CN117907075A - 一种样品稀释液及其制备方法与在elisa检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物检测的技术领域，具体公开了一种样品稀释液及其制备方法与在ELISA检测中的应用。本申请公开的一种样品稀释液，具体包括以下浓度的组分：氯化钠35‑45g/L、NP‑40乙基苯基聚乙二醇2‑8ml/L、酪蛋白0.25‑0.75g/L、新生牛血清44‑56ml/L、硫氧还蛋白7‑13g/L、Proclin300防腐剂0.3‑0.8ml/L、Tris‑HCl 5.8‑6.2g/L、Tris‑Base 0.8‑1.1g/L、表面活性剂0.5‑1.5g/L。本申请还提供了样品稀释液的制备方法。利用本申请提供的样品稀释液用于ELISA检测，可以有效提高检测方法的特异性、灵敏度和稳定性。

Description

一种样品稀释液及其制备方法与在ELISA检测中的应用

技术领域

本申请涉及生物检测的技术领域，具体涉及一种样品稀释液及其制备方法与在ELISA检测中的应用。

背景技术

酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay)简称ELISA，其中ELISA抗体检测试剂盒主要原理为将可溶性抗原吸附到聚苯乙烯等固相载体上，样品中的抗体与载体上吸附的抗原发生特异性反应，形成抗原抗体免疫复合物，加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上，加入底物进行显色反应，测定光吸收度，通过计算达到抗体测定的目的。

ELISA检测方法操作步骤虽简单，但影响因素较多，其中样品稀释液是最重要的影响因素之一。在检测过程中，为了避免过高的阴性本底影响检测结果的判定，样品必须先进行稀释，样品稀释液可以减少样品中杂蛋白和无关免疫球蛋白等的非特异性吸附，提高试验的特异性和灵敏度。稀释液选择不好反而会提高阴性本底值，增强非特异性反应，造成假阳性结果的出现。一般情况下人们会采用PBST作为ELISA试剂盒的样品稀释液，该配方的生产成本低，但是无法起到降低阴性本底值和保护待测样品的作用。

发明内容

为了降低样品非特异性反应，减少假阳性的出现，提高试剂盒的特异性，本申请提供一种样品稀释液及其制备方法与在ELISA检测中的应用。

本申请提供了一种样品稀释液，具体包括以下浓度的组分：氯化钠35-45g/L、NP-40乙基苯基聚乙二醇2-8ml/L、酪蛋白0.25-0.75g/L、新生牛血清44-56ml/L、硫氧还蛋白7-13g/L、Proclin300防腐剂0.3-0.8ml/L、Tris-HCl 5.8-6.2g/L、Tris-Base 0.8-1.1g/L、表面活性剂0.5-1.5g/L。

本申请提供的样品稀释液中，氯化钠可以起到维持溶液渗透压的作用，NP-40可降低表面张力，酪蛋白及新生牛血清起封闭作用，可减少非特异性反应，硫氧还蛋白具有很好的抗氧化作用，作为氢受体参与氧化还原反应，大大降低了抗体被损坏的几率，对样品中的抗体起到了保护作用，Proclin300起防腐作用；Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和Tris-Base三羟甲基氨基甲烷提供Tris缓冲液，使溶液具备缓冲能力，表面活性剂有助于使稀释液中各组分进行良好的相容，提高各组分的相互协同性，进而使得各组分发挥最大的作用。

目前，常用的样品稀释液PBST起不到稳定蛋白及去除非特异的作用，从而无法达到保护样品及提高试剂盒特异性的目的；相比于PBST样品稀释液，本申请提供的上述样品稀释液具有稳定待测样品蛋白的作用，进而提高检测方法的灵敏度；且可以起到有效地保护蛋白的作用，提高检测方法的稳定性；同时降低反应过程中的基质效应，进而提高检测方法的特异性。

优选地，所述样品稀释液具体包括以下重量份的组分：氯化钠38-42g/L、NP-40乙基苯基聚乙二醇3-7ml/L、酪蛋白0.35-0.65g/L、新生牛血清48-53ml/L、硫氧还蛋白9-11g/L、Proclin300防腐剂0.35-0.65ml/L、Tris-HCl 5.9-6.1g/L、Tris-Base三羟甲基氨基甲烷0.92-1.05g/L、表面活性剂0.7-1.2g/L。

优选地，所述表面活性剂选自月桂基羟丙基磺基甜菜碱、十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺中的一种或多种。

优选地，所述表面活性剂是由重量比为11-15：1-3的十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺混合制备得到。

在一个具体的实施方案中，所述十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺的重量比可以为11：1、11：2、11：3、13：1、13：2、13：3、15：1、15：2、15：3。

