CN117904038A - 一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基及其合成工艺和应用 - Google Patents
一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基及其合成工艺和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其包括基础培养基、谷氨酰胺、促增殖因子、细胞抗衰老和活性维持因子、生长因子组合；促增殖因子为LN‑332、LN‑511、胰岛素、氢化可的松、孕酮、肝细胞生长因子、干细胞生长因子中的一种或多种；细胞抗衰老和活性维持因子为透明质酸、转铁蛋白、白藜芦醇中的一种或多种；生长因子组合为肝细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子‑β1、表皮生长因子、神经生长因子中的多种。该无动物血清的脐带间充质干细胞培养基具有更高的安全性、更强的促增殖作用、更好的活力维持和更强的分化潜能，解决了脐带间充质干细胞扩增和临床应用面临的技术难题，具有重要的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养和生物材料技术领域，具体涉及一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基及其合成工艺和应用。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)具有多种多样的治疗潜力、安全性、高增殖能力、高度的自我更新能力、多向分化潜能，其临床应用在世界范围内不断增加。间充质干细胞(MSCs)可以从脂肪组织、牙髓、毛囊、角膜、脐带和胎盘等人体组织中分离出来。间充质干细胞(MSCs)已被证明在肛瘘、勃起功能障碍、神经系统疾病、退行性关节疾病和心血管疾病等方面具有巨大的潜力，同时间充质干细胞(MSCs)能够调节免疫反应、促进血管生成和产生有利于内源性干细胞再生的环境。因此间充质干细胞(MSCs)成为研究和临床应用的热点之一。
现有技术中无血清干细胞培养基产品主要有如下几种：
1.mTeSRTM1培养基：一种针对人胚胎干细胞和诱导分化干细胞的无血清商业化培养基，其由BD Matrigel、FGF2、TGF-β和其他生长因子组成，但不含任何动物衍生成分。其培养工艺是将细胞接种到涂有BD Matrigel的细胞培养皿中，之后每天更换新鲜的mTeSRTM1培养基，培养环境为37℃、5％CO2培养箱中。
2.TeSRTM-E8TM培养基：也是一种针对人胚胎干细胞的无血清商业化培养基，其由活化型维生素C、FGF2、TGF-β和其他必需因子组成，其制备工艺较为复杂。其培养方法同mTeSRTM1培养基相同。
3.hESC SFM培养基：独立开发的一种无血清人胚胎干细胞培养基，含丝氨酸、亮氨酸等氨基酸以及bFGF、TGF-β等生长因子，培养环境和培养方法同上。
4.MesenCultTM-ACF Plus Medium培养基：无血清的人间充质干细胞专用培养基，采用化学合成生长因子替代血清，同样不含任何动物来源成分。其培养方法为接种细胞后第3-5天更换新鲜培养基，之后每3-4天半量更换。
现有无血清干细胞培养基产品主要采用完全化学合成所有的培养基成分，包括氨基酸、维生素、无机盐、底物以及重要的生长因子如bFGF和TGF-β，而不再含有任何动物血清。培养方法主要为定期更换新鲜培养基，并适当调整更换频率。这些产品为本申请中的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基的研发提供了参考。
现有的脐带间充质干细胞(UC-MSCs)培养基在具体使用时存在如下问题：
1.现有的UC-MSCs培养基大多含有动物血清，如胎牛血清(FBS)，存在一定的安全隐患和疏忽。
2.现有的无血清干细胞培养基的扩增效率较低，脐带间充质干细胞的体外扩增难度较大。
3.现有的无血清干细胞培养基的脐带间充质干细胞的活力较低，稳定性较差。
4.现有的无血清干细胞培养基的脐带间充质干细胞的定向分化潜能较差。
综上，本发明提供了一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基克服了现有技术的局限性，具有更高的安全性、更强的促增殖作用、更好的活力维持和更强的分化潜能。
发明内容
为了解决上述背景技术中存在的问题，本发明提供一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其使用安全性高，能显著提高脐带间充质干细胞的增殖速度和增殖效率，促进脐带间充质干细胞的体外扩增，有效地提高脐带间充质干细胞的细胞活力和稳定性，并具有增强脐带间充质干细胞的定向分化潜能，具有重要的临床应用价值。此外，本发明还提供一种上述无动物血清的脐带间充质干细胞培养基的合成工艺和其在脐带间充质干细胞的体外培养和扩增的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，包括基础培养基、谷氨酰胺、促增殖因子、细胞抗衰老和活性维持因子、生长因子组合；
其中，所述促增殖因子为LN-332、LN-511、胰岛素、氢化可的松、孕酮、肝细胞生长因子(HGF)、干细胞生长因子(SCF)中的一种或多种；
所述细胞抗衰老和活性维持因子为透明质酸(HA)、转铁蛋白、白藜芦醇(RSV)中的一种或多种；
所述生长因子组合为肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)中的多种。
具体地，所述基础培养基为DMEM-LG培养基。
