荧光光谱；

图3（b）为探针EDOT-LDs在不同比例的甲醇/1, 4-二氧六环混合溶剂中的荧光强度的折线图；

图4为探针EDOT-LDs随粘度变化的荧光光谱和荧光强度的折线图；

其中图4（a）为EDOT-LDs随粘度变化的荧光光谱；

图4（b）为探针在不同比例的甲醇/丙三醇混合溶剂中的荧光强度的折线图；

图5为探针EDOT-LDs随pH变化的荧光光谱和柱状图；

其中图5（a）为探针EDOT-LDs随pH变化的荧光光谱；

图5（b）为探针EDOT-LDs在不同pH溶液中的荧光强度的柱状图；

图6为探针EDOT-LDs选择性图谱和柱状图；

其中图6（a）为探针EDOT-LDs的选择性图谱；图6（b）为探针EDOT-LDs的选择性柱状图；

图6（a）的从下往上的曲线对应的干扰溶剂分别为谷胱甘肽、Na₂CO₃、MgSO₄、MgCl₂、Na₃HSO、缬氨酸、K₃PO₄、ZnCl₂、空白、 CaCl₂、HCl、精氨酸、H₂O_2；

图6（b）中1、空白；2、缬氨酸；3、谷胱甘肽；4、ZnCl₂；5、Na₂CO₃；6、MgSO₄；7、MgCl₂；8、精氨酸；9、K₃PO₄；10、Na₃HSO ；11、HCl；12、H₂O₂；13、CaCl_2；

图7为探针EDOT-LDs对细胞中脂滴的荧光成像；

其中图7A为BODIPY 通道图像：λ_ex= 405 nm, λ_em= 470–500 nm；图7B为EDOT-LDs通道图像：λ_ex= 405 nm, λ_em= 530–570 nm（黄色通道）；图7C为（a）和（b）的合并图像；图7D为明场图像；图7E为EDOT-LDs和BODIPY 强度的相关图像；图7F为EDOT-LDs和 BODIPY 的共聚焦曲线图像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

化合物1为2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛；

化合物2为2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛。

实施例1探针化合物EDOT-LDs的合成

（1）制备化合物2

将化合物1（2.0 g，11.8 mol）悬浮于干燥的乙腈（50mL）中，冷却至0℃，加入N-溴代琥珀酰亚胺（2.3g，12.9mol），在室温条件下反应60h，得到橙色透明溶液混合物。将混合物与150 mL乙酸乙酯一起转移到分液漏斗中，先用10% Na₂CO₃水溶液萃取2次，每次100mL，再用水萃取2次，每次100mL，然后加入无水硫酸钠（200g）搅拌干燥1h后，用布氏漏斗抽滤去除无水硫酸钠固体，然后以石油醚与乙酸乙酯（体积比为50：1）作为洗脱剂柱，采取色谱法纯化后得到化合物2，产率为62 %。

（2）制备化合物3

将2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛（2mmol, 0.4958g）、4-(二甲氨基)苯基硼酸频哪醇酯（2mmol, 0.5943 g）、{ [1,1'-双 (二苯基膦)二茂铁]二氯化钯 (II)}（0.2 mmol,0.1463 g）和乙酸钾（2.5mmol, 0.2453g）溶于1, 4-二氧六环 (8mL)溶液中，在N₂气氛中，80℃下反应12h。将得到的粗产物进行抽滤除去乙酸钾，利用二氯甲烷（400mL）和水（200mL）进行萃取，萃取后的有机相用无水硫酸钠 (150g) 除去水分，用石油醚和乙酸乙酯（体积比为12:1）作为洗脱剂，柱色谱法提纯得到探针EDOT-LDs，即7-(4-(二甲基氨基)苯基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶烷-5-甲醛，产率为53%。

实施例2探针EDOT-LDs在不同溶剂中的吸收和荧光光谱的测定

取实施例1制备的探针EDOT-LDs溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制成1 mmol/L储备液。每次从储备液中取20μL，加入2mL不同溶剂中，进行荧光强度和紫外吸收测试。如图2（b）和表1所示，随着极性增加，最大发射波长由481nm（蓝光范围）到590nm（黄光范围），红移了109nm。