在一些具体的实施方案中，所述十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺的重量比还可以为11-13：1、11-13：2、11-15：3、13：1-2、13：2-3、13：1-3、13-15：1、15：1-2、15：1-3。

经过试验分析可知，本申请利用上述重量比的十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺混合制备得到表面活性剂，可以进一步提高检测方法的稳定性。

优选地，所述样品稀释液还包括0.06-0.12g/L的多酚物质。

在一些具体的实施方案中，所述多酚物质的浓度可以为0.06g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.10g/L、0.12g/L。

在一个具体的实施方案中，所述多酚物质的浓度还可以为0.06-0.08g/L、0.06-0.09g/L、0.06-0.10g/L、0.08-0.09g/L、0.08-0.10g/L、0.08-0.12g/L、0.09-0.10g/L、0.09-0.12g/L、0.10-0.12g/L。

进一步地，所述多酚物质选自苹果多酚、柑橘多酚、山竹多酚中的一种或多种。

优选地，所述样品稀释液的pH值为7.6-8.2。

第二方面，本申请还提供了一种上述样品稀释液的制备方法，具体包括以下步骤：

分别称取相应重量份的各原料组分；

将所述Tris-HCl及所述Tris-Base溶解于纯化水中，调整pH至7.6-8.2，然后加入剩余原料组分，混匀，最后利用纯化水定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌。

第三方面，本申请还提供了一种ELISA检测试剂盒，包括上述的样品稀释液。

第四方面，本申请还提供了上述样品稀释液或者上述ELISA检测试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中的应用。

综上所述，本申请的技术方案具有以下效果：

本申请提供的样品稀释液中，通过特定用量的特定组分相互配合、相互协同，应用于ELISA抗体检测中，具有稳定待测样品抗体的作用，且可以起到有效地保护抗体的作用，同时降低反应过程中的基质效应，进而提高检测方法的特异性、稳定性和灵敏度。

附图说明

图1为实施例1中微孔板加样位置示例图。

具体实施方式

本申请所用原料的来源具体如下；

NP-40(乙基苯基聚乙二醇)购自Thermo(货号：85124)；酪蛋白购自索莱宝(货号：C8221)；新生牛血清购自hyclone(货号：SH30413.06)；硫氧还蛋白购自Sigma(货号：T0910-1MG)；Proclin300购自Sigma(货号：48917-U)；Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)购自Sigma(货号：T3253-1KG)；Tris-Base(三羟甲基氨基甲烷)购自Sigma(货号：T1503-100G)；苹果多酚(含量规格为80％)、柑橘多酚(含量规格为40％)、山竹多酚(含量规格为40％)购自信阳市沐凡生物科技有限公司；其余原料与试剂均可通过商购获得。

以下结合实施例、对比例以及性能检测试验对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

实施例

实施例1-4

实施例1-4分别提供了一种样品稀释液。

上述实施例的不同之处在于：样品稀释液中各原料组分的用量不同，具体如表1所示。

上述实施例中样品稀释液具体制备过程如下：

按表1所示的配方要求，分别称取相应重量份的氯化钠、NP-40乙基苯基聚乙二醇、酪蛋白、新生牛血清、硫氧还蛋白、Proclin300防腐剂、Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、Tris-Base三羟甲基氨基甲烷、表面活性剂(由重量比为13：2的十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺混合制备得到)、山竹多酚各原料组分；

将Tris-HCl及Tris-Base溶解于900ml纯化水中，用5M氢氧化钠或5M盐酸溶液调整pH至8.0，然后加入氯化钠、NP-40乙基苯基聚乙二醇、酪蛋白、新生牛血清、硫氧还蛋白、Proclin300防腐剂、表面活性剂，最后利用纯化水定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌。

表1实施例1-4与对比例1中样品稀释液中各原料组分的用量

实施例5-9

实施例5-9分别提供了一种样品稀释液。

上述实施例与实施例2的不同之处在于：样品稀释液中表面活性剂的种类不同，具体如下所示。

实施例5中：表面活性剂为十四烷基二羟乙基氧化胺。

实施例6中：表面活性剂由重量比为13：2的月桂基羟丙基磺基甜菜碱、月桂基二甲基氧化胺混合制备得到。

实施例7中：表面活性剂由重量比为13：4的十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺混合制备得到。

实施例8中：表面活性剂由重量比为11：3的十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺混合制备得到。

实施例9中：表面活性剂由重量比为15：1的十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺混合制备得到。