DMEM-LG培养基中不含有FBS(胎牛血清)等动物血清，将其作为溶剂，向其中加入其它添加成分得到无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，避免了其潜在的病原体污染和免疫原性问题，更安全地用于脐带间充质干细胞的体外培养和临床应用，具有更高的临床转化价值。
具体地，所述谷氨酰胺的加入后浓度为20-50μg/mL。
具体地，所述促增殖因子中LN-332的加入后浓度为5-15ng/mL、LN-511的加入后浓度为5-15ng/mL、胰岛素的加入后浓度为10-20μg/mL、氢化可的松的加入后浓度为20-50ng/mL、孕酮的加入后浓度为1-10ng/mL、肝细胞生长因子加入后浓度为50-100ng/mL、干细胞生长因子的加入后浓度为5-15ng/mL。
向无血清的基础培养基中加入含有LN-332、LN-511、胰岛素、氢化可的松、孕酮、肝细胞生长因子(HGF)、干细胞生长因子(SCF)等多种促增殖因子，能显著提高脐带间充质干细胞的增殖速度和体外扩增效率，解决脐带间充质干细胞扩增难度大的问题。
具体地，所述细胞抗衰老和活性维持因子中透明质酸的加入后浓度为10-50μg/mL、转铁蛋白的加入后浓度为0.01-0.1μg/mL、白藜芦醇的加入后浓度为0.5-1μg/mL。
向无血清的基础培养基中加入含有透明质酸、转铁蛋白、白藜芦醇等细胞抗衰老和活性维持因子，能够有效提高脐带间充质干细胞的细胞活力和稳定性,产生更健康活性的脐带间充质干细胞用于临床应用。
具体地，所述生长因子组合中血小板衍生生长因子的加入后浓度为10-15ng/mL、转化生长因子-β1的加入后浓度为0.5-2ng/mL、表皮生长因子的加入后浓度为1-5ng/mL、神经生长因子的加入后浓度为5-10ng/mL。
向无血清的基础培养基中加入含有肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)的多种生长因子，能增强脐带间充质干细胞的成骨、成软骨和成神经等多向分化潜能，为脐带间充质干细胞的再生医学应用提供更广泛的前景。
本发明的第二方面，提供一种上述无动物血清的脐带间充质干细胞培养基的合成工艺，包括如下步骤：
S1、准备基础培养基，并将其作为溶剂；
S2、向基础培养基中依次加入配方量的谷氨酰胺、促增殖因子、细胞抗衰老和活性维持因子和生长因子组合；
S3、添加的组分完全溶解后，经过滤除菌处理，将pH值调节至7.2-7.4，保存于4℃的环境。
本发明的第三方面，提供一种上述无动物血清的脐带间充质干细胞培养基的应用，所述无动物血清的脐带间充质干细胞培养基用于脐带间充质干细胞的体外培养和扩增。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明中的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其完全摒除了FBS(胎牛血清)等动物血清，避免了其潜在的病原体污染和免疫原性问题，更安全地用于脐带间充质干细胞的体外培养和临床应用，具有更高的临床转化价值；
(2)本发明中的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其含有LN-332、LN-511、胰岛素、氢化可的松、孕酮、肝细胞生长因子(HGF)、干细胞生长因子(SCF)等多种促增殖因子，能显著提高脐带间充质干细胞的增殖速度和体外扩增效率，解决脐带间充质干细胞扩增难度大的问题；
(3)本发明中的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，含有透明质酸、转铁蛋白、白藜芦醇等细胞抗衰老和活性维持因子，能够有效提高脐带间充质干细胞的细胞活力和稳定性,产生更健康活性的脐带间充质干细胞用于临床应用；
(4)本发明中的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，含有肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)的多种生长因子，能增强脐带间充质干细胞的成骨、成软骨和成神经等多向分化潜能，为脐带间充质干细胞的再生医学应用提供更广泛的前景；
综上，本发明中的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其使用安全性高，能显著提高脐带间充质干细胞的增殖速度和增殖效率，促进脐带间充质干细胞的体外扩增，有效地提高脐带间充质干细胞的细胞活力和稳定性，并具有增强脐带间充质干细胞的定向分化潜能，具有更高的临床应用价值和更广泛的应用前景，是一种非常有效和实用的脐带间充质干细胞培养体系。
附图说明
下面结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1中A为实施例1配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中的贴壁细胞的形态特征图；
B为实施例1配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基分别培养的脐带间充质干细胞的表面标记表达结果。
图2中A为实施例2配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基分别培养脐带间充质干细胞的细胞增殖率对比图；
B为实施例2配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基分别培养的脐带间充质干细胞的克隆形成结果。
图3为实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中分别培养的脐带间充质干细胞的成骨分化结果、成软骨分化结果和细胞成脂分化结果。