表1EDOT-LDs在各种有机溶剂中的最大紫外吸收值和最大发射波长

。

实施例3探针EDOT-LDs随极性变化的荧光光谱的测定

取实施例1制备的探针EDOT-LDs溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制成1 mmol/L储备液。每次从储备液中取20μL，加入2 mL不同比例的甲醇/1, 4-二氧六环混合溶剂中，测量其荧光性质，激发波长λ_ex= 405 nm，电压U= 440 V，荧光光谱如图3 所示，随着甲醇在混合溶剂中的体积百分比从0 %增加到100 %（溶液极性逐渐增强），光谱中的荧光强度逐渐降低，并伴随着最大发射的红移。

图3（a）中，从上往下的曲线对应的甲醇/1, 4-二氧六环混合溶剂中甲醇的体积百分比分别为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。

实施例4探针EDOT-LDs随粘度变化的荧光光谱的测定

取实施例1制备的探针EDOT-LDs溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制成1 mmol/L储备液。每次从储备液中取20μL，加入2mL不同体积比例的甲醇/丙三醇混合溶剂中，测量其荧光性质。激发波长λ_ex= 405 nm，电压U= 530 V，荧光光谱如图4（a）所示，随着甘油在混合溶剂中的体积百分比从0%增加到100%，粘度逐渐增大，光谱中的荧光强度逐渐增强，并伴随着最大发射的红移。

图4（a）中，从下往上的曲线对应的甲醇/丙三醇混合溶剂中甘油的体积百分比分别为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。

实施例5探针EDOT-LDs随pH变化的图谱数据的测定

取实施例1制备的探针EDOT-LDs溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制成1 mmol/L储备液。每次从储备液中取20μL，加入1mL的1, 4-二氧六环液体，再加入1 mL不同pH的PBS缓冲溶液，测量其荧光性质，激发波长λ_ex=405 nm，电压U= 530 V，荧光光谱如图5 所示，由图5可见，加入探针EDOT-LDs后，不同pH下对探针的影响也很小。

实施例6探针EDOT-LDs选择性图谱测定

取实施例1制备的探针EDOT-LDs溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制成1 mmol/L储备液。用去离子水来制备所有的10 mmol/L干扰溶液。每次从储备液中各取20 μL，加入2 mLDMSO: PBS（体积比为1:1）液体，加入20 μL不同干扰溶液，激发波长λ_ex= 405 nm，发射波长为571 nm，荧光光谱如图6所示。由图6可见，加入探针EDOT-LDs后，各种干扰溶剂对探针的影响也很小。

实施例7探针EDOT-LDs对细胞中脂滴的细胞成像

将探针EDOT-LDs应用于HeLa细胞中脂滴和溶酶体双通道成像（图7）具体操作步骤如下：将EDOT-LDs（终浓度为10 μM）与商业染料BODIPY（最终浓度为500 nM）一起加入到HeLa细胞培养基（初始细胞密度为1×10⁴个/ml）中并共同培养30分钟后，检测细胞中脂滴的成像，证明了EDOT-LDs可以进入细胞并且靶向脂滴。

Claims

1.一种极性-粘度敏感型脂滴可视化的新型小分子荧光探针，其特征在于：所述荧光探针为7-(4-(二甲基氨基)苯基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶烷-5-甲醛，化学结构式如下：

。

2.一种极性-粘度敏感型脂滴可视化的新型小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述荧光探针的制备方法为将2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛、4-(二甲氨基)苯基硼酸频哪醇酯、{ [1,1'-双 (二苯基膦)二茂铁]二氯化钯 (II)}和乙酸钾溶于1, 4-二氧六环溶液中，在N₂气氛中， 78-82℃下反应11.5-12.5h，将得到的粗产物经抽滤、萃取、干燥、提纯得到探针7-(4-(二甲基氨基)苯基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶烷-5-甲醛。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛和4-(二甲氨基)苯基硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:0.9-1.1；所述2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛和{ [1,1'-双 (二苯基膦)二茂铁]二氯化钯 (II)}的摩尔比为10:0.9-1.1；所述2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛和乙酸钾的摩尔比为1:1.2-1.3；所述乙酸钾和1, 4-二氧六环的质量体积比为1g:31-33mL。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述2-溴-3,4-乙烯二氧噻吩-5-甲醛的制备方法为将2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛悬浮于乙腈中，冷却至-0.8～0.2℃，加入N-溴代琥珀酰亚胺，在室温条件下反应58-62h，得到橙色透明溶液混合物，经萃取、干燥、纯化得到。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛与N-溴代琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.05-1.15；所述2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛与乙腈的质量体积比为1g:24-26mL。

6.权利要求1所述的荧光探针在制备生物成像试剂中的应用。