上述实施例中与实施例2的其余组分、各组分的用量以及样品稀释液的制备方法均相同。

实施例10-13

实施例10-13分别提供了一种样品稀释液。

上述实施例与实施例2的不同之处在于：样品稀释液中多酚物质的种类不同，具体如下所示。

实施例10中：多酚物质为苹果多酚。

实施例11中：多酚物质为柑橘多酚。

实施例12中：多酚物质由重量比为1：1的柑橘多酚和山竹多酚组成。

实施例13中：多酚物质由重量比为1：1的苹果多酚和山竹多酚组成。

上述实施例中与实施例2的其余组分、各组分的用量以及样品稀释液的制备方法均相同。

对比例

对比例1

本对比例提供了一种样品稀释液。

本对比例与实施例2的不同之处在于：样品稀释液中各原料组分的用量不同，具体如表1所示。

本对比例中与实施例2中组分的种类以及样品稀释液的制备方法均相同。

对比例2

对比例2提供了一种样品稀释液。

对比例2中的样品稀释液为PBST溶液，制备方法为：称取氯化钠8g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.58g，氯化钾0.2g，Tween-20 0.5ml，Proclin300 0.5ml，加纯化水定容至1L，混匀，0.22μm滤膜过滤除菌。

性能检测试验

利用实施例与对比例提供的样品稀释液，对猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体进行ELISA检测，评判检测方法的特异性、灵敏度和稳定性，具体过程如下：

注：1倍洗涤液的制备方法为：10倍洗涤液：氯化钠8g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.58g，氯化钾0.2g，Tween-20 0.5ml，Proclin300 0.5ml，加纯化水定容至100ml，混匀即可。1倍洗涤液由10倍洗涤液稀释而来，即10ml 10倍洗涤液加入90ml纯化水中，混匀即得。

(1)将所有组分从试剂盒中取出，在恒温箱(25℃±3℃)中放置90min。

(2)对样品进行50倍稀释。按照“微孔板加样位置示例图”(如图1所示)在稀释板中每孔加入245μL样品稀释液，各孔加入5μL样品，充分混匀。

(3)按照“微孔板加样位置示例图”向抗原包被板指定孔中加入100μL提前在稀释板中稀释后的样品。

(4)加样：向指定孔中分别加入100μL未稀释的阴性对照血清(NC)和阳性对照血清(PC)，盖上封板膜，在恒温箱(25℃±3℃)中孵育30分钟(±1分钟)；用ELISA洗板机或微量移液器洗板，弃去孔中液体，每孔加300μL 1倍洗涤液，洗涤3次。最后一次洗涤后将酶标板在吸水纸上轻轻拍干，严禁各步骤之间孔板出现干燥情况。注：阴性对照血清(NC)和阳性对照血清(PC)来源于北京金诺百泰生物技术有限公司自制。

(5)每孔加入100μL PRRSV HRP标记抗体(警告：倒出瓶的HRP标记物禁止再次使用)；盖上封板膜，在恒温箱(25℃±3℃)中孵育30分钟(±1分钟)；用ELISA洗板机或微量移液器洗板，弃去孔中液体，每孔加300μL 1倍洗涤液，洗涤3次。最后一次洗涤后将酶标板在吸水纸上轻轻拍干，严禁各步骤之间孔板出现干燥情况。

(6)每孔中加入100μL TMB底物液；盖上封板膜，在恒温箱(25℃±3℃)中孵育15分钟(±1分钟)。

(7)每孔中加入50μL终止液0.5M硫酸溶液，终止酶促反应。

(8)使用450nm波长测量吸光度值(OD值)。

(9)结果判定与计算：

试验成立条件：阳性对照OD_450nm平均值＞0.4；阴性对照OD_450nm平均值＜0.3；

如果检测结果不在界定范围内则需要重新进行检测。

样品S/P值计算公式为式(1)所示：

式(1)

判定标准为：当待测样品S/P值≥0.4，判为阳性；当待测样品S/P值＜0.4，判为阴性。

一、本试验例研究了ELISA检测方法的特异性

对用商品化试剂盒确定的10份猪繁殖与呼吸综合征病毒临床阳性血清、10份猪繁殖与呼吸综合征病毒临床阴性血清、10份猪瘟病毒阳性血清、10份猪伪狂犬病毒阳性血清、10份猪圆环病毒2型阳性血清、10份猪细小病毒阳性血清为待测血清样品，然后进行检测，确定本申请中检测方法的检测特异性。