其中，各图中的1表示：各实施例配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基；2表示：商品化普通干细胞培养基。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
各实施例中所使用的干细胞生长因子(SCF)、LN-332、LN-511、转铁蛋白、TGF-β1、EGF、HGF和NGF购于PeproTech公司。
各实施例中所使用的谷氨酰胺、透明质酸(HA)、白藜芦醇(RSV)、胰岛素、氢化可的松和孕酮购于Sigma公司。
本发明所使用的PDGF、TGF-β1购于Santa公司。
实施例1
一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其以DMEM-LG培养基为溶剂，向DMEM-LG培养基中添加的成分及其浓度组成见表1。
表1
上述无动物血清的脐带间充质干细胞培养基的制备工艺为：
S1、取一包DMEM-LG培养基粉末9g，加入900mL去离子水，再向其中加入2g的碳酸氢钠完全溶解；
S2、再向其中依次加入以下成分：谷氨酰胺、透明质酸、白藜芦醇、胰岛素、氢化可的松、孕酮、干细胞生长因子、LN-332、LN-511、转铁蛋白、PDGF、TGF-β1、TGF-β1、EGF、HGF和NGF，完全溶解后加入双抗，调节pH为7.2，去离子水定容至1L，常温下无菌操作过0.22μm的滤膜，封口膜封口并于4℃冰箱中保存待用。
实施例2
一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其以DMEM-LG培养基为溶剂，向DMEM-LG培养基中添加的成分及其浓度组成见表2。
表2
上述无动物血清的脐带间充质干细胞培养基的制备工艺可参考实施例1。
实施例3
一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其以DMEM-LG培养基为溶剂，向DMEM-LG培养基中添加的成分及其浓度组成见表3。
表3
上述无动物血清的脐带间充质干细胞培养基的制备工艺可参考实施例1。
实验例1
脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的分离与培养
1.实验对象：
实施例1中配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基(MesenPRO RS培养基)；
2.试验方法：
2.1从手术室取得新鲜健康新生儿脐带，用PBS将脐带组织冲洗干净，用剪刀镊子剔除血管，剥出里面的华氏胶组织，再将组织块转移至1个1.5mL的EP管内，将华氏胶组织用已灭菌处理的组织剪剪碎为1mm3大小，将EP管内的组织平均转移到2个无菌EP管内，向两个无菌EP管内分别加入等量的实施例1所配的培养基和商品化干细胞培养基，直接将2个EP管内的糊状组织分别接种于培养瓶中，一个EP管对应一个T175的培养瓶，然后分别对应加入10mL实施例1所配的培养基和商品化干细胞培养基，轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部，然后放入5％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中静置贴壁培养，期间避免振荡，目的是使富含间充质干细胞的组织充分贴壁。
2.2静置培养24小时后，在倒置显微镜下观察，组织块贴壁牢固后，可补加完全培养基10～15ml之后3～4天换1次培养液，静置培养7～9天后，可见大量细胞贴壁。此时，用吸管轻轻吸出一半培养液，轻轻摇晃培养瓶，使组织块脱离瓶底，弃掉上清和悬浮组织块并在培养瓶中对应加入新鲜的实施例1所配的培养基和商品化干细胞培养基，继续进行贴壁培养，密切观察细胞生长情况，依据细胞生长情况，每隔3～4天进行换液处理。待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化传代，按1:3的比例进行传代，收集细胞进行冻存或继续传代培养。传代培养的过程是纯化间充质干细胞的过程。
2.3流式细胞术测试UC-MSCs的表面标记：
使用以下抗体进行：CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD11b。
通过胰蛋白酶消化试验方法2.2所分离的细胞后，并用PBS洗涤两次。单细胞悬浮液在含有5％FBS的封闭溶液中孵育。通过离心回收细胞并用如前所述的抗体染色。在黑暗中孵育后，用洗涤缓冲液(1％FBS+0.1％叠氮化钠的1×PBS)洗涤细胞两次，重悬于洗涤缓冲液中，使用流式细胞仪进行检测。
3.实验结果：
3.1如图1A所示，实施例1配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中的贴壁细胞均呈现出典型的平行或漩涡状的纺锤形、成纤维细胞样(细长的梭形)形态，但两者也显示出不同的形态特征。与商品化普通干细胞培养基相比，实施例1配制的原代无动物血清的脐带间充质干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的细胞更小和形态更长。
3.2如图1B所示，通过流式细胞术分析了MSC阳性标记(CD73、CD90、CD105)和MSC阴性标记(CD34、CD45、CD11b)的表达。实施例1配制的原代无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞之间的表面标记表达没有显著差异。CD73、CD90、CD105表达均为阳性，CD34、CD45、CD11b表达为阴性。这些结果表明，实施例1配制的原代无动物血清的脐带间充质干细胞培养基不影响脐带间充质干细胞的细胞表面标记表达。
实验例2
脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的增殖能力检测
1.实验对象：
实施例2中配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基(MesenPRO RS培养基)；
2.试验方法：
2.1取第五代实施例2配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞分别通过胰蛋白酶消化后，以1×106的细胞浓度加入到96孔板中，每孔分别100μL，每个时间段设置12个复孔，在培养时间到达时，分别在不同时间点加入CCK-8溶液20μL，轻轻震荡混匀，继续培养4小时，用酶联免疫检测仪在波长450nm处测定各孔吸光度值。
2.2取第五代实施例2配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞分别通过胰蛋白酶消化后，将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每孔100-200个细胞的梯度密度接种含37℃预温培养液的6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置于37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。每隔2天换一次培养基。在培养过程中经常观察，当出现肉眼可见的克隆时，终止培养。加4％多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去除固定液，加适量结晶紫液染10-30分钟，然后用PBS洗涤3-5次，每次5分钟。吸干PBS，自然晾干后拍照。
3.实验结果：
如图2A所示，实施例2配制的原代无动物血清的脐带间充质干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞增殖速率比商品化普通干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞增殖速率快。
如图2B所示，使用克隆形成实验来评估单个细胞的扩增能力。实施例2配制的原代无动物血清的脐带间充质干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞都能够支持集落生长形成，且实施例2配制的原代无动物血清的脐带间充质干细胞培养基培养的克隆形成数量多于商品化普通干细胞培养基。结果表明，与商品化普通干细胞培养基相比，实施例2配制的原代无动物血清的脐带间充质干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞具有更高的集落形成能力。
实验例3
成骨、成软骨和成脂分化测定
1.实验对象：
实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基(MesenPRO RS培养基)；
2.试验方法：
2.1成骨分化：取第五代实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中培养的脐带间充质干细胞分别通过胰蛋白酶消化后，以5,000个细胞/孔的数量接种在放有细胞爬片的12孔板中。24小时后，加入成骨诱导条件培养基2mL后放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每隔1天换液一次，持续诱导3周，3周后用茜素红素染色法检测钙沉积。诱导21天后，吸去成骨诱导条件培养基，细胞爬片用PBS清洗细胞3次，每次5分钟，然后4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS清洗细胞3次去除残留多聚甲醛。用2％茜素红染色液将细胞染色3分钟。3分钟后细胞爬片用PBS冲洗5次后，使用茜素红分化液洗涤1次，每次15秒，用PBS洗涤3次后，显微镜下观察并拍照。
2.2软骨细胞分化：取第五代实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中培养的脐带间充质干细胞分别通过胰蛋白酶消化后，以5,000个细胞/孔的数量接种在放有细胞爬片的12孔板中。24小时后，加入成软骨诱导培养基2mL后放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，诱导培养基每3天更换一次，连续14天。14天后用Alcian Blue染色。诱导14天后，吸去成软骨诱导培养基，细胞爬片用PBS清洗细胞3次，每次5分钟，然后4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS清洗细胞3次去除残留多聚甲醛。使用1％Alcian Blue染液室温孵育30分钟，0.1M HCL洗去多余浮色。用PBS洗涤3次后，显微镜下观察并拍照。
2.3成脂分化：取第五代实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中培养的脐带间充质干细胞分别通过胰蛋白酶消化后，以5,000个细胞/孔的数量接种在放有细胞爬片的12孔板中。24小时后，加入成脂诱导液2mL后放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，持续诱导3天后加入成脂诱导保持液处理1天，重复循环3次后，再用成脂诱导保持液处理7天，每隔3天换液一次。19天后用油红O染色法检测脂滴形成。诱导19天后，吸去成脂诱导保持液，细胞爬片用PBS清洗细胞3次，每次5分钟，然后4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS清洗细胞3次去除残留多聚甲醛。用2％油红O染色液将细胞染色5分钟。60％异丙醇漂洗30s除去多余染料，用PBS洗涤3次后，显微镜下观察并拍照。