表2实施例1-13与对比例1-2中检测方法的特异性检测结果

结果显示，利用本申请实施例1-13提供的样品稀释液对10份猪繁殖与呼吸综合征病毒临床阳性血清的检测结果均为阳性，而对10份猪繁殖与呼吸综合征病毒临床阴性血清、10份猪瘟病毒阳性血清、10份猪伪狂犬病毒阳性血清、10份猪圆环病毒2型阳性血清、10份猪细小病毒阳性血清的检测结果均为阴性。上述检测结果表明，本申请提供的检测方法具有良好的特异性。

二、本试验例研究了ELISA检测方法的灵敏度

以猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清为待测样品，分别按照1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048、1∶4096倍进行梯度稀释，然后进行检测，计算待测血清样品的S/P值，对待测血清样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体进行判定，考察本申请中检测方法的灵敏度。

检测结果：如表3所示。

表3实施例1-13与对比例1-2中检测方法的灵敏度检测结果

三、本试验例研究了猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测方法的稳定性利用实施例与对比例中提供的样品稀释液分别对经商品化试剂盒确定的猪繁殖与呼吸综合征病毒临床阳性血清稀释，然后进行ELISA检测OD_450nm值；同时将待测样本分别在-20℃、4℃保存120h，然后进行ELISA检测OD_450nm值，计算检测方法的稳定性；稳定性＝(保存前样品的OD_450nm值-保存后样品的OD_450nm值)/保存前样品的OD_450nm值×100％。

检测结果：如表4所示。

表4实施例1-13与对比例1-2中检测方法的稳定性检测结果

结合表2-4，通过对比实施例1-13与对比例1-2的检测结果，本申请以氯化钠、NP-40、酪蛋白、新生牛血清、硫氧还蛋白、Proclin300、Tris-HCl、Tris-Base以及表面活性剂和多酚物质作为样品稀释液的组分，用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA检测试剂盒和检测方法中，可以有效稳定蛋白及去除非特异性的反应，从而达到保护样品及提高试剂盒特异性、灵敏度和稳定性的目的。

通过对比实施例1-3与对比例1的检测结果，各原料的用量对于样品稀释液的性能具有较大的影响，本申请控制各原料的用量可以使得样品稀释液在检测方法中的性能达到较优的水平。

通过对比实施例2、5-9的检测结果，本申请利用重量比为11-15：1-3的十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺混合制备得到表面活性剂，可以进一步提高检测方法的稳定性。

通过对比实施例2、4、10-13的检测结果，相比于未添加多酚物质、单独使用苹果多酚、单独使用柑橘多酚、或者联合使用柑橘多酚和山竹多酚、或者联合使用苹果多酚和山竹多酚，本申请单独使用山竹多酚作为样品稀释液的原料组分，可以进一步提高检测方法的稳定性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种样品稀释液，其特征在于，具体包括以下浓度的组分：氯化钠35-45g/L、NP-40乙基苯基聚乙二醇2-8ml/L、酪蛋白0.25-0.75g/L、新生牛血清44-56ml/L、硫氧还蛋白7-13g/L、Proclin300防腐剂0.3-0.8ml/L、Tris-HCl 5.8-6.2g/L、Tris-Base 0.8-1.1g/L、表面活性剂0.5-1.5g/L。

2.根据权利要求1所述的样品稀释液，其特征在于，具体包括以下浓度的组分：氯化钠38-42g/L、NP-40乙基苯基聚乙二醇3-7ml/L、酪蛋白0.35-0.65g/L、新生牛血清48-53ml/L、硫氧还蛋白9-11g/L、Proclin300防腐剂0.35-0.65ml/L、Tris-HCl 5.9-6.1g/L、Tris-Base三羟甲基氨基甲烷0.92-1.05g/L、表面活性剂0.7-1.2g/L。

3.根据权利要求1所述的样品稀释液，其特征在于，所述表面活性剂选自月桂基羟丙基磺基甜菜碱、十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的样品稀释液，其特征在于，所述表面活性剂是由重量比为11-15：1-3的十四烷基二羟乙基氧化胺、月桂基二甲基氧化胺混合制备得到的。

5.根据权利要求1所述的样品稀释液，其特征在于，所述样品稀释液还包括0.06-0.12g/L的多酚物质。

6.根据权利要求5所述的样品稀释液，其特征在于，所述多酚物质选自苹果多酚、柑橘多酚、山竹多酚中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的样品稀释液，其特征在于，所述样品稀释液的pH值为7.6-8.2。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的样品稀释液的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

分别称取相应重量份的各原料组分；

将所述Tris-HCl及所述 Tris-Base溶解于纯化水中，调整pH至7.6-8.2，然后加入剩余原料组分，混匀，最后利用纯化水定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌。

9.一种ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的样品稀释液。

10.权利要求1-7任一项所述的样品稀释液或者权利要求9所述的ELISA检测试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中的应用。