3.实验结果：
3.1如图3所示，分化21天后，通过钙沉积茜素红染色观察实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中培养的脐带间充质干细胞的成骨分化。分化后，实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中培养的脐带间充质干细胞都具有骨样结节的特征性染色，表明实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中培养的脐带间充质干细胞均保持了成骨分化潜力。
3.2如图3所示，分化14天后，通过Alcian Blue染色观察实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中培养的脐带间充质干细胞的成软骨分化。分化后，Alcian Blue均对软骨内的酸性蛋白聚糖染色，染色为蓝色。表明实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中培养的脐带间充质干细胞均保持了成软骨分化潜力。
3.3如图3所示，分化19天后，油红O染色观察细胞成脂分化。实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中培养的脐带间充质干细胞具有脂肪空泡沉积的特征性染色，表明实施例3配制的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基和商品化普通干细胞培养基中培养的脐带间充质干细胞均保持了成脂分化潜力。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
Claims (8)
1.一种无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基、谷氨酰胺、促增殖因子、细胞抗衰老和活性维持因子、生长因子组合；
其中，所述促增殖因子为LN-332、LN-511、胰岛素、氢化可的松、孕酮、肝细胞生长因子、干细胞生长因子中的一种或多种；
所述细胞抗衰老和活性维持因子为透明质酸、转铁蛋白、白藜芦醇中的一种或多种；
所述生长因子组合为肝细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-β1、表皮生长因子、神经生长因子中的多种。
2.根据权利要求1所述的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM-LG培养基。
3.根据权利要求1或2所述的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述谷氨酰胺的加入后浓度为20-50μg/mL。
4.根据权利要求1所述的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述促增殖因子中LN-332的加入后浓度为5-15ng/mL、LN-511的加入后浓度为5-15ng/mL、胰岛素的加入后浓度为10-20μg/mL、氢化可的松的加入后浓度为20-50ng/mL、孕酮的加入后浓度为1-10ng/mL、肝细胞生长因子加入后浓度为50-100ng/mL、干细胞生长因子的加入后浓度为5-15ng/mL。
5.根据权利要求1所述的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述细胞抗衰老和活性维持因子中透明质酸的加入后浓度为10-50μg/mL、转铁蛋白的加入后浓度为0.01-0.1μg/mL、白藜芦醇的加入后浓度为0.5-1μg/mL。
6.根据权利要求1所述的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述生长因子组合中血小板衍生生长因子的加入后浓度为10-15ng/mL、转化生长因子-β1的加入后浓度为0.5-2ng/mL、表皮生长因子的加入后浓度为1-5ng/mL、神经生长因子的加入后浓度为5-10ng/mL。
7.一种如权利要求1所述的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基的合成工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1、准备基础培养基，并将其作为溶剂；
S2、向基础培养基中依次加入配方量的谷氨酰胺、促增殖因子、细胞抗衰老和活性维持因子和生长因子组合；
S3、添加的组分完全溶解后，经过滤除菌处理，将pH值调节至7.2-7.4，保存于4℃的环境。
8.一种如权利要求1所述的无动物血清的脐带间充质干细胞培养基的应用，其特征在于，所述无动物血清的脐带间充质干细胞培养基用于脐带间充质干细胞的体外培养和扩增。
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Cited By (2)
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| CN119405783A (zh) * | 2025-01-08 | 2025-02-11 | 奥辰生物(云南)有限公司 | 一种包含高活性脐带msc的药物组合物 |
| CN120168405A (zh) * | 2025-03-21 | 2025-06-20 | 北京益华生物科技有限公司 | 一种注射用细胞药物保护液及其制备方法和应用 |
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